單重與雙重進樣文氏管電噴灑游離質譜法的應用

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(1)國立高雄大學應用化學系(碩士班) 碩士論文. 單重與雙重進樣文氏管電噴灑游離質譜法的應用. Applications of Single and Dual Inlet Venturi Electrospray Ionization Mass Spectrometry. 研究生：潘怡桂指導教授：何永皓博士. 中華民國一百零三年七月.

(2) 目錄中文摘要…………………………………………………………………..….1 英文摘要……………………………………………………...………………2 第一章. 前言................................................................................................... 4. 第二章. 文獻探討 .......................................................................................... 7. 2.1 線上偵測反應的工具 ......................................................................... 7 2.2 各種不同游離法搭配質譜儀進行線上偵測反應 ............................. 8 2.2.1 以電噴灑游離法搭配質譜儀進行線上偵測反應 ................... 9 2.2.2 常態游離法搭配質譜儀進行線上偵測反應 ......................... 14 2.3 合成苯並咪唑的化學反應 ............................................................... 27 2.4 茶葉化學 ........................................................................................... 32 2.5 藍瓶反應 ........................................................................................... 37 第三章. 實驗方法 ........................................................................................ 40. 3.1 藥品與儀器 ....................................................................................... 40 3.2 自動進樣 (Self-pumping) 裝置 ...................................................... 41 3.3 以 sVESI 進行線上即時偵測 .......................................................... 44 3.3.1 苯並咪唑化合物之合成反應 ................................................. 44 3.3.2 不同條件下沖泡茶葉所釋放之化合物 ................................. 45 3.3.3 藍瓶反應 ................................................................................. 46 3.3.4 果皮表面附著農藥之偵測 ..................................................... 47 3.4 以 dVESI 進行線上即時偵測 .......................................................... 48 3.4.1 快速反應之偵測 ..................................................................... 49. II.

(3) 3.4.2 調節茶湯中化合物之 ESI 效率 ............................................. 49 第四章. 結果與討論 .................................................................................... 50. 4.1 溶液流速之探討 ............................................................................... 50 4.2 sVESI/MS 於線上即時偵測的應用 ................................................ 55 4.2.1 苯並咪唑化合物合成反應實驗參數之探討 ......................... 55 4.2.1.1 反應時間之影響 ........................................................... 56 4.2.1.2 溶劑之影響 ................................................................... 62 4.2.1.3 酸催化之影響 ............................................................... 66 4.2.1.4 BA 純度之影響.............................................................. 69 4.2.2 不同條件下沖泡茶葉所釋放之化合物 ................................. 72 4.2.2.1 不同茶品之比較 ........................................................... 78 4.2.2.2 沖泡溫度之影響 ........................................................... 86 4.2.3 藍瓶反應中亞甲基藍濃度之變化 ......................................... 89 4.3 果皮表面附著農藥之偵測 ............................................................... 93 4.3.1 果皮表面單一農藥之偵測 ..................................................... 94 4.3.2 果皮表面混合農藥之偵測 ..................................................... 99 4.3.2.1 以不同溶劑偵測農藥混合液 ..................................... 106 4.4 dVESI 之應用 .................................................................................. 111 4.4.1 快速反應的偵測 ................................................................... 112 4.4.2 調節茶湯中化合物之 ESI 效率 ........................................... 119 第五章. 結論............................................................................................... 125. 第六章. 參考文獻 ...................................................................................... 129. III.

(4) 圖目錄圖 2-1 mobile HPLC 裝置與自動進樣設備 ................................................... 8 圖 2-2 ESI-MS 搭配汞弧光燈作光化學反應之裝置示意圖 ...................... 10 圖 2-3 直接注射電噴灑游離法結合質譜儀裝置示意圖 ........................... 10 圖 2-4 微型反應器混和分析液後搭配 ESI 游離源進行偵測 ................. 11 圖 2-5 咖啡因氧化降解反應式 ................................................................... 12 圖 2-6 咖啡因降解反應之質譜圖 ............................................................... 12 圖 2-7 直接分析即時離子化方法的裝置示意圖 ....................................... 15 圖 2-8 solid-state organic reactions 生成物與產物的 3D 關係圖 .............. 16 圖 2-9 萃取式電噴灑游離法的裝置示意圖 ............................................... 17 圖 2-10 以 Venturi effect 方式進樣，利用 EESI-MS 方式進行線上偵測之裝置示意圖 ........................................................................................... 18 圖 2-11 水楊酸乙酯水解成水楊酸的動力學曲線圖 ................................. 18 圖 2-12 文氏里音速噴灑游離法裝置圖 ..................................................... 19 圖 2-13 利用 V-EASI 裝置進行 MBH reaction 線上偵測的動力學曲線 ................................................................................................................... 19 圖 2-14 以 Venturi effect 串聯微萃取系統及螢光顯微鏡之系統裝置圖 . 21 圖 2-15 以 V-EASI-MS 即時觀測核鹼基自組裝過程之系統裝置圖 ....... 22 圖 2-16 無接觸式大氣壓下游離法裝置示意圖 ......................................... 23 圖 2-17 自動化 C-API 進樣系統裝置示意圖 ............................................. 24 圖 2-18 無接觸式大氣壓下游離法搭配氮氣球裝置示意圖 ..................... 24 圖 2-19 利用無接觸式大氣壓下游離法線上偵測 ..................................... 25. IV.

(5) 圖 2-20 paper-base 電噴灑游離法裝置示意圖 ............................................ 26 圖 2-21 正丁胺和苯甲醛反應後，產物與起始物的比值對時間作圖 ..... 26 圖 2-22 在矽硫酸催化下，以鄰苯二胺與醛類化合物合成苯並咪唑的反應式 ........................................................................................................... 28 圖 2-23 以鄰苯二胺與醛類化合物當作起始物合成苯並咪唑 ................. 29 圖 2-24 在 p-TsOH 催化下，以鄰苯二胺與醛類化合物合成苯並咪唑的反應式 ....................................................................................................... 29 圖 2-25 在 p-TsOH 催化下進行合成苯並咪唑的反應 ............................ 30 圖 2-26 鄰苯二胺以及苯甲醛的反應式 ..................................................... 31 圖 2-27 於負電模式下，分析物之質譜圖表現 ......................................... 34 圖 2-28 藍瓶反應之速率方程式 ................................................................. 38 圖 2-29 thiazine 結構 ..................................................................................... 39 圖 3-1 不同樣品承載容器的 sVESI 自動進樣裝置示意圖 ..................... 42 圖 3-2 dVESI 自動進樣裝置示意圖 ........................................................... 43 圖 3-3 以升降台與磁力攪拌器來協助 sVESI 裝置進行線上偵測反應... 45 圖 3-4 茶葉實驗之反應示意圖 ................................................................... 46 圖 3-5 藍瓶反應實驗室意圖 ....................................................................... 47 圖 3-6 以 sVESI 裝置即時偵測水果表皮農藥示意圖 ............................... 48 圖 3-7 以 dVESI 裝置進行茶葉實驗之反應示意圖 .................................. 49 圖 4-1 以 sVESI-MS 線上即時偵測苯並咪唑化合物合成反應之實驗步驟 ................................................................................................................... 56 圖 4-2 推測 o-PD 與 BA 反應之反應機制 ................................................. 56. V.

(6) 圖 4-3 不同甲醇溶液之 sVESI/MS 質譜圖 ................................................ 57 圖 4-4 o-PD 與 BA 於甲醇中反應之 TIC 圖和 EIC 圖.............................. 58 圖 4-5 圖 4-4 中 0~40 分鐘區間之擷取圖 .................................................. 59 圖 4-6 o-PD 與 BA 於甲醇中之反應，其化合物相對離子強度與反應時間趨勢圖 ....................................................................................................... 61 圖 4-7 不同水溶液之 sVESI/MS 質譜圖 .................................................... 63 圖 4-8 o-PD 與 BA 於水溶液中反應之 TIC 圖和 EIC 圖.......................... 64 圖 4-9 圖 4-8 中 0~80 分鐘區間之擷取圖 .................................................. 65 圖 4-10 o-PD 與 BA 於水溶液中之反應其化合物相對離子強度與反應時間趨勢圖 ................................................................................................... 66 圖 4-11 不同甲醇溶液之 sVESI/MS 質譜圖 .............................................. 67 圖 4-12 o-PD 與 BA 於添加醋酸之甲醇溶液中反應之 TIC 圖和 EIC 圖 68 圖 4-13 圖 4-12 中 0~30 分鐘區間之擷取圖 .............................................. 68 圖 4-14 o-PD 與 BA 於添加醋酸之甲醇溶液中反應之化合物相對離子強度與反應時間趨勢圖 ............................................................................... 69 圖 4-15 不同水溶液之 sVESI/MS 質譜圖 .................................................. 70 圖 4-16 o-PD 與 BZA 於水溶液中反應之 TIC 圖和 EIC 圖 ...................... 71 圖 4-17 以正電模式分析之化合物 ............................................................. 72 圖 4-18 以負電模式分析之化合物 ............................................................. 73 圖 4-19 以 sVESI/MS 線上即時偵測茶湯中成分之實驗步驟 .................. 73 圖 4-20 以 80oC 熱水沖泡綠茶一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(+)質譜圖 .... 74 圖 4-21 不同碰撞能下 m/z 175.4 之 CID 質譜圖 ....................................... 75. VI.

(7) 圖 4-22 m/z 175.4 離子之斷裂途徑 .............................................................. 75 圖 4-23 不同碰撞能下 m/z 195.4 之 CID 質譜圖 ....................................... 76 圖 4-24 m/z 195.4 之斷裂途徑 ...................................................................... 77 圖 4-25 以 80oC 熱水沖泡綠茶一分鐘內，茶湯中化合物離子強度與時間之關係圖 ................................................................................................... 77 圖 4-26 以 80oC 熱水沖泡綠茶一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(-)質譜圖 ..... 78 圖 4-27 以 80oC 熱水沖泡紅茶一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(+)質譜圖 .... 79 圖 4-28 以 80oC 熱水沖泡紅茶一分鐘後茶湯之 sVESI/MS(-)質譜圖 ..... 79 圖 4-29 以 80oC 熱水沖泡紅茶一分鐘內，茶湯中化合物離子強度與時間之關係圖 ................................................................................................... 80 圖 4-30 不同沖泡次數下，紅茶茶湯中 m/z 218.8 離子強度與沖泡時間之關係圖 ....................................................................................................... 81 圖 4-31 不同沖泡次數下，紅茶茶湯中 m/z 350.6 離子強度與沖泡時間之關係圖 ....................................................................................................... 81 圖 4-32 不同沖泡次數下綠茶(GT)與紅茶(BT)所釋出質子化茶氨酸離子強度與沖泡時間之關係圖 ....................................................................... 82 圖 4-33 不同沖泡次數下綠茶(GT)與紅茶(BT)所釋出去質子化茶氨酸離子強度與沖泡時間之關係圖................................................................... 83 圖 4-34 不同沖泡次數下綠茶(GT)與紅茶(BT)所釋出去質子化 EGC 離子強度與沖泡時間之關係圖 ....................................................................... 84 圖 4-35 不同沖泡次數下綠茶(GT)與紅茶(BT)所釋出去質子化 EC、ECG 及 EGCG 等類兒茶素離子強度與沖泡時間之關係圖.......................... 85. VII.

(8) 圖 4-36 綠茶分別以 80oC 和 100oC 各沖泡三次時，ECG 離子強度與沖泡時間之關係圖 ........................................................................................... 86 圖 4-37 紅茶分別以 80oC 和 100oC 各沖泡三次時，ECG 離子強度與沖泡時間之關係圖 ........................................................................................... 88 圖 4-38 藍瓶反應之反應機制 ..................................................................... 89 圖 4-39 藍瓶反應溶液於不同時間之顏色變化 ......................................... 90 圖 4-40 不同果糖濃度之藍瓶反應液中還原態亞甲基藍(m/z 286.6)之 EIC 圖 ............................................................................................................... 92 圖 4-41 不同果糖濃度氧化還原態亞甲基藍(m/z 286.6)之快慢比較 ....... 93 圖 4-42 以 sVESI/MS(+)進樣 10-4 M 甲基多保淨之質譜圖 ..................... 94 圖 4-43 以 sVESI/MS(+)偵測附著在(A)錶玻璃；(B) 樣品瓶底部之甲基多保淨質譜圖 ........................................................................................... 95 圖 4-44 以 sVESI/MS(+)偵測添加在芒果表皮之甲基多保淨質譜圖 ...... 95 圖 4-45 未經清洗之芭樂表皮其三個不同取樣點之 sVESI/MS(+)質譜圖 ................................................................................................................... 97 圖 4-46 以水清洗過之芭樂表皮其三個不同取樣點之 sVESI/MS(+)質譜圖 ............................................................................................................... 97 圖 4-47 以 10-4 M 甲基多保淨噴灑之芭樂表皮其三個不同取樣點之 sVESI/MS(+)質譜圖 ................................................................................ 98 圖 4-48 再次以清水洗過的芭樂表皮其三個不同取樣點之 sVESI/MS(+) 質譜圖 ....................................................................................................... 99 圖 4-49 不同農藥標準品之 sVESI/MS(+)質譜圖 .................................... 101. VIII.

(9) 圖 4-50 10-6 M 之 TM、BC、TFN、CPF 等四種農藥甲醇混和液之 sVESI/MS(+)質譜圖 .............................................................................. 102 圖 4-51 以 sVESI/MS(+)偵測附著在樣品瓶底部之農藥混合液質譜圖 103 圖 4-52 以 sVESI/MS(+)偵測添加在芒果表皮之農藥混合液質譜圖 .... 104 圖 4-53 清洗芭樂表皮之農藥混合液時不同階段之 sVESI/MS(+)質譜圖 ................................................................................................................. 105 圖 4-54 以不同溶劑萃取未經處理香蕉表皮之 sVESI/MS(+)質譜圖 .... 106 圖 4-55 以不同溶劑萃取已噴灑農藥混和液之香蕉表皮其 sVESI/MS(+) 質譜圖 ..................................................................................................... 107 圖 4-56 溶於不同溶劑之農藥混和液 ESI/MS(+)質譜圖 ........................ 109 圖 4-57 dVESI 自動進樣裝置示意圖 ........................................................ 111 圖 4-58 BA 甲醇溶液之穩定性 .................................................................. 113 圖 4-59 BA 水溶液之穩定性 ...................................................................... 113 圖 4-60 dVESI/MS 探討 o-PD 與 BA 於甲醇溶液中反應之 TIC 圖和 EIC 圖 ............................................................................................................. 115 圖 4-61 以 dVESI 觀測 o-PD 與 BA 反應之質譜圖 ................................ 116 圖 4-62 圖 4-60 中 0~6 分鐘區域 EIC 圖 ................................................. 117 圖 4-63 以 dVESI 觀測 o-PD 與 BA 之反應中各化合物相對強度與觀測時間關係圖 ................................................................................................. 118 圖 4-64 以 dVESI/MS 分析茶湯之實驗步驟圖 ....................................... 120 圖 4-65 不同操作方式下所得之綠茶茶湯質譜圖 ................................... 121. IX.

(10) 圖 4-66 sVESI/MS(-)和 dVESI/MS(-)分析綠茶茶湯時[奎寧酸-H]+之 EIC 質譜圖 ..................................................................................................... 121 圖 4-67 sVESI/MS(-)和 dVESI/MS(-)分析綠茶茶湯時之 EIC 質譜圖.... 122 圖 4-68 不同操作方式下所得之綠茶茶湯質譜圖 ................................... 123 圖 4-69 sVESI/MS(+)和 dVESI/MS(+)分析綠茶茶湯時之 EIC 質譜圖.. 124. X.

(11) 表目錄表 4-1 溶液物性與其流速之比較 ............................................................... 51 表 4-2 V-EASI 與 VESI 之比較 .................................................................... 54 表 4-3 農藥之結構與分子量 ..................................................................... 100. XI.

(12) 單重與雙重進樣文氏管電噴灑游離質譜法的應用. 指導教授：何永皓博士國立高雄大學應用化學系 (碩士班). 學生：潘怡桂國立高雄大學應用化學系 (碩士班). 摘要我們實驗室已成功利用電噴灑游離源之霧化氣體開發出文氏管電噴灑游離質譜法 (Venturi electrospray ionization mass spectrometry, VESI/MS)，此項質譜法具有快速、簡單、樣品使用量少與可進行線上即時偵測之能力等優點。為了瞭解 VESI/MS 未來可能之應用性，本研究以單重和雙重進樣方式之 VESI/MS 偵測一系列性質不同之實驗，凸顯線上即時偵測於反應動力學研究上之優點。以五種溶劑測試結果顯示，VESI 裝置內溶液之平均流速約為 9~32 μL/min，10~20 秒即可將分析液傳送至游離源進行分析，具有線上即時偵測之功能。使用單重進樣方式之 VESI/MS (sVESI/MS) 探討苯並咪唑化合物之合成反應，分析不同溶劑或有無酸催化下，單取代與雙取代基產物之消長變化，可以用來判斷何者是動力學有利或熱力學有利之產物。探討藍瓶反應之應用，則是依據還原態亞甲基藍之選擇離子層析(EIC) 圖，展現還原劑濃度與氧氣對此氧化還原反應速率之影響。有別於探討化學反應機制，sVESI/MS 轉而研究茶葉於不同沖泡條件下所溶出物質之變化，EIC 圖清楚顯示發酵程度、沖泡溫度與沖泡次數對茶葉溶出物質之影響。利用 sVESI/MS 具有自動進樣和分析液只需 10 μL 之優點，我們以 sVESI/MS 進行水果表皮農藥殘留之分析，證實洗滌水果雖有清潔作用，但無法完全移除農藥之殘留。苯並咪唑化合物之合成反應改以雙重進樣方式之 VESI/MS (dVESI/MS) 偵測時， EIC 圖證實反應開始數秒之內中間產物已生成，再隔數秒後產物也開始生成。藉由 dVESI/MS 可以使用 post-reactor 方式添加氨水或醋酸於分析液中之優勢，我們成功提升偵測茶湯內容物時，茶氨酸、咖啡因和兒茶素之訊號強度。. 關鍵字: VESI、即時偵測、反應機制、苯並咪唑化合物、溶劑效應、藍瓶反應、樣品前處理、萃取.

(13) Applications of Single and Dual Inlet Venturi Electrospray Ionization Mass Spectrometry Advisor: Dr. Yeung-Haw Ho Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung. Student: Yi-Kuei Pan Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung. ABSTRACT Extended utilization of nebulizer gas of electrospray ionization source, we had developed Venturi electrospray ionization mass spectrometry (VESI/MS). The advantages of this method are rapid, simple, small sample amount, and on-line real-time monitoring. To explore potential applications of this method in the future, we examined a variety of applications of VESI/MS. Sample inlet methods of VESI/MS can be single-inlet or dual-inlet. Information provided by VESI/MS was especially favored for studies of reaction kinetics. Measurements of five different solvents showed that the flow rate for delivering solution was ranged from 9 to 32 μL/min. Delivery time of solution was 10~20 seconds. Hence, VESI/MS was suitable for on-line real-time analysis. Single-inlet VESI/MS (sVESI/MS) was applied on monitoring synthesis of benzimidazole. Productions of monosubstituted and disubstituted final products upon different experimental conditions were recorded continuously. Experimental conditions that studied were solvent effect and acid catalysis. Results were conducted to justify which product was kinetic-controlled product. sVESI/MS was also applied on study of blue bottle reaction. Fluctuation of reduction-state methylene blue upon periodic redox reaction was clearly demonstrated by extracted ion chromatogram (EIC). The function of oxygen and effect of fructose concentration on the reduction rate were also shown. Besides reaction mechanism, sVESI/MS can be used to investigate compounds released from tea leaves upon different drewing conditions. Effects of drewing temperature and number of drewing and extend of fermentation were examined. sVESI/MS was an automatic sampler and required small sample amount (10 μL). It was suitable for 2.

(14) preliminary inspection of pesticide residue of fruits. We examined the washing procedures for cleaning out pesticide residue of fruits. Results indicated that the pesticide residue can be removed to an extent, but not all. Synthesis of benzimidazole was also studied by dual-inlet VESI/MS (dVESI/MS). EICs obtained from dVESI/MS showed that reaction intermediate was formed in few tens of seconds after reaction initiated. Final products were formed in seconds after the formation of intermediate. dVESI/MS had a capability to perform post-reactor technique. By on-line adding ammonia or acetic acid into solution that brewing from tea, the signal intensity of theanine, caffeine, and catechin in mass spectrum were improved with dVESI/MS. Keywords: Venturi electrospray ionization, on-line real-time monitoring, solvent effect, reaction kinetics, blue bottle reaction, pesticide residue. 3.

(15) 第一章. 前言. 瞭解反應機制是尋求反應實驗條件最佳化過程中不可或缺的一環，而即時地監控反應過程可以在反應時提供較詳細的資訊，有助於解釋許多現象並提供一些解決問題的方法，並使我們更理解反應的機制。探討反應機制的研究基本上可分為離線 (off-line) 和線上 (on-line) 兩種。採用離線方式時，樣品的分離和鑑定是分別在兩個獨立的場域中進行，偵測樣品時也須純化處理，在無法取得純化物的狀況下便無法使用離線方法進行結構的鑑定，離線偵測方式不僅麻煩耗時，所得到的資訊也比較不連貫、不完整。相反地，線上偵測方式是將分離過程與鑑定儀器藉由介面串連使用，其改善了離線偵測的缺失，也較有利於不穩定化合物的分析。與各種分析工具 (例如 NMR、Raman、HPLC 等) 比較之下，質譜儀 (Mass Spectrometry, MS) 因為具有高靈敏度和專一性的特性，乃成為最有前景的分析工具，而質譜儀也可以提供在反應系統中所參與的物質的質量對電荷比值之資訊，使獲得的資料更加完善。質譜儀線上偵測的游離方式是由電噴灑游離法開始作應用，但為了改善前處理的步驟，在 2004 年由 Cooks 等人所研發出來的脫附電噴灑游離法 (Desorption Electrospray Ionization, DESI) 帶動了一連串新的常態游離方式的發展。常態游離法為一不需要樣品前處理、不受腔體限制、可與各種質譜儀結合使用的游離方式，近年來，以不需要任何樣品前處理或分離的常態游離法質譜技術作為即時分析的方法，被廣為研究探討。雖然以質譜法進行線上反應偵測的研究已經有小有成果，但大部分有 4.

(16) 機反應的相關文獻都在探討改變不同反應條件而得到的產率多寡，近年來質譜相關的文獻也都著重於游離源的改良方式 (例如利用樹葉、紙張等不同表面的材質，作為使分析物游離且帶電的平台，進而進入質譜儀分析偵測)，使樣品藉由不同的方式氣化且游離，較偏向創意、開發的方向。因此本實驗室開發一套自動進樣裝置，稱為文氏管電噴灑游離質譜法 (Venturi Electrospray Ionization, VESI) ，藉由電噴灑游離源所使用的 nebuliser gas 因高速流動在 ESI tip 的前端形成 Venturi effect 產生一壓力差而推動樣品液，使此裝置在不外加幫浦等設備，也無需改裝儀器下就能達到連續自動進樣的效果。此自動進樣裝置的優勢為能搭配傳統市售 ESI/APCI 游離源的質譜儀，不需額外改造游離端，而且可快速拆裝，作為質譜儀的額外配件，沒有受過專業訓練的人員也能獨立操作本實驗裝置，自動進樣搭配操作人員的輔助能幫助質譜儀快速且大量的進行樣品的偵測，上述兩點為此實驗裝置的最大優勢。因為連續自動進樣方式能提供穩定的進樣速率使偵測訊號穩定，所以將反應瓶改為樣品瓶時會因為承載樣品容量變大而達大量的分析效果。可利用不同容量的反應瓶作連續進樣與清洗質譜系統，不需擔心注射針幫浦的注射針容量影響連續偵測時間與樣品交叉汙染的問題。首先以單重進樣 VESI (sVESI) 針對不同的溶劑進行探討，搭配溶劑之黏滯度、密度以及極性等性質了解 sVESI 於不同溶液下其與流速大小間之關係，以利推算觀測反應時的延遲時間。研究初期利用文氏管電噴灑游離質譜法進行有機反應的線上即時偵測，包含合成苯並咪唑化合物. 5.

(17) 反應的線上即時偵測以及其反應機制之研究，進一步探討溶劑效應與催化劑對反應的影響及結果，並搭配已知結果進行比較；還有線上即時觀測藍瓶反應隨時間之顏色變化，主要針對還原態亞甲基藍進行偵測，研究其於氧化、還原過程中由藍色變為無色的訊號改變，並探討反應濃度對氧化還原速率的影響及結果。雖然有許多茶葉相關之研究發表，但大多以離線方式分離茶內化學物質後再以儀器鑑定結構，而本研究中，以 sVESI 自動進樣裝置進行即時偵測短時間內之沖泡茶葉實驗，偵測一分鐘內不同茶品、沖泡溫度和沖泡次數之茶湯所含特定化合物的變化。進一步發揮裝置可自動進樣及樣品用量少之特點，將裝置應用於常態偵測水果表皮農藥殘留上，以甲基多保淨 (Thiophanate-methyl, TM)、丁基拉草 (Butachlor, BC)、得芬諾 (Tebufenozide, TFN) 及陶斯松 (Chlorpyrifos, CPF) 作為模擬樣品即時檢測蔬果表面農藥殘留量，開發簡易偵測蔬果農藥的方法，並針對不同極性萃取液於真實樣品表面之質譜圖表現作探討。苯並咪唑化合物之合成反應改以雙重進樣 VESI (dVESI) 偵測時發現中間產物於反應後數秒即以生成，且單、雙取代基之產物於中間產物生成後也立刻生成，顯示此反應為一快速反應。而我們也以 dVESI 裝置搭配 post-reactor 方法，藉由調質液成功提升茶湯內容物 (茶氨酸、咖啡因和類兒茶素) 之訊號強度。. 6.

(18) 第二章. 文獻探討. 瞭解反應機制是尋求反應實驗條件最佳化過程中不可或缺的一環，而即時地監控反應過程可以在反應時提供較詳細的資訊，幫助我們更理解反應的機制。探討反應機制的研究基本上可分為離線 (off-line) 和線上 (on-line) 兩種。採用離線方式時，樣品的分離和鑑定是分別在兩個獨立的場域進行，例如將樣品中的化合物以管柱分離純化後，再以 NMR 和其它光譜儀進行各個成分的鑑定。離線偵測方式不僅麻煩耗時，而且所得到的資訊也比較不連貫、不完整，對於一些不穩定化合物以及中間產物的偵測來說，要得到完整的資訊是比較困難的；相反的，線上偵測方式是將分離過程與鑑定儀器藉由介面串連使用，其改善了離線偵測的缺失。. 2.1 線上偵測反應的工具 1989 年 Henion1 等人，以簡易的 LC/MS 介面方式即時偵測胜肽在酶水解反應下胜肽序列初步的結構鑑定。1999 年 Farquharson2 等人，利用拉曼光譜儀 (Raman spectroscopy) 搭配穩定的光纖系統的光感測器，作為 Raman probes 對線上監測有機反應過程中的中間產物，研究其反應機制。2004 年 Besson3 等人利用傅立葉轉換紅外光譜儀/減弱全反射光譜儀 (fourier. transform. infrared. spectroscopy/attenuated. total. reflection,. FTIR/ATR) 線上偵測未飽和酮類的氫催化反應，例如 exocyclic α, β-unsaturated ketone，得到的產物藉由 chiral auxiliary 使反應具有鏡相異構物選擇性的效果，以 FTIR/ATR 作為即時監測的工具，可對動力學反 7.

(19) 應的實驗作線上偵測應用。 2007 年 Schafer4 等人利用 mobile HPLC 裝置與自動進樣設備 (圖 2-1) 將有機反應瓶中的反應溶液抽樣偵測反應的進度，例如 Suzuki coupling 反應的探討。此方式以極少的樣品量即可作即時分析，作為攜帶型的監測工具。. 圖 2-1 mobile HPLC 裝置與自動進樣設備 4. 2.2 各種不同游離法搭配質譜儀進行線上偵測反應與各種分析工具 (例如 NMR、Raman、HPLC 等) 比較之下，質譜儀 (Mass Spectrometry, MS) 因為具有高靈敏度和專一性的特性，乃成為最有前景的分析工具，而質譜儀也可以提供在反應系統中所參與的物質的質量對電荷比值之資訊，使獲得的資料更加完善。近年來，以不需要任何樣品前處理或分離的常態游離法 (ambient ionization) 質譜技術作為即時分析的方法，被廣為研究探討 5。. 8.

(20) 2.2.1 以電噴灑游離法搭配質譜儀進行線上偵測反應目前常用的游離方式可分為電噴灑游離法 ESI) 和介質輔助雷射脫附游離法. 6 7. (electrospray ionization, (matrix-assisted laser. desorption/ionization, MALDI) 兩種，前者適用於有機小分子的分析，後者則較常用於生化大分子等的分析。1989 年時 Fenn6 等人發表了電噴灑游離法，為質譜學的應用開啟另一個里程碑。電噴灑游離為大氣游離法的一種，使用時在金屬毛細管上外加一高電壓，使得毛細管內的溶液帶電荷並在毛細管尖端匯聚形成泰勒錐 (Taylor cone)，當尖端溶液的庫倫排斥力大於表面張力時，溶液會從尖端噴灑而出並形成帶電荷的小液滴，受電場吸引而朝著質譜儀入口飛去，溶劑在飛行中不斷揮發，直到完全揮發後剩下帶電荷分析物進入質譜儀偵測分析。 1998 年 Brum 與 Dell’Orco8 利用線上的大氣游離法 (Atmospheric Pressure Ionization, API) 方式設計液相實驗裝置(圖 2-2)，先行利用光解的 triphenylethylene 分子溶於甲醇作光化學反應的模擬實驗，以證明此裝置可被應用於即時監控反應動力學的變化。作者利用開發的裝置搭配汞弧光燈 (Hg arc lamp) 研究液相的 idoxifene 光化學轉換反應，即時偵測反應動力學結果並探討其反應機制。這種以傳統的 HPLC 進樣系統方式直接與質譜儀連接，表現出質譜儀游離端與即時偵測裝置的潛在應用性，作者設計此裝置介面希望成為一套即時偵測的探針 (in-situ probing) 來對有機合成反應與其反應途徑作探討。. 9.

(21) 圖 2-2 ESI-MS 搭配汞弧光燈作光化學反應之裝置示意圖 8. 而在 1999 年時 Dell’Orco9 等人利用直接注射電噴灑游離法 (direct injection electrospray ionization) 結合質譜儀 (圖 2-3) 的方法監測在甲苯 (toluene) 溶劑下，利用哌啶 (piperidine) 催化 Knoevenagel 縮合反應，並藉由相對離子含量對時間作圖，得到動力學速率及反應機制的資訊，由動力學曲線可以得知起始物、中間產物及產物三者間隨時間變化的轉換關係。. 圖 2-3 直接注射電噴灑游離法結合質譜儀裝置示意圖 9 10.

(22) 2005 年 Santos10 等人也利用 ESI-MS 質譜法搭配光化學反應裝置的概念作線上偵測有機反應，探究反應機制。作者設計一微型反應器 (microreactor) 作有機反應的反應槽介面，連接質譜儀作線上偵測 (圖 2-4)，並說明此裝置的優勢是能快速偵測反應結果。搭配 HPLC 管線與注射針幫浦而設計了針對有機反應的即時偵測裝置，搭配 ESI-MS 直接從溶液中快速偵測反應的中間體 (intermediate)，這將會對有機化學家在研究化學反應的機制上獲得更多資訊。. 圖 2-4 微型反應器混和分析液後搭配 ESI 游離源進行偵測 10. 2005 年 Augusti11 等人利用 ESI 游離法搭配串聯式質譜儀線上即時監測咖啡因 (caffeine) 在水中的氧化降解反應 (圖 2-5)，藉由 ESI 軟性的游離方法將起始物、中間產物以及產物從溶液裡轉換到氣相離子狀態。咖啡因水溶液在 TiO2/UV 條件下，反應零分鐘時看到質子化咖啡因訊號 (m/z 195)，隨著反應時間來到九十以及一百五十分鐘時，除了質子化咖啡因訊號外，質譜圖上額外出現兩個訊號峰，分別是咖啡因降解後所產生的 dimethylparabanic acid (m/z 143) 和 dimethylparabanic acid 降解後. 11.

(23) 所產生的 di(hydroxymethyl)parabanic acid (m/z 175)，反應時間越長，降解後產物的相對含量會越多 (圖 2-6)。而將此兩降解產物作碰撞誘導解離後得到斷片資訊，進一步地確定其產物結構。. 圖 2-5 咖啡因氧化降解反應式 11. 圖 2-6 咖啡因降解反應之質譜圖: (a) 反應零分鐘； (b) 反應九十分鐘； (c) 反應一百五十分鐘 11. 2011 年 Creaser12 等人利用離子遷移 (Ion Mobility, IM) 光譜法結合質譜儀來進行即時反應的偵測。此 IM-MS 的方法是利用電噴灑游離法來提供氣相分析物，藉由氫氧化鈉水溶液使得 7-fluoro-6-hydroxy-2-methylindole 進行去質子化反應後進一步聚合形成二聚體 (dimer)、三聚體 (trimer) 直到六聚體 (hexamer) 為止，並得到質荷比和漂移時間 (drift time) 的資訊，即時偵測反應時間大約持續了幾小時，而每隔幾分鐘就取樣並進行分析。ESI-IM-MS 的方法對於藥物反應. 12.

(24) 過程的控制及反應機構的證明，有快速偵測且選擇性良好的效果。而電噴灑游離法搭配質譜儀的方法也經常被用在無機領域當中，藉由質譜儀能夠線上即時偵測的優點來進行無機催化循環過程的監控。2004 年 Eberlin13 和其團隊利用電噴灑游離法結合質譜儀及串聯質譜儀線上偵測 Baylis-Hillman 催化反應，並且在正電模式 (positive mode) 和負電模式 (negative mode) 下都可進行監測，而也利用此方法偵測到初期推測的反應中間體訊號，並進一步進行碰撞誘導解離 (Collision Induced Dissociation, CID) 確認結構，使得反應結果更具有說服力。 2007 年 Santos14 等人利用了電噴灑游離法搭配串聯質譜儀 (tandem mass spectrometer) 進行了施蒂勒反應 (Stille reaction) 的線上偵測。在電噴灑游離法正電模式 (positive ion mode) 下，施蒂勒反應裡所有主要步驟中所牽涉到的物種為具有催化活性的鈀物種 (Pd(PPh3)2) 、中間產物二價鈀 (Pd(II)) 、還有環狀的 IPd-(CH2CH)Sn 物種，皆可以直接從溶液轉變為氣相分析物。而在負電模式條件下 (negative ion mode) 搜尋陰離子時，發現在反應介質中只有得到碘離子 (I-) 的訊號。藉由此方法作施蒂勒反應線上偵測，來闡述較詳細的施蒂勒反應催化循環過程並得到反應物、中間產物和產物間的轉換關係，也有助於得到更詳細的反應機構資訊。 2011 年 J. Scott15 等人利用了電噴灑游離法搭配質譜儀來進行無機催化的實驗，並藉由監測起始物、產物以及中間產物來推測其催化的反應機制。由反應機構推斷出有副產物的出現，並利用起始物 (ArI)、產物 (ArC2Ph) 以及副產物 (ArH) 的消長關係繪製出一條動力曲線圖，圖中可. 13.

(25) 以明顯看到起始物訊號隨時間變化而降低，產物及副產物的訊號則是隨著時間而增高。2005 年 Metzger10、2008 年及 2011 年 Santos16-17 都分別整理了利用電噴灑游離法搭配質譜儀進行各種不同反應的線上偵測及分析之文獻。. 2.2.2 常態游離法搭配質譜儀進行線上偵測反應以質譜儀進行線上偵測的方式是由電噴灑游離法開始作應用，雖然直接注射電噴霧游離質譜法 9, 11, 18, 19, 20 (direct infusion electrospray ionization spectrometry) 與膜進樣質譜法. 21,22,23. (membrane introduction mass. spectrometry, MIMS) 已經有了許多線上即時偵測的應用與研究，但為了改善前處理的繁複步驟，於 2004 年由 Cooks5 等人所研發出來的脫附電噴灑游離法 (desorption electrospray ionization, DESI) 帶動了一連串新的常態游離方式的發展。常態游離法為一不需要樣品前處理、不受腔體限制、可與各種質譜儀結合使用的游離方式，近年來，以不需要任何樣品前處理或分離的常態游離法質譜技術作為即時分析的方法，被廣為研究探討。 2005 年 Cody24 等人發展了直接分析即時離子化方法 (direct analysis in real time, DART) ，裝置圖如圖 2-7，並且利用 DART 偵測許多不同化學物質，例如有化學試劑、藥物、代謝物、生化分子、合成的有機物、有機金屬化合物、爆炸物等，也有利用 DART 在不同表面上作偵測，例如人體皮膚、貨幣、名片、水果和衣服等。而 2007 年 Petucci25 等人利用了 DART 來線上偵測合成轉換以及雜環化合物脫苯基的反應，於轉化合. 14.

(26) 成反應上溫度設置在 350oC，反應時間從零分鐘到十六小時。由質譜圖可以觀察到隨著時間變化，起始物 indole 的訊號 (m/z 254) 強度會逐漸降低，產物的訊號 (m/z 268) 強度會隨著時間逐漸升高，而 DART 的圖譜顯示起始物對產物比值的趨勢與 LC/UV/ESI-MS 相比之下是很相近的。. 圖 2-7 直接分析即時離子化方法的裝置示意圖 24. 2009 年 Zheng26 等人研究酮類化合物在大氣環境下，以間-氯過氧苯甲酸 (meta-chloroperoxybenzoic acid, m-CPBA) 作固態的 Baeyer-Villiger (BV) 氧化反應並搭配脫附電噴灑游離法與質譜儀 (DESI-MS) 作反應的線上偵測工具。直接將反應的產物以質譜法進行偵測，得到有關於固態 BV 反應的即時動力學結果，包括反應速率、動力學曲線等資訊。此裝置的開發將質譜儀的技術擴充應用於直接偵測固態有機反應 (solid-state organic reactions, SSORs)，結果將能得到一關於生成物與產物的質荷比、強度與時間的即時 3D 資訊 (圖 2-8)，更利於反應機制的探討。. 15.

(27) 圖 2-8 solid-state organic reactions 生成物與產物的質荷比、強度與時間的 3D 關係圖 26. 2008 年 Zenobi27 團隊利用氮氣吹送方式將分析物與電噴灑液滴混合，以萃取式電噴灑游離法 (Extractive Electrospray Ionization, EESI) 與串聯式質譜儀作 Michael addition 反應的線上偵測，裝置示意圖 (圖 2-9) 中可得知反應處與游離源為兩個不同場合，此種萃取進樣與游離方式改善了反應基質會干擾質譜偵測的現象。作者藉 EESI 裝置介面搭配質譜儀得到反應機制與動力學資訊，協助提高反應產率及降低對環境的損耗和污染。雖然 EESI 裝置以氮氣吹送的方式較利於質譜法對易揮發的分析物偵測，改善了進樣時反應溶液的基質干擾，但無法得知反應中未被吹送出裝置的物質資訊，仍具有偵測上的限制。. 16.

(28) 圖 2-9 萃取式電噴灑游離法的裝置示意圖 27. 2011 年 McCullough28 等人利用 EESI-MS 質譜方式作有機反應的線上即時偵測，將分析物以 Venturi effect 方式進樣，與 ESI 電噴灑液作萃取使分析物帶電荷 (圖 2-10)，不需額外動力推送分析物進入質譜作反應的即時偵測，可以得到反應中的動力學曲線以及反應速率 (圖 2-11)。即時監測水楊酸乙酯 (ethyl salicylate, m/z 165) 水解成水楊酸 (salicylic acid, m/z 137) 的動力學反應，其中發現此監測方法可以偵測到中間產物水楊酸甲酯 (methyl salicylate, m/z 151) 的訊號。. 17.

(29) 圖 2-10 以 Venturi effect 方式進樣，利用 EESI-MS 方式進行線上偵測之裝置示意圖 28. 圖 2-11 水楊酸乙酯水解成水楊酸的動力學曲線圖 28. 2011 年 Santos29 等人發展了一個新的常態游離方法，稱為文氏里音速噴灑游離法 (Venturi Easy Ambient Sonic-Spray Ionization, V-EASI)，裝置圖如圖 2-12，此為常態游離法雙模式之技巧，其方法簡單、易組合和 18.

(30) 容易操作，而且也不需要額外提供電壓、不需要加熱和高能量放射線等外力的施加，就能達到游離的效果，造成此種現象的原因為此游離方法是藉由 venturi effect 使得待測物能夠自動進樣，並且經由高速的氮氣或是空氣吹送的輔助下，同時進行進樣和氣化游離，而後帶電離子進入質譜儀後進行分析。本篇作者利用 V-EASI 偵測到 peptide、myoglobin 和 cytochrome c 等生化大分子的多電荷分佈質譜圖，也進行了 Morita-Baylis-Hillman reaction (MBH reaction) 的線上偵測，由質譜圖所得到的動力學資訊去描繪出起始物、中間產物和產物間轉換的消長關係圖 (圖 2-13)。. 圖 2-12 文氏里音速噴灑游離法裝置圖 29. 圖 2-13 利用 V-EASI 裝置進行 MBH reaction 線上偵測的動力學曲線 29 19.

(31) 以質譜儀分析一些複雜的生化樣品時，適當的前處理是必要的，然而於質譜分析上，若是將樣品進行前處理的過程自動化還是有其困難處，於是 2014 年 Urban30 等人藉由 Venturi effect 來發展一個可將樣品進行萃取處理後即時分析的自動系統，並將此方法應用於偵測毫米尺寸的樣品上。擬建的平台上能夠萃取相對來說尺寸較小的樣品，並能夠同時偵測萃取後的分析物，於進樣質譜前，還能搭配螢光顯微鏡獲得額外資訊 (激發波長設於 320-380 以及 460-500 nm)，此串聯步驟花費時間小於十分鐘即可完成，也因此方法為自動系統，所以不太需要操作人員隨時待命，一旦樣品被放置於腔體上，操作人員只需於操作介面上按下按鈕即可，整體而言是一個操作簡單的裝置及方法，裝置如圖 2-14。以果蠅樣品 (因果蠅為廣泛被研究的真核生物且容易解剖)及綠茶茶葉做為模擬樣品以測試裝置的可行性，偵測果蠅樣品時發現於正電及負電模式下可以獲得約 70 個分析物訊號峰，而分析綠茶茶葉上則可獲得約 30 個分析物訊號峰。而以棉棒採集藥物粉末，並以此自動系統偵測後也得到質子化分析物及分析物帶鈉鹽之訊號。. 20.

(32) 圖 2-14 以 Venturi effect 串聯微萃取系統及螢光顯微鏡之系統裝置圖 30. 2014 年 Ouyang31 等人也利用文氏里音速噴灑游離質譜法 (V-EASI-MS) 進行即時分析自組裝之核鹼基，以 6-methyluracil (6MU)、 uracil (U) 以及 thymine (T) 三種核鹼基作為樣品進行偵測，於正電模式及負電模式資料下皆可記錄到基團中心為不同金屬離子之核鹼基團訊號，而與傳統電噴灑游離質譜法 (ESI-MS) 相比較，於同樣之實驗條件下，以 V-EASI-MS 能夠偵測到的基團訊號較多，這也證明此軟性游離法用於研究非共價相互作用之自組裝過程上是可行的。此外，也以注射針幫浦 (syringe pump) 額外添加鉀離子 (K+) 於系統內進行直接萃取樣品，並以 V-EASI-MS 即時觀測基團自組裝之形成過程。此游離法為一不需使用高電壓、熱能及輻射等外力的軟性游離法，適合用於觀測自組裝之過程上，並可即時獲得反應資訊，另外注射針幫浦也使於系統內直接萃取樣品變得更為便利。裝置示意圖如圖 2-15。 21.

(33) 圖 2-15 以 V-EASI-MS 即時觀測核鹼基自組裝過程之系統裝置圖 31. 2011 年 Chen32 設計出一個不需要外加電力或者是注射針幫浦，也不需要額外提供氣體的游離方式 (圖 2-16)，只需要在質譜儀入口端施加一個高電壓，就能使一錐形的毛細管作為進樣通道與噴灑氣化離子之出口，好讓樣品在大氣壓下形成氣體離子進而到質譜儀內作分析。此游離法稱為無接觸式大氣壓下游離法 (Contactless Atmospheric Pressure Ionization, contactless-API)，Chen 利用此游離法來偵測 bradykinin、cytochrome C 和 myoglobin、urine 等的生化大分子，在質譜圖上都可以看到這些目標物的特徵峰。而 2013 年 Chen33 等人也以此游離質譜法發展一自動化 C-API 進樣系統 (圖 2-17)，系統內包含了約一公分長的毛細管，以及可進行 X、 Y 軸移動之樣品載台，並以此裝置進行有機及生化分子的定量分析。而樣品噴灑則與質譜儀入口成直角並放置於質譜儀前方，如此一來，於施. 22.

(34) 加高電壓之質譜儀的入口附近可容易形成噴灑動作，並於質譜儀內被偵測到。作者也展示出此自動化 C-API 裝置可於 3.5 分鐘內分析 6 個樣品，此外，小於 1 nL 的樣品溶液也能以此裝置分析，顯示裝置所需的樣品體積為極少量，且所能偵測之最低極限可達到 attomole 等級，而作者也證明了 C-API 對於定量分析之可行性。. 圖 2-16 無接觸式大氣壓下游離法裝置示意圖 32. 23.

(35) 圖 2-17 自動化 C-API 進樣系統裝置示意圖 33. 2012 年 Chen34 又以 contactless-API 搭配氮氣球將 bradykinin 和 cytochrome c 生化大分子作了多電荷的偵測 (圖 2-18)以及 Zemplén reaction 的線上偵測，與上述的 contactless-API 游離方式一樣，都是由一個短長度的錐形毛細管當作是噴灑出口，讓液態溶液產生氣體離子。由質譜圖得知，隨著時間變化起始物的訊號會逐漸下降，中間產物的訊號則是先升後降，而產物的訊號隨著時間變化而逐漸升高 (圖 2-19)。. 圖 2-18 無接觸式大氣壓下游離法搭配氮氣球裝置示意圖 34 24.

(36) 圖 2-19 利用無接觸式大氣壓下游離法線上偵測 Zemplén reaction 的反應質譜圖 34. 一級胺和羰基化合物的反應會縮合成希夫鹼 (Schiff’s base)，而希夫鹼在醫藥、催化領域和分析化學上都扮演著重要的角色，基於上述原因， 2013 年 Lin35 等人利用 paper spray 搭配 ESI-MS 方式 (圖 2-20) 且使用正丁胺 (butylamine) 和苯甲醛 (benzaldehyde) 的縮合反應當作應用例子來監測希夫鹼的形成過程，而此反應持續偵測四十分鐘。反應零分鐘時，將 20 mM 正丁胺 20 μL 加到 1 mL 苯甲醛內，並且追蹤質子化正丁胺訊號 (m/z 74)、質子化產物訊號 (N-butylbenzylidenimine,m/z 162)，由於溶液從毛細管進樣口到出口需要一段傳輸時間，導致反應在二十分鐘時，質子化產物的訊號才趨於平穩。得到動力學資訊後，將產物與起. 25.

(37) 始物的比值對時間作圖，發現數據點會隨時間先上升，而後呈現平穩狀態 (圖 2-21)。. 圖 2-20 paper-base 電噴灑游離法裝置示意圖 35. 圖 2-21 正丁胺和苯甲醛反應後，產物與起始物的比值對時間作圖 35. 26.

(38) 雖然以質譜法進行線上反應偵測的研究已經有小有成果，但大部分相關的研究還是需要改變質譜儀的游離源端來使樣品藉由不同的方式氣化且游離，並進一步進入質譜分析器與偵測器來獲得分析物訊號，因此本實驗室開發一套自動進樣裝置，稱為文氏管電噴灑游離法. 36. (Venturi. Electrospray Ionization, VESI) ，在不需要改變游離源的條件下，使用市售質譜儀就能進行樣品的分析以及線上偵測，並且在不外加電力設備或是氣動裝置以及注射針幫浦的輔助下，此自動進樣裝置搭配操作人員的輔助，就能幫助質譜儀快速且大量的進行樣品的分析。本研究計畫將進一步利用文氏管電噴灑游離法進行反應的線上即時偵測(包含不可逆之有機反應與一可逆之氧化還原反應)，以及偵測一非反應系統之茶內物質釋放趨勢，與簡易偵測蔬果農藥的方法。. 2.3 合成苯並咪唑的化學反應苯並咪唑 (benzimidazole) 在藥物化學裡占有顯著的重要性，一些含有苯並咪唑的化合物也表現其生物活性可以對抗病毒，例如愛滋病毒、流感病毒等，另外在獸醫醫學領域裡，也有使用苯並咪唑的衍生物來當作驅蟲的藥劑的商業應用，而在人類醫學上則將苯並咪唑的衍生物用來治療潰瘍，或者是當作抗組織胺藥，功能為減輕身體對致敏原的過敏反應 37。而傳統合成苯並咪唑的方法通常牽涉到鄰苯二胺 (o-phenyldiamine, o-PD) 以及羧酸 (或是羧酸衍生物) 在脫水條件下的縮合反應。而 2006 年， Salehi38 等人利用了鄰苯二胺和醛類化合物，在不同的條件和矽硫酸. 27.

(39) 的酸性催化下進行合成苯並咪唑的反應 (圖 2-22) ，本反應會形成雙取代的產物 (編號 3，product 3) 以及單取代的產物 (編號 4，product 4) ，且本反應具有高度的選擇性。作者也利用鄰苯二胺及對 -氯苯甲醛 (p-chlorobenzaldehyde) 的化學反應來探討溶劑效應 (如甲醇、水等) 對於單取代和雙取代產物產率比值的影響，並且也改變了醛類化合物的取代基，進一步去探討不同取代基與鄰苯二胺反應後的單取代產物的產率。. 圖 2-22 在矽硫酸催化下，以鄰苯二胺與醛類化合物當作起始物合成苯並咪唑的反應式 38. 而 2010 年，Azarifar39 等人也利用鄰苯二胺和醛類化合物當作起始物來進行縮合反應，在以醋酸為溶劑與微波輻射的條件下合成了苯並咪唑，並且也進一步地推導可能發生的反應機制 (圖 2-23) ，在此篇文獻裡，作者推測了兩條反應路徑，路徑 A 會有兩次親核性攻擊，而後形成雙取代產物，路徑 B 則是會先形成含有兩個環的化合物，而後在有氧氣的條件下脫氫變成單取代產物。. 28.

(40) 圖 2-23 以鄰苯二胺與醛類化合物當作起始物合成苯並咪唑的反應路徑推測示意圖 39. 2007 年，Henan40 也利用 p-TsOH 當作催化劑來合成苯並咪唑 (圖 2-24)，並且在文獻中探討到 R group 的不同對於反應的影響。若使用具有芳香性的 R group 來進行反應時，則產率都有 70%以上，使用烯類化合物時產率還有 60%，但若是將 R group 換成直鏈碳的醛類化合物來進行此反應時，只有很微量的產率 (圖 2-25)。. 圖 2-24 在 p-TsOH 催化下，以鄰苯二胺與醛類化合物當作起始物合成苯並咪唑的反應式 40. 29.

(41) 圖 2-25 在 p-TsOH 催化下進行合成苯並咪唑的反應並探討改變其 R group 後對反應時間與產率的影響 40. 而本研究利用此反應 (鄰苯二胺和醛類化合物的化學反應) 來當作 VESI 自動進樣的應用模型，希望能利用此 VESI 自動進樣裝置來線上即時偵測此反應的化學變化，並進一步去驗證此反應的反應機構正確與否。起始物分別是鄰苯二胺以及苯甲醛 (Benzaldehyde, BA) ，在室溫環境且不加入任何酸性催化劑的條件下進行反應，反應的結果會生成單取代與雙取代的產物 (圖 2-26)。. 30.

(42) 圖 2-26 鄰苯二胺以及苯甲醛的反應式. 藉由本實驗室開發的 VESI 自動進樣裝置，並結合質譜儀能即時偵測的優點，使我們能在反應中即時地得知起始物和產物間的轉換關係，這對有機化學家在研究化學反應的機制上可以獲得更多資訊，早期觀測化學反應大部分是採用離線方式 (例如使用 NMR、UV)，通常只能得到反應終止結果，卻無法得知在反應過程中特定化合物生成及消失的變化，所以利用 VESI 自動進樣裝置搭配質譜儀進行線上即時偵測合成苯並咪唑類化合物的反應並探討其反應機制，並由動力學資料繪製出隨時間變化的動力學曲線圖。. 31.

(43) 2.4 茶葉化學綠茶是世界上最常被飲用的飲料之一，且因其含有抗氧化劑，對健康方面能提供許多優點，且於預防心血管疾病及癌症有良好的功效。於綠茶內主要的活性物質為多酚類化合物，比較特別的是兒茶素(通常也可稱為flavan-3-ols)，其含量約占茶葉重量的30%。於綠茶內含量較豐富的兒茶素物種包含了表兒茶素 (Epicatechin, EC) 、表沒食子兒茶素 (Epigallocatechin, EGC)、表兒茶素沒食子酸酯 (Epicatechin gallate, EGC) 及表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯 (Epigallocatechin gallate, EGCG) 等四種41。於2000年 Dalluge、Nelson 42及2013年 Zhou41等人所發表的 review 期刊中，統整了偵測茶內兒茶素之分析方法。對於兒茶素分離、鑑定及定量而言，液相層析及毛細管電泳是最常被提及的技巧，且液相層析常搭配 UV. 43,44,45. 偵測器來進行使用，而質譜儀、電化學方法46、螢光47,48. 及化學發光49,50的偵測器因有較好的靈敏度及選擇性，所以也被利用在其他的分析例子上。其他的分析技巧像是氣相層析、紙張層析、分光光度法、生化感測器以及核磁共振儀在此篇回顧文獻都被提及用於偵測兒茶素。而最早發表將液相層析儀結合質譜儀用於鑑定分離後的兒茶素在 1993年的時候51，文獻指出作者利用TSI-MS (Thermospray Ionization Mass Spectrometry) 方法將含有EC、EGC、ECG及EGCG之混合物進行分離，而後利用碰撞誘導解離法來鑑定分析物的斷片結構。也有利用毛細管液相層析儀結合電噴灑質譜儀 (Capillary LC-ESI-MS) 方法來分離並鑑定綠茶與人類血漿中之兒茶素，利用此方法也能在複雜基質下偵測到. 32.

(44) picomolar 等級之EGCG，而以質譜儀作為偵測器也能提供高靈敏度及選擇性，為實驗提供一個可信的結果。而 1998 年 Poon52 直接注射樣品溶液於質譜儀內作偵測。於負電模式下，觀察到兒茶素及其類化合物在圖譜上的表現，而進一步地利用串聯質譜儀進行結構確認。此篇研究證明天然植物萃取物之各種不同分析物在不經液相層析分離下，能夠以質譜儀直接偵測並分析。而文獻提及利用質譜儀進行沒食子酸 (Gallic acid)、兒茶素 (Catechin) 及奎寧酸 (Quinic acid) 標準品之偵測，由圖譜表現可發現去質子化沒食子酸、兒茶素及奎寧酸之訊號 (圖 2-27)，並偵測到兒茶素及奎寧酸之二聚體訊號。而偵測茶類樣品時，不僅偵測到沒食子酸、兒茶素及奎寧酸之訊號，也觀測到 EGC、ECG、EGCG 之訊號，作者將一些有興趣之訊號作 CID 法以判定其結構，並且整理出兒茶素及類似之多酚類化合物。. 33.

(45) 圖 2-27 於負電模式下，分析物之質譜圖表現: (A) gallic acid；(B) catechin；(C) quinic acid52. 2004 年 Crozier53 等人利用高效能液相層析儀 (High-performance Liquid Chromatography, HPLC) 結合質譜儀 (Mass Spectrometer, MS) 之方法快速地分析茶內超過三十種之酚類化合物。將綠茶及紅茶的溶液直接注射至 HPLC 逆相管柱 (reverse phase column) 中經過分離後，結合 DAD 偵測器與串聯質譜儀進行結構確認，使得鑑定與定量的可信度大幅 34.

(46) 提升。而茶內化合物包含了兒茶素，茶黃素，和各式各樣的沒食子酸酯衍生物，皆可藉由分析物在管柱內的滯留時間，吸收圖譜和質譜圖之斷片來加以鑑定。 2010年Marcus54等人以液相層析搭配粒子束並串聯電子游離法質譜儀 (Liqid Chromatography-Particle Beam/Electron Ionization Mass Spectrometry, LC-PB/EIMS) 發展一套定量綠茶內標準參考物質的分析方法。由實驗結果證明此 LC-PB/EIMS 能夠作為一分析方法用來鑑定綠茶之參考物，且由咖啡因及兒茶素的質譜圖及斷片圖證明此方法之可行性。實驗結果指出線性回歸曲線及最低偵測極限值 (LODs) 能達到nanogram 等級，其他的類兒茶素物種(gallocatechin and gallocatechin gallate)也經由層析圖之滯留時間和質譜圖來判定並確認。分析物的定量則利用標準添加法及內標準法來完成，比較兩種方法後發現，利用內標準法能得到較好的濃度值 (較高的回收率) 以及較能增強樣品間之變異性。而紅茶內包含了茶黃素及茶紅素兩種主要的色素，這些多酚類化合物與某些健康疾病息息相關，例如心臟疾病或是癌症等。茶紅素是紅茶內含量最豐富的色素，多年來在確認並鑑定茶紅素結構方面，都是一大挑戰，因此進行紅茶內多酚類化合物之研究是為了能解決茶紅素結構之困惑。在現今的研究內，藉由液相層析儀結合電噴灑游離質譜法發現紅茶萃取物內具有茶黃素之衍生物 (theaflavin trigallate 及 theaflavin tetragallate)，而這些化合物皆經由質譜儀作碰撞後確認其結構，並且對照標準品 ((−)-epigallocatechin-3-gallate、(−)-epicatechin-3-gallate 及 theaflavin-3,3′-digallate) 的碰撞質譜圖已進行比對 55。而 2012 年 Sang55. 35.

(47) 等人所發表的文獻是第一個確認紅茶內存在有茶黃素衍生物 (theaflavin trigallate 及 theaflavin tetragallate)之研究結果。一樣使用液相層析儀搭配電噴灑質譜儀 (EIS-MS) 來進行實驗，再經由層析圖之滯留時間和分析物斷片圖來判定並確認結構。 2013 年 Chang56 等人發展出一套簡單、快速、再現性良好的 SALDI-MS 方法，並利用二氧化鈦奈米粒子 (TiO2 NPs)及 captopril (CAP) 分別作為基質和內標物，進行茶氨酸及兒茶素之含量測定，且藉由分析台灣的四個區域之茶類樣品來正明此分析方法之可行性。每一個樣品都有其獨特的圖譜表現，由此可發現樣品來源、採收的季節都會影響分析物的含量，而阿里山及竹山生產的金萱茶樣品相較其他縣市含有較高的茶氨酸含量；台灣生產的烏龍茶樣品相較其他國家則含有較少的 ECG 和 EGCG 含量。初步的結果顯示出 SALDI-MS 方法能有效地鑑別茶類樣品。. 36.

(48) 2.5 藍瓶反應藍瓶反應 (blue bottle reaction) 是由 1963 年的 Campbell57 在其文獻中 (Kinetics-Early and Often) 所提及而大受歡迎，錐形瓶內為葡萄糖 (glucose)、氫氧化鈉 (sodium hydroxide) 及亞甲基藍 (methylene blue， MB) 混合後的水溶液，亞甲基藍為一染料，在氧化態下呈現藍色，而於環原態時則呈現透明無色，稱為無色亞甲基藍 (leucomethylene blue， LMB)，於此反應下，葡萄糖與氫氧化鈉反應形成 glucoside 作為還原劑之角色，而氧氣則是作為氧化劑，所以當搖晃瓶子時，空氣中的氧氣會溶進溶液中並且使亞甲基藍形成氧化狀態呈現藍色，而當靜置溶液後， glucoside 發揮其還原劑之功能，使亞甲基藍變為還原狀態而成無色，而此氧化還原之震盪變色反應可以反覆進行。此反應為學生上課之教材內容，在不告知錐形瓶的內容物為何下，讓學生觀察此反應之變色過程，並嘗試推測反應速率方程式以及反應機構。於此篇文獻中也提到反應速率方程式 (圖 2-28)，G 為葡萄糖、G-為 glucoside、OH-代表氫氧化鈉、 A 是氧氣、X 為亞甲基藍、B 為氧化態之亞甲基藍，由方程式可得知葡萄糖與氫氧化鈉反應以及亞甲基藍與氧氣反應都是一快速反應，而當氧化態之亞甲基藍與 glucoside 作用時則是較慢的反應，故當搖晃瓶子時可以於較短時間內觀測到溶液變為藍色，而靜置溶液須花較長時間才能觀測到由藍色變為無色的過程。1999 年 Cook58 等人也表示以此藍瓶反應作為動力學上課之教材，藉由觀測反應過程進一步地推導反應機構。. 37.

(49) 圖 2-28 藍瓶反應之速率方程式 57. 藍瓶反應內含物包括葡萄糖、亞甲基藍及氫氧化鈉三者混和之水溶液，於 1994 年時 Williams59 等人發表的文獻內提到，藍瓶反應除了以葡萄糖及亞甲基藍作為反應物外，還有其他物質可替換作為反應物，以亞甲基藍來說，其屬於 thiazine 結構之化合物 (圖 2-29)，屬於 thiazine 結構之其他染料理論上也會有相同效果 (如 Azure A 或是 Toluidine blue 等)，作者們發現這些結構類似的染料，於鹼性有氧之葡萄糖水溶液下會也與亞甲基藍有同樣表現。除了結構相似的染料可互相替換外，醣類反應物也不僅只有葡萄糖可用來進行實驗，其他例如 D-Galactose 或是 D-Fructose 等也可作為反應物，而醣內物質內又以 D-Ribose 進行實驗時有最快的反應速率，以 D-Mannose 作為反應物時則有最慢的反應速率。而 1997 年 Mosher60 等人也有利用不同的染料指示劑進行實驗，然而不同染料的氧化及還原狀態所呈現之顏色都不相同，所以進行震盪時產生的顏色變化也不同。. 38.

(50) 圖 2-29 thiazine 結構 59. 由於綠色化學的提倡，2003 年 Noble61 等人提出以傳統方式進行藍瓶反應實驗時的兩大問題，一為傳統上會使用氫氧化鈉或氫氧化鉀作為鹼性反應環境之來源，而此鹼有強烈腐蝕性疑慮，二則為傳統上皆使用大量反應物來進行反應，使得用量消耗大，而綠色化學強調使用更安全的溶劑和反應條件，以及防止過多廢液產生，於是作者們欲利用對環境影響較溫和且用量更少之反應物進行反應。實驗上依然使用亞甲基藍及氧氣作為染料及氧化劑，而還原劑的部分則是以維他命 C 替換，並以碳酸氫鈉調整 pH 值到 3，而亞甲基藍經由維他命 C 還原後會產生淡綠色色調。此溶液與氧氣反應後卻不易進行氧化反應，於是藉由添加銅做為催化劑，使 LMB 氧化為 MB，銅於還原反應下也有催化的效果，可以使用 CuSO4·5H2O 或是 CuCl2·2H2O 作為銅的來源。此篇文獻所提出的方法相對於傳統方法來說，於安全及用量使用上都有助益，雖然技巧上沒這麼完美，但以安全性來說是適合讓學生獨自動手操作的實驗。. 39.

(51) 第三章. 實驗方法. 3.1 藥品與儀器藥品名稱. 廠牌. 分子量. CAS Number. (g/mol) o-Phenylenediamine. Aldrich. 108.14. 95-54-5. Benzaldehyde. Riedel-de haën. 106.12. 100-52-7. Benzoic acid. Riedel-de haën. 122.12. 65-85-0. Acetic acid. J.T.Baker. 60.05. 64-19-7. Green tea. mall. -. -. Black tea. mall. -. -. D-Fructose. Riedel-de haën. 180.16. 57-48-7. Methylene-blue. TCI. 373.90. 7220-79-3. Thiophanate Methyl. 惠光公司. 342.39. 23564-05-8. Tebufenozide. 惠光公司. 352.47. 112410-23-8. Butachlor. 惠光公司. 311.85. 23184-66-9. Chlorpyrifos. 惠光公司. 350.59. 2921-88-2. 使用的溶劑有 HPLC 級甲醇 (購買於 J.T.Baker) ，氨水 (28.0%-30.0%，購買於 J.T.Baker) 以及去離子水。. 40.

(52) 質譜儀為 Micromass Q-TOF，使用的游離源為電噴灑游離，正、負電模式皆有操作。電噴灑游離裝置使用的霧化氣體 (Nebuliser Gas) 流速 20 liters/hour，而去溶劑氣體 (Desolvation Gas) 的流速為 300 liters/hour。分析時質譜儀的最佳參數為 Source Block Temp: 100℃、Desolvation Temp: 180℃、TOF: 7200 V、MCP: 2700 V、Capillary Voltage: 2600 V、Cone: 25 V、Collision Energy: 3 V、Gas Cell: 5 psi。離子碰撞誘導解離 (Collision Induced Dissociation，CID) 的碰撞氣體為氬氣 (Ar)。進樣方式以本實驗室開發的自動進樣裝置 (self-pumping pump) 或以注射針幫浦 (KD Scientific,KDS101) 直接注入進樣 (direct infusion) 兩種方式，直接注入的流速固定為 8.0 μL/min，而自動進樣系統的操作流速則約為 10.0-30.0 μL/min。樣品液的配置為秤取/吸取所需樣品的克數/體積，以 100% 甲醇 (或純水) 作為溶劑配製成 10-2 M 的貯存溶液 (stock solution)，並利用超音波震盪器 (Sonicator，Brandsonic 5510R-DTH) 將樣品液均勻混合。配製完成的樣品液放置於冰箱中保存，等待後續實驗使用。待進行質譜分析前，再吸取 10 μL 貯存溶液並加入 990 μL 甲醇 (或純水) 稀釋成約 10-4 M 溶液，進而進入質譜分析。. 3.2 自動進樣 (Self-pumping) 裝置實驗上使用到的裝置是本實驗室開發設計的自動進樣裝置 (self-pumping)，命名為文氏管電噴灑游離質譜法 (Venturi Electrospray Ionization Mass Spectrometry,VESI-MS)。藉由電噴灑游離源所使用的. 41.

(53) nebulizer gas 因高速流動在 ESI tip 的前端形成 Venturi effect 造成一壓力差來推動樣品液，使此裝置在不外加幫浦等設備，就能達到連續自動進樣的效果。單管進樣 VESI (sVESI) 自動進樣裝置的示意圖如圖 3-1，組裝時先將口徑為 130 μm 的 PEEK 毛細管裁切成約 10 公分長度，作為自動進樣裝置的連接管線，再將樣品瓶的瓶蓋打洞，方便讓 PEEK 毛細管穿入瓶蓋進入樣品瓶內，將 PEEK 毛細管的末端浸入溶液液面下，另一端以轉接頭連接到質譜儀的電噴灑游離源，而後自動進樣到質譜儀進行訊號偵測。此自動進樣裝置的樣品承載處所使用的容器可以為樣品瓶 (vial) 或者是微量離心管 (eppendorf) (圖 3-1) 。自動進樣搭配操作人員的輔助能幫助質譜儀快速且大量的進行樣品的偵測。. 圖 3-1 不同樣品承載容器的 sVESI 自動進樣裝置示意圖. 42.

(54) 質譜儀電噴灑游離端因 Venturi effect 造成一壓力差來推動樣品液，使 sVESI 裝置有自動進樣的效果。將 sVESI 裝置進一步作改良，以 T 型分流裝置呈現 (圖 3-2) 成為雙重進樣 (dual mode) 模式，稱之為雙重進樣文氏管電噴灑游離法 (Dual Inlet Venturi Electrospray Ionization, dVESI)。 dVESI 自動進樣裝置示意圖如圖 3-2，組裝時先將口徑為 130 μm 的 PEEK 毛細管裁切成約 6.5 公分長度，作為自動進樣裝置的連接管線，再將微量離心管的蓋子打洞，方便讓 PEEK 毛細管穿入蓋子進入微量離心管內，並利用 T 型連接頭串連兩個 sVESI 裝置，將 PEEK 毛細管的末端浸入溶液液面下，另一端以 T 型轉接頭連接到質譜儀的電噴灑游離源，而後自動進樣到質譜儀進行訊號偵測。. 圖 3-2 dVESI 自動進樣裝置示意圖. 43.

(55) 3.3 以 sVESI 進行線上即時偵測本研究將利用 sVESI 自動進樣裝置結合質譜儀進行線上偵測合成苯並咪唑類化合物反應的即時變化，並搭配已知的流速結果來獲得更精確的反應時間與偵測時間的延遲關係，以便了解反應進行的過程及其機制；也將利用此裝置偵測沖泡茶葉時茶內化學物質隨時間的變化關係，並改變茶類品種及反應水溫以探討不同反應條件對結果之影響；進一步地以 sVESI 裝置進行藍瓶反應的偵測，發揮此裝置線上即時偵測的特點，觀測到亞甲基藍於氧化、還原過程中從藍色變為無色的訊號變化；而最後也以單重進樣裝置進行常態偵測額外添加於水果表皮上的農藥，並比較真實樣品處理前後的圖譜變化，以及不同萃取溶劑對水果表皮的影響。. 3.3.1 苯並咪唑化合物之合成反應利用 sVESI 自動進樣裝置進行線上偵測有機反應時，因反應溶液在樣品瓶內需經過攪拌子 (stir bar) 均勻攪拌，故架設升降台與磁力攪拌器 (hot plate) 來使攪拌子產生作用 (圖 3-3)。進行反應前，將鄰苯二胺溶於甲醇配置成 10-4 M 鄰苯二胺甲醇溶液 (o-PD/MeOH(sol)) 備用。於樣品瓶內盛裝 15 mL 甲醇作為反應溶劑，反應一開始先以 sVESI 進樣甲醇，收集兩分鐘偵測訊號當作背景值 (blank) ，兩分鐘時藉由微量移液吸管 (micropipette) 將 o-PD/MeOH(sol) 1 mL 加到樣品瓶內，四分鐘時加入 Benzaldehyde (BA) 10 μL，進行線上偵測苯並咪唑類化合物的化學反應。. 44.

(56) 圖 3-3 以升降台與磁力攪拌器來協助 sVESI 裝置進行線上偵測反應. 3.3.2 不同條件下沖泡茶葉所釋放之化合物除了線上即時偵測有機反應的變化外，也將裝置應用於偵測短時間內變化的茶內物質釋放趨勢，利用升降台與磁力攪拌器來使攪拌子產生作用，以確保進樣溶液為均相狀態。進行反應前需備用好反應所需溶劑，反應溶劑則是利用去離子水加熱至 80oC (或 100oC) 後直接使用，反應容器為樣品瓶。首先利用 sVESI 進樣備好的反應溶劑，以確保進樣穩定，而後放入茶葉樣品後即可開始進行分析，偵測時間為一分鐘 (圖 3-4)。. 45.

(57) 圖 3-4 茶葉實驗之反應示意圖: (A) 進樣溶劑；(B) 放入茶葉樣品. 3.3.3 藍瓶反應藍瓶反應內之亞甲基藍經由氧化、還原過程會由藍色變為無色，實驗上也需以升降台及磁力攪拌器輔助實驗進行，加入攪拌子以確保進樣溶液為均相狀態。反應進行前先配置好 10-4 M 亞甲基藍水溶液，並秤取 0.0496 g / 0.1022 g 果糖溶於 5 mL 氨水配置成 0.055 M 及 0.11 M 之溶液備用。於反應初期先進樣 fructose/NH4OH(aq)一分鐘，確定溶液進樣穩定後再以微量移液吸管將 10-4 M 亞甲基藍溶液 1 mL 加入至樣品瓶中，以攪拌子使溶液混合均勻 30 秒後停止攪拌，開始偵測亞甲基藍由藍色變為無色的反應過程 (圖 3-5)。. 46.

(58) 圖 3-5 藍瓶反應實驗室意圖: (A) 進樣 blank；(B) 預備加入 MB；(C) 加入 MB；(D) 攪拌後靜置. 3.3.4 果皮表面附著農藥之偵測選用的模擬樣品為甲基多保淨 (Thiophanate Methyl, TM)、丁基拉草 (Butachlor, BC)，得芬諾 (Tebufenozide, TFN) 及陶斯松 (Chlorpyrifos, CPF) 等四種農藥，因其易溶於有機溶劑當中，故選用甲醇當作溶劑。偵測單一農藥時先取 10-4 M 甲基多保淨甲醇溶液 100 μL 滴在容器或真實樣品上備用，等待甲醇溶劑揮發。進行即時偵測前先以 sVESI 進樣甲醇，收集一分鐘偵測訊號當作背景值，一分鐘後將微量離心管置換成添加 (spike) 甲基多保淨後的容器或真實樣品，利用 10 μL 的萃取溶劑 (extraction solvent) 將分析物萃取出來，藉由 PEEK 毛細管吸取農藥萃取液，而後以質譜儀進行分析；偵測多種農藥之樣品液時也與上述的操作方法一致。. 47.

(59) 圖 3-6 以 sVESI 裝置即時偵測水果表皮農藥示意圖. 3.4 以 dVESI 進行線上即時偵測不同於 sVESI 裝置進行線上即時偵測反應需將樣品液置於同一個樣品承載容器內並觀察起始物與產物間的動力學變化，或是觀測反應隨時間的變化過程，利用 dVESI 自動進樣裝置時，樣品液只需個別放置於 T 型轉接頭的兩邊，待兩端 PEEK 毛細管吸取樣品液後，會在 T 型轉接頭的交會處混合，進入質譜儀作偵測分析。利用雙管進樣裝置不僅操作方便簡單、樣品使用量少，而且不同樣品間的切換時間短暫，可即時偵測反應於不同條件下之變化，於正、負電模式下，還能以雙管進樣裝置撘配醋酸水溶液及氨水水溶液使訊號有提升之效果，達到改質的目的。. 48.

(60) 3.4.1 快速反應之偵測於 dVESI 裝置兩邊之微量離心管內盛裝 1 mL 甲醇作為反應溶劑，反應一開始先以 dVESI 裝置進樣甲醇，並收集兩分鐘偵測訊號當作背景值，兩分鐘時快速地將左邊之微量離心管置換為盛裝 o-PD/MeOH(sol) 的微量離心管，確定樣品液穩定進樣後，四分鐘時再快速地將右邊的微量離心管置換為盛裝 BA/MeOH(sol) 的微量離心管，進行以雙管進樣線上即時偵測合成苯並咪唑類化合物的反應。. 3.4.2 調節茶湯中化合物之 ESI 效率欲利用雙管進樣方式於沖泡茶葉實驗上進行改質，以提升訊號強度。於 dVESI 裝置右端放置 0.1% 醋酸水溶液或是氨水水溶液，左端先以純水進樣，收集 45 秒偵測訊號作為背景值並確認進樣穩定後，放入茶葉樣品後即可鎖定特定分析物並觀察分析物訊號隨時間變化之趨勢 (圖 3-7)。. 圖 3-7 以 dVESI 裝置進行茶葉實驗之反應示意圖: (A) 進樣溶劑；(B) 放入茶葉樣品. 49.