針對 BMAA 及 DAB 之分析，目前學界通常採用以下三種方法進行處 理：(1)衍生處理：利用衍生劑(如 6-aminoquinolyl-N- hydroxysuccinimidyl-carbamate (AQC))將極性的 BMAA 轉化為非極性物質，並具有紫外光吸收 能力或螢光特性的物質，再利用HPLC 進行檢測(Kubo et al., 2008; Faassen et al., 2009)；(2)更換層析柱：利用極性層析柱進行分離(如 HILIC 層析柱)，
提高對各化合物的留置效果。(3)更換檢測器：利用質譜直接對其定性、定 量分析。由於文獻指出藍綠菌具有產生多種BMAA 異構物的能力(Jiang et al., 2012; Banack et al., 2012; Metcalf et al., 2012)，因此無論採用衍生法還是 直接檢測，使用HPLC/MS/MS 鑑別 BMAA 等異構物是十分必要的。本團 隊已成功建立 BMAA 分析方法，可不經衍生、直接以 LC/MS/MS 分析，
不僅檢量結果良好，已於多個水體測得測得BMAA。
3-3-2-1 樣品前處理
以超音波破碎機(Digital Sonifier，BRANSON 公司)破碎水體中藻顆粒 15 分鐘(Amplitude= 61%, Pulse on= 5.0 sec, Pulse off= 3.0 sec)，接著離心並 以0.45 μm 濾膜過濾藻液，並調整至 pH 為 3，即可進行固相萃取。
3-3-2-2 固相萃取步驟 (如圖 3-24 所示)
取10 mL 的甲醇、10 mL 的 2%甲酸活化 MCX 管柱；另取 10 mL 的甲
醇、10 mL 的 LC water 活化 HLB 管柱。活化後，將 HLB 及 MCX 管柱串 聯以通過樣品。
待樣品全數通過串聯管柱後，取 10 mL 的 2%甲酸以及 10 mL 的甲醇 清洗MCX 管柱。並以 7.5 mL 溶在甲醇的 5%氨水溶液進行脫附。
將脫附液以氮氣吹乾，再以0.5 mL 的 0.1%甲酸回溶。
最後，離心過濾後即可上機分析。
圖 3-24 樣品 BMAA 與 DAB 之固相萃取步驟
Agilent 公司所生產之 1260 Infinity Quaternary LC System，搭配串聯式質譜 儀為Thermo 公司生產之 TSQ Quantum Ultra，選用之層析管柱為 HILIC 管 柱(Shiseido 公司，Capcell Core PC , S 2.7um, 4.6mm X 150 mm I.D.)。本研 究所採用的高壓液相層析質譜儀，配合著兩個高壓微量移動相幫浦，而後 接著串聯式質譜儀；分析所用的溶劑移動相為 0.1%的甲酸水溶液與添加 0.1% 甲酸的乙晴(Acetonitrile)，分析管柱選用內徑 2.7 μm (Capcell Core PC, Shiseido, Japan)，選擇使用的偵檢器為 ESI (Electrospray)，監測模式為正電 荷(Positive)模式，分析模式為 SRM，流速為 0.25 mL/min，注入樣本體積為 20 μL，分析時間為 20 分鐘。
研究中以標準品配製100 μg/L 的 BMAA 及 DAB 進行定性分析，以得 知BMAA 與 DAB 在分析管柱中的停留時間，結果顯示 BMAA 及 DAB 的 出峰時間皆為10.53 分鐘，precursor ion m/z 為 119，而 product ions m/z 則 分別為 88 及 101。另配製 BMAA 與 DAB 於一系列之稀釋濃度進行分析，
配製濃度分別為2、5、10、100、250、500 μg/L，體積為 0.5 mL，而後以 LC/MS/MS 以上述所設定之 SRM 模式進行定量分析，並利用統計軟體進行 迴歸分析，所獲得之檢量線如圖 2-10，R2值皆為 0.999，顯示分析結果良 好
3-3-3
酵素連結免疫吸附分析方法(ELISA)本分析方法係參照環境保護署環境檢驗所公告之標準分析方法(NIEA E510.50B)，以分析水體中藻類毒素的濃度，本計畫採用商品化的盤式酵素 連結免疫吸附套組(ELISA kit，Abraxis，USA)，包括：微囊藻毒素Microcystins Kit (PN 520012)、柱孢藻毒素Cylindrospermopsin Kit (PN 522011)、蛤蚌毒 素毒素Saxitoxin Kit (PN 52255B)，配合酵素連結免疫吸附分析儀進行分析，
該分析方法已應用於移動式監測系統中。整體分析時間(包含樣品的前處理) 約1至3小時內，最多可同時檢測完成最大96個樣品。
圖 3-25 為微囊藻毒素之檢量線，依據標準操作步驟施作，檢量線上每 一濃度點為重複施作 3 次所得之平均值，並繪製標準差於各濃度點。該圖 顯示，各濃度點量測再現性佳，檢量線之 R2值為 0.98，最低偵測極限為 0.15 µg/L(廠商提供之資料)。圖 3-26 為柱孢藻毒素之檢量線，該圖顯示，各濃 度點量測再現性皆在可接受的誤差範圍內，且檢量線之 R2值為 1，最低偵 測極限為 0.05 µg/L(廠商提供之資料)。圖 3-27 為蛤蚌毒素(Saxitoxin)之檢 量線，各濃度點皆在可接受的誤差範圍內，檢量線之 R2值為 0.99，最低偵
3-3-3-1 實驗設備、試藥與試劑 (1) 過濾設備：飛碟式濾膜。
(2) 震盪器。
(3) 酵素連結免疫分析儀：Multiskan FC，Thermo Scientific 公司，芬蘭。
3-3-3-2 分析步驟
3-3-4
藻類臭味物質分析臭味物質的分析為依照環境保護署環境檢驗所公告之標準分析方法 (NIEA W537.51B)，以固相微萃取法(Solid Phase Micro-Extraction，SPME)將 水 樣 中 臭 味 物 質 吸 附 於 吸 附 纖 維 上 ， 再 搭 配 氣 相 層 析 質 譜 儀 (gas chromatograph/mass spectrometry detector ， GC/MSD) (6890/5973, Agilent, USA)，將吸附完畢之吸附針注入 GC/MSD 進行定性及定量分析，主要分析 之臭味物質包含 Geosmin、2-MIB 及 β-Cyclcitral。詳細方法參考 Lin et al.
(2003)。
3-3-5
藻類鏡檢技術為與分子生物技術互相印證，本計畫水庫樣品的藻類鏡檢分析部分，
將以傳統分析技術的顯微鏡鏡檢法進行藻類的鑑種與計數的工作。目前台 灣水體中主要之產毒藻種多屬於藍綠細菌門，較常見為微囊藻(Microcystis spp.)、柱孢藻(Cylindrospermopsis spp.)及魚腥藻(Anabaena spp.)等，藻類鑑 種需由資深或透過長期訓練之人員進行目視判定，而藻體計數定量方式則 参考自 Standard Method 10200F 標準方法，該方法係用以檢驗湖河池泊水
(2) 蓋玻片 (cover glass, 24 mm × 60mm)。
(3) 顯微鏡：型號BX51，OLYMPUS公司。
(4) 冰醋酸(Acetic acid)：GR級，MERCK公司。
(5) 碘(Iodine)：GR級，MERCK公司。
3-3-5-2 計數步驟
(2) 將樣品注滿計數盤，避免氣泡於chamber的角落形成。
(3) 靜置30分鐘使樣品沉澱。
3-3-5-3 計數方法
將細胞計數盤置於顯微鏡下，放大倍數調轉至400倍，並隨機選取N行，
計數視野下出現之藻類總數。藻類之鑑定則對照圖鑑而加以判定。
3-3-5-4 結果分析
根據計數所得之數目，以下列公式求得樣品中藻類的濃度：
其中，C = 計數之藻類總數，cells L = 細胞計數盤中每一行之格數 N = 計數的行數
3-3-6
現地螢光水質分析儀本計畫使用現地多參數水質監測系統(Model 6600V2，YSI，USA)，進 行水庫水質之監測。該水質分析儀主要利用多重電極與光學原理，針對多 項水質物理參數進行同時量測，並可即時回傳與收集相關數據資料，除傳 統水質項目外，並可以分析葉綠素a及藻藍素，可與本計畫藍綠細菌濃度互 相印證。由於該設備對於葉綠素a及藻藍素之監測，係使用光學方法，因此 受到水體中葉綠素、濁度、藻種類、藻團粒大小、藻生長期均會影響其測試 準確度。Chang et al. (2012)研究證明，該技術經過適度現場參數校正後，可 以克服葉綠素、濁度、藻團粒等之影響，在水庫現場快速提供準確之藍綠 菌濃度。
除藻類相關參數外，本計畫量測的項目尚包括：溶氧百分比(DO%)、溶 氧值(DO mg/L)、電導度(Conductivity)、比電導度(Specific Conductance)、溫 度(Temperature)、鹽度(Salinity)、總溶解固體(Total Dissolved Solids)、電阻 值(Resistivity)、酸鹼值(pH)、水中深度(Depth)、水位(Vented Level)、流量 (Flow)、濁度(Turbidity)、葉綠素 a(Chlorophyll-a)等 14 種參數，部份樣品亦
3-3-7
分子生物方法與其他方法間之相關性本研究團隊歷年以分子生物 qPCR 方法為基礎所得知分析結果，與化 學分析(如 GCMS)、ELISA 方法、及顯微鏡計數相比較，具有良好之關聯 性，可以做為推估藻數、及相關代謝物之參考。圖 3-28 為 qPCR 法與顯微 鏡計數之比較(Chiu et al., 2017)、圖 3-29 為 qPCR 法與 GC/MS 法比較(Chiu et al., 2016)、圖 3-30 為 qPCR 法與 ELISA 法之比較(Chiu et al., 2017)，均 顯示具有良好之關聯性。顯示 qPCR 定量系統可作為傳統分析法的替代技 術，藉由 qPCR 定量系統的快速監測，搭配基因與有害藻類數目及其代謝 物濃度的相關性以及 95%的預測區間，並可即時地判斷水體中有害藻類數 目及其代謝物濃度的範圍，提供水庫管理單位作為水源管理的重要依據。
舉例來說，當進行環境檢測時，樣品以分子生物技術於 3 小時內檢測到 104 cell/mL 的總微囊藻細胞數時，可在樣品送回實驗室做進一步分析之前，將 此數據代回圖 3-28(a)中，便可立即了解水體中微囊藻細胞數約落在 534
cells/mL 至 95,374 cells/mL 之間。同樣的概念亦適用於臭味物質(圖 3-29) 及藻類毒素(圖 3-30)的推估。
由於圖 3-28、圖 3-29 以及圖 3-30 為綜合 2013 年至 2016 年來台灣 29 座主要水庫的數據，然而 29 座水庫的特性不同，因此其 95%預測區間範圍 較大，若未來能針對單一水庫進行長期數據的收集，便能縮小 95%預測區 間的範圍。
圖 3-28 qPCR 法與顯微鏡計數結果之相關性
Pearson Correlation = 0.860 (p < 0.01, 2-tailed).
Cell abundance of Microcystis, cells mL-1 , log (y+1)
Cell equivalents of 16S rRNA gene, cell equivalents mL-1, log (x+1)
(a)
Pearson Correlation = 0.812 (p < 0.01, 2-tailed).
(b)
Cell equivalents of rpoC1 gene, cell equivalents mL-1, log (x+1) Cell abundance of Cylindro., cells mL-1 , log (y+1)
0
Total 2-MIB concentration, ng L-1 , log (y+1)
Copy number, copies mL-1, log (x+1)
(a)
Pearson Correlation = 0.688 (p < 0.01, 2-tailed).
-0.5
Cell-bound 2-MIB concentration, ng L-1 , log (y+1)
Copy number, copies mL-1, log (x+1)
(b)
Pearson Correlation = 0.692 (p < 0.01, 2-tailed).
1