第四章 結果
3.2 Caspase 3 活性
細胞凋亡訊息傳遞由一連串蛋白酶及核苷酸酶等的活化構成，當 Fas 受器活化 後，最先活化的是caspase 8，接著粒線體膜電位能會改變、cytochrome c 釋出，
接著caspase 9 會活化並導致 caspase 3 活化，然後 caspase 3 的活化會活化下游酵
素並導致DNA 斷裂、細胞膜內脂質翻轉等現象，最後導致細胞皺縮、細胞死亡。
因此觀察細胞凋亡各種現象必須在不同時間點，而由HepG2-2 及 HepG2-2-NS4B 接受anti-Fas 抗體刺激並觀察 caspase 3 活化情形發現，caspase 3 活化約在 anti-Fas 抗體抗體刺激後6-9 小時最明顯(圖五)，故最後選擇在 anti-Fas 抗體(CH11)刺激 8
小時後觀察細胞內caspase 3 活化之情形。
在此觀察培養於doxycycline 誘導 24 小時之 conditioned medium 中的細胞，
其在接受anti-Fas 抗體刺激 8 小時後，細胞內 caspase 3 活性有無改變。結果顯示，
在anti-Fas 抗體刺激 8 小時後，無論是 HepG2-2 或 HepG2-2-NS4B、有無 doxycycline 誘 導 或 anti-Fas 抗 體 刺 激 ， 其 細 胞 活 性 並 無 明 顯 差 異 。 取 等 量 細 胞 經 由 Caspase-Glo® 3/7 Assay 監測細胞中 caspase 3 活性發現，在未受任何刺激時，穩定 細胞株HepG2-2-NS4B 及母細胞株 HepG2-2 之間的 caspase 3 活性並無明顯差異；
而當以 doxycycline 誘導時亦不會使細胞各自間 caspase 3 活性出現差異。當以 anti-Fas 抗體刺激 8 小時後，無論有沒有受 doxycycline 誘導，HepG2-2 的 caspase 3 活性皆約上升到原本的 13 倍以上，而 HepG2-2 -NS4B 的 caspase 3 活性則皆只 上升到原本的5 倍左右(圖六)；因此在 anti-Fas 抗體刺激時，相較於未受 doxycycline 誘導的細胞，HepG2-2-NS4B 並不會因為表現較多的 NS4B 而讓其 caspase 3 活化 程度下降，但是HepG2-2-NS4B 相較於 HepG2-2 卻明顯抑制 caspase 3 的活化。
四、NS4B 蛋白質對 Fas 異構物表現的影響
因為 NS4B 蛋白質可能藉由抑制 FASTK 之表現來調控 Fas 基因之 alternative splicing，並促使細胞產生具有抗 FasL-ligation-induced 細胞凋亡功能之 soluble Fas (sFas)，因此接下來試圖觀察在 doxycycline 誘導下，culture supernatant 中 sFas 是 否會增加，以及sFas 和 mFas 的表現量比例是否會改變。
種等細胞數之 HepG2-2 及 HepG2-2-NS4B，經過 doxycycline 誘導 24 小時，分 別收取細胞全蛋白質(lysate) 及 supernatant，然後以 Quantikine® Human sFas Immunoassay 分析細胞之 lysate 及 supernatant 中含有多少的 Fas 受器。結果顯示，
doxycycline 誘導並不會對 HepG2-2 或 HepG2-2-NS4B 各自細胞中的 Fas 受器總量 及釋放至細胞外的sFas 受器總量造成影響；然而 HepG2-2 之 sFas 量約佔細胞 Fas 受 器總量 10%，而 HepG2-2-NS4B 之 sFas 量約佔其細胞 Fas 受器總量 14%，暗示
HepG2-2-NS4B 傾向於表現 sFas 並釋出至細胞外。另外，以 106細胞數培養在12 well culture plate 中的 HepG2-2-NS4B 細胞中 Fas 受器總量(2752 pg)約為 HepG2-2 的量 (1496 pg)的 1.8 倍，而 HepG2-2-NS4B 釋出至細胞外的 sFas 受器總量(382 pg)約為 HepG2-2 的量(150 pg)的 2.5 倍(圖七)。
上述的差異並非導源於種細胞時細胞數的差異而造成Fas 受器總量的差異，因
為當收取全細胞蛋白質檢視其濃度時，發現經 doxycycline 誘導的 HepG2-2-NS4B 細胞全蛋白質總重(770 μg)為 HepG2-2(582 μg)的 1.3 倍，此增加幅度並不足以解釋 HepG2-2-NS4B 的 sFas 的量為 HepG2-2 的量的 2.5 倍，因此雖然以 doxycycline 誘 導NS4B 表現並無法造成更多 sFas 的釋出，但 HepG2-2-NS4B 之 sFas 的量的確較 其母細胞株HepG2-2 高。
討論
一、穩定細胞株表現 NS4B 之情形
在建立穩定細胞株的過程中，只得到一個能抵抗 hygromycin B 篩選的 clone，
將此clone 命名為 HepG2-2-NS4B；由西方墨點實驗檢視 HepG2-2-NS4B 表現 NS4B 蛋白質的情形可發現，即使在沒有 doxycycline 誘導時，HepG2-2-NS4B 仍會表現 微量NS4B 蛋白質，而此微量之 NS4B 蛋白質由本實驗之部分細胞生理實驗結果看 來，其對細胞是有影響的。不過當有doxycycline 誘導時，穩定細胞株中 NS4B 蛋 白質的表現量遠多於無doxycycline 誘導時的表現量。
先前 Lundin 等人以轉染方式在肝癌細胞株 Hep3B 中過量表現 C 端融合螢光蛋 白(EGFP)的 NS4B 蛋白質時，觀察到 NS4B 蛋白質分佈在細胞之內質網上(76)；而 Hugle 等人以骨癌細胞株 U-2 OS 建立可藉 tetracycline 的存在來抑制 NS4B 蛋白質 表現之穩定細胞株(tet-off system)，並利用 IFA 去檢視，同樣可發現 NS4B 蛋白質 位於內質網之上(75)。本研究以轉染方式將 pcDNA-NS4B-V5HisTopo 質體送進 293 細胞表現NS4B 蛋白質時，由免疫螢光法 IFA (Immuno-Fluorescent Assay)亦可觀察 到相似的NS4B 蛋白質之細胞內分佈特徵如 cytoplasmic foci 及 reticular ER pattern (data not shown)。在建立穩定細胞株 HepG2-2-NS4B 後，嘗試以 IFA 去觀察 NS4B 蛋白質在 HepG2-2-NS4B 內表現分佈之情形及真正能受 doxycycline 誘導表現 NS4B 蛋白質之細胞族群的分佈狀況，並以西方墨點法確認 NS4B 蛋白質表現量(圖 一,and data not shown)；結果顯示，在 doxycycline 誘導 24 小時後以西方墨點實驗 可觀察到穩定細胞株NS4B 蛋白質的表現遠多於未經 doxycycline 誘導之細胞的表 現，但在以IFA 觀察時卻無法得到足以區分兩者差異之螢光訊號。在此，NS4B 蛋 白質的確有表現，但在細胞內卻無法以 IFA 偵測到，其可能原因之一為 NS4B 蛋 白質在內質網上的構造遮蔽住其C 端的 V5-tag。
NS4B 蛋白質在轉譯的同時會嵌入內質網，而負責切割病毒多蛋白質前驅物
的NS3-4A 蛋白質位於細胞質，因此理論上剛切割完之 NS4B 蛋白質其 N 端及 C 端皆位於細胞質端；而 NS4B 蛋白質由 261 個胺基酸構成，經由疏水性圖譜及實 驗指出其具有四個穿膜區域，而N 端約有 95 個胺基酸在細胞質、C 端約有 70 個 胺基酸在細胞質(77)，因此 N 端可能在蛋白質折疊後遮蔽到 C 端之 V5-tag；此外 NS4B 蛋白質亦可能經由聚合作用而使其 C 端之 V5-tag 被包埋而無法被 anti-V5 抗 體偵測到(80)。穩定細胞株之 NS4B 基因來自於 pcDNA-NS4B-V5HisTopo，兩者所 轉譯出之 NS4B 蛋白質之胺基酸序列應該完全一樣；雖然 IFA 無法偵測到穩定細 胞株表現之NS4B 蛋白質，但能偵測到轉染進 293 細胞的 pcDNA-NS4B-V5HisTopo 所轉譯出之NS4B 蛋白質，在此亦提出可能解釋。
真核細胞內蛋白質的合成、折疊主要在內質網中發生，因為細胞chaperon 等 相關幫助蛋白質正確折疊之細胞因子數量有限，所以當大量表現蛋白質時，細胞 即可能無足夠之細胞因子幫忙而無法確保新合成蛋白質的正確折疊；因此當以轉 染方式將 pcDNA-NS4B-V5HisTopo 質體送進 293 細胞使其過量表現 NS4B 蛋白 質，NS4B 蛋白質可能因過度表現而無法正確折疊，使得細胞中 V5-tag 外露並可 經由anti-V5 抗體偵測，甚至 His-tag 也可能造成折疊上的些微差異而使結構不同。
若此構造差異確實存在，則折疊不同之 NS4B 蛋白質可能對細胞有不同的生理影
響；而同樣是表現 NS4B 蛋白質，因其表現量多寡不同，所觀察到之對細胞生理
的影響即可能亦不相同。
二、NS4B 蛋白質對於 FASTK 及細胞的可能影響
經由即時定量聚合酵素鏈鎖反應可發現，穩定細胞株 HepG2-2-NS4B 經 doxycyxline 誘導 24 小時表現 NS4B 蛋白質後，其細胞中 FASTK mRNA 表現量有 被抑制的情形，呼應先前本實驗室以轉染方式促使293 及 Huh7 表現 NS4B 蛋白質 所觀察到之抑制現象(74)。
NS4B 為一嵌在內質網之疏水性蛋白質，不會進到細胞核內調控 FASTK 基因
之轉錄，因此推測NS4B 是透過其它細胞轉錄因子抑制 FASTK 基因轉錄、直接或 間接促進FASTK mRNA 降解等方式使其 mRNA 量下降。在本研究中亦嘗試以西 方墨點法去觀察FASTK 蛋白質層次是否會因 NS4B 蛋白質的存在而有任何改變，
但因FASTK 為一 kinase，其在肝細胞中的蛋白質量可能不高，復以初級抗體效果 不佳，因此無法由西方墨點法確認NS4B 蛋白質對 FASTK 蛋白質表現有無影響。
三、NS4B 蛋白質對細胞生理之影響
2007 年，Izquierdo 等人發現 FASTK 能和 TIA-1/TIAR 協同作用並促使 Fas 基 因之exon 6 在 alternative splicing 過程保留、產生含 transmembrane domain 之 Fas mRNA，而當以 RNAi 將 FASTK knockdown 後，細胞會轉而略過 exon 6 並製造 sFas mRNA(66)；而 Simarro 等人更進一步指出 FASTK 會進到細胞核內並且調控 fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)基因之 alternative splicing(68)，因而在此 視FASTK 為一選擇性剪接調節因子，能調節細胞產生不同之 Fas 異構物並調控 Fas 訊息傳遞過程。
因為 Fas/FasL 訊息傳遞在肝細胞凋亡過程扮演重要角色，因此 HCV 可能影響 Fas 基因表現量或影響其 alternative splicing 使產生不同功能之異構物，並藉此來干 擾受HCV 感染之肝細胞的細胞凋亡過程，使更利於 HCV 複製感染並造成慢性感 染；先前研究指出HCV 慢性感染及 HCV 陽性之肝病變患者之血清經常可偵測到 較高濃度之sFas 受器(62, 98-101)，並有研究指出其細胞內含 exon 6 之 Fas mRNA 較高(56)、細胞表面亦會有較多之 mFas 受器(102)；而除了肝細胞外，活化時的免 疫細胞如peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)中亦可發現 HCV 的複製(12)，
而此兩種細胞皆會表現mFas 及 sFas(54, 57)，所以血清中增加的 sFas 可能來自於 受HCV 感染之肝細胞或 PBMCs。
Krams 等人指出，人類肝臟細胞及肝癌細胞株 HepG2 能夠經由調控 Fas 基 因的alternative splicing 來產生 sFas 並釋放至培養基，將此培養基當作 conditioned
medium 培養 Jurkat cells，發現能抑制 anti-Fas 抗體所引起之細胞凋亡(57)；因此在 發現NS4B 蛋白質會抑制 HepG2-2-NS4B 中 FASTK mRNA 表現量後，本研究便進 一步探討此 FASTK 抑制現象是否間接促使 HepG2-2-NS4B 傾向於轉錄 sFas mRNA、轉譯 sFas 並釋放到細胞外，保護細胞抵抗 anti-Fas 抗體引起之細胞凋亡。
在細胞活性實驗中，HepG2-2-NS4B 受 doxycycline 誘導 24 小時後再以 anti-Fas 抗體刺激，其細胞活性約為未受doxycycline 誘導之 HepG2-2-NS4B 的細胞活性的 1.7 倍，因此 NS4B 蛋白質的確能使 HepG2-2-NS4B 抵抗 anti-Fas 抗體刺激所引起 之細胞凋亡。
雖然NS4B 蛋白質能抑制細胞凋亡，但當進一步檢視 HepG2-2-NS4B 中 caspase 3 活化情形卻發現，NS4B 蛋白質的存在與否、或者說 NS4B 蛋白質的多寡(因為 HepG2-2-NS4B 在未受 doxycycline 誘導時仍會表現微量 NS4B 蛋白質)並不會造成 caspase 3 活化情形上的任何差異；然而比較 HepG2-2 及 HepG2-2-NS4B 可發現，
在anti-Fas 抗體刺激下，HepG2-2-NS4B 的 caspase 3 活性只有 HepG2-2 的 41%。
因為HepG2-2-NS4B 在不受誘導時也會表現微量 NS4B 蛋白質，也許此微量 NS4B 蛋白質即足以抑制caspase 3 活化至最大程度，當 NS4B 蛋白質表現量更多時，也 無法更加抑制caspase 3 活性；若是如此，則 NS4B 應該不是直接和 caspase 3 結合 干擾其活化，而應是直接或間接促使caspase 3 降解、透過其它細胞因子抑制 caspase 3 活化，如此才能解釋沒看到 NS4B 蛋白質量的多寡對 caspase 3 活化的影響。
最 後 本 研 究 利 用 ELISA 方 法 檢 視 HepG2-2-NS4B 及 HepG2-2 在 接 受 doxycycline 誘導後，其 conditioned medium 中 sFas 的量是否有增減；結果發現，
最 後 本 研 究 利 用 ELISA 方 法 檢 視 HepG2-2-NS4B 及 HepG2-2 在 接 受 doxycycline 誘導後，其 conditioned medium 中 sFas 的量是否有增減；結果發現，