HepG2-2-NS4B 細胞株

源於 HepG2-2；將 pHyg-TRE-NS4B-V5 質體以 Lipofetamine 2000 轉染至 HepG2-2 中，然後將轉染細胞持續做繼代培養，並以 100、200、400 μg/ml hygromycin B 篩選細胞，約二個月後得到一抗 hygromycin B 200 μg/ml 之細胞株；在加入

1　μg/ml doxycycline 刺激細胞二十四小時後，收取細胞內容物，經由西方墨點並 以mouse anti-V5 抗體偵測確認 NS4B-V5 的表現。

細胞培養時以含 8% tetracycline-free 胎牛血清(Tet System approved FBS )、1%

penicillin-streptomycin、 200 μg/ml G418、100 μg/ml hygromycin B 之 DMEM，在 5% CO2、37 ^oC 下進行繼代培養。

九、DNA 轉染

以 6 公分培養皿為例，將細胞種於 6 公分培養皿中，待隔夜細胞滿度達到一 定滿度(HepG2-2, 40~60%; 293, 60~80%) 時，先將 4 μg 質體和 10 μl lipofectamine 2000 分別與適量 OPTI-MEM (~200 μl) 混合，於室溫下靜置 5 分鐘，接著將兩者 混合，於室溫下靜置20 分鐘，然後將此混合的轉染液加入已經以 PBS 清洗過並加 入約2.4 ml OPTI-MEM 的細胞培養皿中，接著放回細胞培養箱中(37 ^oC，5% CO2)。

經過4-6 小時，將混有轉染液之 OPTI-MEM 換成一般細胞培養液繼續培養 24~48 hr，收取細胞進行分析。

1X Phosphate Buffered Saline (PBS)

137 mM NaCl , 2.7 mM KCl , 4.3 mM Na2HPO4 , 1.47 mM KH2PO4, adjust to a final pH of 7.4

十、細胞全蛋白質之收取

吸除培養液，以TrypLE 處理 1 min 30 sec (HepG2-2)、3 min (HepG2-2-NS4B)，

然 後 直 接 加 入 培 養 液 、 連 同 Trypsin 將 細 胞 沖 離 培 養 皿 底 部 並 吸 至 1.5 ml eppendorff；接著以 3000 rpm 離心 3min，吸掉上清液，並加入 1 ml PBS，經 vortex 將cell pellet 弄散，然後再以 3000 rpm 離心 3min，吸除上清夜。加入 30 ~ 80 μl 的 RIPA lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl pH8.0, 1 % DCA, 1 % NP-40, 0.1%

SDS)並藉 pippetment 進行 homogenization，然後以 6 w 的功率進行超音波震盪，再 以14000 rpm、4^oC 離心 10 min，收集上清液即為細胞的全蛋白質，儲存於-20℃。

十一、蛋白質定量

採用 Bio-Rad protein assay kit；利用已知濃度的 BSA 溶液(0 μg/ml~16 μg/ml) 對於波長595 nm 的吸光值所做出標準曲線，再由未知蛋白質濃度之樣本對於波長 595 nm 的吸光值經標準曲線反推回去樣本之蛋白質濃度；若樣本之吸光值超過 16 μg/ml BSA 溶液之吸光值，則將樣本行稀釋後再重新定量。

十二、正十二烷硫酸鈉-聚丙醯胺板膠電泳

先用 70%酒精將玻璃及白板擦拭乾淨，組合成直立膠板裝置後，配製 separating gel solution 注入膠槽後，在上層補水將膠面壓平；等膠凝固後倒掉上層的水，確 定膠面乾燥後，配置stacking gel，膠槽插入齒梳狀模板並將 stacking gel solution 注入其餘空隙，待膠凝之後即完成SDS-PAGE 製備。

跑膠前先將 SDS-PAGE 置入電泳槽內，倒入適量一倍 running buffer，拔出齒 梳狀模板。蛋白質樣品先與protein dye 混合，放入 100^oC 加熱板加熱 5 分鐘，冷 卻離心後即可注入齒槽中。先以80 V 電壓進行 stacking 約半小時，等樣品到達 separating gel 之膠面後，將電壓調到 120 V，直到作為指標的 bromophenol blue 跑 至膠底即完成。

Separating gel solution

12~15% polyacrylamide [acrylamide:bisacrylamide=29:1]、0.375 M Tris-HCl (pH 8.8)、0.1 % SDS、0.1% ammonium persulfate (AP)、0.05 % TEMED

Stacking gel solution

4.125 % polyacrylamide [acrylamide:bisacrylamide=29:1]、0.125 M Tris-HCl (pH6.8)、0.1 % SDS、0.1% ammonium persulfate (AP)、0.05 % TEMED 1X Running buffer

0.1% SDS、0.2 M Glycine、25 mM Tris-HCl (pH 8.4)

十三、西方墨點法

先將 Immobilon transfer membrane P 浸在 95 %乙醇約 10 分鐘然後移至 transfer buffer，接著將電泳完成後的 SDS-PAGE 移至轉漬系統中。在轉漬槽中倒入適量 transfer buffer，在 4 ^oC 下以 250 mA 電流將膠上的蛋白質轉印到 membrane 上，約 三個小時後取出membrane，將 membrane 浸入 blocking buffer、室溫下反應 1 小時，

接著倒掉blocking buffer，加入初級抗體，在 4^oC 隔夜反應。反應完成後，以 washing buffer 清洗三次(5、10、15 分鐘)，加入二級抗體在室溫下反應 1 小時，再以 washing buffer 清洗三次(5、10、15 分鐘)，接著以二次水潤洗 membrane，並將水倒乾。最 後加入ECL 試劑並使其充分覆蓋 membrane，然後以 X-ray film 壓片顯影。

Transfer buffer

25 mM Tris-HCl 、192 mM Glycine、20 % Methanol Blocking buffer

5 % (w/v) Skim milk、0.1 % (v/v) Tween-20 in PBS Washing buffer

0.5 % (v/v) Tween-20 in PBS

十四、萃取 RNA

先以 PBS 將細胞沖離培養皿底部並移到 eppendorf tube，以 3000 rpm 離心 3 分鐘，吸去上清液，再加PBS 以振盪方式使細胞懸浮，然後再以 3000 rpm 離心 3 分鐘，吸去上清夜；接著加入1 ml TRIzol，並以微量吸管將細胞均質化，以 12000 xg、4 ^oC 離心 10 分鐘，取上清液至新的 eppendorf tube，室溫下靜置反應 5 分鐘，

此時可後續萃取步驟或將其儲存於-80 ^oC。靜置 5 分鐘後，加入 200 μl choloroform，

上下翻轉eppendorf tube 約十次，室溫下靜置 2 分鐘，再以 12000 xg、4 ^oC 離心 15 分鐘，取上層透明無色之澄清液至新的eppendorf tube，然後加入 isopropanol 500

μl，上下翻轉 eppendorf tube 約十次，室溫靜置 10 分鐘，然後以 12000 xg、4 ^oC 離 心十分鐘，去除上清液。接著加入1 ml 75 % 酒精並上下翻轉 eppendorf tube，然 後以7500 xg、4 ^oC 離心 5 分鐘，去除上清液並待管壁殘留液體蒸發。接著加入 20~50 ml 之 ddH2O 並且 65 ^oC 水浴十分鐘，然後以 OD260、OD280求得其RNA 濃度，調 整濃度到2 μg/μl，取 1 μl跑1 % agarose gel 以確定各樣本稀釋後濃度是否一致、

RNA 的品質如何。

十五、反轉錄-聚合酵素鏈反應

取 2.5 μl 之 total RNA ( 2 μg/μl)加入 0.4 μl 之 RQ-1 DNase (Promega)及 0.45 μl 10x buffer、1.15 μl ddH2O，37^oC 反應 30 分鐘，然後加 0.5 μl stop solution 於 65 ^oC 反應10 分鐘。接著取 2.5 μl aliqout 進行接下來的反應。

取 2.5 μl aliquot 加 0.25 μl 的 24 μM OligodT 及 ddH2O 0.45 μl，於 65 ^oC 反應10 分鐘，然後放在冰上 1 分鐘，接著再加入 0.25 μl 的 10 mM dNTP、

0.2 μl 的 RNasin、0.1 μl 的 AMV RT、1 μl 的 5x buffer、0.25 μl 的 ddH2O，

於42 ^oC 反應 30 分鐘，即完成反轉錄反應。

十六、即時定量聚合酵素鏈鎖反應

取 100 ng total RNA 所翻得之 cDNA，加入適當濃度之正、反股引子及 12.5 μl 的Power SYBR^® Green PCR Master Mix，並補ddH2O 使其總體積為 25 μl，然 後以ABI PRISM 7900 Sequence detection system 進行反應及偵測。各基因引 子序列、取量標準及反應條件見表一。

十七、Fas 抗體刺激細胞凋亡

先將細胞養於含 10 % 血清之培養基，在進行 anti-Fas 抗體 (CH11)刺激時，

加入等體積、不含血清之培養基並加入anti-Fas 抗體，使抗體最後濃度為 200 ng/ml。

十八、Trypan Blue Exclusion Assay

在此利用 trypan blue exclusion assay 來偵測細胞在經過 anti-Fas 抗體刺激後的 細胞活性。Trypan blue 為一藍色染劑，活細胞的細胞膜完整，trypan blue 無法穿透 細胞膜進到細胞內，然而當細胞死亡時，其細胞膜的完整性會喪失，因此trypan blue 即可進到細胞內並將細胞染成藍色。

先在 24 well culture plate 中種下 5*10⁵ cells/well (每個 well 皆有含 10 %胎牛血 清之培養基300 μl)，並且加入 doxycycline (1 μg/ml)，經過二十四小時後，再加入 等體積不含血清之培養基並加入anti-Fas 抗體 (200 ng/ml)，再經過二十四小時後，

收取細胞並利用trypan blue 檢視細胞活性。

收細胞時先吸走培養基，然後加入100 μl TrypEL 反應 30 sec ~1 min，接著再 加入培養基並連同TrypEL 將細胞以微量吸管沖離 well 底部，然後吸至 eppendorf tube 並以微量吸管吸吐約二十次以打散細胞，接著以 3000 rpm 離心三分鐘，吸掉 上清液，再以200 μl PBS 用 vortex 的方式使細胞懸浮。

取5 μl 細胞懸浮液加 20 μl PBS 及 25 μl trypan blue，混勻後靜置 3 分鐘，利用 細胞計數器(Hemacytometer)在顯微鏡下數四個底面積 1 mm²方格中的死細胞和活 細胞並計算細胞活性。當數得之細胞數總合不超過100 顆時，則直接取 5 μl 細胞 懸浮液加5 μl trypan blue，混勻靜置 3 分鐘後再重新計數細胞。

十九、Caspease 3 活性測定

在此利用 Caspase-Glo^® 3/7 Assay 試劑組(Promega)來偵測經 anti-Fas 抗體刺激 後細胞內之caspase 3 活性。

先在 24 well culture plate 中種下 5*10⁵ cells/well (每個 well 皆有含 10 %胎牛血 清之培養基300　μl)，並且加入 doxycycline (1 μg/ml)，經過二十四小時後，再加 入等體積不含血清之培養基並加入anti-Fas 抗體 (200 ng/ml)，經過八小時後，收 取細胞並計算細胞數以進行下一步實驗。

計算出細胞數後，以細胞數最少之樣本計算其 15000 顆細胞需取多少體積之 細胞懸浮液，然後以此體積為準(或取其整數)，每個樣本皆取此體積之細胞懸浮液 至九十六孔白盤，補PBS 至 25 μl，然後加 25 μl 之 Caspase-Glo^® 3/7 substrate，避 光反應一小時後，以微盤式冷光儀(Orion Microplate Luminometer, Berthold electron systems)及軟體 Simplicity 4.02 去測得冷光值。之後再以所測得之冷光值及各樣本 之細胞數計算其15000 顆細胞的 caspase 3 活性。

二十、ELISA for sFas

在此利用由 R&D systems 購得之 human sFas ELISA (DFS00)試劑組來進行細 胞中及培養過細胞之培養液(conditioned medium)中 Fas 受器的量。

首先在 12 well culture plate 中種下 10⁶ cells/well 並使培養基體積為 1 ml，並且 加入doxycycline (1 μg/ml)；經過 24~26 小時後，先收集上清之培養液(supernatant)，

並且收取細胞全蛋白質( lysate)、溶於 50 μl RIPA buffer；supernatant 以 14000 rmp 離心10 分鐘後取上層約 2/3 至新的 eppendorf tube；然後取原本體積 1/9 (約 100 μl ) 之離心後的supernatant 以及 1/27 的 lysate (先取 5 μl lysate 加 45 μl 1x Calibrator Diluent RD5L 並混勻，再從中取 18.5 ml 並加 81.5 μl 1x RD5L 使其體積為 100 μl) 去做定量。

所有檢測過程動作皆依據廠商提供之操作說明，以免疫酵素分析儀( μQuant, BioTek Instruments, Inc.)及 Gen5^TM Microplate Software 去測吸光值，並由 SigmaPlot 10.0 求得回歸曲線；在處理吸光值時，會先分別測量 OD450及OD570，並以OD450

減OD570取代機器校正波長的動作；Calibrator Diluent RD5L 為試劑組所附之 buffer。

結果

一、HepG2-2-NS4B-V5 穩定細胞株的建立及表現

為了排除轉染效率過低及過度表現蛋白質等干擾因素，並且考慮到HCV 主要

感染細胞為肝細胞，因此首先即是以肝癌穩定細胞株 HepG2-2 建立一可經由誘導 來控制NS4B 蛋白質表現與否之穩定細胞株。

由圖一顯示，經由西方墨點實驗可確定穩定細胞株 HepG2-2-NS4B-V5 在 doxycycline 1 μg/ml 誘導 24 小時後會表現 NS4B 蛋白質，而且誘導時間若增長至 48 小時並不會讓 NS4B 的表現量增加，此外在沒有 doxycycline 的誘導情況下，

HepG2-2-NS4B-V5 仍會有微量 NS4B 的表現；因為 NS4B 表現量在 doxycycline 誘 導 24、48 小時後觀察並無太大差異，因此往後實驗皆以誘導 24 小時為準。對照 組HepG2-2 則是無論有無 doxycycline 的誘導皆不產生任何 V5-tagged 蛋白質。

二、NS4B 蛋白質對 FASTK 基因表現量的影響

先前本實驗室在 H7-HCVR 中觀察到 FASTK mRNA 有上升的情形，然而在單 獨轉染NS4B 至 Huh7 時卻觀察到 FASTK mRNA 呈現下降的情形(74)，因此接下 來先分析HepG2-2-NS4B 在經誘導表現 NS4B 蛋白質時是否會對 FASTK mRNA 表 現量造成任何影響。

首先 HepG2-2 及 HepG2-2-NS4B 以 doxycycline 誘導 24 小時，然後萃取細胞 RNA，經反轉錄反應得到 cDNA，再以即時定量聚合酵素反應分析細胞 FASTK mRNA 表現量。結果發現，HepG2-2 中 FASTK mRNA 表現量並不會因 doxycycline 的存在與否而有明顯改變，但 HepG2-2-NS4B-V5 卻會經 doxycycline 誘導表現 NS4B 蛋白質而使其細胞中 FASTK mRNA 表現量下降至沒誘導時的 51%，因此如 同先前轉染實驗之結果，當表現 NS4B 蛋白質時，HepG2-2-NS4B-V5 細胞中 FASTK mRNA 表現量會被抑制(圖二)。

三、NS4B 對 Fas 活化所導致之細胞凋亡的影響

根據Li等人的研究指出，當以siRNA抑制HeLa細胞中FASTK蛋白質表現，細 胞會出現細胞凋亡現象，如細胞萎縮(cell shrinkage)、caspase 3 活化等現象，且過 量表現FASTK蛋白質之HeLa細胞較能夠扺抗Fas受器活化所引起之細胞凋亡(73)；

Izquierdo等人則指出FASTK蛋白質會調控細胞受器Fas的alternative splicing、特別 是exon 6 的略過與否(66)，而mRNA有沒有exon 6 決定所轉譯出之Fas受器在

Izquierdo等人則指出FASTK蛋白質會調控細胞受器Fas的alternative splicing、特別 是exon 6 的略過與否(66)，而mRNA有沒有exon 6 決定所轉譯出之Fas受器在