第一章 緒論
5.3 NS4B 與細胞蛋白之交互作用
目前已知NS4B 會和細胞蛋白質 Rab5、cAMP-response-element-binding protein- related protein (CREB-RP，又稱 activating transcription factor 6β, ATF6β)產生交互作 用(96, 97)；CREB-RP 為一內質網逆境反應相關轉錄因子， NS4B 藉其 N 端和 CREB-RP 結合，推測 NS4B 會透過此蛋白質調控有關內質網逆境的細胞反應，如 上述Zheng 等人觀察到之 UPR(95)。
研究方向
先前研究指出 C 型肝炎病毒之非結構性蛋白質 NS4B 的表現會抑制細胞蛋白 質 FASTK 的 mRNA 量，而 FASTK 的生理功能之一是調節 Fas 基因的 mRNA alternative splicing、使細胞產生具不同生理功能之 Fas 受器並改變 Fas 訊息傳遞過 程、決定細胞是否走向細胞凋亡，NS4B 可能藉由影響 FASTK 來調控 Fas/FasL 訊 息傳遞過程，在細胞凋亡、病毒感染複製、肝病變及肝癌發展中占重要角色。本
研究目的在建立一 NS4B 穩定細胞株，以排除轉染效率及過度表現蛋白質等干擾
因素，探討NS4B 的表現是否會影響 FASTK 的表現並進一步改變 Fas 訊息傳遞過 程及結果；觀察當NS4B 蛋白質表現時，FASTK 表現量的升降、不同型式及生理 功能的Fas 受器生成的比例、Fas 受器表現量的升降、對於 anti-Fas 抗體所誘發之 細胞凋亡的耐受性、以及細胞凋亡相關分子的活化是否受阻等現象，希望藉這些 實驗來了解NS4B 在病毒複製和致病機制方面所扮演的可能角色。
材料與方法
一、藥品
Acrylamide United State Biochemical
Ammonium persulfate Bio-Rad
Ampicillin United State Biochemical
Bis-acrylamide Bio-Rad
Boric acid Merck
Bovine serum albumin (BSA) Sigma
Bromophenol blue Merck
Chloroform Merck Deoxycholic acid (DCA) Sigma
Deoxynucleoside triphosphate (dNTP) GE Healthcare Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma
Disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4) Merck
Ethanol Merck Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Merck
Formadehyde Sigma
Glycine United State Biochemical
Hydrogen chloride (HCl) Merck
Isopropanol Merck Methanol Merck
Mineral oil Sigma
NP-40 Sigma Peptone Merck Phenol Merck Potassium chloride (KCl) Merck
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck
RNasin Promega Sodium chloride (NaCl) Merck
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Merck
TEMED Bio-Rad
Tris-base United State Biochemical
Triton X-100 GE Healthcare
TRIzol Invitrogen
Trypan Blue GIBCO
Tween 20 Sigma
Yeast extract Merck
二、酵素
KlenTaql DNA Polymerase AB peptide, Inc Avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMV-RT) Roche
RQ-1 DNase Promega
三、抗體
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (sc-2004) Santa Cruz Biotech HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (115-035-003) Jackson
HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (305-035-003) Jackson Mouse anti-V5 monoclonal antibody (R990-50) Invitrogen
Goat anti-FASTK (C20) polyclonal antibody (sc-1820) Santa Cruz Biotech Mouse anti-FAS (B10) monoclonal antibody (sc-8009) Santa Cruz Biotech Anti-Fas (human, activating), clone CH11 (05-201) Upstate
Rabbit anti-GAPDH polyclonal antibody (sc-25778) Santa Cruz Biotech Rabbit anti-caspase-3 monoclonal antibody Cell Signaling
Mouse anti-α-tubulin monoclonal antibody (T9026) Sigma
四、細胞培養液及轉染試劑
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) GIBCO
Doxycycline Invitrogen
Geneticin (G418) GIBCO
Hygromycin B Invitrogen
Lipofetamine 2000 Invitrogen
OPTI-MEM GIBCO Penicillin-Streptomycin GIBCO
Tet System approved FBS Clontech
TrypLETM Express GIBCO
五、套組試劑
Caspase-Glo® 3/7 Assay Promega
ECLTM western blotting detection reagents Amersham Bioscience
Plasmid midi kit Geneaid
Mini-M plasmid DNA extraction Viogene Bio-Rad Protein Assay kit Bio-Rad Quantikine® Human sFas Immunoassay (DFS00) R&D Systems Power SYBR® Green PCR Master Mix Applied Biosystems
六、其它
ImmobilonTM-P transfer membrane Millipore
X-ray film FUJI
μQuant BioTek Instruments, Inc.
Orion Microplate Luminometer Berthold electron systems
ABIPRISM7900 Applied Biosystems
七、實驗室提供之質體
7.1 pcDNA-NS4B-V5HisTopo (寇怡衡學姐提供)
以 pcDNA3.1D/V5His-Topo 為載體，帶有 HCV 非結構性蛋白 NS4B 基因，其 質體大小約6.3 kb，在 HepG2 及 293 等細胞中可表現出分子量約 34 kDa、C 端帶 有V5-His tag 的 NS4B 融合蛋白質。
7.2 pHyg-TRE-NS4B-V5 (張巧伶學姐提供)
將 pcDNA-NS4B-V5-HisTopo 質體利用限制酶 BamHI 及 AgeI 切出帶有 V5-tag 的NS4B 基因片段並將其黏接至 pHyg-TRE 質體中。pHyg-TRE-NS4B-V5 質體大小 約6.1 kb，在 pTet-On 的同時存在以及 tetracycline 刺激下，可表現出大小約 34 kDa 之NS4B 蛋白質。
7.3 pTet-On (Clontech)
pTet-On 調控質體大小約 7.4 kb，其上帶有 CMV 啟動子並使啟動子後面之 rTetR (reverse tet repressor)-VP16 調控蛋白質(reverse transcriptional tetracycline- controlled transactivator, rtTA)能持續表現。rtTA 會和 tetracycline 或其衍生物如 doxycycline 結合，此一結會使 rtTA 的構形改變，使 rtTA 能和帶有 TRE (tetracycline responsive element)序列之 DNA 結合並促使 TRE 序列後方之基因進行轉錄及表 現。TRE 序列並不存在於真核細胞中，因此 rtTA 不會結合到真核細胞之核酸序列、
不會影響細胞自身基因之轉譯過程。
7.4 pcDNA-FASTK-V5HisTopo (張巧伶學姐提供)
以 pcDNA3.1D/V5His-Topo 為載體，帶有細胞 FASTK 基因，其質體大小約 7.4 kb，在 HepG2 及 293 等細胞中可表現出分子量約 64 kDa、C 端帶有 V5-His tag 的FASTK 融合蛋白質。
八、細胞株和細胞培養
8.1 HepG2-2 細胞株(董馨蓮老師提供)
源於HepG2 (human hepatoblastoma cells)；將 pTet-On 調控質體(pTet-On regulator plasmid; Clontech)嵌入 HepG2 細胞之染色體而得 HepG2-2 細胞株。當 HepG2-2 受到 doxycycline 刺激時會誘發細胞內啟動子帶有 TRE 之基因的表現。
8.2 HepG2-2-NS4B 細胞株
源於 HepG2-2；將 pHyg-TRE-NS4B-V5 質體以 Lipofetamine 2000 轉染至 HepG2-2 中，然後將轉染細胞持續做繼代培養，並以 100、200、400 μg/ml hygromycin B 篩選細胞，約二個月後得到一抗 hygromycin B 200 μg/ml 之細胞株；在加入
1 μg/ml doxycycline 刺激細胞二十四小時後，收取細胞內容物，經由西方墨點並 以mouse anti-V5 抗體偵測確認 NS4B-V5 的表現。
細胞培養時以含 8% tetracycline-free 胎牛血清(Tet System approved FBS )、1%
penicillin-streptomycin、 200 μg/ml G418、100 μg/ml hygromycin B 之 DMEM，在 5% CO2、37 oC 下進行繼代培養。
九、DNA 轉染
以 6 公分培養皿為例，將細胞種於 6 公分培養皿中，待隔夜細胞滿度達到一 定滿度(HepG2-2, 40~60%; 293, 60~80%) 時，先將 4 μg 質體和 10 μl lipofectamine 2000 分別與適量 OPTI-MEM (~200 μl) 混合，於室溫下靜置 5 分鐘，接著將兩者 混合，於室溫下靜置20 分鐘，然後將此混合的轉染液加入已經以 PBS 清洗過並加 入約2.4 ml OPTI-MEM 的細胞培養皿中，接著放回細胞培養箱中(37 oC，5% CO2)。
經過4-6 小時，將混有轉染液之 OPTI-MEM 換成一般細胞培養液繼續培養 24~48 hr，收取細胞進行分析。
1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
137 mM NaCl , 2.7 mM KCl , 4.3 mM Na2HPO4 , 1.47 mM KH2PO4, adjust to a final pH of 7.4
十、細胞全蛋白質之收取
吸除培養液，以TrypLE 處理 1 min 30 sec (HepG2-2)、3 min (HepG2-2-NS4B)，
然 後 直 接 加 入 培 養 液 、 連 同 Trypsin 將 細 胞 沖 離 培 養 皿 底 部 並 吸 至 1.5 ml eppendorff；接著以 3000 rpm 離心 3min，吸掉上清液，並加入 1 ml PBS，經 vortex 將cell pellet 弄散，然後再以 3000 rpm 離心 3min，吸除上清夜。加入 30 ~ 80 μl 的 RIPA lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl pH8.0, 1 % DCA, 1 % NP-40, 0.1%
SDS)並藉 pippetment 進行 homogenization，然後以 6 w 的功率進行超音波震盪，再 以14000 rpm、4oC 離心 10 min，收集上清液即為細胞的全蛋白質，儲存於-20℃。
十一、蛋白質定量
採用 Bio-Rad protein assay kit；利用已知濃度的 BSA 溶液(0 μg/ml~16 μg/ml) 對於波長595 nm 的吸光值所做出標準曲線，再由未知蛋白質濃度之樣本對於波長 595 nm 的吸光值經標準曲線反推回去樣本之蛋白質濃度；若樣本之吸光值超過 16 μg/ml BSA 溶液之吸光值，則將樣本行稀釋後再重新定量。
十二、正十二烷硫酸鈉-聚丙醯胺板膠電泳
先用 70%酒精將玻璃及白板擦拭乾淨，組合成直立膠板裝置後，配製 separating gel solution 注入膠槽後，在上層補水將膠面壓平；等膠凝固後倒掉上層的水，確 定膠面乾燥後，配置stacking gel，膠槽插入齒梳狀模板並將 stacking gel solution 注入其餘空隙，待膠凝之後即完成SDS-PAGE 製備。
跑膠前先將 SDS-PAGE 置入電泳槽內，倒入適量一倍 running buffer，拔出齒 梳狀模板。蛋白質樣品先與protein dye 混合，放入 100oC 加熱板加熱 5 分鐘，冷 卻離心後即可注入齒槽中。先以80 V 電壓進行 stacking 約半小時，等樣品到達 separating gel 之膠面後，將電壓調到 120 V，直到作為指標的 bromophenol blue 跑 至膠底即完成。
Separating gel solution
12~15% polyacrylamide [acrylamide:bisacrylamide=29:1]、0.375 M Tris-HCl (pH 8.8)、0.1 % SDS、0.1% ammonium persulfate (AP)、0.05 % TEMED
Stacking gel solution
4.125 % polyacrylamide [acrylamide:bisacrylamide=29:1]、0.125 M Tris-HCl (pH6.8)、0.1 % SDS、0.1% ammonium persulfate (AP)、0.05 % TEMED 1X Running buffer
0.1% SDS、0.2 M Glycine、25 mM Tris-HCl (pH 8.4)
十三、西方墨點法
先將 Immobilon transfer membrane P 浸在 95 %乙醇約 10 分鐘然後移至 transfer buffer，接著將電泳完成後的 SDS-PAGE 移至轉漬系統中。在轉漬槽中倒入適量 transfer buffer，在 4 oC 下以 250 mA 電流將膠上的蛋白質轉印到 membrane 上，約 三個小時後取出membrane，將 membrane 浸入 blocking buffer、室溫下反應 1 小時，
接著倒掉blocking buffer，加入初級抗體，在 4oC 隔夜反應。反應完成後，以 washing buffer 清洗三次(5、10、15 分鐘)，加入二級抗體在室溫下反應 1 小時，再以 washing buffer 清洗三次(5、10、15 分鐘)，接著以二次水潤洗 membrane，並將水倒乾。最 後加入ECL 試劑並使其充分覆蓋 membrane，然後以 X-ray film 壓片顯影。
Transfer buffer
25 mM Tris-HCl 、192 mM Glycine、20 % Methanol Blocking buffer
5 % (w/v) Skim milk、0.1 % (v/v) Tween-20 in PBS Washing buffer
0.5 % (v/v) Tween-20 in PBS
十四、萃取 RNA
先以 PBS 將細胞沖離培養皿底部並移到 eppendorf tube，以 3000 rpm 離心 3 分鐘，吸去上清液，再加PBS 以振盪方式使細胞懸浮，然後再以 3000 rpm 離心 3 分鐘，吸去上清夜；接著加入1 ml TRIzol，並以微量吸管將細胞均質化，以 12000 xg、4 oC 離心 10 分鐘，取上清液至新的 eppendorf tube，室溫下靜置反應 5 分鐘，
此時可後續萃取步驟或將其儲存於-80 oC。靜置 5 分鐘後，加入 200 μl choloroform，
上下翻轉eppendorf tube 約十次，室溫下靜置 2 分鐘，再以 12000 xg、4 oC 離心 15 分鐘，取上層透明無色之澄清液至新的eppendorf tube，然後加入 isopropanol 500
μl，上下翻轉 eppendorf tube 約十次，室溫靜置 10 分鐘，然後以 12000 xg、4 oC 離 心十分鐘，去除上清液。接著加入1 ml 75 % 酒精並上下翻轉 eppendorf tube，然 後以7500 xg、4 oC 離心 5 分鐘，去除上清液並待管壁殘留液體蒸發。接著加入 20~50 ml 之 ddH2O 並且 65 oC 水浴十分鐘，然後以 OD260、OD280求得其RNA 濃度，調 整濃度到2 μg/μl，取 1 μl跑1 % agarose gel 以確定各樣本稀釋後濃度是否一致、
RNA 的品質如何。
十五、反轉錄-聚合酵素鏈反應
取 2.5 μl 之 total RNA ( 2 μg/μl)加入 0.4 μl 之 RQ-1 DNase (Promega)及 0.45 μl 10x buffer、1.15 μl ddH2O，37oC 反應 30 分鐘，然後加 0.5 μl stop solution 於 65 oC 反應10 分鐘。接著取 2.5 μl aliqout 進行接下來的反應。
取 2.5 μl aliquot 加 0.25 μl 的 24 μM OligodT 及 ddH2O 0.45 μl，於 65 oC 反應10 分鐘，然後放在冰上 1 分鐘，接著再加入 0.25 μl 的 10 mM dNTP、
0.2 μl 的 RNasin、0.1 μl 的 AMV RT、1 μl 的 5x buffer、0.25 μl 的 ddH2O，
於42 oC 反應 30 分鐘，即完成反轉錄反應。
十六、即時定量聚合酵素鏈鎖反應
取 100 ng total RNA 所翻得之 cDNA，加入適當濃度之正、反股引子及 12.5 μl 的Power SYBR® Green PCR Master Mix，並補ddH2O 使其總體積為 25 μl，然 後以ABI PRISM 7900 Sequence detection system 進行反應及偵測。各基因引 子序列、取量標準及反應條件見表一。
十七、Fas 抗體刺激細胞凋亡
先將細胞養於含 10 % 血清之培養基，在進行 anti-Fas 抗體 (CH11)刺激時，
加入等體積、不含血清之培養基並加入anti-Fas 抗體，使抗體最後濃度為 200 ng/ml。
十八、Trypan Blue Exclusion Assay
在此利用 trypan blue exclusion assay 來偵測細胞在經過 anti-Fas 抗體刺激後的 細胞活性。Trypan blue 為一藍色染劑，活細胞的細胞膜完整，trypan blue 無法穿透 細胞膜進到細胞內，然而當細胞死亡時，其細胞膜的完整性會喪失，因此trypan blue 即可進到細胞內並將細胞染成藍色。
先在 24 well culture plate 中種下 5*105 cells/well (每個 well 皆有含 10 %胎牛血 清之培養基300 μl)，並且加入 doxycycline (1 μg/ml)，經過二十四小時後，再加入 等體積不含血清之培養基並加入anti-Fas 抗體 (200 ng/ml)，再經過二十四小時後，
收取細胞並利用trypan blue 檢視細胞活性。
收細胞時先吸走培養基，然後加入100 μl TrypEL 反應 30 sec ~1 min，接著再 加入培養基並連同TrypEL 將細胞以微量吸管沖離 well 底部，然後吸至 eppendorf tube 並以微量吸管吸吐約二十次以打散細胞，接著以 3000 rpm 離心三分鐘，吸掉 上清液，再以200 μl PBS 用 vortex 的方式使細胞懸浮。
取5 μl 細胞懸浮液加 20 μl PBS 及 25 μl trypan blue，混勻後靜置 3 分鐘，利用 細胞計數器(Hemacytometer)在顯微鏡下數四個底面積 1 mm2方格中的死細胞和活 細胞並計算細胞活性。當數得之細胞數總合不超過100 顆時，則直接取 5 μl 細胞
取5 μl 細胞懸浮液加 20 μl PBS 及 25 μl trypan blue，混勻後靜置 3 分鐘，利用 細胞計數器(Hemacytometer)在顯微鏡下數四個底面積 1 mm2方格中的死細胞和活 細胞並計算細胞活性。當數得之細胞數總合不超過100 顆時，則直接取 5 μl 細胞