92 個肺癌組織樣本之組織塊及鄰近正常組織，在液態氮中分別
搗碎磨成粉後，加入 lysis 緩衝液 (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.4%SDS and 0.4mg/ml proteinase K)，水浴 56oC，2-3 小
時後，以phenol-chloroform 萃取出上清液。再加入 RNase (40µg/ml)，
56oC，45 分鐘；proteinase K (0.2 mg/ml) 及 SDS (0.1%)，56oC，45
分鐘後，利用phenol-chloroform 以及酒精沉澱的步驟純化出 DNA 溶 液，存放在-20oC 冰箱中保存備用。
2. Methylation-specific PCR assay, MSP
將DNA 用 sodium bisulfite 處理 18 小時之後，若此 DNA 之 CpG islands 沒有甲基化，則 cytosines 便會轉變為 uracil，反之，若此 DNA 之 CpG islands 有甲基化的話，則 cytosines 便不會轉變為 uracil；因 此，經過sodium bisulfite 處理的甲基化與未甲基化之 DNA 序列是不 同的，利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，以 判讀啟動子是否有高度甲基化的情形。PCR 產物總體積為 25 ul，其
中包含 3 ul DNA，2.5 ul Gold 10xPCR 緩衝液，2.5 ul 2.5mM 的 MgCl2，2 ul 2.5 mM dNTP，1 ul 10 pmol PCR 引子、0.2 ul 的 AmpliTaq polymerase (Perkin Elmer, Branchburg, NJ)與 13.8 ul ddH2O，PCR 引子 設計 (Table 5) 和反應條件如下：
SLIT2-methyl-U：95oC 10 分鐘，再經 33 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 62oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。
SLIT2-methyl-M：95oC 10 分鐘，再經 36 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 68oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。
ROBO1-methyl-U：95oC 10 分鐘，再經 41 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 63oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。
ROBO1-methyl-M：95oC 10 分鐘，再經 41 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 63oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。
SRGAP1-methyl-U：95oC 10 分鐘，再經 40 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 60oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。
SRGAP1-methyl-M：95oC 10 分鐘，再經 40 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 65oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。
反應完成之 PCR 產物以 2%洋菜膠進行電泳，並以 ethidium bromide 染色 10 分鐘，最後以紫外光顯影照相分析儀照相分析。
3. 判讀標準
若在設計增量有甲基化之引子得到 PCR 產物，則判定此病人啟 動子有甲基化情形發生 (56)。
五 . 細 胞 處 以 去 甲 基 化 藥 物 5’-aza-2’-deoxycytidine (5'-Aza-2'-dC) 之相關分析
1. 細胞培養
將肺癌細胞株 CL1-5 以培養基 DMEM 培養於 37oC、5%CO2 培 養箱中；細胞株以倒立式顯微鏡觀察，當細胞長滿為單層 (monolayer) 時，即可進行繼代培養 (subculture)。在無菌操作台 (laminar flow) 內，以抽氣機吸去上層液，再以5 ml phosphate-緩衝液 ed saline (PBS) 清洗細胞兩次，吸去PBS 並加 1 倍 trypsin-EDTA 1ml，前後左右搖晃 培養皿使trypsin 均勻分散於細胞層，並置於培養箱中約 2~3 分鐘後，
搖晃培養皿同時以倒立式顯微鏡觀察，待細胞層脫落並浮起時，取適 當比例的細胞於新的培養基中 (總體積 8ml)，以十字型搖散細胞，培
養在37oC，5% CO2培養箱中；待 2-3 天細胞株長滿培養皿後，即可 再行繼代培養。
2. 細胞加藥處理
本研究以去甲基化藥物 5'-Aza-2'-dC 處理肺癌細胞株 CL1-5。於 加藥的前一天取 1x106細胞種於 10cm 細胞培養基中培養，隔天加入 5μM 的去甲基化藥物 5’-Aza-2’-dC 處理細胞，之後在繼代培養時同時 加入 5μM 的去甲基化藥物 5’-Aza-2’-dC 處理細胞至少 3 細胞代數
(cell doubling)。處理指定時間七天後，每盤細胞分別抽出 RNA 及 DNA 以做分析，或整盤細胞來做免疫細胞染色與細胞爬行能力分析。
3. 細胞株蛋白免疫細胞染色分析 (Immunocytochemistry assay, ICC)
將細胞株 CL1-5 之培養皿，以 5 ml PBS 清洗細胞兩次，吸去 PBS 並加1% formaldehyde 固定細胞 20 分鐘，待其風乾但仍濕潤狀態下加 入SLIT2 primary antibody (稀釋濃度 1:1000、反應時間室溫 1hr)，以 偵 測 蛋 白 表 現 ， 接 下 來 在 避 光 條 件 下 使 用 螢 光 二 次 抗 體 (CHEMICON, Temecula, CA)與 DAPI (4’,6-Diamidino-2- phenylindole dihydrochloride) (CHEMICON) 處理細胞 30 分鐘，再以 PBS 浸潤細
胞直接以螢光顯微鏡觀察。螢光二次抗體目的為放大蛋白偵測訊號，
在螢光顯微鏡下呈現紅色螢光，DAPI 則是辨認細胞核所在，在螢光 顯微鏡下呈現藍色螢光。
4. 細胞株DNA及mRNA的抽取、定量及分析
使用QIAamp DNA Mini Kit 抽取細胞株的DNA，首先將培養皿 上的DMEM吸乾，拿刮杓將細胞刮至乾淨的eppendorf中，加入20μl Proteinase K及200μl 緩衝液 AL，水浴56oC，10分鐘後加入200μl 99.9%酒精，將所有檢體放入QIAamp spin column，離心8000 rpm 1分
鐘，之後再分別加入500μl緩衝液AW1及AW2，離心後，需將column 下收集管內的緩衝液移除，最後將QIAamp spin column置於乾淨的 eppendorf 上，並加入200μl 緩衝液 AE於室溫下1分鐘，離心、收集 DNA定量備用。
細胞株 CL1-5 DNA 分析採用 MSP 方法，與「方法四」中基因啟 動子高度甲基化分析相同。至於細胞株 CL1-5 mRNA 的抽取、定量 及RT-PCR 方法則與「方法三」中基因 mRNA 分析相同。
5. 細胞株爬行能力分析 (Transwell assay)
分別以 trypsin 與含有 10% FBS 培養基 DMEM 打散並中和培養 皿內的細胞株CL1-5 後，4oC 低速離心 5 分鐘，再以 Serum-Free DMEM 洗去Serum，開始計數細胞並以 Serum-Free DMEM 稀釋細胞。將 1x105 細胞種於 12-well cassette 上層 chamber，並加入 1ml Serum-Free DMEM，而下層 chamber 加入 2ml 含有 10% FBS DMEM，將 transwell cassette 放入 37oC、5%CO2 培養箱中培養 16 至 24 小時後，去除上下
兩 層 培 養 液 ， 以 1ml PBS 清 洗 下 層 chamber 兩 次 ， 再 以 1%
formaldehyde 固定細胞 10 分鐘，最後以 0.1% crystal violet 染色 20 分 鐘並以一次水退染，至抽風櫃風乾後，以光學顯微鏡觀察從上層 chamber 底部通透膜上方爬行到通透膜下方的細胞數目並做定量。
六. 以 RNAi (RNA interference) 策略將細胞株之 SLIT2 knock down 相關分析
1. 細胞培養
肺癌細胞株 CL1-0 培養方法與「方法五」之 1. 細胞培養相同。
2. 細胞株基因 knock down 處理
將含有特定 shRNA 序列的 pGIPZ 質體 (標的基因為 SLIT2) 以
E.coli 少量製備(Mini-prep)，製備步驟為:先將菌液抹盤培養 16 小時
後，挑選數個 clone 至新的培養液當做 library，並用 Ampicillin 做為 bacterial selectable marker 在 37oC、200rpm 震盪條件下培養 16 小時。每個clone 取微量，利用 High-Speed Plasmid Mini Kit 來抽 Mini，首 先依序加入 PD1、PD2 與 PD3 緩衝液混合均勻後，以高速離心 3 分 鐘，取上清液至PD column 離心 1 分鐘，去下層液，依序加入 W1 與 Wash 緩衝液，離心後，需將下收集管內的緩衝液移除，最後將 column 置於乾淨的eppendorf 上，並加入 ddH2O 於室溫下 2 分鐘，離心、收 集plasmid DNA 備用。收集來的 plasmid DNA 取適量送定序並做限 制酶切割以確定質體的正確性。
質體確認無誤後，開始大量製備 (Midi-prep)，首先將 library 上 的clone 刮下加入內有 50ml TB broth (含 Ampicillin) 的錐形瓶混合均
勻後，在 37oC、低速震盪條件下培養 16 至 18 小時。並用 Geneaid Plasmid Midi Kit 抽 Midi，首先將菌液移到專用離心管中，離心後去 上清液，依序加入PM1、PM2 與 PM3 緩衝液混合均勻後，以 4oC 高 速離心20 分鐘後，取上清液到 Plasmid-Midi column，依序加入 PW 緩 衝液、PEL 緩衝液、isopropanol 與酒精並高速離心來清洗、沉澱、
純化並收集Plasmid DNA，最後移除酒精後待 DNA 乾燥至透明，以 ddH2O 回溶並測其濃度備用。
將質體以 kit 中的 transfection reagent 送入細胞中。培養經過 48 小時後，開始以Puromycin (Mammalian selectable marker)篩選細胞五 天後，待細胞長滿，每盤細胞便可抽出 RNA，或整盤細胞來做免疫 細胞染色與細胞爬行能力分析。
RNAi 抑制的對照組使用不具抑制特定基因功能之 pGIPZ 質體，
以與實驗組相同的方式送入細胞中。
3. 細胞株蛋白免疫細胞染色分析 (ICC)
細胞株 CL1-0 SLIT2 蛋白表現分析方法與「方法五」之 3. 細胞 株蛋白免疫細胞染色分析相同。
4. 細胞株mRNA的抽取、定量及分析
細胞株 CL1-0 mRNA 的抽取、定量及 RT-PCR 方法與「方法三」
中基因mRNA 分析相同。
5. 細胞株爬行能力分析 (Wound Healing assay)
將 transfection 成功與抗生素篩選過後的 CL1-0 細胞株以 1x105 的數目種在培養皿上，待細胞貼盤後，吸去培養液，在培養皿由上至 下畫一道間隙使細胞分為左右兩邊，續以 PBS 清洗兩次，目的是將 刮下的細胞與其他雜質去除，再加入培養液，放入 37oC、5%CO2 培 養箱中培養。48 小時後以顯微鏡觀察兩側細胞往間隙移動的情形，
藉此定性分析細胞的爬行能力。
6. 細胞株附著能力分析 (Adhesion assay)
將適量collagen I (以HCl稀釋成100μg/ml) 加入96孔盤存放於4oC 冰箱12至16小時，目的是在in vitro狀態下模擬in vivo中細胞可以貼附 的環境 (collagen I是一種Extra Cellular Matrix, ECM)，再以5% BSA blocking 12至16小時，之後將transfection成功與抗生素篩選過後的 CL1-0細胞用Trypsin打下，並用0.5% FBS/DMEM稀釋後，以1x105的 數目種在96孔盤的每個well上，放入37oC、5%CO2 培養箱中培養4小 時後，依序用0.5% FBS/DMEM清洗兩次、1% formaldehyde固定、0.1%
crystal violet染色、二次水清洗兩次後，最後以1% SDS溶解細胞，用
ELISA reader 測量OD590值，OD590值越大，表示被染色細胞數目越 多，亦表示其細胞附著能力越強。
七. 統計分析
以分析的結果將病人區分為變異組與正常組，利用Pearson X2 test，
分析92 個肺癌病人 SLIT2、ROBO1、SRGAP1 蛋白和 mRNA 異常表 現、啟動子高度甲基化與各種病理分類 (包含年齡、性別、癌症種類、
癌症分期、抽煙狀況) 關係的統計分析。其中癌症分期之 Stage I、II 定義為較早期的病人族群，Stage III、IV 定義為較晚期的病人族群；
而抽煙狀況則分為有抽煙和沒抽煙兩個族群，有抽煙者包含目前仍在 抽煙和已戒煙者。所有分析作業均以SPSS (11.0 版)軟體進行。
陸. 結果
一. 探討台灣地區肺癌病人 SLIT2 基因/蛋白之變異情形
1. SLIT2 蛋白表達情形與病歷資料相關性
利用免疫組織染色法，分析 92 位 NSCLC 病人的癌組織切片之 SLIT2 蛋白表現，染色代表圖見 Figs. 4A-D。實驗結果顯示：在檢驗
的92 個檢體中，38 人(41.3%) 其癌組織切片之癌細胞的細胞質/細胞 膜呈<40%紅褐色反應，判定為 SLIT2 蛋白無表達或低表達的病人；
另外在病歷資料分析方面，發現 SLIT2 蛋白低表達或不表達的情形，
與 病 人 之 性 別 、 抽 煙 狀 況 、 癌 症 種 類 間 並 無 明 顯 相 關 性 存 在 (P>0.05)，但是值得注意的是，在年齡層面，SLIT2 protein 表現降低 情形通常發生在年輕的病人 (P=0.005)；此外，在癌症分期層面，
SLIT2 protein 表現降低情形則通常發生在癌症晚期的病人 (P=0.003) (Table 6)。
2. SLIT2 mRNA 表達情形與病歷資料相關性
利用RT-PCR 方法，分析 92 位 NSCLC 病人癌組織及其鄰近正常 組織 SLIT2 mRNA 表達情形，引子所夾的區域為 exon 36 與 exon 37，
全長為387 bp，RT-PCR 代表圖見 Fig. 5A。實驗結果顯示：在檢驗中
的92 個檢體中，41 位病人(44.5%) 其癌組織 mRNA 表現比正常細胞 降低一半以上；另外在病歷資料分析方面，發現 SLIT2 mRNA 低表達 或不表達的情形，與病人之年齡、性別、抽煙狀況、癌症種類間並無 明顯相關性存在 (P>0.05)，但是值得注意的是，在癌症分期層面，
SLIT2 mRNA 表現降低情形通常發生在癌症晚期的病人 (P=0.05)
(Table 6)。3. SLIT2 基因啟動子高度甲基化情形與病歷資料相關性
利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，PCR 引子所夾的區域為啟動子－676 至－518 位置，長度為 158 bp，MSP 代表圖見Fig. 6A。在所分析的92 位病人中，58 位 (63%)病人的 SLIT2 基因啟動子有過度甲基化情形，另外在病歷資料分析方面，發現 SLIT2 啟動子高度甲基化情形，與病人之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、
癌症分期間並無明顯相關性存在 (P>0.05) (Table 6)。
4. SLIT2 mRNA、蛋白表達情形、啟動子甲基化與癌症分期 之相關性
由上述 SLIT2 mRNA、蛋白表達情形與病歷資料相關性之分析結 果顯示，在癌症分期層面，不管是 SLIT2 mRNA 表現降低情形還是 SLIT2 蛋白質表現降低情形都可發現通常發生在癌症晚期的病人
(P<0.05)。因此我們更進一步將癌症分期從原本的 I + II 期定義為癌症 早期病人，III + IV 期定義為癌症晚期病人，改為 I、II、III、IV 期各 自獨立分期，來更精確的檢測 SLIT2 變異情形與癌症分期的相關性，
此外，特地加入肺癌病人是否遠端轉移此一病歷資料，也去檢測它與
SLIT2 變異情形的相關性。統計分析後發現，SLIT2 mRNA 表現降低
情形與 SLIT2 protein 表現降低情形隨著癌症分期的演進，其不表達此外，特地加入肺癌病人是否遠端轉移此一病歷資料，也去檢測它與