SLIT2及其相關基因變異與肺癌形成之機制探討
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(2) 謝. 誌. 三年的碩士班生涯，說快不快，說慢不慢，在寫完謝誌之後即將 結束。這三年來最要感謝的便是美麗大方又精明聰穎的恩師:王憶卿 教授，感謝老師孜孜不倦、認真有耐心的指導沒有實驗室基礎的我， 不僅給我很大的自由空間，讓我修習教育學程，也使我在碩班生活 中，於研究上思考邏輯模式、實驗技巧、口語表達組織能力都有很大 的進步，實在是非常感激老師。另外，老師和我們亦師亦友的相處， 經常舉辦實驗室聚餐如春酒、送舊迎新餐會，或是實驗室出遊，朋友 們都非常羨慕實驗室與老師的友好關係。 此外，感謝提供實驗檢體的台北榮總胸腔外科許瀚水醫師，還有 協助 IHC 判讀的台北榮總病理部李芬瑤醫師。也要感謝我的口試委 員郭明良教授與蘇銘燦教授，撥冗參與本論文的審查及口試工作，以 及不吝對本論文提出建議，使它的內容更趨完善。 除此之外，也要感謝實驗室的夥伴們:感謝若嘉、若凱學姊在實 驗上的協助與幫忙，讓我能實驗順利成功；感謝哲維學長在實驗上給 我的建議以及解決我不少的電腦問題，實在是可靠的男人!感謝善解 人意的一泓學姊常帶給我快樂與歡笑；更要感謝慶孝學長、秋逸學 姊，芳宜、信銘、昆學同袍、一麟、家揚、偉伶、素芬、翊萱、孝文、 怡珊、衍儒、淨婷、珈鑫等學弟妹和助理本翰、婷芸、喬凱的陪伴與.
(3) 鼓勵，當然還有跟我一樣需要減肥的 Taffy，感謝你們大家的相伴。 最後，感謝爸爸、媽媽一直以來對我的支持，讓我能選我所愛， 在我喜歡的領域裡能無憂無慮的學習。另外要感謝女友宙真對我的支 持與關心，在我歡樂、沮喪時能有你的分享與打氣。也要感謝國中麻 吉們在生活瑣事上的幫忙與鼓勵。 僅以此論文獻給我最親愛的家人及所有關心我、陪我一路走來的 朋友們。 李世華 謹誌于 國立臺灣師範大學生命科學研究所 D309 中華民國九十六年七月.
(4) 目. 錄. SLIT2 及其相關基因變異與肺癌形成之 機制探討 Etiological association of the alteration of SLIT2 and its related genes in lung cancer 壹、中文摘要………………………………………………………. 1. 貳、英文摘要.................................................................................... 3. 叁、文獻總論 ..................................................................................... 5 一、台灣肺癌的重要性………………………………………….. 5 二、研究背景……………………………………………………. 8. 三、SLIT2 signaling pathway 在神經軸索移動、細胞遷徙 所扮演的角色以及 SLIT2 與癌症的關係………………….. 9 四、SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因之結構與功能…………… 11 五、SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因異常與癌症形成的報導… 12 1. SLIT2 基因異常情形與癌症形成的相關性報導………... 13. I.
(5) 2. ROBO1 基因異常情形與癌症形成的相關性報導…...…. 14 3. SRGAP1 基因異常情形與癌症形成的相關性報導…….. 16 肆、研究目標…………………………………………………..…… 18 伍. 方法總論………………………………………………………… 19 一、研究材料 …………………………………………………… 19 1. 檢體來源及病歷資料……………………………………. 19 2. 肺癌細胞株 ……………………………………………… 19 二、SLIT2 與 ROBO1 蛋白表現分析…………………………… 19 1. 免疫組織染色分析 (Immunohistochemistry assay, IHC)……………………. 20 2. 染色切片之判讀標準…………………………………….. 20 三、SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因 mRNA 分析…………….. 21 1. mRNA 萃取……………………………………………….. 21 2. 反轉錄-聚合酵素連鎖反應 (Reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)…22 3. 判讀標準…………………………………………………... 23 四、SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因啟動子過度甲基化分析...... 23 1. DNA 萃取.............................................................................. 23 2. Methylation-specific PCR, MSP assay…………………….. 24 3.判讀標準................................................................................ 25 II.
(6) 五、細胞處以去甲基化藥物 5’-aza-2’-deoxycytidine (5’-Aza-2’-dC) 之相關分析…………………………...….... 26. 1. 細胞培養………………………………………………… 26 2. 細胞加藥處理…………………………………………… 26 3. 細胞株蛋白免疫細胞染色分析 (Immunocytochemistry assay, ICC)…………………...… 27 4. 細胞株 DNA 及 mRNA 的抽取、定量及分析……….... 27 5. 細胞株爬行能力分析 (Transwell assay)………….......... 28 六、以 RNAi (RNA interference)策略將細胞株之 SLIT2 knock down 相關分析........................................................... 29 1. 細胞培養………………………………………………… 29 2. 細胞株基因 knock down 處理……..…………………… 29 3. 細胞株蛋白免疫細胞染色分析 (Immunocytochemistry assay, ICC)……………………… 30 4. 細胞株 DNA 及 mRNA 的抽取、定量及分析………..... 30 5. 細胞株爬行能力分析 (Wound Healing assay)………..... 31 6. 細胞株附著能力分析 (Adhesion assay)……..………..... 31 七、統計分析……………………………………………………. 32. 陸. 結果................................................................................................ 33 一. 探討台灣地區肺癌病人 SLIT2 基因/蛋白之變異情形…….. 33 III.
(7) 1. SLIT2 蛋白表達情形與病歷資料相關性........................... 33 2. SLIT2 mRNA 表達情形與病歷資料相關性……………... 33 3. SLIT2 基因啟動子高度甲基化情形與病歷資料相關性... 34 4. SLIT2 mRNA、蛋白表達情形、啟動子甲基化與 癌症分期之相關性………………………………..….…... 34 5. SLIT2 mRNA、蛋白不表達與啟動子甲基化間 之相關性.............................................................................. 35 二. 探討台灣地區肺癌病人 ROBO1 基因/蛋白之變異情形….. 36 1. ROBO1 蛋白表達情形與病歷資料相關性....................... 36 2. ROBO1 mRNA 表達情形與病歷資料相關性…………… 36 3. ROBO1 基因啟動子高度甲基化情形與病歷資料相關性.. 37 4. ROBO1 mRNA、蛋白不表達與啟動子甲基化間 之相關性.............................................................................. 38 三. 探討台灣地區肺癌病人 SRGAP1 基因/蛋白之變異情形…. 38 1. SRGAP1 mRNA 表達情形與病歷資料相關性………….. 38 2. SRGAP1 基因啟動子高度甲基化情形與病歷資料相關性.. 39 3. SRGAP1 mRNA 與啟動子高度甲基化間之相關性…….. 39 4. SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 基因任一表達變異與 病歷資料相關性.................................................................. 39. IV.
(8) 四、細胞以去甲基化藥物 5’-aza-2’-deoxycytidine (5’-Aza-2’-dC)之處理結果...................................................... 40 1. model cell 的篩選................................................................ 40 2. 5’-aza-2’-deoxycytidine 對 SLIT2 基因/蛋白表現與細胞 爬行能力之影響.................................................................... 42 五、RNAi 處理原先有 SLIT2 表現細胞株 CL1-0 之實驗結果... 43 柒、討論............................................................................................... 44 捌、結論及研究應用與未來工作 ........................................................ 53 玖、附表................................................................................................. 54 拾、附圖................................................................................................. 65 拾壹、參考文獻 .................................................................................... 78. V.
(9) TABLE CONTENT. Table 1. Summary of SLIT2 abnormalities in human cancers….... 55. Table 2. Summary of ROBO1 abnormalities in human cancers…. 56. Table 3. Summary of SRGAP1 abnormalities in human cancers… 57. Table 4. List of antibodies used for immunochemistry in the present study………………………..……….……. 58. Table 5. List of primer sequences used in the present study……... 59. Table 6. Alterations of SLIT2 gene in relation to clinicopathological parameters of resected primary lung tumors…………….…………………………………. 60. Table 7. Alterations of ROBO1 gene in relation to clinicopathological parameters of resected primary lung tumors……………………………………………... Table 8. 61. Alterations of SRGAP1 gene in relation to clinicopathological parameters of resected primary lung tumors……………………………………………... Table 9. 62. Detailed analysis of the correlation between alterations of SLIT2 gene and metastasis………………. 63. Table 10. Alterations of loss of any one protein in relation to clinicopathological parameters of resected primary lung tumors……………………………………………... VI. 64.
(10) FIGURE CONTENT. Figure 1. Model for SLIT-induced neuronal migration………..…. 66. Figure 2. Schematic representation of SLIT/ROBO/SRGAP and their function…………………………………….… 67. Figure 3. Structure and function of SLIT2/ROBO1/SRGAP1 genes.... 68. Figure 4. Representative figures of immunohistochemistry analysis of SLIT2 and ROBO1 in paraffin sections of lung specimens…………………………………..….. 69. Figure 5. Representative figure of SLIT2, ROBO1 and SRGAP1 mRNA expression analysis………………………………. Figure 6. 70. Representative figure of SLIT2, ROBO1 and SRGAP1 MSP assay……………………………………………… 71. Figure 7. Concordance analysis between protein expression, mRNA expression, and promoter methylation of the SLIT2, ROBO1 and SRGAP1 gene……………….… 72. Figure 8. mRNA expression and methylation status of cell lines… 73. Figure 9. SLIT2 promoter methylation status, mRNA expression, protein expression, and cell motility in the CL1-5 cell line treated with 5’-Aza-2’-deoxycytidine and untreated control ……….. 74. Figure 10. Down regulation of SLIT2 mRNA and protein in the CL1-0 cell line coincided with increase VII.
(11) cell motility and decrease cell adhesion ability after transfected with SLIT2 knock down construct……………………………………………….. 75 Figure 11. Final model (SLIT2 pathway)…………………………. 77. VIII.
(12) ABBREVIATIONS. ACC. Adenoid cystic carcinoma. AD. Adenocarcinoma. AGM. Axon guidance molecule. AS. adenosquamous carcinoma. C. Control. CCRCC. Clear cell renal cell carcinoma. CDK. Cyclin-dependent kinase. DAPI. 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride. DCC. Deleted in colorectal cancer. EtBr. Ethidium bromide. HCC. Hepatocellular carcinoma. HDAC. Histone deacetylase. HNSCC. Head and neck squamous cell carcinoma. ICC. Immunocytochemistry. IDV. integrated density value. IHC. Immunohistochemistry. LC. Large cell carcinoma. LOH. Loss of heterozygosity. LRR. Leucine-rich repeats. MSP. Methylation-specific PCR IX.
(13) MW. Molecular weight marker. N. Normal. NSCLC. Non-small cell lung cancer. OOEC. Oral and oropharyngeal epithelial carcinoma. PBS. Phosphate-buffered saline. RNAi. RNA interference. ROBO1. Roundabout human homolog 1. RT-PCR. Reverse-transcriptase polymerase chain reaction. SCLC. Small cell lung cancer. SLIT2. Slit homolog 2 Drosophila. SQ. Squamous carcinoma. SRGAP1. SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1. T. Tumor. TSGs. Tumor suppressor genes. WHO. World Health Organization. 5’-Aza. 5’-aza -2’-deoxycytidine. X.
(14) 壹. 中文摘要 研究背景:自 1982 年起，癌症即為台灣地區十大死亡原因之首 位，其中肺癌的死亡率不論在女性或男性都高居癌症死亡率的首位， 儘管目前醫學已相當進步，但對於分子致癌機制仍未完全釐清。目前 所知，癌症形成的原因，是由於一連串基因發生變異所造成，和癌症 有關的抑癌基因 (tumor suppressor gene) 經研究證實之所以會致癌 往往是因其兩個基因座同時發生變異導致失去活性，變異方式多為一 基因座產生點突變、小片段鹼基缺失或啟動子過度甲基化 (promoter hypermethylation)，而另一基因座發生抑癌基因及鄰近區域 DNA 大片 段缺失 (loss of heterozygosity)，導致抑癌基因活性降低而致癌。因 此，抑癌基因變異的研究有助於了解癌症形成的機制。 SLIT2 蛋白質是一個分泌於細胞膜外的醣蛋白，在神經細胞發育 過程當中，可以控制軸突的分支、遷移，並能引導其生長方向，藉此 調節神經細胞的發育。已有許多文獻報導指出 SLIT2 基因在肺癌、乳 癌與大腸癌皆有嚴重的基因大片段缺失的情形，以說明此基因在腫瘤 形成或轉移過程的重要性。然而，目前並無同時針對位在 SLIT2 訊號 傳導路徑的重要三者成員如: SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1，在癌症病 人的完整分子致癌機轉與變異情形的探討文獻。因此，本研究針對台 灣地區的肺癌病人其 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 三個基因變異情形 以及 SLIT2 蛋白與癌細胞轉移的關係做深入的研究。 材料與方法:為了探討 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 三基因在肺癌 病人中變異情形以及與病人病歷資料的相關性，本研究分析了 92 位 台灣地區非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 的病人 檢 體 ， 利 用 免 疫 組 織 染 色 法 (immunohistochemistry) 觀 察 病 人 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 蛋白的表現，再以反轉錄-聚合酵素鏈反 1.
(15) 應 (Reverse-transcriptase polymerase chain reaction) 分析組織細胞中 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 三基因 mRNA 轉錄是否異常，續以聚合 酵素鏈反應為基礎的甲基化分析 (methylation-specific PCR) 偵測 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 三基因的啟動子過度甲基化頻率。此外， SLIT2 基因在癌症轉移扮演的角色亦利用細胞模式實驗來釐清。 結果: (1) 實驗結果發現所分析的 NSCLC 病人中，SLIT2 和 ROBO1 蛋白低表達頻率分別達 41.3% (38/92) 與 20.1% (19/92)，而 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 mRNA 低表達情形分別為 45% (41/92)、11% (10/92) 和 34% (31/92)，且 SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 啟動子甲基化 頻率各為 63% (58/92)、37% (34/92) 和 40.2% (37/92)。(2) SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 蛋白質/mRNA、mRNA/啟動子甲基化、蛋白質/啟動子甲 基化表現彼此間都呈現統計上的顯著相關性 (P<0.05)。(3) 此外， SLIT2 mRNA 與 蛋 白 屬 於 低 表 達 者 大 多 是 癌 症 分 期 晚 期 的 病 人 (mRNA, P=0.05; protein, P=0.003) 與有遠端臟器轉移的病人 (mRNA, P=0.023; protein, P=0.013)。(4) 我們也發現，原本有 SLIT2 基因變異 的肺癌細胞株在經過去甲基化藥物的處理之後，會使肺癌細胞株的 SLIT2 基因啟動子去甲基化、mRNA 與蛋白質表現量上升，以及細胞 株爬行能力顯著降低 (P<0.001)；另一方面，原本爬行潛力不高的肺癌 細胞株將 SLIT2 基因 knock down 後，會使細胞株的 SLIT2 mRNA 與蛋 白質表現量下降、細胞株爬行能力提高、附著能力下降 (P<0.001)。 結論:本研究證實，SLIT2 與 SRGAP1 基因變異情形確實在肺癌形 成過程中（尤其是癌症轉移）扮演一個很重要的角色，其表現變異的 機制可能主要透過啟動子過度甲基化所致，我們的研究是第一篇在癌 組織樣本中，同時探討 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 三者參與癌症形 成的研究。. 2.
(16) 貳. 英文摘要 Background: The SLIT2 gene encodes a membrane-associated glycoprotein, which mediates the repulsive axons migration during neural development. It is frequently altered in lung, breast, and colorectal tumors. However, the comprehensive clinical correlation and molecular study in genes involved in the SLIT2/ROBO1/SRGAP1 pathway have never been examined. Purpose and study design: To investigate the etiological association of the SLIT2, ROBO1, and SRGAP1 alterations in lung cancer and their clinical significance, we detected the alteration of protein and mRNA expressions of SLIT2, ROBO1, and SRGAP1, as well as promoter hypermethylation of SLIT2, ROBO1, and SRGAP1 in 92 primary lung tumors by immunohistochemistry assay, reverse-transcriptase polymerase chain reaction assay, and methylation-specific PCR assay, respectively. In addition, the role of SLIT2 in cancer metastasis was examined in the lung cell model. Results: (1) The frequencies of low protein expression in lung tumors of SLIT2 and ROBO1 were 41.3% (38/92) and 20.1% (19/92), respectively. Low mRNA expression for SLIT2, ROBO1, and SRGAP1 was found in 45% (41/92), 11% (10/92), and 34% (31/92) of lung tumors, 3.
(17) respectively. The promoter hypermethylation of SLIT2, ROBO1 and SRGAP1 was 63% (58/92), 37% (34/92) and 40% (37/92), respectively; (2) High concordances were observed between low protein/mRNA expression and promoter hypermethylation for the SLIT2, ROBO1, and SRGAP1 genes (P < 0.05); and (3) The low mRNA/protein expression of SLIT2 was significantly associated with advance-staged patients (mRNA, P = 0.05; protein, P = 0.003) and distant metastasis (mRNA, P = 0.023; protein, P = 0.013);. (4) We found that SLIT2 mRNA/protein. re-expression and de-methylation along with a decrease in metastasis potential after demethylation reagent 5’-aza -2’-deoxycytidine treatment in lung cancer cell lines (P<0.001). In addition, SLIT2 mRNA/protein loss of expression along with an increase in metastasis potential and a decrease in adhesion potential after knock down SLIT2 gene in lung cancer cell lines were observed (P<0.001). Conclusion: The frequency of alteration in any one protein among the three genes in the SLIT2 pathway was 63% (58/92). Among the three SLIT2 pathway genes, alterations of SLIT2 and SRGAP1 contribute predominantly to lung tumorigenesis. Our data reveal the importance of SLIT2 alteration especially in cancer metastasis.. 4.
(18) 參. 文獻總論 一. 臺灣肺癌的重要性 自 1982 年起，癌症即是國人十大死因之首位，其中肺癌因為難 以早期偵測，因此開刀成功率或化療效性皆不理想，導致死亡率偏高 (1, 2)；又因最近十年來台灣肺癌病人有顯著的增加，因此肺癌已是 國人最嚴重的癌症死亡原因。根據行政院衛生署的最新統計資料顯示 (中華民國九十四年台灣地區死亡原因統計結果，2007 年 5 月登錄)， 肺癌死亡率在女性及男性分別高居癌症死亡的首位及第二位，每十萬 男性人口肺癌死亡率為 44.0 人，女性則為 19.9 人，每年約有 7000 多 人死於肺癌。迄今，肺癌總死亡數已經超越肝癌，躍居國人癌症死亡 原因之首位。. 依照世界衛生組織 (WHO, World Health Organization) 1982 年在 日內瓦所召開的會議，肺癌的組織學分型可分為八大類：(1) 鱗狀上 皮細胞肺癌 (Squamous carcinoma, SQ)、(2) 小細胞肺癌 (Small cell lung cancer, SCLC)、(3) 肺腺癌 (Adenocarcinoma, AD)、(4) 大細胞 肺癌 (Large cell carcinoma, LC)、(5) 腺鱗狀細胞肺癌、(6) 類癌、(7) 支氣管腺瘤及(8)其他肺癌。其中前四者佔了肺惡性腫瘤 95%。. 5.
(19) 就組織型態來看，臺灣以肺腺癌及鱗狀上皮細胞肺癌較多，各約 佔 35-40%；而肺腺癌有日漸增多的趨勢，若有遠端轉移之後才出現 臨床症狀，多由血路轉移，或無吸煙者所罹患肺癌者常為此類。小細 胞肺癌則佔 10-15%，小細胞肺癌及鱗狀上皮細胞肺癌 (亦稱皮樣癌) 與病患長期吸煙有密切的關係，而鱗狀上皮細胞肺癌常見於男性吸煙 者，早期多為局部向外延伸的轉移，後期則經血路擴散。大細胞肺癌 的生長速度較緩慢，會經由血路及淋巴擴散。而在臨床上，因為腫瘤 本身的特性及治療方式及反應的不同，將鱗狀上皮細胞肺癌、肺腺癌 及大細胞肺癌三者歸類為「非小細胞肺癌」(Non-small cell lung cancer, NSCLC) (3)，台灣地區肺癌病人有 80-90%屬於非小細胞肺癌。一般 而言，非小細胞癌的倍增時間 (doubling time) 較長，即癌細胞數目 增加一倍所需要的時間較長。換言之，非小細胞肺癌長得比較慢，預 後也比小細胞肺癌好一些。. 非小細胞肺癌的分期大略可分為第一、二、三 A、三 B 和四期； 第一、二期屬於局部早期發現，第四期為末期已轉移到脊椎骨、腦部、 肝臟、皮膚等遠端組織或重要臟器。非小細胞肺癌治療的原則是依據 其分期之早晚而不同，局部早期以手術切除為原則，第三 B 及第四 期是屬於晚期無法開刀，須依病人身體狀態及意願，接受化學治療及 或放射線治療。 6.
(20) 目前已知，腫瘤的形成牽涉了許多因素，某些環境因子會引發肺 癌形成，如（1）吸煙、二手煙：男性吸煙者罹患肺癌的機會比非吸 煙者高出十倍；至於女性，吸煙者罹患肺癌比非吸煙者患高出五倍； 此外，吸煙次數愈頻繁或吸煙時間愈久，造成肺癌的風險也就愈大 (2)。（2）空氣污染：都市化的衝擊下，空氣污染使肺癌罹患率有上 升的趨勢；若長期處在石綿、油煙氣、工廠煙塵等環境下生活或工作， 或空氣中含有過量的氧化碘、鎳、鉻化物及脂肪族合碳氫化合物等物 質，都是導致肺癌的原因 (4, 5)。（3）肺臟疾病患者：罹患慢性呼吸 道疾病者，如：肺結核、肺纖維化、支氣管擴張症及慢性阻塞性肺疾 病，也是罹患肺癌的高危險群 (6, 7)。此外， （4）放射線也可能導致 肺癌產生 (8, 9)。. 另外，遺傳因子的改變也在肺癌形成過程中扮演重要的角色，部 分是由於基因變異造成，如致癌基因 (Oncogene) 活性過度增加、腫 瘤 抑 制 基 因 (Tumor suppressor gene, TSGs) 失 去 活 性 所 導 致 (10-13)；然而，詳細的分子機制卻尚未完全明瞭，因此研究台灣地區 肺癌發生的真正原因，以期能早期偵測與治療，來降低國人肺癌死亡 率，實為一項刻不容緩的工作。. 7.
(21) 二. 研究背景 目前所知，癌症形成的原因，和致癌基因 (oncogene) 活性過度 增加、或是抑癌基因 (tumor suppressor gene, TSGs) 活性降低有關。 本實驗室的先前研究結果發現許多致癌及抑癌基因都與台灣地區肺 癌形成有關，包括了 p53 抑癌基因, RB 抑癌基因、p16 抑癌基因、K-ras 致癌基因、cyclin-dependent kinase (CDK) 基因、cyclin 細胞週期控制 基因、ERCC1~6、hMSH2、hMSH3、hMLH1、hPMS1、hPMS2 修補 基因等。 此外，在本實驗室先前使用了 177 個微衛星標竿 (Microsatellite marker) 偵 測 71 位 台 灣 非 小 細 胞 肺 癌 病 人 全 基 因 體 異 質 性 喪 失 (Genome-wide LOH)，研究結果中發現，屬於 SLIT2 signaling pathway 的 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 三個基因，在其基因座附近的微衛星 標竿 (D4S2397、D3S1285 和 D12S1294) 偵測到的 LOH 頻率分別為 56%、57%和 59%。國外也有實驗室發現，SLIT2、ROBO1 在肺癌病 人發生 LOH 的頻率分別為 43% (14) 和 61% (15)，與本實驗室結果吻 合。有鑒於 SLIT2 基因對於癌症形成的分子機轉有如此密切相關，但 是對於肺癌而言，並無完整分析 SLIT2 pathway 相關基因群的研究， 以及呈現 mRNA 和 protein 資料的文獻，因此本研究計畫冀望建立 SLIT2 signaling pathway 中三個成員- SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 參與 8.
(22) 台灣肺癌形成之機制和角色，並瞭解其作為肺癌早期偵測或預後指標 的可能性。. 三. SLIT2 signaling pathway 在神經軸索移動、細胞遷徙所 扮演的角色以及 SLIT2 與癌症的關係 自從在果蠅發現了 SLIT2 (slit homolog 2 Drosophila) 這個基因以 來 (16)，許多針對此基因的研究絡繹不絕，它被證實在神經系統發 育過程中，具有會阻止神經軸索移動的能力，也就是可以控制軸突生 長以及導引延伸其方向，做為一個軸突導向分子 (axon guidance molecule, AGM) (17) ； 此 外 它 更 參 與 神 經 細 胞 的 遷 徙 (neuronal migration) (18, 19)，主要目的是避免神經軸突在發育時跨過體軸中線 後形成紊亂的迴旋。另外除了在神經組織表現之外，SLIT2 也在肺臟、 心臟、腎臟和乳房等非神經組織有表現，意味著 SLIT2 尚有其他功 能，如會參與白血球的趨化作用 (leukocyte chemotaxis)、肌肉細胞的 遷徙等 (20)。 上述有關 SLIT2 的功能皆與細胞的遷徙 (cell migration) 相關， 其分子機制已有可信的假設提出:當細胞外分泌性的一種 SLIT2 醣蛋 白作為訊號傳遞分子時，它會與其受器 ROBO1 (Roundabout human homolog 1) 結合，而 ROBO1 是一個細胞膜上的蛋白接受器，當它細 胞外部份接受到 SLIT2 訊號時，它細胞內的區域便會活化下游的蛋白 9.
(23) 質 SRGAP1 (SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1) (21)， SRGAP1 被刺激後會與 CDC42 競爭 GTP 的磷酸根，換言之，會將有 活性 (active form, GTP-binding form) 也就是跟 GTP 結合的 CDC42 轉變成沒有活性 (inactive form, GDP-binding form) 即與 GDP 結合的 CDC42 (22)，CDC42 一旦失去磷酸根便失去活性，即無法驅使細胞 內骨骼 (cytoskeleton) 的聚合，也就無法影響一個細胞的遷徙動作 (23, 24)。所以 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 所引起的訊號傳遞是偏向 抑制細胞遷徙的，不僅方向性的抑制以驅使神經軸突向既定的方向生 長、甚至抑制細胞的移動能力；此外，2006 與 2007 年分別有科學家 發現 SLIT2 蛋白質會影響 medulloblastoma 細胞以及乳癌細胞的轉移 能力 (25, 26)，因此可以推知 SLIT2 訊號傳遞路徑的變異可能與腫瘤 細胞的侵入與轉移有密不可分的關係 (Fig. 1)。 在一次前人的研究實驗中，把大腸癌細胞株培養在含有 SLIT2 蛋 白質的培養基中，或是以轉殖 (transfection) 技術使腫瘤細胞自體產 生並分泌 SLIT2 蛋白。觀察此蛋白對癌細胞生長的影響時，竟發現 SLIT2 會引起癌細胞凋亡 (apoptosis) (27)。目前對於 SLIT2 之所以會 造成細胞凋亡的詳細機制仍不清楚，推測可能是 SLIT2 會觸發其受器 ROBO1 與 netrin-1 的受器 DCC (deleted in colorectal cancer) 做交互作 用；netrin-1 為另一種參與細胞遷徙的細胞外訊號分子。一旦 ROBO1. 10.
(24) 和 DCC 有 interaction 後，DCC 便喪失與 netrin-1 結合的能力 (28)， 這會觸發 apoptotic pathways 中的 caspase 3 和 caspase 9 活性上升因而 導致細胞凋亡 (29)。SLIT2 藉由引起細胞凋亡使癌細胞無法生長，加 上它可能會抑制腫瘤細胞遷徙的能力，因此被認定為抑癌基因。. 四. SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因之結構與功能 SLIT2 位於染色體 4p15.2 位置 (30)，全長 365 kb，共有 37 個 exons，產生一段 1529 個胺基酸之蛋白質，SLIT2 是一個細胞外分泌 性醣蛋白，由 Leucine-rich repeats (LRR)、EGF-like domain、Laminin G (ALPS) domain 和 C 端的 cysteine knot 所構成 (31, 32)。上述的 4 種 區域在其它能引起 protein-protein interaction 的蛋白質中都有存在，因 此推測它們具有蛋白質交互作用的功能 (protein-protein interaction) (Fig. 2A)。其中又以 LRR 區域最為重要，它共有 4 個，前後各被一 段 cysteine 重複序列所包覆，LRR 是用來與它的受器 ROBO1 做結合 以造成由 SLIT2 所觸發的訊號傳遞 (17)。另外，在靠近 C 端具有一 個可被蛋白水解酶切割的地方，可將 SLIT2 蛋白切割成不同長度的片 段，目前推測不同的神經軸突對於不同形式的 SLIT2 可能有其特定的 反應 (33) (Fig. 3A)。 ROBO1 是一個位於細胞膜上的蛋白接受器，它的 mRNA 長約 8. 11.
(25) Kb，含有 30 個 exon，全長 240kb，共可轉譯出 1612 個胺基酸，首 先被發現在果蠅的神經發育中與 SLIT2 一同扮演著嚮導的角色。 ROBO1 位於染色體 3p12 位置 (34) (Fig. 3B)，其蛋白是 SLIT2 的接 受器，具有活化下游成員 SRGAP1 蛋白的能力，為一個穿過細胞膜 (transmembrane) 的 蛋 白 質 。 由 N 端 至 C 端 依 序 排 列 為 5 個 immunoglobulin (IG) domains、3 個 fibronectin type 3 domains、4 個 transmembrane domains 和 4 個 conserved cytoplasmic domains。其中 IG domain 以及 conserved cytoplasmic domain 有蛋白質交互作用的功 能，各別會與 SLIT2 的 LRR domain 和 SRGAP1 的 SH3 domain 結合 (35, 36) (Fig. 2B)。 SRGAP1 位於染色體 12q14.2 位置，全長 299 kb，共有 22 個 exons，產生一段 1085 個胺基酸之蛋白質 (Fig. 3C)，包含了 3 種主要 的區域，分別為 FER/CIP4-homology (FCH) domain、SH3 domain 和 RhoGAP domain (22)。SH3 domain 可以藉由與 ROBO1 的 conserved cytoplasmic domain 作用後接收到上游 SLIT2 和 ROBO1 的訊號再藉 以 RhoGAP domain 去改變 CDC42 活性進而影響細胞遷徙 (21, 22, 37) (Fig. 2C)。. 五. SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因異常情形與癌症形成的 相關性報導 12.
(26) 1. SLIT2 基因異常情形與癌症形成的相關性報導 其它癌症之前人研究結果: 自從發現了 SLIT2 基因有抑癌基因特 性後 (38)，有許多科學家紛紛投入研究這一個基因的工作，他們發 現在許多人類癌症中，SLIT2 基因發生變異情形與其不正常表現往往 與腫瘤形成息息相關，而引發 SLIT2 基因失去活性的原因多為基因大 片段缺失和啟動子過度甲基化，而突變則比較少發生 (Table 1)。 1999 年 美 國 科 學 家 利 用 鄰 近 SLIT2 基 因 的 微 衛 星 標 竿 (Microsatellite marker) 去偵測 16 位 mesothelioma 病人與 44 位乳癌病 人 SLIT2 基因缺失情形，發現 SLIT2 發生 LOH 頻率各為 63%與 57% (14, 39)；2003 年英國研究室利用 Methylation-specific PCR 方法觀察 32 位大腸癌病人與 63 位 gliomas 病人其 SLIT2 基因啟動子甲基化程 度，發現 SLIT2 發生甲基化頻率各為 72%與 59% (27, 40)；2004 年在 英國另一個研究團隊的研究成果中，發現 25%的腎臟癌病人、38%的 Wilms’ tumour 病人與 29%的 neuroblastoma 病人 (41) 其 SLIT2 基因 發生啟動子高度甲基化；2006 年美國科學家在子宮頸癌患者偵測到 10%的 SLIT2 基因異質性缺失 (LOH) 與 64%的 SLIT2 基因啟動子高 度甲基化 (42)。在乳癌研究方面:英國乳癌病人中，43%病人之 SLIT2 基因發生啟動子高度甲基化 (38)；印度乳癌病人中，則有 58%病人 之 SLIT2 基因發生啟動子高度甲基化 (43)。這些研究結果顯示 SLIT2 13.
(27) 基因變異頻率在各種癌症並不相同，甚至相同癌症在不同族群之變異 率也不盡一致，且其基因異質性缺失與啟動子高度甲基化頻率並不符 合。 肺癌相關研究結果: 對於 SLIT2 基因在肺癌方面的研究，主要著 墨在於它的異質性缺失頻率與基因啟動子的甲基化程度，探討是何種 原因導致 SLIT2 基因在許多人類癌症中的不正常表現。或是在癌症細 胞實驗模式中，利用去甲基化藥物 5’-aza-2’-deoxycytidine 來釐清甲基 化 在 癌 症 中 發 現 SLIT2 基 因 不 正 常 表 現 所 扮 演 的 角 色 (27, 38, 40-42)。至於目前其他科學家針對 SLIT2 基因在肺癌方面的研究結果 顯示: SLIT2 在美國小細胞肺癌病人中發現 60%的 LOH 現象，在非小 細胞肺癌病人中則是發現 25%的 LOH 現象 (14)；SLIT2 在英國小細 胞肺癌病人中發現 36%的啟動子甲基化情形，在非小細胞肺癌病人中 則是發現 53%的啟動子甲基化情形 (38)。在 2005 年德國科學家分析 16 位肺癌病人竟然發現到 100% SLIT2 基因啟動子有高度甲基化 (44)。這些結果顯示 SLIT2 基因變異的重要性在二種主要的肺癌：小 細胞肺癌與非小細胞肺癌是不盡相同的，且其基因異質性缺失與啟動 子高度甲基化頻率也有族群的差異性。. 2. ROBO1 基因異常情形與癌症形成的相關性報導. 14.
(28) 其它癌症之前人研究結果: ROBO1 是 SLIT2 位於細胞膜上的訊號接受器，起初是被發現在 果蠅的神經發育中與 SLIT2 一同扮演著嚮導的角色。科學家會開始注 意它，是因為它基因座所在位置 3p12 在各類人類癌症中，皆有高頻 率的基因異質性缺失現象，因此針對 ROBO1 基因與癌症關係的研 究，甚至比 SLIT2 基因來的早。科學家發現，ROBO1 基因座異質性 缺失頻率在各類人類癌症中確實不低，但是 ROBO1 基因啟動子甲基 化情形卻沒有想像中來的嚴重，因此 ROBO1 基因與腫瘤形成的關係 仍需深入探討。 1999 年義大利科學家在 27 位卵巢癌患者中發現 ROBO1 LOH 頻 率達 30% (45)；2000 年另一個義大利研究團隊在 13 位口咽上皮細胞 癌患者中發現 ROBO1 LOH 頻率達 62% (46)；2002 年在 23 位日本口 腔癌患者中發現 ROBO1 LOH 頻率達 13% (47)；同年在頭頸鳞狀細胞 癌研究方面:39 位英國頭頸鳞狀細胞癌病人中，ROBO1 發生 LOH 頻 率為 56% (48)，在 51 位印度頭頸鳞狀細胞癌病人中，ROBO1 發生 LOH 頻率為 38% (49)；2002 年英國科學家針對 44 位腎臟癌病人偵測 其 ROBO1 基因啟動子甲基化程度，發現 18% ROBO1 基因發生啟動 子高度甲基化 (34)。在子宮頸癌研究方面:2006 年美國科學家在子宮 頸癌患者偵測到 7%的 ROBO1 LOH 頻率與 46%的 ROBO1 基因啟動. 15.
(29) 子高度甲基化 (42)；在乳癌研究方面:美國乳癌病人中，ROBO1 LOH 頻率達 35% (50)，而在英國乳癌病人中，19%病人之 ROBO1 啟動子 高度甲基化 (34)。這些結果顯示 ROBO1 基因其基因異質性缺失與啟 動子高度甲基化頻率也有族群及癌症種類的差異性 (Table 2)。 然而，令人意外的是，2006 年德國科學家利用 real-time PCR 檢 測 50 位大腸癌病人 ROBO1 mRNA 表現情形，竟發現 80%病人其 ROBO1 mRNA 有過度表現的現象 (51)；同年日本科學家利用免疫組 織化學染色法也發現 85%的肝癌病人其 ROBO1 蛋白有過度表現 (52)。 肺癌相關研究結果: 對於 ROBO1 基因在肺癌方面的研究，與 SLIT2 基因相同，主要也是著墨在於它的異質性缺失頻率與基因啟動 子的甲基化程度。目前其他科學家針對 ROBO1 基因在肺癌方面的研 究結果顯示：1998 年美國科學家分別在小細胞肺癌與非小細胞肺癌 病人中發現 ROBO1 LOH 頻率達 100% (9/9) 與 36% (15)；2002 年在 英國 26 位非小細胞肺癌病人中僅發現到 4%病人其 ROBO1 基因發生 啟動子高度甲基化 (34)。但目前未有同時檢測肺癌病人 LOH 與啟動 子高度甲基化的報告。. 3. SRGAP1 基因異常情形與癌症形成的相關性報導. 16.
(30) 目前並沒有針對 SRGAP1 基因與癌症做關聯的詳細探討文獻； 2005 年 美 國 科 學 家 利 用 鄰 近 SRGAP1 基 因 的 微 衛 星 標 竿 (Microsatellite marker) 去偵測 58 位 adenoid cystic carcinoma 病人 SRGAP1 基因缺失情形，發現 SRGAP1 發生 LOH 頻率為 43% (53)； 同年在 42 位德國非小細胞肺癌病人則發現 SRGAP1 發生 LOH 頻率為 14% (54)。顯示 SRGAP1 值得做進一步的癌症臨床及基因變異分析研 究 (Table 3)。. 17.
(31) 肆. 研究目標. 本研究主要探討 SLIT2 signaling pathway 成員: SLIT2、ROBO1、 SRGAP1 其變異參與台灣地區非小細胞肺癌形成之機制。 1. 探討台灣地區肺癌病人其 SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 之蛋白表現 異常頻率、mRNA 表現異常與啟動子甲基化的情形，並探討各變 異機制之間的相關性。 2. 探討 SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因變異 [蛋白質表現、mRNA 表現、啟動子甲基化情形] 與肺癌病人臨床病歷資料 [如性別、 年齡、抽菸習慣、癌症種類、癌症分期（轉移） 、存活率] 之間的 相關性。 3. 將細胞株已去甲基化藥物 5’-Aza-2’-dC (5’-Aza-2’-deoxycytidine) 處理，以研究 SLIT2 的蛋白質、mRNA 表現變化與甲基化改變情 形；並觀察對於細胞型態與移動能力的影響。 4. 以 RNAi 策略 knock down 肺癌細胞株之 SLIT2 基因，以研究 SLIT2 的蛋白質及 mRNA 表現變化；並觀察對於細胞型態與移動能力的 影響。 上述四項研究，將可建立 SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因/蛋白變異 參與台灣地區肺癌形成機制，並了解其作為肺癌分子偵測的可能性。. 18.
(32) 伍. 方法總論 一. 研究材料 1. 檢體來源及病歷資料 92 個 肺 癌 檢 體 ， 多 屬 於 非 小 細 胞 肺 癌 (non small cell lung cancer，NSCLC)，來自台北榮總胸腔外科及病理部，56 個是肺腺癌 (adenocarcinoma, AD) 病人，22 個是鳞狀上皮細胞癌 (squamous carcinoma, SQ) 病人，少部分為 AD、SQ 混合型或大細胞肺癌 (Large cell carcinoma, LC)。肺癌種類以及期數是根據世界衛生組織 (WHO) 分類方法及 TNM system (T=Primary Tumor；N=Regional Lymph Node；M=Distant Metastasis) 所分類。病歷資料尚包括病人的抽煙狀 態：分為吸煙及沒吸煙，前者包含目前仍吸煙及戒煙兩群人。. 2. 肺癌細胞株 肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5 培養在 37oC、5% CO2 培養箱中；培 養基 DMEM 內包含 10% fetal bovine serum (GIBCO BRL, Life Technology, USA) 及 1% 抗生素 (penicillin-streptomycin, GIBCO)。. 二. SLIT2 與 ROBO1 蛋白表現分析 19.
(33) 1. 免疫組織染色分析 (Immunohistochemistry assay, IHC) 92 個病人樣本經福馬林浸潤，包埋在石蠟的 5μm 的肺癌組織切 片，經 xylene 脫蠟及酒精復水後，用一級抗體 (稀釋濃度、反應時間 及廠牌見 Table 4)偵測蛋白表現，再使用 Biotinylated 二級抗體 (DAKO LSAB kit K0675, DAKO, Carpinteria, CA, USA)和一級抗體結 合，再接以 streptavidin-horseradish peroxidase，此過氧化氫酵素會與 3-amino-9-ethylcarbazole containing hydrogen peroxide 、 DAB 及 Substrate-Chromogen 受質反應而呈色，使染色具有放大的效果，最後 切片再經 hematoxylin (DAKO)染色，使背景呈色，即以 mounting solution (ZYMED, San Francisco, CA, USA) 進行封片。. 2. 染色切片之判讀標準 染色後的判讀標準：(a) 在癌組織中，細胞質膜沒有紅褐色反應， 但其周圍之正常細胞，細胞質膜有紅褐色反應 (internal control)，則 稱為陰性表現 (negative expression)；(b) 在癌組織中，細胞質膜有紅 褐色反應，則為陽性表現 (positive expression)。經由台北榮總病理科 李芬瑤大夫輔助判讀後，再與其他實驗資料做一比對，所訂定出的判 讀標準為： SLIT2： 為細胞膜外分泌性蛋白，主要染色區域在細胞質與細胞膜，. 20.
(34) 依照組織切片染色強度分為四個等級:弱、中、強、極強。 若染色強度屬於弱與中等且整張組織切片<40%癌細胞質、 膜有紅褐色反應，則歸為 SLIT2 低度表達病人；染色強度屬 於強與極強且整張組織切片>40%癌細胞有紅褐色反應，則 歸為正常表達病人。 ROBO1：為膜蛋白，主要染色區域在細胞質與細胞膜。若染色強度 屬於弱與中等且整張組織切片<40%癌細胞質、膜有紅褐色 反應，則歸為 ROBO1 低度表達病人；染色強度屬於強與極 強且整張組織切片>40%癌細胞有紅褐色反應，則歸為正常 表達病人。. 三. SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因 mRNA 分析 1. mRNA 萃取 92 個癌組織樣本經外科手術切除癌組織塊及鄰近正常組織塊之 後，以液態氮急速冷凍，mRNA 的萃取則是將組織塊由液態氮取出搗 碎磨成粉之後，利用 TRIZOL 溶液 (GIBCO)、chloroform 與 isopropanol 進行萃取，再以酒精沉澱的步驟純化出 RNA，存放在-80oC 冰箱中保 存備用；而 RNA 的濃度及純度則分別以吸光值 A260 及 A260/280 的比值 (1.8~2.0) 推算出來。 21.
(35) 2. 反 轉 錄 - 聚 合 酵 素 連 鎖 反 應 (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 由病人之正常細胞與肺癌組織塊所萃取出之 mRNA，經反轉錄酵 素反應 (Reverse transcriptase reaction, RT)後製成 cDNA，其過程為： 總反應體積為 20 ul，包括 50 unit 之 SuperSCRIPTTM 反轉錄酵素 (GIBCO)、4 ul 的 5 倍緩衝溶液、2.5 ug 之 RNA、0.2 ug 之 oligo dT 引子和 0.1mM 之 dNTP。此反應物於 70oC 加熱 10 分鐘後，置於 42oC 反應 50 分鐘，再以 70oC 加熱 10 分鐘，最後加入 80 ul 去離子水 (ddH2O)，保存於-20oC 冰箱備用。SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因 mRNA 表現程度即是以 cDNA 進行 PCR，並佐以 GAPDH 基因之 mRNA 表 現程度做為 internal control，其值當作此檢體基因表現的基準值，來 計算所欲偵測基因片段的基因表現相對值，再算出所欲偵測之基因其 cDNA 表現量，藉此偵測 SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因 mRNA 表現 情形。PCR 產物總體積為 25 ul，其中包含 1 ul cDNA、2.5 ul 10xPCR 緩衝液 (Takara)、2 ul 0.2mM dNTP、1 ul 10 pmol PCR 引子、0.2 ul Taq (Takara) 與 18.3 ul ddH2O，PCR 引子設計 (Table 5) 和反應條件如下： SLIT2-cDNA：95oC 5 分鐘將雙股 DNA 打開，接下來做下列步驟 35 個循環：Denature 溫度 95oC 30 秒，引子黏合溫度 (Tm 值) 63oC 30 秒，Extension 溫度 72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 22.
(36) ROBO1-cDNA：95oC 5 分鐘，再經 37 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 65oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 SRGAP1-cDNA：95oC 5 分鐘，再經 37 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 55oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 GAPDH-cDNA：95oC 5 分鐘，再經 31 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 60oC 30 秒、72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 反應完成之 PCR 產物以 2%洋菜膠進行電泳，並以 ethidium bromide 染色 10 分鐘，最後以紫外光顯影照相分析儀定出 cDNA 強 度之 Integrated Density Value (IDV 值)。. 3. 判讀標準 每個檢體之正常細胞和肺癌細胞的 SLIT2 、 ROBO1 、 SRGAP1 cDNA 強度 (IDV 值)，以 GAPDH cDNA 強度(IDV 值) 校正後，再將 肺癌細胞與正常細胞相比，若相比之後，肺癌細胞/正常細胞之值小 於 0.5，則判定 mRNA 表現為低度表達；肺癌細胞/正常細胞之值大 於 2，則判定 mRNA 表現為過度表達 (55)。. 四. SLIT2、ROBO1、SRGAP1 基因啟動子高度甲基化分析 1. DNA 萃取 23.
(37) 92 個肺癌組織樣本之組織塊及鄰近正常組織，在液態氮中分別 搗碎磨成粉後，加入 lysis 緩衝液 (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.4%SDS and 0.4mg/ml proteinase K)，水浴 56oC，2-3 小 時後，以 phenol-chloroform 萃取出上清液。再加入 RNase (40µg/ml)， 56oC，45 分鐘；proteinase K (0.2 mg/ml) 及 SDS (0.1%)，56oC，45 分鐘後，利用 phenol-chloroform 以及酒精沉澱的步驟純化出 DNA 溶 液，存放在-20oC 冰箱中保存備用。. 2. Methylation-specific PCR assay, MSP 將 DNA 用 sodium bisulfite 處理 18 小時之後，若此 DNA 之 CpG islands 沒有甲基化，則 cytosines 便會轉變為 uracil，反之，若此 DNA 之 CpG islands 有甲基化的話，則 cytosines 便不會轉變為 uracil；因 此，經過 sodium bisulfite 處理的甲基化與未甲基化之 DNA 序列是不 同的，利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，以 判讀啟動子是否有高度甲基化的情形。PCR 產物總體積為 25 ul，其 中包含 3 ul DNA，2.5 ul Gold 10xPCR 緩衝液，2.5 ul 2.5mM 的 MgCl2，2 ul 2.5 mM dNTP，1 ul 10 pmol PCR 引子、0.2 ul 的 AmpliTaq polymerase (Perkin Elmer, Branchburg, NJ)與 13.8 ul ddH2O，PCR 引子 設計 (Table 5) 和反應條件如下：. 24.
(38) SLIT2-methyl-U：95oC 10 分鐘，再經 33 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 62oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 SLIT2-methyl-M：95oC 10 分鐘，再經 36 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 68oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 ROBO1-methyl-U：95oC 10 分鐘，再經 41 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 63oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 ROBO1-methyl-M：95oC 10 分鐘，再經 41 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 63oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 SRGAP1-methyl-U：95oC 10 分鐘，再經 40 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 60oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 SRGAP1-methyl-M：95oC 10 分鐘，再經 40 個循環：95oC 30 秒、Tm 值 65oC 30 秒，72oC 30 秒，最後 72oC 10 分鐘結束反應。 反應完成之 PCR 產物以 2%洋菜膠進行電泳，並以 ethidium bromide 染色 10 分鐘，最後以紫外光顯影照相分析儀照相分析。. 3. 判讀標準 若在設計增量有甲基化之引子得到 PCR 產物，則判定此病人啟 動子有甲基化情形發生 (56)。. 25.
(39) 五 . 細 胞 處 以 去 甲 基 化 藥 物 5’-aza-2’-deoxycytidine (5'-Aza-2'-dC) 之相關分析 1. 細胞培養 將肺癌細胞株 CL1-5 以培養基 DMEM 培養於 37oC、5%CO2 培 養箱中；細胞株以倒立式顯微鏡觀察，當細胞長滿為單層 (monolayer) 時，即可進行繼代培養 (subculture)。在無菌操作台 (laminar flow) 內，以抽氣機吸去上層液，再以 5 ml phosphate-緩衝液 ed saline (PBS) 清洗細胞兩次，吸去 PBS 並加 1 倍 trypsin-EDTA 1ml，前後左右搖晃 培養皿使 trypsin 均勻分散於細胞層，並置於培養箱中約 2~3 分鐘後， 搖晃培養皿同時以倒立式顯微鏡觀察，待細胞層脫落並浮起時，取適 當比例的細胞於新的培養基中 (總體積 8ml)，以十字型搖散細胞，培 養在 37oC，5% CO2 培養箱中；待 2-3 天細胞株長滿培養皿後，即可 再行繼代培養。. 2. 細胞加藥處理 本研究以去甲基化藥物 5'-Aza-2'-dC 處理肺癌細胞株 CL1-5。於 加藥的前一天取 1x106 細胞種於 10cm 細胞培養基中培養，隔天加入 5μM 的去甲基化藥物 5’-Aza-2’-dC 處理細胞，之後在繼代培養時同時 加入 5μM 的去甲基化藥物 5’-Aza-2’-dC 處理細胞至少 3 細胞代數 26.
(40) (cell doubling)。處理指定時間七天後，每盤細胞分別抽出 RNA 及 DNA 以做分析，或整盤細胞來做免疫細胞染色與細胞爬行能力分析。. 3. 細胞株蛋白免疫細胞染色分析 (Immunocytochemistry assay, ICC) 將細胞株 CL1-5 之培養皿，以 5 ml PBS 清洗細胞兩次，吸去 PBS 並加 1% formaldehyde 固定細胞 20 分鐘，待其風乾但仍濕潤狀態下加 入 SLIT2 primary antibody (稀釋濃度 1:1000、反應時間室溫 1hr)，以 偵測蛋白表現，接下來在避光條件下使用螢光二次抗體 (CHEMICON, Temecula, CA)與 DAPI (4’,6-Diamidino-2- phenylindole dihydrochloride) (CHEMICON) 處理細胞 30 分鐘，再以 PBS 浸潤細 胞直接以螢光顯微鏡觀察。螢光二次抗體目的為放大蛋白偵測訊號， 在螢光顯微鏡下呈現紅色螢光，DAPI 則是辨認細胞核所在，在螢光 顯微鏡下呈現藍色螢光。. 4. 細胞株DNA及mRNA的抽取、定量及分析 使用QIAamp DNA Mini Kit 抽取細胞株的DNA，首先將培養皿 上的DMEM吸乾，拿刮杓將細胞刮至乾淨的eppendorf中，加入20μl Proteinase K及200μl 緩衝液 AL，水浴56oC，10分鐘後加入200μl 99.9%酒精，將所有檢體放入QIAamp spin column，離心8000 rpm 1分 27.
(41) 鐘，之後再分別加入500μl緩衝液AW1及AW2，離心後，需將column 下收集管內的緩衝液移除，最後將QIAamp spin column置於乾淨的 eppendorf 上，並加入200μl 緩衝液 AE於室溫下1分鐘，離心、收集 DNA定量備用。 細胞株 CL1-5 DNA 分析採用 MSP 方法，與「方法四」中基因啟 動子高度甲基化分析相同。至於細胞株 CL1-5 mRNA 的抽取、定量 及 RT-PCR 方法則與「方法三」中基因 mRNA 分析相同。. 5. 細胞株爬行能力分析 (Transwell assay) 分別以 trypsin 與含有 10% FBS 培養基 DMEM 打散並中和培養 皿內的細胞株 CL1-5 後，4oC 低速離心 5 分鐘，再以 Serum-Free DMEM 洗去 Serum，開始計數細胞並以 Serum-Free DMEM 稀釋細胞。將 1x105 細胞種於 12-well cassette 上層 chamber，並加入 1ml Serum-Free DMEM，而下層 chamber 加入 2ml 含有 10% FBS DMEM，將 transwell cassette 放入 37oC、5%CO2 培養箱中培養 16 至 24 小時後，去除上下 兩 層 培 養 液 ， 以 1ml PBS 清 洗 下 層 chamber 兩 次 ， 再 以 1% formaldehyde 固定細胞 10 分鐘，最後以 0.1% crystal violet 染色 20 分 鐘並以一次水退染，至抽風櫃風乾後，以光學顯微鏡觀察從上層 chamber 底部通透膜上方爬行到通透膜下方的細胞數目並做定量。. 28.
(42) 六. 以 RNAi (RNA interference) 策略將細胞株之 SLIT2 knock down 相關分析 1. 細胞培養 肺癌細胞株 CL1-0 培養方法與「方法五」之 1. 細胞培養相同。. 2. 細胞株基因 knock down 處理 將含有特定 shRNA 序列的 pGIPZ 質體 (標的基因為 SLIT2) 以 E.coli 少量製備(Mini-prep)，製備步驟為:先將菌液抹盤培養 16 小時 後，挑選數個 clone 至新的培養液當做 library，並用 Ampicillin 做為 bacterial selectable marker 在 37oC、200rpm 震盪條件下培養 16 小時。 每個 clone 取微量，利用 High-Speed Plasmid Mini Kit 來抽 Mini，首 先依序加入 PD1、PD2 與 PD3 緩衝液混合均勻後，以高速離心 3 分 鐘，取上清液至 PD column 離心 1 分鐘，去下層液，依序加入 W1 與 Wash 緩衝液，離心後，需將下收集管內的緩衝液移除，最後將 column 置於乾淨的 eppendorf 上，並加入 ddH2O 於室溫下 2 分鐘，離心、收 集 plasmid DNA 備用。收集來的 plasmid DNA 取適量送定序並做限 制酶切割以確定質體的正確性。 質體確認無誤後，開始大量製備 (Midi-prep)，首先將 library 上 的 clone 刮下加入內有 50ml TB broth (含 Ampicillin) 的錐形瓶混合均 29.
(43) 勻後，在 37oC、低速震盪條件下培養 16 至 18 小時。並用 Geneaid Plasmid Midi Kit 抽 Midi，首先將菌液移到專用離心管中，離心後去 上清液，依序加入 PM1、PM2 與 PM3 緩衝液混合均勻後，以 4oC 高 速離心 20 分鐘後，取上清液到 Plasmid-Midi column，依序加入 PW 緩 衝液、PEL 緩衝液、isopropanol 與酒精並高速離心來清洗、沉澱、 純化並收集 Plasmid DNA，最後移除酒精後待 DNA 乾燥至透明，以 ddH2O 回溶並測其濃度備用。 將質體以 kit 中的 transfection reagent 送入細胞中。培養經過 48 小時後，開始以 Puromycin (Mammalian selectable marker)篩選細胞五 天後，待細胞長滿，每盤細胞便可抽出 RNA，或整盤細胞來做免疫 細胞染色與細胞爬行能力分析。 RNAi 抑制的對照組使用不具抑制特定基因功能之 pGIPZ 質體， 以與實驗組相同的方式送入細胞中。. 3. 細胞株蛋白免疫細胞染色分析 (ICC) 細胞株 CL1-0 SLIT2 蛋白表現分析方法與「方法五」之 3. 細胞 株蛋白免疫細胞染色分析相同。. 4. 細胞株mRNA的抽取、定量及分析 細胞株 CL1-0 mRNA 的抽取、定量及 RT-PCR 方法與「方法三」 30.
(44) 中基因 mRNA 分析相同。. 5. 細胞株爬行能力分析 (Wound Healing assay) 將 transfection 成功與抗生素篩選過後的 CL1-0 細胞株以 1x105 的數目種在培養皿上，待細胞貼盤後，吸去培養液，在培養皿由上至 下畫一道間隙使細胞分為左右兩邊，續以 PBS 清洗兩次，目的是將 刮下的細胞與其他雜質去除，再加入培養液，放入 37oC、5%CO2 培 養箱中培養。48 小時後以顯微鏡觀察兩側細胞往間隙移動的情形， 藉此定性分析細胞的爬行能力。. 6. 細胞株附著能力分析 (Adhesion assay) 將適量collagen I (以HCl稀釋成100μg/ml) 加入96孔盤存放於4oC 冰箱12至16小時，目的是在in vitro狀態下模擬in vivo中細胞可以貼附 的環境 (collagen I是一種Extra Cellular Matrix, ECM)，再以5% BSA blocking 12至16小時，之後將transfection成功與抗生素篩選過後的 CL1-0細胞用Trypsin打下，並用0.5% FBS/DMEM稀釋後，以1x105的 數目種在96孔盤的每個well上，放入37oC、5%CO2 培養箱中培養4小 時後，依序用0.5% FBS/DMEM清洗兩次、1% formaldehyde固定、0.1% crystal violet染色、二次水清洗兩次後，最後以1% SDS溶解細胞，用. 31.
(45) ELISA reader 測量OD590值，OD590值越大，表示被染色細胞數目越 多，亦表示其細胞附著能力越強。. 七. 統計分析 以分析的結果將病人區分為變異組與正常組，利用 Pearson X2 test， 分析 92 個肺癌病人 SLIT2、ROBO1、SRGAP1 蛋白和 mRNA 異常表 現、啟動子高度甲基化與各種病理分類 (包含年齡、性別、癌症種類、 癌症分期、抽煙狀況) 關係的統計分析。其中癌症分期之 Stage I、II 定義為較早期的病人族群，Stage III、IV 定義為較晚期的病人族群； 而抽煙狀況則分為有抽煙和沒抽煙兩個族群，有抽煙者包含目前仍在 抽煙和已戒煙者。所有分析作業均以 SPSS (11.0 版)軟體進行。. 32.
(46) 陸. 結果 一. 探討台灣地區肺癌病人 SLIT2 基因/蛋白之變異情形 1. SLIT2 蛋白表達情形與病歷資料相關性 利用免疫組織染色法，分析 92 位 NSCLC 病人的癌組織切片之 SLIT2 蛋白表現，染色代表圖見 Figs. 4A-D。實驗結果顯示：在檢驗 的 92 個檢體中，38 人(41.3%) 其癌組織切片之癌細胞的細胞質/細胞 膜呈<40%紅褐色反應，判定為 SLIT2 蛋白無表達或低表達的病人； 另外在病歷資料分析方面，發現 SLIT2 蛋白低表達或不表達的情形， 與病人之性別、抽煙狀況、癌症種類間並無明顯相關性存在 (P>0.05)，但是值得注意的是，在年齡層面，SLIT2 protein 表現降低 情形通常發生在年輕的病人 (P=0.005)；此外，在癌症分期層面， SLIT2 protein 表現降低情形則通常發生在癌症晚期的病人 (P=0.003) (Table 6)。. 2. SLIT2 mRNA 表達情形與病歷資料相關性 利用 RT-PCR 方法，分析 92 位 NSCLC 病人癌組織及其鄰近正常 組織 SLIT2 mRNA 表達情形，引子所夾的區域為 exon 36 與 exon 37， 全長為 387 bp，RT-PCR 代表圖見 Fig. 5A。實驗結果顯示：在檢驗中 33.
(47) 的 92 個檢體中，41 位病人(44.5%) 其癌組織 mRNA 表現比正常細胞 降低一半以上；另外在病歷資料分析方面，發現 SLIT2 mRNA 低表達 或不表達的情形，與病人之年齡、性別、抽煙狀況、癌症種類間並無 明顯相關性存在 (P>0.05)，但是值得注意的是，在癌症分期層面， SLIT2 mRNA 表現降低情形通常發生在癌症晚期的病人 (P=0.05) (Table 6)。. 3. SLIT2 基因啟動子高度甲基化情形與病歷資料相關性 利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，PCR 引子所夾的區域為啟動子－676 至－518 位置，長度為 158 bp，MSP 代表圖見 Fig. 6A。在所分析的 92 位病人中，58 位 (63%)病人的 SLIT2 基因啟動子有過度甲基化情形，另外在病歷資料分析方面，發現 SLIT2 啟動子高度甲基化情形，與病人之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、 癌症分期間並無明顯相關性存在 (P>0.05) (Table 6)。. 4. SLIT2 mRNA、蛋白表達情形、啟動子甲基化與癌症分期 之相關性 由上述 SLIT2 mRNA、蛋白表達情形與病歷資料相關性之分析結 果顯示，在癌症分期層面，不管是 SLIT2 mRNA 表現降低情形還是 SLIT2 蛋白質表現降低情形都可發現通常發生在癌症晚期的病人 34.
(48) (P<0.05)。因此我們更進一步將癌症分期從原本的 I + II 期定義為癌症 早期病人，III + IV 期定義為癌症晚期病人，改為 I、II、III、IV 期各 自獨立分期，來更精確的檢測 SLIT2 變異情形與癌症分期的相關性， 此外，特地加入肺癌病人是否遠端轉移此一病歷資料，也去檢測它與 SLIT2 變異情形的相關性。統計分析後發現，SLIT2 mRNA 表現降低 情形與 SLIT2 protein 表現降低情形隨著癌症分期的演進，其不表達 或低表達情形有越來越嚴重的趨勢，尤其是 SLIT2 protein 不表達或 低表達情形，從 I 期病人的 27.0% (10/37)、II 期病人的 31.3% (5/16)、 III 期病人的 53.1% (17/32)到 IV 期病人的 85.7% (6/7)，達到顯著相關 性 (P=0.01)；此外，值得注意的是，不管是 SLIT2 mRNA 表現降低 情形還是 SLIT2 protein 表現降低情形皆通常發生在有遠端轉移的病 人 (mRNA, P=0.023；protein, P=0.013)，至於 SLIT2 啟動子甲基化情 形與癌症分期與遠端轉移與否並無顯著相關性 (P>0.05) (Table 9)。. 5. SLIT2 mRNA、蛋白不表達與啟動子高度甲基化間之相關 性 分析 SLIT2 mRNA、蛋白不表達以及啟動子高度甲基化之相關性 (Fig. 7A)，發現 mRNA 有表達/蛋白亦有表達，與 mRNA 低表達/蛋白 亦低表達的病人佔全部之 90.2% (83/92)，二者間達顯著相關性. 35.
(49) (P<0.001)，顯示 SLIT2 mRNA 與蛋白表達情形有相當大的一致性； 啟動子甲基化與否和 mRNA 表達情形相符合者佔 62.0% (57/92)，且 達顯著相關 (P=0.008)；至於啟動子甲基化與否和蛋白表達情形，其 相符合者佔 56.5% (52/92)，僅有邊緣統計顯著相關性 (P=0.076)。. 二. 探討台灣地區肺癌病人 ROBO1 基因/蛋白之變異情形 1. ROBO1 蛋白表達情形與病歷資料相關性 利用免疫組織染色法，分析 92 位 NSCLC 病人的癌組織切片之 ROBO1 蛋白表現，染色代表圖見 Figs. 4E-H。實驗結果顯示：在檢 驗的 92 個檢體中，19 人(20.1%) 其癌組織切片之癌細胞的細胞質/細 胞膜呈<40%紅褐色反應，判定為 ROBO1 蛋白無表達或低表達的病 人；另外在病歷資料分析方面，發現 ROBO1 蛋白低表達或不表達的 情形，與病人之性別、抽煙狀況以及癌症分期間並無明顯相關性存在 (P>0.05)；但有趣的是，在年齡層面，發現在年輕的病人中，ROBO1 蛋白質表現降低情形有高於年老病人的趨勢 (P＝0.087)；此外，在癌 症種類層面，可以稍微發現在肺腺癌病人中，ROBO1 蛋白質表現降 低情形有高於鱗狀上皮肺癌病人的趨勢 (P＝0.117) (Table 7)。. 2. ROBO1 mRNA 表達情形與病歷資料相關性. 36.
(50) 利用 RT-PCR 方法，分析 92 位 NSCLC 病人癌組織及其鄰近正常 組織 SLIT2 mRNA 表達情形，引子所夾的區域為 exon 1 至 exon 2， 全長為 362 bp，RT-PCR 代表圖見 Fig. 5B。實驗結果顯示：在檢驗的 92 個檢體中，10 位病人(10.8%) 其癌組織 mRNA 表現比正常細胞降 低一半以上；另外在病歷資料分析方面，發現 ROBO1 mRNA 低表達 或不表達的情形，與病人之年齡、性別、年齡、抽煙狀況、癌症分期 間並無明顯相關性存在 (P>0.05)，但是值得注意的是，在癌症種類層 面，ROBO1 mRNA 表現降低情形通常發生在肺腺癌的病人 (P=0.046) (Table 7)。. 3. ROBO1 基因啟動子高度甲基化情形與病歷資料相關性 利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，PCR 引子所夾的區域為 exon 1，位置 257 至 503，長度為 246 bp，，MSP 代表圖見 Fig. 6B。在所分析的 92 位病人中，34 位 (37.0%) 的 ROBO1 基因啟動子有過度甲基化情形，另外在病歷資料分析方面，發現 ROBO1 啟動子高度甲基化情形，與病人之年齡、性別、抽煙狀況間 並無明顯相關性存在 (P>0.05)，但值得注意的是，在癌症種類層面， 可以稍微發現在肺腺癌病人中，ROBO1 基因啟動子過度甲基化情形 有高於鱗狀上皮肺癌病人的趨勢 (P＝0.073) (Table 7)。. 37.
(51) 4. ROBO1 mRNA、蛋白不表達與啟動子高度甲基化間之相 關性 分析 ROBO1 mRNA、蛋白不表達以及啟動子高度甲基化之相關 性 (Fig. 7B)，發現 mRNA 有表達/蛋白亦有表達，與 mRNA 低表達/ 蛋白亦低表達的病人佔全部之 88.1% (81/92)，二者間達顯著相關性 (P<0.001)，顯示 ROBO1 mRNA 與蛋白表達情形有相當大的一致性； 啟動子甲基化與否和蛋白表達情形相符合者佔 72.8% (67/92)，有達到 顯著相關性 (P<0.001)；而啟動子甲基化與否和 mRNA 表達情形相符 合者佔 67.4% (62/92)，亦達到顯著相關性 (P=0.022)。. 三. 探討台灣地區肺癌病人 SRGAP1 基因/蛋白之變異情形 1. SRGAP1 mRNA 表達情形與病歷資料相關性 利用 RT-PCR 方法，分析 92 位 NSCLC 病人癌組織及其鄰近正常 組織 SRGAP1 mRNA 表達情形，引子所夾的區域為 exon 22，全長為 315 bp，RT-PCR 代表圖見 Fig. 5C。實驗結果顯示：在檢驗中的 92 個檢體中，31 位病人(33.7%) 其癌組織 mRNA 表現比正常細胞降低 一半以上；另外在病歷資料分析方面，發現 SRGAP1 mRNA 低表達 或不表達的情形，與病人之年齡、性別、抽煙狀況、癌症種類、癌症 分期間並無明顯相關性存在 (P>0.05) (Table 8)。 38.
(52) 2. SRGAP1 基因啟動子高度甲基化情形與病歷資料相關性 利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，PCR 引子所夾的區域為啟動子－813 至－690 位置，長度為 123 bp，MSP 代表圖見 Fig. 6C。在所分析的 92 位病人中，37 位 (40.2%) 的 SRGAP1 基因啟動子有過度甲基化情形，另外在病歷資料分析方面，發現 SRGAP1 啟動子高度甲基化情形，與病人之年齡、癌症種類、癌症分 期間並無明顯相關性存在 (P>0.05)，但值得注意的是，在性別層面， 可以發現在女性族群病人中，SRGAP1 基因啟動子過度甲基化情形有 高於男性族群病人 (P＝0.011)；此外，在抽煙狀況層面，可以發現在 非吸煙族群病人中，SRGAP1 基因啟動子過度甲基化情形有高於吸煙 族群病人 (P＝0.008) (Table 8)。. 3. SRGAP1 mRNA 與啟動子高度甲基化間之相關性 分析 SRGAP1 mRNA 與啟動子高度甲基化之相關性 (Fig. 7C)， 啟動子甲基化與否和 mRNA 表達情形相符合者佔 63.0% (58/92)，且 達顯著相關 (P=0.041)。. 4. SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 基因任一表達變異與病歷資料 之相關性. 39.
(53) 文獻中報導，SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 有直接的交互作用關 係，意即三者屬同一訊息傳導路徑的成員 (21, 22)。因此我們推想， 若是三者間任一者發生變異，可能就會導致整體訊息傳導路徑的失 常，進而影響下游路徑的蛋白，因此特地統計分析 SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 三基因若任一基因蛋白質不表達或低表達就判定為不表 達或低表達之時 (SRGAP1 蛋白表現以 mRNA 計算)，此聯合低表達 率達 63.0% (58/92) (Table 10)；其蛋白質表達情形與病歷資料相關 性，統計結果顯示：三基因之聯合分析，其蛋白質表現降低情形與病 人之性別、抽煙狀況、癌症種類間並無明顯相關性存在 (P>0.05)， 但值得注意的是，在病人年齡層面，可以稍微發現在年輕族群病人 中，三基因聯合分析之蛋白質表現降低情形有高於年長族群病人的趨 勢 (P＝0.059)；此外，在癌症分期層面，可以發現在癌症晚期病人中， 三基因聯合分析之蛋白質表現降低情形有高於癌症早期病人的趨勢 (P＝0.136) (Table 10)。. 四. 細胞以去甲基化藥物 5’-aza-2’-deoxycytidine 之處理結 果 1. model cell 的篩選 文獻中報導，SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 蛋白質所參與的 SLIT2 40.
(54) signaling pathway 其訊號傳遞路徑與細胞的遷徙、移動能力有密不可 分的關係，此外，上述段落探討台灣地區肺癌病人 SLIT2 基因/蛋白 之變異情形部份，實驗結果顯示 SLIT2 變異情形與肺癌轉移也有密切 的相關性；而且上述 DNA 甲基化與 mRNA/蛋白質低表現的高度相關 性，使我們推測啟動子過度甲基化可能是導致 SLIT2 、 ROBO1 與 SRGAP1 基因不表現的主要機制。因此我們想以細胞模式去探討高移 動能力的肺癌細胞株是否真的代表 SLIT2 啟動子過度甲基化導致 mRNA 甚至是蛋白質表現降低，而低移動能力的肺癌細胞株則代表 SLIT2 啟動子無過度甲基化，因此 mRNA 與蛋白質表現可以正常表 現。 首先本研究先篩選適當的模式細胞進行去甲基化分析及轉移能 力分析。利用 RT-PCR 方法，分析 IMR90、CL1-0、CL1-1、CL1-5、 H647、A549、H1435 與 H1437 八株細胞株其 SLIT2 mRNA 表達情形， RT-PCR 代表圖見 Fig. 8A。實驗結果顯示：IMR90、CL1-0、CL1-1 與 H647 四株細胞株其 SLIT2 mRNA 表現正常，而 CL1-5、A549、H1435 與 H1437 四株細胞株其 SLIT2 mRNA 表現有不表達或低表達的情 形；亦利用 MSP 方法，檢測 IMR90、CL1-0、CL1-5、H647、A549 與 H1437 六株細胞株其 SLIT2 基因啟動子甲基化情形，MSP 代表圖 見 Fig. 8B。實驗結果顯示：IMR90 與 H647 兩株細胞株其 SLIT2 基因. 41.
(55) 啟動子沒有甲基化的情形，CL1-5、A549 與 H1437 三株細胞株其 SLIT2 基因啟動子有過度甲基化的情形，而 CL1-0 細胞株其 SLIT2 基因啟動 子則是有部份甲基化的情形。此外，CL1-0 與 CL1-5 兩株細胞株，前 者為移動能力低而後者為移動能力高的細胞株，SLIT2 基因/蛋白變異 情形亦符合我們預期，因此本研究挑選 CL1-0 與 CL1-5 此兩株細胞 株作為我們細胞模式實驗的 model cell。. 2. 5’-aza-2’-deoxycytidine 對 SLIT2 基因/蛋白表現與細胞爬 行能力之影響 5’-aza-2’-deoxycytidine (5’-Aza-2’-dC)為 cytosine 的類似物，在細 胞進行複製時，會鑲嵌到 DNA 中取代 cytosine，並且與 DNA 甲基轉 移酵素形成共價鍵結，阻斷其甲基化的能力，因此隨著 DNA 進行複 製的過程中，DNA 組成中的 cytosine 其甲基化現象會慢慢的趨緩， 達到去甲基化的效果 (57)。我們將 CL1-5 細胞株處理 5’-Aza-2’-dC 後，觀察當 SLIT2 基因啟動子去甲基化之後，對 SLIT2 基因的 mRNA、 蛋白質的表現與 CL1-5 細胞株爬行能力的影響，研究結果顯示：當細 胞處以 5’-Aza-2’-dC 之後，會使 CL1-5 細胞株的 SLIT2 基因啟動子去 甲基化 (Fig. 9A)、SLIT2 mRNA 表現量上升 (Fig. 9B)、蛋白質表現 量上升 (Fig. 9C) 以及 CL1-5 細胞株爬行能力大大降低 (P < 0.001). 42.
(56) (Fig. 9D)。因此我們推論：SLIT2 基因啟動子甲基化確實會對其 mRNA、蛋白質造成低表現的影響與細胞爬行能力造成上升的影響。. 五. RNAi 處理原先有 SLIT2 表現細胞株 CL1-0 之實驗結果 5’-Aza-2’-dC 的處理會造成整體基因組的影響，也就是說，可能 SLIT2 以外的許多基因啟動子有被去甲基化的情形，因此我們採用更 能專一性的將 SLIT2 基因 knock down 的實驗方法：RNA 干擾 (RNA interference, RNAi)，我們將 CL1-0 細胞株以 RNAi 方式 knock down SLIT2 基因後，觀察 SLIT2 基因的 mRNA、蛋白質的表現與 CL1-0 細 胞株爬行能力的影響，研究結果顯示：當細胞以 RNAi 方式 knock down SLIT2 基因之後，會使 CL1-0 細胞株的 SLIT2 mRNA 表現量下 降 (Fig. 10A)、蛋白質表現量下降 (Fig. 10B) 以及 CL1-0 細胞株爬行 能力大大提高 (Fig. 10C)、附著能力顯著降低 (P < 0.001) (Fig. 10D)。因此我們推論：SLIT2 mRNA、蛋白質的表現的確與細胞爬行 能力甚至是細胞附著能力有密不可分的關係。. 43.
(57) 柒. 討論 癌症的形成，通常由致癌基因與腫瘤抑制基因所主導，一旦發生 了致癌基因的突變引發致癌基因蛋白過度表現，或是抑癌基因的功能 喪失，都可能是造成腫瘤形成的主因。其中抑癌基因變異的原因包含 了突變、基因大片段缺失、以及屬於表遺傳 (epigenetic) 變異的啟動 子過度甲基化。此外，尤其是肺癌難以早期偵測、開刀成功率或化療 成效皆不理想，導致預後情形不佳或死亡率偏高，又鑒於肺是一個會 直接接觸空氣中物質的臟器，空氣污染物質容易進入肺臟，加上許多 肺癌患者有抽煙或接觸環境中致癌因子，都有可能造成肺細胞發生基 因變異，導致形成癌症的機率與風險變高，所以肺癌之分子致癌機轉 研究是刻不容緩的。. 自從相繼發現 SLIT2 和 ROBO1 基因以來 (16, 30, 34)，許多科學 家致力於探討它們訊息傳遞路徑所扮演的角色，一般認為 SLIT2 和 ROBO1 這二個基因與其下游成員 SRGAP1 參與了軸突生長與分支的 調控、細胞的遷徙、細胞的生長甚至是細胞凋亡 (18, 20-24)。而 SLIT2 蛋白質屬於細胞外分泌性的醣蛋白，與它的細胞膜上之接受器 ROBO1 結合後啟動下游的訊號傳遞，然而至於 SLIT2 蛋白質的作用 機制是屬於自體作用 (autocrine) 亦或是旁分泌作用 (paracrine) 目. 44.
(58) 前尚未明瞭，仍需要進一步的研究來釐清。此外，在癌症研究方面， 目前已證實在眾多腫瘤型態都發現位於染色體 4p15.2 的 SLIT2 基因 有啟動子過度甲基化的現象 (27, 38, 40-44)，亦或是包含 4p15.2、 3p12、12q14.2 區位 (各為 SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 基因座所在區 域) 的染色體有高頻率 LOH 情形發生 (14, 15, 39, 42, 45-50, 53, 54)。 由於它們在細胞生理中扮演多重角色，並且已有文獻報導它們在人類 癌症中都有變異的情形，因此研究 SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 三個 基因在肺癌患者中的變異情形，是非常重要之課題。. 儘管已有不少文獻針對 SLIT2 和 ROBO1 基因各別去偵測不同癌 症類型中它們啟動子甲基化情形與 LOH 頻率，但不是組織樣本庫數 目不足就是研究重點著墨在細胞株方面的實驗；再者，在大量癌組織 樣本中觀察蛋白質與 mRNA 的變異情形也鮮少探討；此外，研究 SRGAP1 與癌症關係的文獻亦附之闕如。因此本研究利用大量癌組織 樣本同時針對 SLIT2、ROBO1 與 SRGAP1 三個基因探討其 DNA、 mRNA 與蛋白質層面變異情形，做一個綜合的分析。本研究共分析了 92 位台灣地區非小細胞肺癌的病人檢體，進行 SLIT2 訊號傳導路徑 三個重要成員: SLIT2、ROBO1 和 SRGAP1 的研究。. 在 SLIT2 蛋白質分析層面，92 位病人當中，有 38 人 (41.3%) 的. 45.
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