用4
毫升的10毫克reduced glutathione/10
毫升elution buffer），再通入6
毫升的elution buffer
（elution buffer：
50 mM Tris-Base，pH 8.0，要使用前取出10 毫升外加100毫克reduced glutathione）至管柱，以微量離心管收集溶離液。
最後再以
Regeneration buffers清洗GST tag ‧ 管柱
；40毫升Buffer 1（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），接著以40毫升Buffer 2（0.1 M Sodium acetate，0.5 M NaCl，pH 4.5），再以20毫升Buffer 3（140 mM NaCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.5），最後將管柱內溶液置換成20%乙醇，上下蓋外包覆paraffin，保存於4℃冰箱。接著以SDS-PAGE分析收集到的蛋 白質
的純度 (1, 36, 44)。
西方轉印免疫法
將蛋白質經由SDS-PAGE分離，以轉印緩衝液（39 mM glycine，48 mM Tris base，0.037％SDS）轉印到纖維膜上，然後將纖維膜（PVDF）浸泡於含 有5％ skim milk的PBS中，置於4℃搖晃兩小時，用PBST沖洗二次、PBS沖洗 一次，再加入稀釋1000倍的anti-GST，用PBST沖洗二次、PBS沖洗一次，加 入稀釋5000倍的anti-mouse AP，在室溫搖晃30分鐘，以PBST 沖洗二次、PBS 沖洗一次後，纖維膜浸入加有NBT和BCIP的冰鹼性磷酸緩衝液（100 mM
NaCl，5 mM MgCl2，100 mM Tris-HCl pH 9.5）中進行呈色。
結果
rstA 或 rstB 的基因缺損不影響細菌的生長
如圖一所示，克雷白氏肺炎桿菌 rstA/rstB 上下游基因組成的不同，可能 暗示著其有不同的功能，所以在這裡我們分別建構 rstA 或 rstB 缺損株。建構 的方法為將基因缺損的片段建構於質體後，利用同源互換的方式與野生株做 交換，再以電泳分別確認 rstA（圖二 A）及 rstB 缺損株（圖二 B）。在此挑 選出的 rstA 及 rstB 缺損株於外觀上和野生株無區別，為了解基因缺損是否對 菌株的生長有所影響，我們分別測試菌株於營養充分的 LB 培養液以及僅供 應最低營養生長需求的 M9 培養液中，觀察缺損株在生長上是否會受影響，
由實驗的結果顯示 rstA 或 rstB 缺損株在此兩種培養液中生長情形和野生株相 比無差異（圖三）。
大量表現 RstA 使大腸桿菌對 cefotaxime 抗性稍為變大
我們以實驗室現有不同藥物濾紙錠，分析 RstA 是否與抗藥性有關，圖 四 A 顯示不論野生株、rstA 缺損株、rstA 互補株，都對這些抗生素的感受性 無明顯差異。另一方面，rstB 基因缺損也不影響其對抗生素的感受性（圖四 B）。而 cefotaxime 在大量表現 RstA 於大腸桿菌，相較於僅含 N 端 RstA 片 段的菌株感受性較大（45.2 mm vs. 36.6 mm），其他藥物則沒有明顯的差異
（圖五）。
RstA 和 RstB 會參予 asr 啟動子的活性表現
Ogasawara 等人發現：在大腸桿菌裡，RstA 能調控和抗酸有關 asr 基因 的表現。如圖六 A 所示，克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中也含有 asr 基因，並於 其啟動子區域有比對到 RstA 鍵結辨認序列（圖六 B）。因此我們將 asr 可能 的啟動子區域建構於 pLacZ15（圖七 A），藉由偵測 LacZ 活性的表現來看 asr 啟動子是否會受到 RstA 所調控。由圖七 B 顯示，在 pH 7.0 LPM 中，不
論是野生株或 rstA 缺損株，asr 啟動子活性表現量都很低。然而相對的，在 pH 4.6 LPM 中，野生株裡 asr 啟動子活性表現量高達 5000 miller units，而在 rstA 缺損株裡 ，asr 啟動子活性表現量僅 250 miller units。由於 rstA 基因缺損
後， asr 啟動子活性明顯減少，我們進一步想了解 rstB 基因的缺損是否也會 影響 asr 啟動子的活性表現。因此偵測 rstB 基因缺損下，asr 啟動子的活性表 現，由圖七 C 結果顯示，不論 rstA 或 rstB 基因的缺損，都會明顯降低 asr 啟 動子的活性表現。
rstA 的基因缺損不影響 hdeD、yfdX、yfiD 啟動子的活性表現
由於 RstA 表現與否顯著影響 asr 啟動子活性，因此我們想了解是否還有 其他和抗酸相關的基因也會受到 RstA 所調控。在此選擇實驗室研究和抗酸 相關的三個基因：hdeD、yfdX、yfiD，分別測試其啟動子的活性表現。結果
顯示，這三個基因之啟動子活性在野生株及 rstA 缺損株中無明顯差異（圖 八）。
rstA 的基因缺損不影響細菌在酸環境下指數生長期的生長曲線以及酸逆境下
的存活率
為了更進一步確認 RstA/RstB 在克雷白氏肺炎桿菌裡是否扮演抗酸作用 的角色，在此藉由測試在酸環境下的生長曲線以及酸逆境下的存活率分析。
在分析酸環境下的生長曲線，如圖九所示，rstA 缺損株於指數生長期在不同 酸 pH 值環境下的生長趨勢和野生株相比無明顯的差異，然而於靜止生長 期，rstA 缺損株的生長情形相較於野生株則較緩慢。在酸逆境比較方面，
rstA 缺損株、rstB 缺損株或野生株的菌存活比例，也無明顯差異（圖十 A、
B）。
asr 的基因缺損對於細菌在酸環境下的生長曲線及酸逆境下的存活率影響不
大
在酸環境下， rstA/rstB 存在與否會顯著影響 asr 啟動子的活性表現，然
而並不影響細菌在酸性環境下指數生長期的生長曲線及酸逆境下的存活率。
因此，推測真正參予抗酸作用機制得藉由 asr 的表現。在此，我們利用同源 互換的方式建構 asr 缺損株（圖十一 A），並且以 DNA 電泳確認 asr 缺損株
（圖十一 B）。接著分析 asr 缺損株在酸環境下的生長情形，如圖十二 A 所
示，asr 基因缺損會使其生長略慢於野生株。在酸逆境菌的存活率分析，如 圖十二 B 所示，其存活率與野生株的存活率相比僅相差百分之十（67.3％
→57.4％）。另一方面，野生株、asr 缺損株、asr 互補株在酸逆境的存活率 分析也無明顯差異（圖十二C）。
克雷白氏肺炎桿菌 Asr 蛋白於細胞質內會被切割
為了解 Asr 參予抗酸的機制，我們利用大腸桿菌表現系統大量表現 Asr 重組蛋白（圖十三 A），接著以 GST 管柱純化，並以 SDS-PAGE（圖十三 B）及利用西方墨點法分析（圖十三 C）。結果顯示，純化後的重組 Asr 蛋 白呈現兩種片段的大小，大片段為完整的 Asr 重組蛋白，而小片段為 GST 接 上 Asr 之 N 端部分的重組蛋白，由此，克雷白氏肺炎桿菌 Asr 的作用方式和 大腸桿菌Asr 的作用方式可能相同，即 Asr 須經切割後才具有功能性。
rstA 的基因缺損不會影響 feo 啟動子的活性表現
在沙門氏菌，RstA/RstB 會活化 feoAB 的表現，為了解克雷白氏肺炎桿 菌 RstA/RstB 是否也會調控 feoAB 的表現，我們對 feo 啟動子進行活性分析，
如圖十四 A 所示，野生株與 rstA 缺損株在無含鐵離子、含 40 μM 鐵離子，
或加入 0.2 mM 螯鐵劑於 M9 培養液中，對於 feo 啟動子活性表現並沒有明顯 的差異（圖十四 A）。在此，為了在 rstA 缺損株中大量表現 RstA 並偵測 feo 啟動子的活性表現，因而需要於培養液中同時加入 chloramphenicol（35
µg/ml）及 tetracycline（10 µg/ml）兩種抗生素以維持兩種質體的存在，因此 造成細菌生長明顯變慢，活性分析也下降，無法觀測 feo 啟動子的活性表現 是否有差異（圖十四B）。
PhoP 於低鎂離子濃度會影響 rstA、rstB 啟動子的活性表現
如圖十五所示，在克雷白氏肺炎桿菌 rstA 的啟動子區域有 PhoP 及 RstA 的 鍵 結 辨 認 序 列 。 為 了 解 在 克 雷 白 氏 肺 炎 桿 菌 中 ， 能 感 應 鎂 離 子 的 PhoP/PhoQ 調控系統是否會活化 rstA/rstB，在此我們比較在野生株與 phoP 缺 損株中 rstA 及 rstB 啟動子的活性表現。由啟動子活性分析結果：rstA 啟動子 於低鎂離子濃度活性表現量較高，其表現量在 phoP 基因缺損或高鎂離子濃 度下則相對較低（圖十六）。另外，由實驗室 EMSA 分析結果，也顯示 PhoP 會專一性的鍵結於 rstA 啟動子區域（附錄二）。由於 phoP 的基因缺損 會降低 rstA 啟動子活性，是否 phoP 的基因缺損對 rstB 啟動子活性也有影 響，在此，我們測試 rstB 啟動子活性表現，rstB 啟動子活性在高或低鎂離子 濃度表現差異不大（圖十七）；同於 rstA 啟動子活性測試結果，phoP 的基 因缺損會降低 rstB 啟動子的活性表現，在此證明 PhoP 會影響 rstB 啟動子的 活性表現。除了 PhoP 鍵結辨認序列，rstA 啟動子區域也有比對到 RstA 鍵結 辨認序列（圖十五），是否 rstA 的表現除了受到 PhoP 影響外，也會受到 RstA 自我調控，在此經由啟動子活性分析結果：rstA 啟動子活性於野生株中
表現量高，而於 rstA 缺損株中則活性下降，由此，RstA 也會去影響 rstA 啟 動子的活性表現（圖十八）。另外，實驗室 EMSA 結果也顯示，RstA 會鍵 結於 rstA 啟動子區域（附錄三）。
銅離子會影響 rstA
、
rstB、asr 啟動子的活性表現克雷白氏肺炎桿菌中 RstA/RstB 調控系統所感應的訊息還未被報導，由 前面實驗結果也顯示：RstA/RstB 會受到感應鎂離子濃度的 PhoP/PhoQ 所調 控，而 asr 啟動子活性表現會顯著受到 RstA/RstB 所影響。在此，我們分析 不同金屬離子對 rstA、rstB、asr 啟動子活性表現的影響。實驗結果顯示外加 銅離子對 rstA 啟動子活性表現影響不大（圖十九 A），然而會明顯降低 rstB 及 asr 啟動子的活性表現（圖十九 B、C）。
fur 的基因缺損會影響 rstA、rstB、asr 啟動子的活性表現
Fur 是細菌體內重要的調控因子（global regulator），可調控多種基因表
現，其鍵結辨認序列已被確認 (2)。我們以此特定鍵結序列分析克雷白氏肺炎 桿菌基因體序列時，在 rstB 啟動子區域找到ㄧ處可能為 Fur 鍵結辨認的序列
（圖二十 A）；在進一步的實驗顯示：fur 的基因缺損對 rstA 及 rstB 啟動子 的活性表現影響不大，然而卻會明顯降低 asr 啟動子的活性表現（圖二十 B）。
討論
雙分子調控系統是細菌體內傳遞訊號很重要的工具，已知有許多和細菌 的致病性有關，單一菌體內往往擁有多套系統，使細菌因應不同環境以利存 活 (34)。目前，許多套雙分子系統的功能已被鑑定，然而 RstA/RstB 的研究 直 到 近 兩 年 才 有 報 告 。 大 腸 桿 菌 的 RstA/RstB 會 受 感 應 鎂 離 子 濃 度 的 PhoP/PhoQ 所調控，並可活化和抗酸有關的 asr 表現 (29)；而沙門氏菌的 RstA/RstB 可活化和螯鐵有關之 feoA/feoB 的表現，使生成的 FeoB 可將體外 傳輸進細菌體內的二價鐵和 Fur 形成 Fur-Fe 複合體，此複合體進而去抑制 feoA/feoB、運鐵系統以及其他受 Fur 調控的基因表現 (17)。
由於克雷白氏肺炎桿菌中 rstA/rstB 及其前後基因組成和大腸桿菌及沙門 氏菌不同，因而推測其在功能表現上會有所不同，因此，本論文想探討
由於克雷白氏肺炎桿菌中 rstA/rstB 及其前後基因組成和大腸桿菌及沙門 氏菌不同，因而推測其在功能表現上會有所不同，因此，本論文想探討