克雷白氏肺炎桿菌CG43中RstA/RstB雙分子訊息傳遞系統的特性分析

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國立交通大學生物科技學系

碩士論文

克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中 RstA/RstB 雙分子訊息傳

遞系統的特性分析

Characterization of the two-component system

RstA/RstB in Klebsiella pneumoniae CG43

研究生 : 蔡雅雯

Student : Ya-Wun Cai

指導教授 : 彭慧玲博士

Advisor : Hwei-Ling Peng, Ph.D

中華民國九十八年六月

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中文摘要

因為克雷白氏肺炎桿菌( Klebsiella pneumoniae )的 RstA/RstB 之基因組

成和大腸桿菌、沙門氏菌不盡相同，為了了解克雷白氏肺炎桿菌中 RstA/RstB 的功能：首先，我們利用同源互換的方式取得 rstA 及 rstB 缺損

株，其外型和生長曲線和野生株並沒有差異；另外，分析 RstA/RstB 對細菌

抗藥性的影響時發現，大量表現 RstA 會增加細菌對 cefotaxime 的感受性；進

一步，我們發現克雷白氏肺炎桿菌 asr（acid shock RNA）的啟動子活性在 rstA 或 rstB 缺損株中皆明顯下降，因此，我們推測 RstA/RstB 可能和抗酸作 用有關。然而，rstA 或 rstB 缺損株在酸性環境的生長曲線或酸逆境下的存活 率和野生株差異不大。更意外的，asr 的基因缺損對細菌在酸性環境的生長 或酸逆境下存活的影響也不明顯。不過，藉由西方墨點法分析，我們發現克雷白氏肺炎桿菌的 Asr 在生成過程中也會有被切割的情形；另外，藉由啟動 子活性分析，我們也發現 rstA 的基因缺損不會影響其它和酸有關的 hdeD、 yfdX、yfiD 的啟動子活性表現。分析 rstA 啟動子序列，可以找到 PhoP 及

RstA 可能的鍵結序列，而以啟動子活性測試，輔以實驗室 EMSA 分析的結果，證實 PhoP/PhoQ 會調控 RstA/RstB 的表現。而為了解 RstA/RstB 所感應的訊息，我們以添加不同金屬離子來分析啟動子活性表現，結果發現銅、鋅

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離子可以使 rstA、rstB、asr 啟動子活性明顯減少。另外，分析 rstB 啟動子序

列，發現類似 Fur 的鍵結序列，而由啟動子活性測試顯示 fur 的基因缺損，

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Abstract

Gene organization of the two-component signal transduction system RstA/RstB

in Klebsiella pneunomiae is different from that of Salmonella enterica and Escherichia coli. In order to investigate if different functional role exerted by the

RstA/RstB, deletion mutants of rstA or rstB were firstly generated by allelic exchange via homologous recombination. Neither deletion has apparent effect on the phenotype or growth. The drug susceptibility analysis revealed that the overexpression of RstA rendered the E. coli an increase of susceptibility to cefotaxime. Deletion of rstA or rstB was found to decrease dramatically the promoter activity of the acid response regulator Asr. Hence, we presumed RstA/RstB may involve in the acid resistance. However, deletion of rstA or rstB did not change the acid survival rate or affect the growth in acidic condition. Intriguingly, neither the asr deletion had apparent effect on the acid survival rate or the growth in acidic condition. Nevertheless, we found that the K. pneumoniae Asr was also susceptible to the protease digestion and hence two fragments were found in the cytosol after the overexpression of the Asr in the recombinant E. coli. Moreover, the deletion of rstA did not influence the promoter activity of the acid resistance-related genes hdeD, yfdX and yfiD. Analyses of the putative promoter of rstA revealed a conserved PhoP and RstA binding box, suggesting a

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PhoP/PhoQ-dependent expression of the RstA/RstB. In order to determine the signal sensory molecules for the expression of RstA/RstB, different metal ions were added into the medium for the effect on the promoter activity. The results showed that copper or zinc ion could reduce the promoter activity of rstA, rstB and asr. A putative Fur binding box was found in the rstB promoter, and therefore fur deletion effect was studied. Interestingly, deletion of fur not only reduced the promoter activity of rstB but also the asr promoter activity.

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致謝

記得當初爸媽把我載到新竹放下後，對自己有一種期許，希望自己在這裡有更多的成長。而在這兩年的時間也真的是一晃眼就過去，時間快的就像我昨日才初到新竹的感覺。在這裡，兩年的生活，除了邏輯思考的進步，實驗技巧，表達能力外，感覺也磨練自己做事情的態度與方法，同時也學習人與人之間的溝通與相處。這兩年的生活，我最感謝的人是我的指導教授彭慧玲老師，當初可以進這個實驗室其實心情是充滿感激，感謝老師的識人。在這裡，每一週跟老師面對面討論實驗也獲益良多，因為老師總是會帶領我思考找出盲點，或者在討論的過程中，讓我突然想通一些卡在腦袋裡的疑問，也因為老師的用心與關心，讓我覺得自己其實是一個很幸運的人，能遇到這樣一位好老師。還有感謝清大張晃猷老師以及張老師實驗室的夥伴給予實驗上的建議以及協助，以及中興大學鄧文玲老師，給予我諸多建議，讓我對實驗有多一點的想法而加以探討，也感謝交通大學楊昀良老師，給予不同的觀點以及教導論文中的修正。而這兩年的生活，最重要的是有實驗室大夥的歡樂與扶持。親愛的小丸子總是在我實驗卡關會陪著我一步步討論，在我實驗低潮時也不忘給我鼓勵而讓我繼續努力，更是吃飯邀約的好咖；秉熹則是在實驗上傳授我諸多功

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力；靜柔姐姐，則是會在我不順遂時，陪著我聊天，當我有開心的事情時也能一同分享；而我的好同學顗峰，也感謝你兩年來給予我的幫助以及支持；還有實驗室可愛又體貼的學妹家華和佩君，你們真是實驗室的開心果，總是讓我感動在心裡；也感謝小新學長及建誠學長實驗上的指導，讓我可以實驗卡關時找出問題點；也感謝志桓、小珊、承哲、哲充、信文、朝彥、豪君、崴云，實驗室有你們真好。最後要感謝我最強的後盾，親愛的老爸老媽，總是在我週末回家陪我聊天，給我打氣，讓我充滿能量的回來繼續努力。也感謝我的好麻吉玉秀和松志，陪我談心陪我逛街；以及景程，給予我研究所生活諸多的協助。最後，我要開始邁入人生的另一個啟程，我會繼續努力，也希望大家一同努力，往自己的目標邁進。雅雯民國 98 年 7 月 19 日筆於新竹交通大學竹銘館分子調控實驗室

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目錄

中文摘要---i 英文摘要---iii 致謝---v 目錄---vii 圖表目錄---viii 縮寫表---1 前言--- 2 實驗材料及方法---8 結果---18 討論--- 24 參考文獻--- 32

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圖表目錄

表一、本實驗所使用之菌株---39 表二、本實驗所使用之質體---40 表三、本實驗所使用之引子---42 圖一、不同菌種中rstA/rstB及其上下游基因分析---43 圖二、確認rstA及rstB基因缺損株---44 圖三、分析rstA或rstB基因缺損株在LB及M9培養液的生長情形---45 圖四、分析克雷白氏肺炎桿菌中RstA或RstB對於不同藥物濾紙錠的影響-46 圖五、大腸桿菌中大量表現RstA對於不同藥物濾紙錠的影響---48 圖六、分析不同菌種中asr上下游基因以及其可能的啟動子序列---49 圖七、rstA或rstB基因缺損對asr啟動子活性的影響---51 圖八、分析rstA基因缺損對hdeD、yfdX、yfiD啟動子活性表現的影響---52 圖九、野生株及rstA缺損株於LPM pH 4.8、pH 4.4、pH 4.0環境下生長曲線 ---53 圖十、rstA及rstB的基因缺損於酸逆境下的存活率分析---54 圖十一、asr缺損株的建構示意圖以及確認---55 圖十二、asr的基因缺損在酸環境下的生長曲線及酸逆境下的存活率---56 圖十三、重組蛋白Asr的表現純化及西方墨點法分析---58 圖十四、分析rstA的基因缺損對於feo啟動子活性的影響---60 圖十五、rstA啟動子區域序列分析---61 圖十六、PhoP對於rstA啟動子活性的分析---62 圖十七、PhoP對於rstB啟動子活性的分析---63

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圖十八、RstA對於rstA啟動子活性的分析---64

圖十九、不同金屬離子對於rstA、rstB、asr啟動子活性的影響---65

圖二十、分析fur的基因缺損對rstB、rstA、asr啟動子活性表現的影響---66

附錄一、克雷白氏肺炎桿菌RstA/RstB調控示意圖---67

附錄二、藉由EMSA分析PhoP對於PrstA的鍵結能力---68

附錄三、藉由EMSA分析RstA對於PrstA的鍵結能力---69

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縮寫表

Ap Ampicilin

APS Ammonium persulfate asr acid shock RNA

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate DTT Dithiothreitol

EDTA N'N'N'N'-ethylenediamineteraacetate EMSA Electrophoretic mobility shift assay IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside Km Kanamycin

KP Klebsiella pneumoniae LB Luria-Bertani broth

NBT Nitro blue tetrazolium chloride ONPG ο-nitrophenyl-β-galactopyranoside PBS Phosphate buffer saline

PCR Polymerase chain reaction PVDF Polyvinylidene fluoride rpm Revolution per minute

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Str Streptomycin

Tc Tetracycline

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前言

克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）是一株伺機性的革蘭 氏陰性病原菌，與大腸桿菌（Escherichia coli）同屬腸內菌科，在臨床 上容易造成院內感染，常在老人、小孩、以及免疫力較差的宿主造成

嚴重的病徵，例如敗血症（septicemia），肺炎（pneumonia），尿道感

染（urinary tract infection），和腦膜炎（meningitis）(32)。在台灣，許多研究顯示克雷白氏肺炎桿菌造成的肝膿瘍與糖尿病人有高度的相關性 (7, 31, 47)。克雷白氏肺炎桿菌的毒力因子（virulence factor）包含：可以使細菌躲過吞噬細胞（phagocytes）攻擊而有致病能力的莢膜多醣體（ capsular polysaccharide ）、會保護細菌使不被補體（complements）攻擊的脂多醣體（lipopolysaccharide）(45)、能幫助細菌黏附於宿主細胞而順利入侵的黏附蛋白（adhesin）、會螯合外界環境中的鐵來促進細菌生長及致病力、對抗生素具有抗性的螯鐵系統（siderophores）(27, 40)；近幾年來的研究證實雙分子調控系統（Two-component system, TCS ）也和細菌的致病有關，例如 E. coli 的 EvgA/EvgS (23)及 Salmonella 的 PhoP/PhoQ (28)。

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TCS 包含感應蛋白（ sensor ）和反應調節蛋白（ response regulator），其訊號傳遞主要靠組胺酸到天門冬胺酸的磷酸根傳遞（His-to-Asp phosphorelay）使細菌可以因應外在環境，例如溫度、滲透壓、營養物、酸逆境等的改變，而活化或抑制下游基因的表現。這樣的調控方式並非僅出現於細菌，在真核生物及植物中也都有相同的系統存在。目前已知 TCS 的訊號傳遞有三種模式：第一種稱為典型的 TCS，主要由位於膜上的感應蛋白接受到外界訊號後，其組胺酸激酶（histidine kinase）會自行磷酸化（autophosphorylation），而由於此蛋白同時具有轉移磷酸酶（phosphotransferase）的功能，所以感應蛋白磷酸化後會繼續將磷酸根（phosphate group）傳給位在細胞質的反應調節蛋白，此蛋白分子的反應調節區域（response regulator domain, receiver domain）的天門冬胺酸（aspartic acid）在接收到磷酸根後，改變蛋白的結構，進而調控下游基因的表現；第二種為多步驟的磷酸根傳遞，主要在接受到外界訊號後，磷酸根經由磷酸根傳遞分子（ His-containing phosphotransfer）上的組胺酸傳到下游的反應調節蛋白上的天門冬胺酸；第三種的 TCS 和第二種類似，皆為多步驟的傳遞，差別在於含組胺酸的磷酸根傳遞分子和感應蛋白是分開的，分別位於兩個蛋白質上 (14, 26)。

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本論文所研究的主角為 RstAB，其中 RstB 為感應蛋白而 RstA 則

是反應調節蛋白，這套系統在分類上屬於典型的 TCS (6)。有研究顯示

PhoP/PhoQ TCS 會影響 RstA/RstB 的表現，大腸桿菌的 PhoP/PhoQ 能感

應鎂離子（Mg2+）濃度的改變，被微量（μM）的鎂離子活化後的

PhoP/PhoQ ，會辨認帶有串聯正向重複序列 (T/G)GTTTA-nnnnn-(T/G)GTTTA 的啟動子，與此啟動子結合後調節下游基因的表現 (25)。 Minagawa 等人利用 DNA 微陣列分析，再以膠體移位實驗（gel shift assay）證明了 PhoP/PhoQ 會調控數個下游基因的表現，其中包含了 RstA/RstB 雙分子調控系統 (25)。而在 2003 年，利用顯型微陣列（Phenotype Macroarray）分析大腸桿菌的 TCS，結果顯示 RstAB 突變後的菌株對於 ketoprofen，pridinol 和 troleandomycin 等抗生素比較敏感 (51)；另一研究發現大量表現 RstA 後會使細菌對於 cefmetazole、 crystal violet 、fosfomycin 較有抗性 (12, 13)。

除了影響細菌對抗生素的敏感性外，Hiroshi Ogasawara 等人利用 genomic SELEX （ systematic evolution of ligands by exponential enrichment）分析發現：E. coli 的 RstA/RstB 會負向調控與 curli 生合成 有關的 csgD 表現，卻正向調控和酸逆境有關的 asr 基因的表現。而在 asr 啟動子可以找到 RstA 辨認的序列（TACA-nnnnnn-TACA），經由

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活性實驗推測 RstA/RstB 負責感應弱酸的環境 (29)。分析已發表的克雷白氏肺炎桿菌基因體（MGH78578： http://genome.wustl.edu/；342： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），可以找到 asr 但未發現 csgD 相似序 列。

Asr（acid shock RNA）可轉譯一百個胺基酸，在腸內菌科細菌中普遍存在，可在 pH < 5.0之下被誘導表現，並且被發現在M9培養液中的表現量比在LB 培養液中高 (39) 。 E. coli Asr 在送到膜間隙 （periplasmic space）過程中，會先行去掉訊號序列（signal peptide），

到了膜間隙時，N端部分被切割，剩下的C端才真正具有抗酸的能力 (38)。一旦asr突變，除了使細菌對酸的敏感性增加外，也會影響E. coli 在老鼠腸道的群聚 (3)。過去研究指出，微量的鋅是生物生長所必需的，鋅的濃度改變會影響生物生理的正常運作 (11)。而在2005年的一篇論文指出給予大腸桿菌0.2 mM ZnSO4，再利用微陣列分析去分析訊息核醣核酸（mRNA）的表現量，結果顯示asr，rstA，rstB表現量皆會變高 (20)。除了RstA/RstB外，E. coli asr的表現也受感應磷離子變化的 PhoB/PhoR 所調控 (43) 。另有研究指出在生長靜止期（ stationary phase），asr的轉錄與RpoS有關 (39)。沙門氏桿菌的RstA/RstB除了可 調控受RpoS影響的三個基因表現（narZ, spvA, and bapA）外，也影響

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RpoS的降解，還可抑制生物膜的生合成 (6, 52)。

鐵是細菌生長與繁殖所必須，細菌具有螯鐵分子（siderophore）和運鐵系統由環境中取得微量的鐵。在克雷白氏肺炎桿菌CG43中，有三個螯合氧化態三價鐵（Fe3+）的螯鐵分子：aerobactin，enterobactin，以及yersinabactin ，生成 aerobactin 及 enterobactin 的基因組 iucABCD 和 iroBCDN位於CG43的大質體上，而生成yersinabactin的ybt基因組和負責

二價鐵（Fe2+）運輸的基因組feoABC和sitABCD則在染色體上 (8, 9)。 2008年，有報導指出沙門氏菌的RstA/RstB會活化feoA/feoB的表現使其

產生FeoB， FeoB會將外界的二價鐵（Fe2+）運輸到細胞內與Fur結合形

成Fur-Fe複合體，Fur-Fe複合體會轉而負向調控feoA/feoB的表現，並抑制其他運鐵系統及受Fur 調控的基因表現 (17)。

分析比較大腸桿菌、沙門氏菌，以及克雷白氏肺炎桿菌RstA/RstB 相鄰的基因組成（如圖一所示），大腸桿菌的rstA與rstB為相鄰，而沙 門氏菌的rstA與rstB中間則有三個開讀框架（Open reading frame）： stm1474、ompN、stm1472；而克雷白氏肺炎桿菌則在rstA與rstB中間有

一可被轉譯的假設性蛋白（hypothetical protein）。比較不同來源之大腸桿菌、沙門氏菌，以及克雷白氏肺炎桿菌胺基酸序列得知RstA有91.0 ％相似度，RstB則有96.5％相似度。但不同的基因構造暗示著克雷白氏

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肺炎桿菌RstA/RstB可能有不一樣的調控。因此本實驗目的即在探討 RstA/RstB在克雷白氏肺炎桿菌中所扮演的角色：（一）RstA/RstB的功能性分析，在建構突變株後，觀察RstA/RstB是否會影響細菌對酸的耐 受性，是否影響asr、feoAB和其他相關基因的表現；（二）將以啟動子 活性報告系統分析RstA/RstB的表現，是否受PhoP/PhoQ所調控，並探討是否會受鎂離子或其他離子及抗生素所影響，以及是否受Fur所影響。

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實驗材料及方法

菌種與質體 本實驗所使用的菌種及質體列於表一及表二。克雷白氏肺炎桿菌 CG43 為K2 血清型的伺機性病源菌，LD50為 10 c.f.u. (22)。製備質體的過程，包括限制酶作用、連接作用（ligation）、轉形作用（transformation），按照 Molecular cloning 實驗手冊描述的方法操作 (35)。抽取大腸桿菌質體依據 Protech miniprep kit（波士特，台北，台灣）說明書操作。

實驗試劑藥品和材料來源 LB（Luria-Bertani）培養基及培養液中的tryptone及yeast extract購自生工，而限制酶購自Promega、Biolab或MBI，Tag聚合酶購自生工，其他藥品則購自Sigma或Merck。 培養基及培養液的配法 LB 培養液：取 25 克 LB 粉末（內含 Bacto-tryptone 10 克， Bacto-yeast extract 5克，NaCl 10克）先加水800毫升，調pH值至7.0，最後加水至1升，滅菌後使用。LB 培養基：每500毫升加入7.5克的洋菜粉及12.5克LB粉末，滅菌後，待溫度降至60℃時，依所需加入抗生素，混合後，倒入培養皿中，凝固後使用。M9培養基：15克的洋菜粉加入二次水使成800毫升和200毫升的5X M9，經滅菌，待溫度降至60℃時，將其混合2毫升的1 M MgSO4、20毫升的

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20%葡萄糖和100微毫升的1 M CaCl2，再加入所需的抗生素，倒入培養皿中

凝固後使用。LPM培養液：一升的水中含50 mM Tris base，20 mM KCl，7.5 mM (NH4)2SO4，6.5 μM FeCl3，0.6% Bacto peptone待滅菌後，再分別加入9.6

微毫升的1 M MgCl2，12.8微毫升的1 M CaCl2，及0.4毫升的20% glucose後使用。 勝任細胞（competent cell）的製作 將菌畫於LB培養基上，隔夜培養於37℃培養箱，挑單一菌落接種於50毫升的LB培養液震動培養隔夜後，將此菌液加入500毫升的LB中於37℃培養至 OD600 = 0.4，將500毫升的菌液分裝於三個250毫升滅過菌的離心瓶中冰浴20 分鐘，在4℃以13,000 xg離心20分鐘，倒掉上清液，各以150毫升滅過菌冰的二次水將菌塊重新懸浮，並將三瓶合於兩瓶，於4℃再以13,000 xg離心20分鐘後倒掉上清液，用100毫升滅過菌冰的10%甘油將菌塊重新懸浮，再一次離心倒掉上清液，用10%無菌冰甘油（glycerol）洗沉澱物後將兩瓶合成一瓶再離心，倒乾水分，最後以1毫升的GYT培養液（10%甘油，0.125% yeast extract，0.25% tryptone）將沉澱物懸浮以每40微毫升分裝於1.5毫升離心管中。這些勝任細胞可以直接使用或者保存於攝氏零下80℃。 染色體DNA製備 取1毫升隔夜培養的菌液，離心之後用0.8毫升的lysis溶液（200 mM

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NaCl，20 mM EDTA，40 mM Tris-HCl，0.2% Triton X-100，5 mM DTT，80 μg lysozyme）溶解於37℃放置30分鐘後加入4微毫升蛋白脢K（20 毫克/毫升），在50℃水浴作用2小時，接著置於冰上10分鐘，再加入250微毫升的飽和食鹽水，搖晃之後，以16,000 xg離心10分鐘，分別取500微毫升的上清液到兩個1.5毫升的離心管中，並各加入1,000微毫升絕對的冰酒精，搖晃之後以16,000 xg離心10分鐘，最後倒掉上清液，用冰的75%酒精清洗兩次，烘乾並以50微毫升二次水溶解之後保存於-20℃。 轉型作用（電穿孔法） 將勝任細胞從-80℃冰箱中拿出來退冰，取要轉殖的質體1微毫升到勝任細胞中，混合並移至電菌管中，以2.5 V電極（BIO-RAD#165-2098）5秒鐘後用1毫升的LB清洗電極管，將此細胞與質體混合液在37℃培養60分鐘，塗盤於含抗生素的篩選性培養基上，於37℃培養箱中培養。隔天挑選平板上之單一菌落接種於篩選性培養液，經培養後抽取質體DNA ，以瓊脂膠電泳（agrose gel electrophoresis）來確定轉型成功與否。

建構突變株與互補株

建構含asr或rstB基因缺損的質體

DNA 引子的設計見於表三，由生工公司代為合成。先以（ asr ： YWp09、YWp10）（rstB：YWp18、YWp19）PCR分別將基因及其前後2 kb

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的序列接入pyT&A ，再以（ asr ： YWp11 、 YWp12 ）（ rstB ： YWp20 、 YWp21）PCR分別增幅去掉asr（約300 bp）和rstB（約1300 bp），留下前後 兩段各約1 kb的核酸片段，再將此兩片段結合，接入質體pKAS46，送入大腸桿菌S17-1λpir中。接合作用與挑選突變株將帶有建構好質體的大腸桿菌S17-1λpir做隔夜培養，同時亦將克雷白氏肺炎桿菌CG43S3隔夜培養，分別取1毫升的隔夜培養液於1毫升的新鮮LB中於37℃培養30分鐘，再分別取1毫升於無菌的1.5毫升離心管中，以適當的轉速將菌體離心下來，使用無菌0.85% NaCl重新懸浮細胞，重複至少兩次，將 500微毫升已洗淨的克雷白氏肺炎桿菌混合於1毫升的S17-1λpir中，再離心去 除上清液，用100微毫升0.85% NaCl重新懸浮，再把這100微毫升懸浮小心滴在滅菌過的纖維膜上（事先先將滅過菌的消化纖維膜置於培養基中），培養基正放於37℃培養箱中12~16小時，用滅過菌的夾子輕輕將纖維膜捏起放入新鮮LB 中，震盪讓菌體離下來，吸取 100 微毫升，系列稀釋後（ 1x ， 1/10x），塗於M9培養基中（Km25微毫克/毫升、Ap100微毫克/毫升、0.2% glucose）。隨機選取5顆單一菌落，分別培養於4毫升的LB中後（37℃， 12~16小時），吸取1毫升的菌液抽取菌體染色體DNA，另外的3毫升菌液暫時存放於4℃中。設計一組引子，用PCR檢查，任選一株質體有成功進入菌體

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DNA的克雷白氏菌，吸取100微毫升隔夜的菌液種於於4毫升LB（含有Str 500 微毫克/毫升）中置於37℃培養8小時，吸取100微毫升的菌液，系列稀釋後（1x，1/100x，1/10,000x），塗在LB培養基（含Str500），用牙籤隨機挑選至少50菌落，分別種在含Str500微毫克/毫升的LB培養基與含Ap100微毫克/毫升Km25微毫克/毫升培養基上，挑選對streptomycin有抗性但對kanamycin沒有抗性的菌落，抽取染色體DNA後，進行PCR檢查，找尋只含有突變片段的菌落即為突變株。建構互補株

以YWp09 、 YWp10 PCR 增幅出包含 asr 及其啟動子區域的片段接入 pRK415質體中，再轉型至大腸桿菌S17-1λpir，利用接合作用送入突變株 中。 生長曲線測試 取隔夜培養的菌液 200 微毫升加至新鮮的 4 毫升 M9、LB 或 LPM 中，每隔一段時間測OD600的吸光值直到生長趨於靜止生長期。 IPTG誘導RstA或Asr蛋白質的表現 取200微毫升隔夜培養的菌液，加入4毫升新鮮LB或LPM培養液，在37℃ 培養2小時後，將IPTG 加入培養液中至濃度為0.5 mM，經37℃培養6小時後，以2,800 xg離心10分鐘取得菌體，進一步以SDS-PAGE分析並作為蛋白質

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純化的來源。 抗生素抗性試驗 隔夜培養的菌液取200微毫升至新鮮4毫升LB中，於37℃培養箱中培養 2~3小時後，加入IPTG至0.5 mM作用3小時後，同時進行SDS-PAGE分析蛋白質的表現，並且將菌液三重複用棉花棒塗抹於LB盤，待10~20分，將含抗生素的濾紙錠放於盤中央，放入37℃培養箱中培養12~16小時後觀察抑菌圈大小。 啟動子活性試驗

抽取pLacZ15 的質體並將目標基因（ asr ： YWp01 、 YWp02 ； rstB ： YWp27、YWp28）啟動子區域用PCR增幅出來之後切酵素，再與pLacZ15接合在一起，接著利用轉型作用送入大腸桿菌S17-1λpir。取隔夜培養的菌液

200微毫升至新鮮的4毫升M9、LB或LPM中，置於37℃培養箱至OD600 = 0.7，

取1毫升菌液於1.5毫升的離心管中，用Z buffer（取16.1克 Na2HPO4·7H2O、

4.78克NaH2PO4、0.75克KCl、0.246克MgSO4·7H2O配製成一升且pH為7.0，滅

菌完後使用前加入2.7毫升2-mercaptoentanol）洗兩次菌塊並將細菌刮破後，

加入1毫升的Z buffer使之懸浮，取100微毫升至試管中（已加入35微毫升

chloroform，17微毫升0.1％ SDS，900微毫升Z buffer）使混合均勻，將試管

(24)

Na2HPO4·2H2O、22.5毫升0.2 M NaH2PO4·2H2O、一克ONPG，補水至250毫升）200微毫升使之反應開始，待達作用完成之時間點加入1 M Na2CO3 500微毫升使之停止反應。測量OD420之吸光值並記錄之 (24)。 酸逆境下菌存活試驗 將隔夜培養的菌液取 200 微毫升至新鮮 pH 7.0 LPM 培養液中，至 OD600=0.6 塗盤，並分兩部分；第一部分，直接給予酸逆境，pH 3.0 作用兩小時後塗盤，隔夜計數菌落數除以初始反應菌數為存活率；第二部分，先在弱酸pH 4.6 適應 2 小時後，再給予酸逆境 pH 3.0 作用兩小時，再塗盤，隔夜培養將酸逆境後塗盤菌數除以初始反應菌數為存活率 (38)。 十二酯硫酸鈉- 聚丙烯醯氨膠體電泳（SDS-PAGE） 首先先將玻璃擦拭乾淨架好之後，迅速倒入Running gel（12.5%）： deionized water 3.7毫升；Running buffer 1毫升（3 M Tris-HCl，pH 8.0）; 10% SDS 80微毫升；40%（w/v）acrylamide solution（acrylamide：bis-acrylamide = 37.5：1）3毫升；TEMED 9微毫升，10% APS 100微毫升）至適當高度，以酒精輕輕加至電泳膠上方，等待電泳膠凝固後，倒掉上層水並以紙吸乾，再加入stacking gel（Deionized Water 1.9毫升；Stacking buffer（1.0 M Tris-HCl pH 6.8 ）， 83 毫升； 10% SDS 33 微毫升； 40% (w/v) acrylamide solution （acrylamide：bis-acrylamide = 37.5：1）0.4毫升；TEMED，5微毫升；10%

(25)

APS，60微毫升）至溢出，隨即插入樣品梳，凝固之後移去樣品梳，並置於電泳槽內，倒入 running buffer（35 mM Tris-base，250 mM glycine，0.1％ SDS）待用，將欲分析的蛋白質加入2X loading dye [ 2X SDS gel-loading buffer：100 mM Tris-HCl pH 6.8；4% SDS；20% glycerol；0.2% bromophenol blue（3’,3”,5’,5”-tetrabromophenol Sulfonphtalein）；200 mM dithio-threitol ]，並於100℃加熱十分鐘後加至電泳膠well中，以100伏特數電泳分析15分鐘後，再以90伏特電泳2小時，最後由玻璃夾層中取出電泳膠。將經電泳後的 SDS-PAGE切掉stacking-gel後，浸於staining buffer（0.25克Coomassie Brilliant Blue R250；45毫升deionized water；45毫升methanol；10毫升glacial acetic acid）室溫搖晃30分鐘，再浸於Destain buffer（30% methanol；10% acetic acid）中退染至可清楚的看見蛋白質為止。

Gst‧tag 親和性管柱純化Asr蛋白質

以GST ta‧ g親和性管柱純化蛋白質，將200毫升菌液離心後的菌體加入

10 毫升 1X loading buffer 混勻（ 10X Extraction/Loading Buffer ： 1.4 mM NaCl；100 mM Na2HPO4；18 mM KH2PO4，pH 7.5），使用超音波震碎菌體

後離心4 13,000 ℃ xg（微量離心機）20分鐘，上清液內即含有所要的蛋白

質。先將4毫升離子水通入GST tag‧ 管柱（重複三次），再加入4毫升loading

(26)

GST tag‧ 管柱，蓋住上下蓋直立插於冰上20分鐘。接著拿掉上下蓋，通入

4毫升1X extraction buffer至管柱5次（前4次使用extraction buffer，第5次使

用4毫升的10毫克reduced glutathione/10毫升elution buffer），再通入6毫升

的elution buffer（elution buffer：50 mM Tris-Base，pH 8.0，要使用前取出10

毫升外加100毫克reduced glutathione）至管柱，以微量離心管收集溶離液。

最後再以Regeneration buffers清洗GST tag‧ 管柱；40毫升Buffer 1（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），接著以40毫升Buffer 2（0.1 M Sodium acetate，0.5 M NaCl，pH 4.5），再以20毫升Buffer 3（140 mM NaCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.5），最後將管柱內溶液置換成20%乙醇，上下蓋外包覆paraffin，保存於4℃冰箱。接著以SDS-PAGE分析收集到的蛋白質的純度 (1, 36, 44)。 西方轉印免疫法 將蛋白質經由SDS-PAGE分離，以轉印緩衝液（39 mM glycine，48 mM Tris base，0.037％SDS）轉印到纖維膜上，然後將纖維膜（PVDF）浸泡於含有5％ skim milk的PBS中，置於4℃搖晃兩小時，用PBST沖洗二次、PBS沖洗一次，再加入稀釋1000倍的anti-GST，用PBST沖洗二次、PBS沖洗一次，加入稀釋5000倍的anti-mouse AP，在室溫搖晃30分鐘，以PBST 沖洗二次、PBS 沖洗一次後，纖維膜浸入加有NBT和BCIP的冰鹼性磷酸緩衝液（100 mM

(27)

(28)

結果

rstA 或 rstB 的基因缺損不影響細菌的生長 如圖一所示，克雷白氏肺炎桿菌 rstA/rstB 上下游基因組成的不同，可能 暗示著其有不同的功能，所以在這裡我們分別建構 rstA 或 rstB 缺損株。建構 的方法為將基因缺損的片段建構於質體後，利用同源互換的方式與野生株做 交換，再以電泳分別確認 rstA（圖二 A）及 rstB 缺損株（圖二 B）。在此挑 選出的 rstA 及 rstB 缺損株於外觀上和野生株無區別，為了解基因缺損是否對 菌株的生長有所影響，我們分別測試菌株於營養充分的 LB 培養液以及僅供應最低營養生長需求的 M9 培養液中，觀察缺損株在生長上是否會受影響， 由實驗的結果顯示 rstA 或 rstB 缺損株在此兩種培養液中生長情形和野生株相 比無差異（圖三）。 大量表現 RstA 使大腸桿菌對 cefotaxime 抗性稍為變大 我們以實驗室現有不同藥物濾紙錠，分析 RstA 是否與抗藥性有關，圖四 A 顯示不論野生株、rstA 缺損株、rstA 互補株，都對這些抗生素的感受性 無明顯差異。另一方面，rstB 基因缺損也不影響其對抗生素的感受性（圖四 B）。而 cefotaxime 在大量表現 RstA 於大腸桿菌，相較於僅含 N 端 RstA 片段的菌株感受性較大（45.2 mm vs. 36.6 mm），其他藥物則沒有明顯的差異（圖五）。

(29)

RstA 和 RstB 會參予 asr 啟動子的活性表現

Ogasawara 等人發現：在大腸桿菌裡，RstA 能調控和抗酸有關 asr 基因

的表現。如圖六 A 所示，克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中也含有 asr 基因，並於

其啟動子區域有比對到 RstA 鍵結辨認序列（圖六 B）。因此我們將 asr 可能

的啟動子區域建構於 pLacZ15（圖七 A），藉由偵測 LacZ 活性的表現來看

asr 啟動子是否會受到 RstA 所調控。由圖七 B 顯示，在 pH 7.0 LPM 中，不

論是野生株或 rstA 缺損株，asr 啟動子活性表現量都很低。然而相對的，在 pH 4.6 LPM 中，野生株裡 asr 啟動子活性表現量高達 5000 miller units，而在 rstA 缺損株裡，asr 啟動子活性表現量僅 250 miller units。由於 rstA 基因缺損

後， asr 啟動子活性明顯減少，我們進一步想了解 rstB 基因的缺損是否也會 影響 asr 啟動子的活性表現。因此偵測 rstB 基因缺損下，asr 啟動子的活性表 現，由圖七 C 結果顯示，不論 rstA 或 rstB 基因的缺損，都會明顯降低 asr 啟 動子的活性表現。 rstA 的基因缺損不影響 hdeD、yfdX、yfiD 啟動子的活性表現 由於 RstA 表現與否顯著影響 asr 啟動子活性，因此我們想了解是否還有 其他和抗酸相關的基因也會受到 RstA 所調控。在此選擇實驗室研究和抗酸 相關的三個基因：hdeD、yfdX、yfiD，分別測試其啟動子的活性表現。結果

(30)

顯示，這三個基因之啟動子活性在野生株及 rstA 缺損株中無明顯差異（圖 八）。 rstA 的基因缺損不影響細菌在酸環境下指數生長期的生長曲線以及酸逆境下 的存活率 為了更進一步確認 RstA/RstB 在克雷白氏肺炎桿菌裡是否扮演抗酸作用的角色，在此藉由測試在酸環境下的生長曲線以及酸逆境下的存活率分析。 在分析酸環境下的生長曲線，如圖九所示，rstA 缺損株於指數生長期在不同 酸 pH 值環境下的生長趨勢和野生株相比無明顯的差異，然而於靜止生長 期，rstA 缺損株的生長情形相較於野生株則較緩慢。在酸逆境比較方面， rstA 缺損株、rstB 缺損株或野生株的菌存活比例，也無明顯差異（圖十 A、 B）。 asr 的基因缺損對於細菌在酸環境下的生長曲線及酸逆境下的存活率影響不 大 在酸環境下， rstA/rstB 存在與否會顯著影響 asr 啟動子的活性表現，然 而並不影響細菌在酸性環境下指數生長期的生長曲線及酸逆境下的存活率。 因此，推測真正參予抗酸作用機制得藉由 asr 的表現。在此，我們利用同源 互換的方式建構 asr 缺損株（圖十一 A），並且以 DNA 電泳確認 asr 缺損株

(31)

示，asr 基因缺損會使其生長略慢於野生株。在酸逆境菌的存活率分析，如 圖十二 B 所示，其存活率與野生株的存活率相比僅相差百分之十（67.3％ →57.4％）。另一方面，野生株、asr 缺損株、asr 互補株在酸逆境的存活率 分析也無明顯差異（圖十二C）。 克雷白氏肺炎桿菌 Asr 蛋白於細胞質內會被切割 為了解 Asr 參予抗酸的機制，我們利用大腸桿菌表現系統大量表現 Asr 重組蛋白（圖十三 A），接著以 GST 管柱純化，並以 SDS-PAGE（圖十三 B）及利用西方墨點法分析（圖十三 C）。結果顯示，純化後的重組 Asr 蛋白呈現兩種片段的大小，大片段為完整的 Asr 重組蛋白，而小片段為 GST 接上 Asr 之 N 端部分的重組蛋白，由此，克雷白氏肺炎桿菌 Asr 的作用方式和大腸桿菌Asr 的作用方式可能相同，即 Asr 須經切割後才具有功能性。 rstA 的基因缺損不會影響 feo 啟動子的活性表現 在沙門氏菌，RstA/RstB 會活化 feoAB 的表現，為了解克雷白氏肺炎桿

菌 RstA/RstB 是否也會調控 feoAB 的表現，我們對 feo 啟動子進行活性分析，

如圖十四 A 所示，野生株與 rstA 缺損株在無含鐵離子、含 40 μM 鐵離子，

或加入 0.2 mM 螯鐵劑於 M9 培養液中，對於 feo 啟動子活性表現並沒有明顯

的差異（圖十四 A）。在此，為了在 rstA 缺損株中大量表現 RstA 並偵測 feo

(32)

µg/ml）及 tetracycline（10 µg/ml）兩種抗生素以維持兩種質體的存在，因此 造成細菌生長明顯變慢，活性分析也下降，無法觀測 feo 啟動子的活性表現

是否有差異（圖十四B）。

PhoP 於低鎂離子濃度會影響 rstA、rstB 啟動子的活性表現

如圖十五所示，在克雷白氏肺炎桿菌 rstA 的啟動子區域有 PhoP 及 RstA 的鍵結辨認序列。為了解在克雷白氏肺炎桿菌中，能感應鎂離子的 PhoP/PhoQ 調控系統是否會活化 rstA/rstB，在此我們比較在野生株與 phoP 缺 損株中 rstA 及 rstB 啟動子的活性表現。由啟動子活性分析結果：rstA 啟動子 於低鎂離子濃度活性表現量較高，其表現量在 phoP 基因缺損或高鎂離子濃

度下則相對較低（圖十六）。另外，由實驗室 EMSA 分析結果，也顯示

PhoP 會專一性的鍵結於 rstA 啟動子區域（附錄二）。由於 phoP 的基因缺損 會降低 rstA 啟動子活性，是否 phoP 的基因缺損對 rstB 啟動子活性也有影 響，在此，我們測試 rstB 啟動子活性表現，rstB 啟動子活性在高或低鎂離子 濃度表現差異不大（圖十七）；同於 rstA 啟動子活性測試結果，phoP 的基 因缺損會降低 rstB 啟動子的活性表現，在此證明 PhoP 會影響 rstB 啟動子的

活性表現。除了 PhoP 鍵結辨認序列，rstA 啟動子區域也有比對到 RstA 鍵結

辨認序列（圖十五），是否 rstA 的表現除了受到 PhoP 影響外，也會受到 RstA 自我調控，在此經由啟動子活性分析結果：rstA 啟動子活性於野生株中

(33)

表現量高，而於 rstA 缺損株中則活性下降，由此，RstA 也會去影響 rstA 啟 動子的活性表現（圖十八）。另外，實驗室 EMSA 結果也顯示，RstA 會鍵 結於 rstA 啟動子區域（附錄三）。 銅離子會影響 rstA、rstB、asr 啟動子的活性表現 克雷白氏肺炎桿菌中 RstA/RstB 調控系統所感應的訊息還未被報導，由前面實驗結果也顯示：RstA/RstB 會受到感應鎂離子濃度的 PhoP/PhoQ 所調 控，而 asr 啟動子活性表現會顯著受到 RstA/RstB 所影響。在此，我們分析 不同金屬離子對 rstA、rstB、asr 啟動子活性表現的影響。實驗結果顯示外加 銅離子對 rstA 啟動子活性表現影響不大（圖十九 A），然而會明顯降低 rstB 及 asr 啟動子的活性表現（圖十九 B、C）。 fur 的基因缺損會影響 rstA、rstB、asr 啟動子的活性表現

Fur 是細菌體內重要的調控因子（global regulator），可調控多種基因表 現，其鍵結辨認序列已被確認 (2)。我們以此特定鍵結序列分析克雷白氏肺炎 桿菌基因體序列時，在 rstB 啟動子區域找到ㄧ處可能為 Fur 鍵結辨認的序列

（圖二十 A）；在進一步的實驗顯示：fur 的基因缺損對 rstA 及 rstB 啟動子

的活性表現影響不大，然而卻會明顯降低 asr 啟動子的活性表現（圖二十 B）。

(34)

討論

雙分子調控系統是細菌體內傳遞訊號很重要的工具，已知有許多和細菌的致病性有關，單一菌體內往往擁有多套系統，使細菌因應不同環境以利存活 (34)。目前，許多套雙分子系統的功能已被鑑定，然而 RstA/RstB 的研究直到近兩年才有報告。大腸桿菌的 RstA/RstB 會受感應鎂離子濃度的 PhoP/PhoQ 所調控，並可活化和抗酸有關的 asr 表現 (29)；而沙門氏菌的 RstA/RstB 可活化和螯鐵有關之 feoA/feoB 的表現，使生成的 FeoB 可將體外

傳輸進細菌體內的二價鐵和 Fur 形成 Fur-Fe 複合體，此複合體進而去抑制 feoA/feoB、運鐵系統以及其他受 Fur 調控的基因表現 (17)。 由於克雷白氏肺炎桿菌中 rstA/rstB 及其前後基因組成和大腸桿菌及沙門 氏菌不同，因而推測其在功能表現上會有所不同，因此，本論文想探討 RstA/RstB 在克雷白氏肺炎桿菌裡所扮演的功能及角色。首先，在此建構的 rstA 及 rstB 缺損株於外觀上和野生株無明顯差異，而培養於富含養分的 LB 培養液或僅提供最低營養生長需求的 M9 培養液中，其生長情形和野生株相 比也無明顯的差異，因此 rstA 或 rstB 的基因缺損並不影響細菌的生長。 另外，為了解 RstA/RstB 是否會影響其對抗生素的感受性，我們分別於克雷白氏肺炎桿菌中轉殖帶有表現 RstA 的質體、在大腸桿菌中大量表現

(35)

RstA，以及在 rstB 缺損株比較不同抗生素的影響，實驗結果顯示於大腸桿菌 中大量表現 RstA 會對抑制細胞壁生合成的 cefotaxime 較敏感，其抑菌圈接近顯著差異值，因此要探討是否 RstA 會影響細菌對於 cefotaxime 的感受性，還需要進一步的驗證 (37, 42, 49)。 大腸桿菌的 RstA/RstB 已被證實會調控和酸逆境有關的 asr 基因表現， 然而在基因結構的比對上，大腸桿菌及克雷白氏肺炎桿菌 asr 前後的基因組 成不太一樣，在此我們推測不同菌種中 asr 在調控反應上可能有所不同。在 克雷白氏肺炎桿菌 asr 啟動子區域有 RstA 鍵結保留序列很相近的片段，推測 克雷白氏肺炎桿菌的 RstA 可能會影響 asr 啟動子的活性表現。在此，分析 asr 啟動子的活性表現結果顯示，在 pH 4.6 LPM 培養液中，rstA 的基因缺損 會顯著的影響 asr 啟動子的活性表現，而這樣的影響在 rstB 缺損時也觀測得 到。由以上的結果推測其調控路徑為磷酸化後的 RstB 將磷酸根傳遞給

RstA，接受到磷酸根的 RstA 會進一步調控 asr 的表現（RstB-RstA-Asr）。 在分析比對其他套雙分子調控系統的反應調節蛋白胺基酸序列，可以發現雖然反應調節區域有多個相同的天門冬胺酸，然而，經由比對多數磷酸化位置

為於D52，由此，我們推測 RstB 在接受到訊號刺激而磷酸化時，會將磷酸根

(36)

RstA/RstB 對於 asr 啟動子活性影響很大，因此推測 RstA/RstB 可能和抗 酸的調控作用有關，然而 rstA 或 rstB 的基因缺損並不影響細菌在酸逆境中的 存活率分析，對酸環境下的生長曲線也無顯著差異，因此 RstA/RstB 於克雷白氏肺炎桿菌裡並非直接和抗酸的作用有關，推測其真正行使抗酸功能還是得經由 Asr。此外，在大腸桿菌的研究中，他們發現 asr 缺損株在 pH 4.5 LPM 中的生長情況和野生株相比有明顯的差異，而在酸逆境中，asr 缺損株 的存活率和野生株相比有高達二十倍的差異（40％ → 2％）(38)。然而克雷 白氏肺炎桿菌，asr 缺損株和野生株在酸環境下的生長曲線以及酸逆境下的 存活率並沒有像大腸桿菌差異很明顯，在此推測可能是實驗所使用的條件下，Asr 並不是主要參予抗酸作用的蛋白。另外，由於細菌在接觸到酸時， 會有多種和酸相關的基因被同時誘導表現，所以儘管 asr 基因缺損，其他受 酸誘導的基因仍會被誘發表現而協助細菌在酸環境下可以存活下來 (39)。在此，由 Asr 表現純化及西方墨點法分析，我們發現重組蛋白 Asr 也會有被切割的情形，因此會純化出兩個大小的片段，這樣的情形如同大腸桿菌裡的 Asr，由此，我們推測 Asr 於大腸桿菌及克雷白氏肺炎桿菌的作用機制相似。由於 Asr 在大腸桿菌中被指出其於膜間隙會行使抗酸的作用，有推測指出其具有類似 HdeA 保護蛋白（chaperone）的功能，可以保護細菌在酸性環境下得以存活，也有推測指出 Asr 因為含有較多鹼性胺基酸，而使細菌在酸性環

(37)

境下可以減低傷害 (38)。在過去的研究中指出，酸性環境下，外界的氫離子會進入細胞內，當細胞內的 pH 值下降，細菌為了維持胞內離子的恆定，會將過多的氫離子中和或送出菌體外，其中，胞內鹼性胺基酸（Arg, His, Lys）的羧基於環境中 pH 值小於其 pKa 值時，羧基會與一個氫離子鍵結再輸送到胞外以維持胞內pH 值的恒定 (33)。分析克雷白氏肺炎桿菌 Asr，推測可行使抗酸功能的C 端部分經由序列比對，含有鹼性胺基酸的比例為 16/43。由於我們分析酸逆境存活率以及酸環境下的生長曲線差異性都不明顯，在此，藉由分析比較大腸桿菌及克雷白氏肺炎桿菌，我們發現其最大不同之處在於克雷白氏肺炎桿菌擁有較多的莢膜多醣體，或許包覆較多的莢膜多醣體可以使細菌在酸環境下擁有較多的保護而得以存活，因此，要觀察酸性環境下對克雷白氏肺炎桿菌特定基因是否有影響，或許可以於莢膜多醣體生成 量低的情況下進行分析。克雷白氏肺炎桿菌 rcsB 在實驗室的研究中發現其基 因缺損後，莢膜多醣體會明顯減少，並且在 M9 培養液中其酸逆境存活率和 野生株相比有顯著差異，在此，分析我們所使用的條件之下，rcsB 缺損株對 於酸逆境的存活率，實驗結果顯示沒有明顯差異，推測或許是 rcsB 缺損株仍 擁有少許的莢膜多醣體得以保護細菌，也或許是在本實驗所使用的條件無法觀測到差異值（附錄四）。

(38)

由於 RstA 會明顯影響 asr 啟動子的活性表現，因此我們推測 RstA/RstB 可能也會調控其他和抗酸作用有關的基因表現，在此分析實驗室研究和抗酸 作用相關的基因：hdeD、yfdX、yfiD。HdeD 是一個和抗酸有關的膜間隙蛋 白，且經由微陣列分析，在 gadX 大量表現於 pH 5.5 M9 培養液中，hdeD 可 以被誘發表現 (15, 30)；而 yfdX 在大腸桿菌中座落於 evgA/evgS 附近，因而被推測與酸有關 (16, 21)；有關於 YfiD 則是在大腸桿菌被報導與抗酸的作用有關，其啟動子活性在有氧及菌生長靜止期時有較高的表現，而在克雷白氏肺 炎桿菌，yfiD 被實驗室證明在微氧弱酸環境下表現量較高 (46, 50)。然而由實 驗結果顯示，克雷白氏肺炎桿菌的 RstA 並不會影響 hdeD、yfdX、yfiD 啟動 子的活性表現。 在沙門氏菌有報導指出 RstA/RstB 會調控和螯鐵有關的 feoA/feoB 表現， 然而在我們以啟動子活性分析的結果上並沒有得到相同結果；而在沙門氏菌的研究是在大量表現 RstA 的情況下才看的出差異，因此，我們也在克雷白氏肺炎桿菌中大量表現 RstA，並偵測 feo 啟動子的活性表現，然而在此同時 加入兩種抗生素以維持兩種質體存在於細菌體內的情況下，即使我們將抗生素濃度各減半，甚至嘗試將 Tetracycline 的濃度降為 5 微毫克/毫升，細菌的生長狀況仍舊較慢，並且偵測到的活性表現量也相對較低，因此要探討在克

(39)

雷白氏肺炎桿菌裡，RstA/RstB 是否會調控 feoA/feoB，可能需要藉由其他實驗，例如real-time PCR 來驗證。

在大腸桿菌中已知會感受低鎂離子濃度的 PhoP/PhoQ 會影響 rstA/rstB 的

表現，因此我們想了解克雷白氏肺炎桿菌中的 PhoP/PhoQ 是否也會調控

RstA/RstB 的表現。首先在序列的分析上，rstA 啟動子區域有 PhoP 及 RstA

鍵結辨認序列，並且經由實驗室 EMSA 結果可進一步確定 PhoP 的確會鍵結 於 rstA 啟動子區域。在啟動子活性分析方面， rstA 啟動子活性於低鎂離子濃 度下表現量較高，而在高鎂離子濃度以及 phoP 基因缺損下則活性相對較 低。由於 PhoP/PhoQ 會去調控 rstA 啟動子的活性表現，在此我們也想了解 PhoP/PhoQ 是否也會去調控 rstB 的表現，由實驗結果顯示 rstB 啟動子活性在 高或低鎂離子環境下，啟動子活性表現結果差異不大，然而 phoP 基因的缺 損，則會降低 rstB 啟動子的活性表現，因此我們推測 rstB 也會受 PhoP/PhoQ 所調控。經序列分析， rstA 啟動子區域也有 RstA 鍵結保留序列，因此我們

推測 RstA 會有自我調控的機制，在此，實驗室 EMSA 的結果顯示 RstA 會鍵

結於其啟動子區域，並且在啟動子活性分析結果也顯示 rstA 啟動子活性於低 鎂離子濃度下表現量較高，而將 rstA 基因缺損則會使活性下降，由此可以證

實 RstA 會自我調控表現。此外，儘管 rstA 缺損，rstA 啟動子的活性表現仍

(40)

另外，已知 RstA/RstB 會受到感應鎂離子變化的 PhoP/PhoQ 所調控，然而對於 RstA/RstB 這套系統是否會感應特定金屬離子仍未知，也因為 asr 目 前僅了解其和抗酸有關以及知道它可以受到感應磷離子濃度的 PhoB/PhoR 所 影響，所以在此想進一步了解不同離子對於 rstA、rstB、asr 啟動子活性表現 的影響。在此結果顯示銅離子的作用會降低 asr、rstB、rstA 啟動子的活性表 現，因此推測 rstB 在感應到銅離子後可能會經由 RstA 影響 asr 的表現。而由 於銅離子會參予細胞內酵素的反應，因此推測銅離子也會直接影響 Asr 的酵素活性表現 (52)。有報導指出經由微陣列實驗分析，0.2 mM 的鋅可以誘導

rstA、rstB 及 asr 的表現，而本實驗使用的鋅離子濃度為 1 mM，rstA、rstB

及 asr 的啟動子活性表現就明顯降低，我們推測這樣的環境下，可能鋅離子

濃度過高，所以活性下降，因此對於 RstB-RstA-Asr 的訊號傳遞，我們推測

其也會受到鋅離子所影響。

Fur 被報導可以調控多種基因表現，為了解 Fur 是否會調控 rstA/rstB 以 及影響 asr 的啟動子活性表現。首先，經由序列分析， rstB 的啟動子區域有

一處 Fur 鍵結保留序列，然而在啟動子活性分析測試結果，fur 的基因缺損並

沒有明顯降低 rstA、rstB 啟動子的活性表現，因此推測或許是 rstA/rstB 本身 表現量不大，而看不出明顯的影響。而在觀測 asr 啟動子活性方面，fur 的基 因缺損會明顯降低 asr 啟動子的活性表現（從 5900 減少到 3600 miller

(41)

units），由此推測 Fur 可能藉由 RstB/RstA 或藉由自己影響 asr 啟動子的活性 表現。綜合以上對於克雷白氏肺炎桿菌RstA/RstB 的研究，我們推測 RstA/RstB 調控路徑，如附錄一所示RstA/RstB 非專一的接受 PhoP/PhoQ 的調控，也非 單一的調控和酸有關的 asr，在此暗示著 RstA/RstB 調控系統可能參予更複雜 的調控路徑，進而協調克雷白氏肺炎桿菌裡多項刺激訊號傳遞。

(42)

參考文獻

1. GST Gene Fusion System Handbook. Amersham Biosciences.

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(49)

表一：Bacterial strains used in this study

Strains Descriptions Reference or source

E. coli：

JM109 RecA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 rolA1thi △(lac-proAB)

Laboratory stock S17-1 λ pir Tpr Smr recA, thi, pro, hsdR－

M+ [RP4-2-Tc::Mu:KmrTn7]（pir）

(10) BL21（DE3） F– ompT hsdSB(rB

–

mB–) gal dcm met Laboratory stock

K. pneumoniae：

CG43 K2 serotype Laboratory stock

CG43S3 △rspL, Str Laboratory stock

CG43-101 Curing the large plasmid pLVPK from

CG43 Laboratory stock

CG43S3-Z01 CG43-S3 △lacZ Smr _{Laboratory stock}

CG43S3△rstA CG43-S3 △rstA Smr This study

CG43S3△rstB CG43-S3 △rstB Smr This study

CG43S3△asr CG43-S3 △asr Smr This study

CG43S3-Z01△rstA Z01△rstA Smr This study

(50)

表二：Plasmids used in this study

Plasmid Relevant characteristic Source or reference yT&A PCR cloning vector, Apr Yeastern Biotech _Co. pKAS46 Suicide vector；Kmr, Apr, Strs (41)

pRK415 Broad-host-range IncP cloning vector, Tcr (18)

pLacZ15

A derivative of pYC016 (19), containing a promoterless lacZ from K. pneumoniae CG43S3

as the reporter, Cmr

(21)

pGEX-5X-1 GST-tagging protein expression vector, Apr (5) pHY015 SacI/XbaI digested fragment of pHY014 cloned into pKAS46 Laboratory stock

pHY048 450 bp BamHI/BglII digested fragment of the putative rstA promoter region was cloned _{into pLacZ15} Laboratory stock pHY089 700 bp EcoRV/SacI digested fragment of expressing RstA cloned into pET30b Laboratory stock

pHY091 rstA gene with no C-terminal domain was digested by SalI and cloned into pET30b Laboratory stock pHY110 1.1 kb EcoRI/PstI fragment containing the putative rstA promoter and rstA was cloned _{into pRK415} Laboratory stock pHY112 3 kb HindIII digested fragment containing putative rstA promoter, rstA, rstB promoter _{region, and rstB was cloned into pRK415} Laboratory stock pHY070 400 bp BamHI/BglII digested fragment containing the putative mgtA promoter was cloned _{into pLacZ15} Laboratory stock pfeoZ15 564 bp BamHI/BglII digested fragment containing the putative feo promoter was cloned _{into pLacZ15} Laboratory stock pirocyZ15 455 bp BamHI/BglII digested fragment containing the putative iro promoter was cloned _{into pLacZ15} Laboratory stock pYjcC525 525 bp BamHI/BglII digested fragment containing the putative yjcC promoter was cloned

into pLacZ15 Laboratory stock

pYfdX 417 bp BamHI/BglII digested fragment containing the putative yfdX romoter was cloned _{into pLacZ15} Laboratory stock pYfiD02 302 bp BamHI/BglII digested fragment of pYfiD01 cloned into the BamHI site of _pLacZ15 Laboratory stock

(51)

pHdeD 417 bp BamHI/BglII digested fragment containing the putative HdeD promoter was _{cloned into pLacZ15} Laboratory stock pAsr2-2 270 bp BamHI/BglII digested fragment containing the putative asr promoter was cloned _{into pLacZ15} This study pAsr-2-yT 2.3 kb PCR product containing the asr, the upstream of asr, and the downstream of asr _{was cloned into pyT&A} This study pAsr-m-yT The 4.7 kb fragment containing no asr gene amplified from pAsr-2-yT by using PCR, and _{then was religated} This study pAsr-m-46 The fragment which was digested from pAsr-m-yT by using SacI/XbaI was cloned into _pKAS46 This study pGEX-5X-1-Asr 200 bp PCR product of asr with no signal peptide was cloned into pGEX-5x-1 This study pRstB-2-yT 3.3 kb PCR product containing the rstB, the upstream of rstB, and the downstream of rstB _{was cloned into pyT&A} This study pRstB-m-yT The 4.7 kb fragment containing no rstB gene amplified from pRstB-2-yT by using PCR, _{and then was religated} This study pRstB-m-46 The fragment which was digested from pRstB-m-yT by using EcoRI/XbaI was cloned _{into pKAS46} This study pRstB 300 bp PCR product carrying PrstB cloned into the BamHI site of pLacZ15 This study

pAsr-c-yT 550 bp PCR product carrying asr and Pasr cloned into yT&A This study

(52)

表三：Primers used in this study Primer Sequence RstA04 5'-CAGGTCGAGCTCTTTAAGGG-3' RstAp01 5'-GCAGGATCCCGGTGAAATAC-3' YWp01 5’-ATGCTGCGGATCCGTTTT-3’ YWp02 5’-CGGCAACGACCAGATCTAATAC-3’ YWp07 5’-GCAGAATGTTCGGATCCGCCTATG-3’ YWp08 5’-GCTACCACCACCAAGATCTCGTCGTTA-3’ YWp09 5’- GGTCATGGGCTTTATTGGATTACTGGT-3’ YWp10 5’- CATTATGGTGCGTTCGATTGGACTC-3’ YWp11 5’- CGGCAACGACCATGGCTAATACTT-3’ YWp12 5’- GCACCATGGTCAGGGCGTTAAG-3’ YWp14 5’-CCAGAATTCGCCGATGCGGCAAGCACCACCCC-3’ YWp15 5’-CTTCTCGAGCCATTATGCCGCCGGTTTA -3’ YWp16 5’-GCTGACCGATATGATTGTGCC-3’ YWp17 5’-TATTTAAACATCAAGCGCAGGGTA-3’ YWp18 5’-GAGCCCTATCGTATTAAGACCGTTCGCA-3’ YWp19 5’-TCGGCATCATAGTTCAGCAGCTCGC-3’ YWp20 5’-ATAGGATCCCAGAAAGCAGACGAAGAGCAGAAGAT-3’ YWp21 5’- ATTGGATCCTAGCTGCCTGATTTCACCTCTGCC-3’ YWp27 5’- CACGGATCCGGTAGACATTCCTTATTAT-3’ YWp28 5’- GAAGATAGATCTGCACGAACAGCT-3’ YWp31 5’-CCACGGATCCGGTAGACATTCCTTA-3’ YWp32 5’-GAATTCAGATTTTTGCAGCATACCCAGCCC-3’ YWp33 5’- GCAGCGCCAGCCTTCCAGCATCATC-3’ YWp34 5’- GGCGCTGTTCAGCGCCGGTTTATCA-3’

(53)

K. pneumoniae MGH78578

rstA rstB ydgC

ydgB ydgI

ydgH HP tus fumC fumA

E. coli K-12 MG1655 rstA rstB ydgB ydgI ydgH tus ydgC

fumC fumA manA ydgA

rstA ompN ydgC ydgI ydgH stm1474 stm1472 rstB S. enterica serovar Typhimurium LT2

1 kb

tus fumC fumA K. pneumoniae MGH78578