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149-62.
柒、圖表
A.
B.
圖一、Osm10 在液態培養基中的含量變化情形。
A. 懸浮培養水稻細胞期間，定期取定量培養基 (10 μL) 進行 15% SDS-PAGE 及 銀染呈色。B. 將圖 A 的銀染呈色結果，利用 Fujifilm LAS-3000 影像分析儀進行 拍攝，並以 Multi Gauge V2.1 影像分析軟體分析 Osm10 蛋白質含量的變化情形，
圖中的數據為三個重複的平均值及其標準差。
0 2 4 6 8 10 12 14
2 4 6 8 10 12 14
Culturing days Osm10 intensity (x106 U)
A.
B.
圖二、水稻細胞培養七天後，分泌性蛋白質樣品中 Osm10 的測量值與總蛋白質 量的相關性。
A. 在水稻細胞培養七天後，將 80％硫酸銨飽和度鹽析的分泌性蛋白質 2.5 – 15 μg 進行 15% SDS-PAGE 及 CBB 呈色。B. 將圖 A 的 CBB 呈色結果，利用 Fujifilm LAS-3000 影像分析儀拍攝，並以 Multi Gauge V2.1 影像分析軟體分析 Osm10 蛋 白質含量，作出 Osm10 測量值與分泌性蛋白質總量的線性關係圖。
y = 385363x + 2E+06 R² = 0.9962
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Amount of secretory proteins (μg) Osm10 intensity (x106 U)
圖三、水稻細胞培養七天後，Osm10 佔全部分泌性蛋白質的比例分析。
培養七天後的水稻細胞分泌性蛋白質樣品 (10 μg) 進行 15% SDS-PAGE 及 CBB 呈色。Lane 1 – 4 為各自獨立的水稻分泌性蛋白質樣品。
表一、培養七天後的水稻細胞分泌性蛋白質樣品中，Osm10 的含量比例。
將圖三的 CBB 呈色結果，利用 Fujifilm LAS-3000 影像分析儀拍攝，並以 Multi Gauge V2.1 影像分析軟體分析樣品的 Osm10 含量與總蛋白量的測量值，將兩者 相除即為 Osm10 含量比例。
Sample # Osm10 含量 (U) 總蛋白量 (U) Osm10 含量比例 (%)
1 78518586.16 277067826.39 28.3
2 77294278.16 254157218.39 30.4
3 76342898.16 237931894.39 32.1
4 77389817.16 238502078.39 32.4
平均 77386394.91 251914754.4 30.7
標準差 890550.3 18376851 4.8
圖四、水稻細胞分泌性蛋白質的二維膠體電泳分析結果。
水稻細胞分泌性蛋白質 (10 μg) 經過 80%飽和濃度硫酸銨濃縮與二次水透析之 後，以 pH 3-10 的 IEF 膠體電泳與 15% SDS 膠體電泳進行分離，並以 CBB 染色。
圖中標示 I、II、III 為取樣進行 LC-MS/MS 蛋白質定序的樣品位置。
表二、Osm10 蛋白質的胺基酸定序結果。
灰底為樣品定序與蛋白質資料庫的序列吻合的片段，sequence coverage 為樣品定序符合蛋白質資料庫序列的比例。
Sample Gene locus Amino acid sequence Sequence
coverage
Designated name I Os11g0114900 MARPANNNYAAAVMVVALLVAAPAASAVTC
GQVVSMLAPCIMYATGRVSAPTGGCCDGVR TLNSAAATTADRQTTCACLKQQTSAMGGLR PDLVAGIPSKCDVNIPYAISPSTDCSRVH
42% Osm10-I
II Os12g0114500 MARAANNKYVAAVMVVALLLAAPAASAVTC GQVVSMLAPCIMYATGRVSAPTGGCCDGVRT LNSAAATTADRQTTCACLKQQTSAMGGLRPD LVAGIPSKCGVNIPYAISPSTDCSRVH
66% Osm10-II
III Os01g0822900 MAPRCATLAVVVVLVAAVVAPPTAVRAAISCS AVYNTLMPCLPYVQAGGTVPRACCGGIQSLLA AANNTPDRRTICGCLKNVANGASGGPYITRAA ALPSKCNVSLPYKISTSVNCNAIN
66% Osm10-III
表三、Osm10 的推定物化性質。
MW: molecular weight, pI: isoelectric point
Signal peptide 為 SignalP 3.0 Server 分析結果；MW 與 pI 為 ExPASy Proteomics Server 分析結果。
Desinated name Chromosome # Signal peptide (aa) MW (kDa) pI Osm10-I 11 27 12.00 (9.39)* 8.49 (8.20) Osm10-II 12 26 11.98 (9.41) 8.90 (8.52) Osm10-III 1 26 12.09 (9.46) 9.28 (9.07)
*註：括號中的數值是除去 signal peptide 之後的 MW 與 pI 值。
圖五、Osm10-I~III 的胺基酸序列特徵分析結果。
灰底為 LTP 保守性的 8-Cys motif；方框為 LTP1 的兩段保守性胺基酸序列 (T/S-X-X-D-R/K 與 P-Y-X-I-S) (Douliez et al., 2000)；H1 ~ H4 是形成 α-helix 的序 列。
表四、Osm10 與已知功能的 LTP 之胺基酸序列相同度比較。
Amino acid sequence identity Function Reference Osm10-I Osm10-II Osm10-III
Osm10-I 100% 96% 39%
Osm10-II 96% 100% 39%
Osm10-III 39% 39% 100%
P29420 52% 52% 35% Antifungal activity Terras et al. 1992 Q43871 49% 50% 44% Antifungal activity Molina and
Garcia-Olmedo 1993
Q43766 46% 50% 40% Antifungal activity Molina and
Garcia-Olmedo 1993 Q43767 49% 52% 43% Antifungal activity Molina and
Garcia-Olmedo 1993 Q41258 27% 26% 23% Antifungal activity Cammue et al. 1995 Q2QYL3 48% 49% 42% Antifungal activity Cammue et al. 1995 ABO28527 54% 55% 42% Antifungal activity Kirubakaran et al. 2008 Q8W453 -* 23% 24% SAR Signaling Maldonado et al. 2002 CAA65680 49% 50% 38% Cutin formation Hollenbach et al. 1997 Q9SW93 53% 52% 41% Pollen tube growth Park et al. 2000 Q03461 53% 54% 47% Cell wall loosening Nieuwland et al. 2005
*註：「-」表示序列間相同度太低，BLAST 結果不具參考意義。
圖六、Osm10-I、Osm10-II、Osm10-III 的保守性胺基酸序列立體位置。
本研究利用 SWISS-MODEL Server 模擬 Osm10 的立體結構，Osm10-I 與 Osm10-II 的模板編號都是 1fk5A，與模板的序列相同度分別是 59.14%以及 60.22%；
Osm10-III 的模板編號是 2algB，與模板的序列相同度是 48.91%。使用 PyMOL 軟體以「cartoon」模式呈現 Osm10 模型，紅色部分是 LTP1 保守性序列
T/S-X-X-D-R/K，藍色部分是 LTP1 保守性序列 P-Y-X-I-S，superimpose 為將兩模 型重疊在一起。
A. B.
圖七、Osm10-I & II 與 Osm10-III 的疏水性凹陷開口之差異。
使用 PyMOL 軟體以「surface」(左) 及「cartoon」(右) 模式呈現 Osm10 模型，紅色部分是 LTP1 保守性序列 T/S-X-X-D-R/K，藍色部 分是 LTP1 保守性序列 P-Y-X-I-S，黃色部分是非極性胺基酸，Osm10 的疏水性凹陷開口處之差異以紅圈標示。A、B 圖為以不同角度 觀察 Osm10 立體模型的影像。
A.
B.
圖八、Osm10-I~III 與其他功能性蛋白質的立體結構比對。
取具有不同生物功能的 LTP 與 Osm10-I~III 以 PyMOL 軟體進行立體結構的相似 程度分析。ABO28527 (抗真菌活性) 的模板編號是 1fk5A，與模板的序列相同度 是 68.48%；Q8W453 (SAR 訊息傳遞分子) 的模板編號是 2rknA，與模板的序列 相同度是 100%；Q9SW93 (與花粉管生長相關) 的模板編號是 2algB，與模板的 序列相同度是 57.14%。
A. Osm10-I~III 與 ABO28527、Q8W453 及 Q9SW93 的基本立體結構比對。
B. Osm10-I~III 與基本立體結構相似的 LTP（ABO28527 及 Q9SW93）的立體結 構比對。
表五、Osm10 基因的啟動子區域所含有的 cis-acting elements 一覽表。
「Y」代表啟動子包含的 cis-acting elements，「N」代表啟動子不包含的 cis-acting elements。