水稻細胞主要分泌性蛋白質（Osm10）的鑑定與分析研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系. 碩士論文. 水稻細胞主要分泌性蛋白質（Osm10）的鑑定與分析研究 Identification and characterization of a major extracellular protein (Osm10) secreted by suspension-cultured rice cells. 研究生：周坤 Kun Chou. 指導教授：王玉麒. 博士. Dr. Yu-Chie Wang. 中華民國 101 年 8 月.

(2) 致謝感謝上帝在我讀碩士班的期間無時無刻充足的供應，在我面臨困難感到沮喪的時候，使事態發生戲劇化的好轉，讓我順利地完成碩士班的學業。感謝指導教授王玉麒老師，教導我做研究所需具備的積極、勇敢、細心的態度，並且在修改我的論文的時候付出了很多的時間與心血，一一訂正我的錯誤。感謝口試委員張永達老師與周雪美老師，給予我諸多改正論文的建議，使這篇論文更加完整。感謝超凡學長和政霖學長教導我許多實驗的方法、分享了許多讀碩士班的心路歷程、毫不吝嗇的提供各種的幫助，使我讀碩士班的過程比起他們輕鬆很多。感謝哲雄學長的鼓勵，以及韻如、宗明、泰霖、奕輝、國華、國緯等實驗室同伴們互相切磋、討論實驗的心得，給予我莫大的幫助。感謝雋絜常常的關心、為我做了非常多的付出，是我重要的心靈支柱。特別感謝我的父母在我讀碩士班期間的完全支持，在我遭遇挫折時給我最真摯的安慰。謝謝外婆、奶奶、舅舅們、姑姑們和哥哥的關心，全力的支持我、滿足我的各種需要。能夠完成論文，我的家人們是最大的功臣。. 2.

(3) 目錄中文摘要..................................................................................................... 1 英文摘要..................................................................................................... 4 壹、緒論..................................................................................................... 6 一、以水稻組織培養細胞為研究模式系統................................................................ 6 二、LTP 的物化性質 ................................................................................................... 7 三、LTP 的結構特徵 ................................................................................................... 8 四、LTP 的表現特性 ................................................................................................... 9 五、LTP 的功能 ......................................................................................................... 10 六、研究的重要性...................................................................................................... 14. 貳、研究材料與方法 .............................................................................. 16 一、水稻與野生稻細胞的懸浮培養方法.................................................................. 16 二、細胞培養液內蛋白質的收集.............................................................................. 16 三、蛋白質定量.......................................................................................................... 16 四、膠體電泳分析...................................................................................................... 17 五、定量 SDS-PAGE 蛋白質 band ............................................................................ 18 六、Osm10 的蛋白質體學鑑定 ................................................................................. 18 七、Osm10 序列相關資訊的資料庫分析 ................................................................. 20 八、水稻組織蛋白質的萃取...................................................................................... 20 九、抗血清的製作與分析.......................................................................................... 21 十、Osm10 的免疫染色分析 ..................................................................................... 25 十一、植物激素處理水稻細胞.................................................................................. 26 十二、水稻培養基蛋白質的 in vitro 抗真菌分析 .................................................... 26. 参、結果................................................................................................... 27 I.

(4) 一、Osm10 於水稻懸浮培養細胞的表現特性 ......................................................... 27 二、Osm10 基因的鑑定 ............................................................................................. 28 三、Osm10 的胺基酸序列特徵分析 ......................................................................... 29 四、Osm10 的立體結構特徵分析 ............................................................................. 30 五、Osm10 的表現特性分析 ..................................................................................... 33 六、Osm10 的 in vitro 抗真菌活性分析 ................................................................... 37. 肆、討論................................................................................................... 38 一、水稻細胞懸浮培養期間，培養液中成分的變化情形...................................... 38 二、Osm10 在最新分類系統中屬於第一型的 LTP ................................................. 38 三、Osm10-I 與 Osm10-III 為首次被發現會被水稻懸浮培養細胞分泌 ............... 39 四、Osm10-I 與 Osm10-II 可能源於同一基因 ......................................................... 40 五、由一級與三級結構分析 Osm10 的功能性 ........................................................ 41 六、Osm10 可能是懸浮培養細胞專一性表現蛋白質 ............................................. 43 七、Osm10 基因對稻屬植物而言可能具有演化上的意義 ..................................... 45 八、Osm10 的表現可能不受抗病反應或逆境相關激素影響 ................................. 45 九、Osm10 可能不具 in vitro 抗真菌活性 ............................................................... 47 十、Osm10 的啟動子在基因工程方面的應用潛力 ................................................. 47. 伍、結論................................................................................................... 50 陸、參考文獻........................................................................................... 52 柒、圖表................................................................................................... 61 附錄........................................................................................................... 83. II.

(5) 摘要水稻細胞在懸浮培養條件下會分泌多種蛋白質至培養液中，其中有一分子量約 10 kDa 的蛋白質 (簡稱 Osm10) 的含量豐富，約佔全部分泌蛋白質總量的 30%，本研究的目的即在鑑定生合成此蛋白質的基因與探討其表現特性。為能鑑定 Osm10 的生合成基因，本研究首先利用二維膠體電泳將水稻細胞的分泌性蛋白質進行分離，再經蛋白質體學的方法分析後，得知 Osm10 主要包含三種蛋白質，命名為 Osm10-I、Osm10-II 及 Osm10-III，皆屬第一群脂質傳送蛋白 (lipid transfer protein 1, LTP1) 的成員。Osm10-I 與 Osm10-II 之間胺基酸序列相同度達 96%，而 Osm10-III 和另兩個 Osm10 成員差異較大，胺基酸序列相同度都只有 39%。立體結構模擬的結果顯示 Osm10-I 及 Osm10-II 屬於典型的 LTP1，保守性序列 D71、R72 及 Y107 位於疏水性凹陷區域的開口周圍； Osm10-III 則屬於特殊的 LTP1，由第一與第三個 α-helix 圍成疏水性凹陷區域的開口，此立體結構的差異可能使 Osm10-III 具有與 Osm10-I、 Osm10-II 不同的生理功能。若將 Osm10 與其他已知功能的 LTP 比較， Osm10-I 及 Osm10-II 的胺基酸序列與大多數 LTP 的相同度約為 50%，而 Osm10-III 與這些 LTP 的相同度則約為 40%；Osm10-I 及 Osm10-II 的立體結構最接近具抗真菌活性的 LTP (ABO28527)，而 Osm10-III 1.

(6) 的立體結構最接近與花粉管生長有關的 LTP (Q9SW93)。利用資料庫分析 Osm10 基因的啟動子序列，結果顯示其序列可能具有種子專一性表現以及受多種植物激素與生物及非生物逆境調控的特徵。本研究發現不僅是多種栽培稻，五種野生稻（O. alta、O. glaberrima、O. mtipogon、O. nivara、TWR-6）的細胞也同樣擁有 Osm10 基因且表現模式與栽培稻細胞一致，顯示 Osm10 可能在稻屬植物間具有特殊的生理功能。然而在本研究的分析條件之下，除了懸浮培養細胞的培養基中之外，水稻的種子、幼苗、成熟植株、花及發育中的種子都沒有發現有 Osm10 的表現，顯示 Osm10 可能是懸浮培養細胞專一性表現的蛋白質，或是必須使用更靈敏地分析方法才能確認 Osm10 的表現部位與表現時序特徵。本研究也使用與抗病或逆境相關的植物激素（SA、MeJA 與 ABA）來處理水稻細胞，結果並未觀察到顯著的差異變化。取水稻細胞的分泌性蛋白對四種水稻病原真菌（Rhizoctonia solani、Fusarium moniliforme、Bipolaris oryzae 和 Sarocladium oryzae）進行 in vitro 的抗真菌實驗，結果真菌的生長並不受抑制，可能代表 Osm10 不具備抑制受測病原真菌生長的活性。本研究發現 Osm10 基因具備在懸浮培養的水稻細胞中專一且大量表現的特性，其啟動子及分泌調控序列可能具有應用於以懸浮培養的水稻細胞作為生物反應器，來生產高附加價值的外源重組蛋白質的 2.

(7) 潛力，除了可提升植物基因工程的應用之外，亦可避免基因改造植物對生態環境造成衝擊的疑慮。. 關鍵字：水稻、懸浮培養細胞、脂質傳送蛋白、分子模擬. 3.

(8) Abstract Suspension-cultured rice cells secrete various proteins into the culturing medium, and over 30% of these secretory proteins were found to be a protein of 10 kDa in molecular mass (hereafter referred to as Osm10 protein). The aims of this research are to identify the encoding gene and to investigate the plausible functions and expression pattern of Osm10 in rice plants. To identify Osm10 gene, Osm10 was first purified from 2-D gel electrophoresis, and analyzed using proteomic analytical methods. The results showed that Osm10 indeed consisted of 3 distinct proteins, designated as Osm10-I, Osm10-II and Osm10-III, and all of which are LTP1 proteins. Among these three Osm10 proteins, Osm10-I and Osm10-II share 96% amino acid sequence similarity, while Osm10-III only exhibits 39% sequence identity to the other two. Besides, 3D structural simulation pointed out that Osm10-I and Osm10-II are both typical LTP1s according to their conserved amino acid residues (D71, R72 and Y107) locating around the opening of hydrophobic cavity, while Osm10-III is an atypical LTP1 due to its opening of hydrophobic cavity surrounded by the 1st and 3rd α-helix. Structural difference of Osm10-III may contribute to a unique protein function other than common LTP1s. Sequences comparison with well studied LTPs also indicated that, Osm10-I and Osm10-II are about 50% identical to most of them, while Osm10-III shows only 40% identity. Structures of Osm10-I and Osm10-II resemble LTP with antifungal activity (ABO28527), on the other hand, Osm10-III are most like LTP relating pollen tube growth (Q9SW93). 4.

(9) Analysis of Osm10 genes promoters revealed that their expression may be seed-specific and are regulated by plant hormones, biotic and abiotic stresses. We found out that not only cultivated rice but also 5 species of wild rice (O. alta, O. glaberrima, O. mtipogon, O. nivara and TWR-6) cells highly express Osm10, which revealed that Osm10 proteins may play an important role in Oryza genus. Nevertheless, Osm10 proteins were only detected in cultured cell medium, not in seeds, intact seedlings, flowers and immature seeds. Treatment with pathogen or stress resistance hormones (SA, MeJA and ABA) didn’t alter Osm10 expression. Secretory proteins of rice cells were also tested their anti-fungal activity against 4 fungal phytopathogens (Rhizoctonia solani, Fusarium moniliforme, Bipolaris oryzae and Sarocladium oryzae), but the growth of all the fungi being tested were not inhibited, indicating that Osm10 may not possess in vitro antifungal activity against the 4 fungi tested in the research. These results, overall, indicates that expression of Osm10 may be suspension-cell-specific. The suspension-cell-specific and highly-expressing feature of Osm10 gene suggest a highly profitable application of its promoter in production of heterologous recombinant protein within rice cell culture system, which can also be used to avoid the doubt of gene-modified crops in environmental aspect.. Keyword: rice, suspension cell, lipid transfer protein, molecular modeling. 5.

(10) 壹、緒論一、以水稻組織培養細胞為研究模式系統水稻的胚在適當培養基中能被誘導形成逆分化的癒傷組織 (callus)，若將癒傷組織移置於含有 10 μM 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) 的液態 Murashige-Skoog (MS) 培養基 (Murashige & Skoog, 1962) 中進行懸浮培養，則癒傷組織將逐漸形成穩定分裂生長的懸浮細胞團。早期，植物組織培養常被用來研究植物的遺傳學、生長發育情形和作物的育種研究 (Phillips, 1993)；隨著組織培養技術的日漸進步，目前已建立出一些模型系統 (model system)，可提供植物生理方面的基礎研究 (Decker et al., 2006)。相較於植物植株的各組織部位具有生理差異，懸浮培養的細胞為一個均質的系統，並且具有方便重複操作的優點，很適合進行基因轉殖或生物與非生物因子的處理，以觀察特定基因的表現情形與調節機制。懸浮培養細胞在培養過程期間，會分泌多種蛋白質於培養液中，這些分泌性蛋白質的 N 端常帶有 20 – 25 個胺基酸長度的訊號序列 (signal peptide) (Emanuelsson et al., 2007)，經由特定路徑而分泌於胞外 (apoplast)。Jung 等人於 2008 年以二維電泳法分析水稻的葉片細胞壁蛋白質體與懸浮培養細胞的分泌蛋白質體 (secretome)，發現兩者之間的重複性很低，只有 6 個交集的蛋白質。此外也發現懸浮培養細 6.

(11) 胞的分泌性蛋白質中，多數 (約 64％) 為與防禦機制相關的蛋白質 (Jung et al., 2008)。Cho 等人於 2009 年以多維蛋白質鑑定技術 (multi-dimensional protein identification technology, MudPIT) 分析水稻懸浮培養細胞的分泌蛋白質體，鑑定出 154 種分泌性蛋白質，是 Jung 等人於 2008 年的研究鑑定出的蛋白質 (30 種) 的 5 倍多，這些分泌性蛋白質主要分為細胞壁修飾、維持結構與細胞防禦等三種功能 (Cho & Kim, 2009)。本研究主要以懸浮培養的水稻細胞為材料，發現水稻細胞所分泌的蛋白質當中，有一群分子量約為 10 kDa 的蛋白質 (Oryza sativa medium 10-kDa protein，簡稱 Osm10) 表現量最為豐富，約佔全部分泌蛋白質總量的 31%。本研究利用二維膠體電泳將 Osm10 分離、經蛋白質酶水解，並以 LC-MS/MS 定序其胺基酸序列，再進行基因資料庫比對後，得知其為三種第一群脂質傳送蛋白 (lipid transfer protein 1, LTP1)，本研究將進一步探討此三種 LTP1 的功能與表現特性之差異。二、LTP 的物化性質 LTP 是鹼性、小分子量的脂質結合蛋白質，目前已知 LTP 可以和多種脂質與疏水性分子結合，包括脂肪酸 (fatty acid) (Zachowski et al., 1998)、脂肪醯輔酶 A (fatty acyl CoA) (Lerche et al., 1997)、溶血磷脂 7.

(12) 醯膽鹼 (lysophosphatidylcholine) (Gomar et al., 1996) 以及磷脂醯甘油 (phosphatidylglycerol) (Pons et al., 2003)；疏水性凹陷區域的結構差異能控制脂質結合的特性，例如只有第二群脂質傳送蛋白能與固醇結合 (Cheng et al., 2008)。三、LTP 的結構特徵 LTP 目前僅於各種開花植物當中被發現，例如番茄 (Tomassen et al., 2007)、水稻 (Liu et al., 2002)、玉米 (Castro et al., 2003) 等等，並且同物種之內的 LTP 數量眾多，形成一個多基因型家族 (multigenic family)，例如水稻 (Oryza sativa) 擁有 52 個 LTP 基因、阿拉伯芥 (Arabidopsis thaliana) 則有 49 個 (Boutrot et al., 2008)。植物的 LTP 分為兩群：LTP1 與 LTP2，兩者之間的分別在於分子量的不同：LTP1 約為 9 kDa，而 LTP2 則約為 7 kDa。此兩群 LTP 之間胺基酸的同源性低，只有約 30%的相同度，但是具有相似的立體構型 (Douliez et al., 2001)，兩者共同的結構特徵為：LTP 包含四至六個 α-helices 構造，在其中四個 α-helices 之中特定的位置上，具有八個保守性的 cysteine 基團，此八個 cysteine 基團形成四組雙硫鍵，固定此四個 α-helices 的位置，使其形成一個穩定的疏水性凹陷的區域，可以和脂質以及疏水性分子結合 (Gincel et al., 1994, Samuel et al., 2002)。 8.

(13) 四、LTP 的表現特性 LTP 於發育生長時期的特定時段以及特定的組織才會表現，例如就組織差異性而言，很多植物的根部都不會表現 LTP，例如菸草 (Fleming et al., 1992)、大麥 (Gausing, 1994)、棉花 (Ma et al., 1995) 等，而是在葉部、莖部、芽頂會表現 LTP (Fleming et al., 1992, Ma et al., 1995)，並且在年輕的組織當中，LTP 的表現量較年老的組織更多 (Fleming et al., 1992)。在發芽以及開花的過程中，LTP 都在早期的階段分別於胚芽的子葉以及花序當中大量表現 (Soufleri et al., 1996, Fleming et al., 1992)。在這些組織當中，LTP 多由表皮細胞所表現，並且位於細胞壁上 (Thoma et al., 1994)。 LTP 的表現會受到植物荷爾蒙的調控，但是不同的 LTP 受到調控之表現量存在很大的差異，Vignols 等人觀察三個水稻 LTP 受到水楊酸 (salicylic acid, SA) 與離層酸 (abscisic acid, ABA) 的處理所發生的表現量變化，發現其中一個 LTP 不會被 SA 與 ABA 誘導，另兩個 LTP 的表現量之間也有明顯的差異 (Vignols et al., 1997)，Jung 等人也發現兩個辣椒的 LTP 會被乙烯 (ethylene)、甲基茉莉酸 (methyl jasmonate, MeJA)、ABA 誘導 (Jung et al., 2003)。除了植物荷爾蒙以外，LTP 的表現也會受到諸如高鹽、低溫、缺水、創傷等逆境因素所誘導 (Wang et al., 2009a, Wu et al., 2004)。 9.

(14) 五、LTP 的功能由於植物的 LTP 具有 in vitro 的攜帶脂質分子的能力，LTP 最初被認為具有細胞內脂質運輸的生理功能，但是隨後的研究發現 LTP 帶有訊號序列 (Bernhard et al., 1991)，致使 LTP 會被分泌至細胞外基質 (extracellular matrix)，這項證據顯示 LTP 不會參與細胞內的脂質運輸。到目前為止，許多研究顯示 LTP 與包括防禦、訊息傳遞、繁殖與生長發育在內的生理現象相關，但是關於 LTP 的 in vivo 的生理功能仍然沒有一個明確的定論。 LTP 最普遍被認為作用於植物的防禦體系當中，並且 LTP 與多樣的防禦體系皆有所關聯。LTP 被認為具有直接防禦病原細菌與真菌的能力，從蘿蔔 (Terras et al., 1992)、大麥 (Molina et al., 1993)、洋蔥種子 (Cammue et al., 1995) 等不同物種萃取所得的 LTP 都被發現具有 in vitro 的抗病原細菌與真菌的能力，不同的 isoform 之間抗病能力有差異，同一種 isoform 對抗不同的病原菌的能力也有差別 (Sun et al., 2008)。此類 LTP 抗病原菌的機制仍未完全明白，不過目前研究的跡象指出這些 LTP 具有促進病原菌的細胞膜通透性的能力、並且不傷害宿主細胞 (Regente et al., 2005)。現時此類 LTP 全屬於 LTP1，尚未發現具有此種功能的 LTP2 成員。很多 LTP isoforms 會受到病原菌的感染所誘導而增加表現量，此 10.

(15) 種表現特性使得 LTP 被歸類為第 14 類病原相關蛋白質 [pathogenesis-related (PR) proteins] (Sels et al., 2008)，證據為大量表現 LTP 的基因轉殖植物獲得更高的抗病性：大量表現一個大麥 LTP2 基因的阿拉伯芥或菸草轉殖株能夠增強對 Pseudomonas syringae 的抗病性 (Molina & Garcia-Olmedo, 1997)；另外，LTP 與其他的 PR proteins 具有協同作用：同時大量表現一個 LTP 基因與一個幾丁質酶基因的基因轉殖胡蘿蔔，和只轉殖其中一種 PR protein 基因的轉殖株相比，能夠獲得更高的抗病原真菌能力 (Jayaraj & Punja, 2007)。有些 LTP 可能是啟動植物防禦系統的訊息傳遞分子，例如缺乏 DIR1 此一 LTP 基因的阿拉伯芥突變株會發生無法產生系統獲得抗性 [systemic acquired resistance (SAR)] 的缺陷，卻不影響患部的防禦反應；然而，過量表現 DIR1 的轉殖植株卻不會引發持續性的 SAR 反應 (Maldonado et al., 2002)，顯示 DIR1 可能在 SAR 反應過程中，具有運送訊息傳遞分子的功能。另外，研究也發現胡椒的兩個 LTP1 基因 (CALTPI 與 CALTPII) 大量表現於轉殖菸草上時，能夠提升菸草的抗病原菌能力，其後進一步將野生種嫁接於轉殖株、而後對野生種的葉片進行病原菌感染處理，實驗結果顯示此二個基因的大量表現能夠顯著的減少病徵的發生，由此推論此二個 LTP 可能為 SAR 反應的訊息傳遞分子 (Sarowar et al., 2009)。 11.

(16) 病原激發蛋白 (elicitin) 是由卵菌綱 (oomycetes) 的疫黴屬 (Phytophthora) 和腐黴屬 (Pythium) 的某些種産生的低分子量蛋白，其中有些具有誘引劑 (elicitor) 活性，能夠與宿主植物的特定受器 (receptor) 結合，引發宿主植物的防禦反應 (Yu, 1995)，例如 cryptogein。 cryptogein 具有 6 個 cysteine 基團，形成三個雙硫鍵，並且包含 5 個 α-helices 與 1 個 β-sheet，構成一個疏水性的凹陷，用以與固醇結合 (Fefeu et al., 1997)。由於 LTP 的結構特徵與 cryptogein 相似，LTP 可能藉由與 elicitin 相同的方法刺激植物的防禦反應，研究發現一個小麥的 LTP1 能夠與 elicitin 競爭結合位於菸草細胞上的 elicitin 受器 (Buhot et al., 2001)，其後的研究更發現一個菸草的 LTP1 與茉莉酸 (jasmonic acid, JA) 的複合物也能夠與 elicitin 的受器結合，並且能夠提升菸草對疫黴菌 Phytophthora parasitica 的抗病性 (Buhot et al., 2004)，此外也有研究針對一個已知具有抗真菌活性的水稻 LTP1，發現在水稻細胞膜上存在此 LTP1 的蛋白質受器，由此推測此 LTP1 藉由與其受器結合引發防禦反應 (Wang et al., 2009b)。除了防禦的功能以外，LTP 也有可能具有其他的生理功能，包括形成角質層 (cuticle)、以及協助植物的生長與發育。角質層是陸生植物的氣生器官外所覆蓋的脂質聚合物質，其組成成分包括角質 (cutin) 單體以及各種通稱為蠟 (waxes) 的高熔點的脂質分子，由於角質與蠟 12.

(17) 是在表皮細胞內生合成，並且必須通過親水性的細胞壁以到達細胞外形成角質層，因此 LTP 即被認為是使角質與蠟通過細胞壁的攜帶蛋白。研究發現一個大麥的 LTP 於表皮細胞上被表現，並且誘導此一 LTP 會導致形成更厚的角質層 (Hollenbach et al., 1997)，另一項使用菸草的研究也發現角質層的蠟的增加與 LTP 的表現兩者之間具有關連性 (Cameron et al., 2006)。關於 LTP 如何運送角質層通過細胞壁，有兩個可能的假說：其一為 LTP 與細胞膜上的 LTP 受器結合，藉由胞吞作用進入細胞內，與角質單體結合之後，經由高基氏體外泌路徑穿透到細胞壁外形成角質層；其二為 LTP 保持在細胞膜外，當角質單體輸送到細胞膜上時，由 LTP 攜帶角質單體通過細胞壁形成角質層 (Kader, 1996)。有些特殊的 LTP 和植物的繁殖有關，從百合的花柱中分離出一種 LTP1，名稱為 stigma/style Cys-rich adhesin (SCA)，此 LTP1 與一果膠多醣類所形成的複合物，是使花粉管在雌蕊中生長所必需的物質 (Park et al., 2000)，其後的研究發現阿拉伯芥的一個與 SCA 相似的 LTP，名為 LTP5，此基因的突變株會產生花粉管膨脹、花粉管生長延緩、受精卵減少等性狀 (Chae et al., 2009)，單子葉植物也有類似的情形：以 RNAi 抑制水稻的一個 LTP (OsC6) 表現，會使花粉的發育不成熟以及使花粉不會萌發，導致種子的量減少 (Zhang et al., 2010)。 13.

(18) 除了與繁殖相關的功能以外，有些 LTP 能夠鬆弛植物細胞壁，被認為與細胞的擴張與植物的生長有關：2005 年 Nieuwland 等人從菸草柱頭的分泌物中分離出了一種具有鬆弛細胞壁活性的 LTP，並且另一種從小麥種子萃取純化的 LTP 也具有同樣的活性，顯示這樣的活性可能是 LTP1 普遍具有的特性；這項研究也發現 LTP 的疏水性凹陷區域必須是空的才具有鬆弛細胞壁的活性，推測可能是 LTP 與細胞壁的疏水性結構結合，導致細胞壁產生非水解性的分解，隨後促進細胞壁的擴張，但是實際的機轉仍然不明 (Nieuwland et al., 2005)。六、研究的重要性開花植物具有許多脂質傳送蛋白基因，不同的脂質傳送蛋白不只於不同生長時期與組織部位的表現量有差異，對於病原菌、植物激素以及環境逆境的反應也不盡相同 (Jung et al., 2003)，目前雖已有數篇水稻脂質傳送蛋白的研究報告 (Vignols et al., 1997, Garcia-Garrido et al., 1998, Blilou et al., 2000, Ge et al., 2003)，然而其研究的蛋白質種類皆與本研究所發現的脂質傳送蛋白不同。是以，本研究主要針對新鑑定的脂質傳送蛋白進行其表現與調控的研究，並期盼探究其可能的生理功能。另外，由於植物細胞表現的外源真核生物蛋白質具有正確的結構以及轉錄後修飾（post-translational modification）特徵，並且植物細 14.

(19) 胞培養系統的維持成本比動物細胞培養系統低，植物細胞能夠用來生產動物性的藥用蛋白質，以取代動物細胞的使用。目前已有一套廣泛使用的系統能夠成功的生產動物性重組蛋白質：以水稻懸浮培養細胞表現由水稻的 α-amylase 3（RAmy3）啟動子調控且融合 signal peptide 的重組蛋白質。此系統能夠以缺糖的培養基誘導重組蛋白質大量表現，並且分泌到培養基中，簡化純化重組蛋白質的步驟。以此方法已經成功的利用水稻懸浮細胞生產人類的 γ 干擾素（IFN-γ）(Chen et al., 2004)、血清白蛋白（serum albumin）(Huang et al., 2005)、人類與小鼠的顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor）(Liu et al., 2012, Shin et al., 2011)以及牛的胰蛋白酶（trypsin） (Kim et al., 2011)。其中，Huang et al. (2005) 的重組蛋白質產率為所有培養基蛋白質的 11.5%，而本研究發現 Osm10 的含量約為所有培養基蛋白質的 31%，因此 Osm10 的啟動子可能具有比 RAmy3 啟動子更好的應用潛力。. 15.

(20) 貳、研究材料與方法一、水稻與野生稻細胞的懸浮培養方法水稻 (Oryza sativa L., cv. TZS10、TK1、TNG67) 與野生稻（O. alta、 O. glaberrima、O. mtipogon、O. nivara、TWR-6）種子去殼，於消毒液 (1% NaOCl, 0.05% Tween 20) 內搖盪消毒 10 分鐘，再於無菌操作台內以 1 L 無菌水沖洗種子，接種於含 3% (w/v) sucrose、10 μM 2,4-D 和 1% agar (w/v) 的 MS 固態培養基中，在光照 16 小時、26℃的生長箱中培養一個月，誘導胚形成癒傷組織細胞團。將 1 mL 水稻細胞加入 49 mL 含 3% (w/v) sucrose、10 μM 2,4-D 的 MS 液態培養基中，在黑暗、26℃的培養箱內，以 120 rpm 轉速進行震盪培養，每週繼代培養一次。二、細胞培養液內蛋白質的收集水稻細胞在懸浮培養七天後，以兩層 Whatman #1 濾紙過濾分離細胞與培養液，將收集到的培養液離心 (10,000 g, 30 min)，並保留上清液，加入硫酸銨 (ammonium sulfate) 至 80% 飽和濃度，置於 4℃ 下，攪拌 30 min，離心 (15,000 g, 30 min)，保留沉澱物，以離心前樣品 1/200 體積之 PBS (10 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, pH 7.4) 回溶沉澱物。離心 (15,800 g, 10min)，保留上清液，保存於-20℃中。三、蛋白質定量 16.

(21) 本實驗以 Bovine serum albumin（BSA）做為標準樣品，藉 Bradford (1976)的方法測定蛋黃樣品中蛋白質總量。設定同為 50 l 的待測樣品與標準樣品，加入 200 l 的 Bradford reagent〔0.01％（w/v） Coomassie Brilliant Blue G-250, 4.7％（v/v）ethanol, 8.5％（v/v）phosphoric acid〕，靜置十分鐘後，以分光光度計（BIO-TEK MQX220）測定 595 nm 的吸光值。四、膠體電泳分析 [Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ] 電泳膠使用 15% Polyacrylamide gel，主成分為 4% Stacking gel [125 mM Tris-Cl, pH 6.8, 0.1% (w/v) SDS, 4% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) Ammonium persulfate (APS), 0.05% (v/v) N,N,N,‘N’-tetramethylethylene-diamine (TEMED)]與 12% Separating gel [375 mM Tris-Cl, pH 8.8, 0.1% (w/v) SDS, 15% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) APS, 0.05% (w/v) TEMED]，膠體厚度為 0.75 mm，使用 10-well comb 鑄造樣品槽。將已聚膠的膠體組裝於電泳槽，拔掉 comb，並於槽內注入 SDS running buffer [25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% (w/v) SDS]。將待測之蛋白質樣品溶入 SDS sample buffer [62.5 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 5% (v/v) 2-mercaptoethanol, 10% (v/v) glycerol, 0.05 (w/v) bromophenol blue]，並於沸水浴中加熱 5 分鐘，接著將樣品注入膠體的樣品槽內，以固定電壓 120 伏特進行電泳約 2 小. 17.

(22) 時 50 分鐘。五、定量 SDS-PAGE 蛋白質 band 電泳完成的膠體利用 Blum et al. (1987) 的方法進行銀染呈色或是置於 Coomassie Blue 染液 [0.25% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Acetic acid] 中，染色 1 小時以上，接著以一級褪染液 [50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Acetic acid] 褪染 10～20 分鐘，再以二級褪染液 [5% (v/v) Methanol, 7% (v/v) Acetic acid] 褪染至蛋白質色帶清晰可見且背景呈透明為止。使用 Fujifilm LAS-3000 影像分析儀掃描膠片影像，再使用 Multi Gauge v. 2.1 分析軟體計算所有分泌性蛋白質與 Osm10 的蛋白量。六、Osm10 的蛋白質體學（proteomics）鑑定等焦電泳 (Isoelectric focusing, IEF) 使用 GE Healthcare 公司的二維電泳設備與器材，按照該公司的建議方法操作。將硫酸銨沉澱後的樣品加入透析膜袋 (Cellu Sep; MWCO: 3,500) 中，以透析夾夾緊兩端，用 500 ml 二次水於 4℃下進行透析，每二小時更換一次透析液，共換三次，最後一次放置過夜。將透析後的蛋白質液離心 (15,800 g, 10 min)，收集上清液，以 Bradford method 定量，取 15 μg 蛋白質，用 rehydration buffer [8M urea, 2% (w/v) 3-(3-cholamidopropyl) dimethylammonio-1-propanesulfonate (CHAPS), 0.5% (v/v) IPG (Immobilized pH gradient) buffer, 0.002% (w/v) bromophenol blue] 補 18.

(23) 足樣品體積至 100 μL。用含有 40 μM DL-dithiothreitol (DTT) 的 rehydration buffer 將 IPG strip (ImmobilineTM DryStrip pH 3-10, 7 cm) 浸泡過夜。將 IPG strip 裝置於 Ettan IPGphor II 等焦電泳儀器上，在 IPG strip 兩端覆蓋以二次水浸潤的濾紙片，於 IPG strip 上覆蓋礦物油，在 IPG strip 上安裝樣品槽並注入樣品，架設電極，啟動等焦電泳。溫度設定為 20℃，電泳條件：(1) 固定於 300 伏特進行 4 小時 (2) 梯度上升至 1000 伏特進行 1 小時 (3) 梯度上升至 5000 伏特進行 3 小時 (4) 固定於 5000 伏特進行 5000 Vhr。將 IPG strip 浸泡於含有 1% (w/v) DTT 的 equilibration buffer [6 M urea, 75 mM Tris-Cl, pH 8.8, 29.3% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 0.002% (w/v) bromophenol blue] 15 分鐘，取出後再浸泡於含有 2.5% (w/v) iodoacetamide 的 equilibration buffer 15 分鐘。鑄好 10 – 20% gradient SDS-PAGE，上方留下 3 mm 高度的凹槽，先用 0.1% (w/v) SDS 加滿凹槽，再放入 IPG strip，將 0.1% (w/v) SDS 倒出，注入 sealing agarose [0.1% (w/v) agarose in SDS running buffer]，再放入點有 protein MW marker (Bioman #PREP1025) 的濾紙，以固定電壓 120 伏特進行電泳約 2 小時 30 分鐘。將膠體置於 Coomassie Blue 染液中，染色 1 小時。染色後，以一級褪染液褪染 15 分鐘後，再以二級褪染液褪染，直至蛋白質色帶清楚為止。用解剖刀切下 10-kDa. 19.

(24) 蛋白質膠塊，送交明欣生技公司進行 LC-MS/MS 蛋白質序列分析，再於 Mascot 資料庫比對鑑定蛋白質身份。七、Osm10 序列相關資訊的資料庫分析利用 ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進行 Osm10-I~III 的胺基酸序列比對（alignment）；在 NCBI 資料庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜尋其他功能性植物 LTP 的胺基酸序列，和 Osm10-I~III 進行 BLAST（basic local alignment search tool）分析；利用 SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）模擬、以 PyMOL 軟體分析 Osm10-I~III 與其他功能性植物 LTP 的立體結構；在 NCBI 取得 Osm10-I~III 基因的啟動子序列，利用 PLACE server （http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析啟動子的 cis-acting elements。八、水稻組織蛋白質的萃取 (A) 水稻植株蛋白質的萃取水稻種子以 1% NaOCl, 0.05% Tween-20 消毒 30 分鐘，清水沖洗 1 小時，一次水潤洗 5 次以後，放置於裝有兩張一次水潤濕的濾紙的培養基內，於 30℃黑暗中培養 3 天，發芽後轉移到 half strength 木村氏水耕液，於 30℃光照 12 小時的條件下培養 10 天，切取水稻植株的根、莖、葉部各 1 g，加入液態氮後研磨碎，以 2 mL 的 1X SDS sample 20.

(25) buffer 萃取蛋白質，離心（15000 g，30 min），收取上清液，將樣品儲存於-20℃。 (B) 水稻種子蛋白質的萃取水稻種子去殼，分離胚與胚乳，分別取 0.1 g 的胚及 3 g 的胚乳研磨碎，以 2 mL 的 1X SDS sample buffer 萃取蛋白質，離心（15000 g， 30 min），收取上清液，將樣品儲存於-20℃。 (C) 水稻幼苗蛋白質的萃取用前述 (A) 水稻植株蛋白質的萃取的方法使水稻種子發芽，發芽 3 天後去殼，分離胚乳、胚芽鞘與胚根，分別取 3 g 的胚乳、0.1 g 的胚芽鞘及胚根研磨碎，以 2 mL 的 1X SDS sample buffer 萃取蛋白質，離心（15000 g，30 min），收取上清液，將樣品儲存於-20℃。 (D) 水稻花與乳熟期種子蛋白質的萃取水稻的花以及授粉後 14 天的乳熟期種子，分別取 60 顆穀粒的量研磨碎，以 2 mL 的 1X SDS sample buffer 萃取蛋白質，離心（15000 g，30 min），收取上清液，將樣品儲存於-20℃。九、抗血清的製作與分析 (A) Osm10 抗原的製備為了獲得高純度的 Osm10 蛋白質，本研究將水稻細胞培養基蛋白質加入樣品槽為 6.8 cm 寬的 12% SDS 膠片中，於電泳分離及 CBB 21.

(26) 染色後，以解剖刀切下 10 kDa 位置的蛋白質膠條，並放置於去離子水內搖洗，每次 30 分鐘，共 4~6 次。隨後以解剖刀將膠條切成體積約 1 mm3 的細膠塊。以鑽孔器將透析膜(CelluSep 1230-25)切取成圓片，組裝於 elution cell 內，並用藥杓將含蛋白質的膠塊置入 elution cell 的 loading well (粗孔端)內，再加入 soaking buffer（2% SDS, 400 mM NH4HCO3）至剛好覆蓋小膠塊之高度，隨後從 soaking buffer 上緣輕緩添入 elution buffer （0.1% SDS, 50 mM NH4HCO3）至比「水平連接道」之最上端稍高的位置。將 elution cell 移入 elution tank（C.B.S. Scientific ECU-040）內，並添加 elution buffer 至較 drain troughs 最低處稍高的水位，再以 elution buffer 填滿 mixing tank。隨後將 peristaltic pump 的兩端分別與 elution tank 與 mixing tank 連接，並控制流向與流速使 elution buffer 於 mixing tank 端以「滴流」方式回流至 elution tank 端。當蛋白質小膠塊浸泡於 soaking buffer 中達 3~5 小時後，將 elution tank 上之電極與電源供應器連接，以 50 V 的電壓通電 12~16 小時，並記錄通電開始與結束的時間及電流。通電結束後，取出 elution cell 置於乾淨的 petri dish 上。利用玻璃滴管小心吸取藍色的蛋白質溶液，加入於 0.5 mL 微量離心管中。 22.

(27) 之後將蛋白質溶液置於 MWCO 為 12-14 kDa 的透析袋（CelluSep 1230-25）內，以去離子水於 4°C 進行透析，每 2 小時換水一次，連續透析 4 次以上。透析完成後則將蛋白質樣品分裝至微量離心管中，藉 SpeedVac sc110 進行濃縮乾燥，最終取少部分樣品與 cytochrome C 標準品進行 SDS-PAGE 分離與 CBB 染色，並透過影像處理系統進行蛋白質定量分析。 (B) 紐西蘭白兔之免疫注射取 100 μg 上述藉 electroelution 方式純化的 Osm10 回溶至 1 mL 去離子水中，並與等體積的 Freund’s complete adjuvant（CFA；Sigma F5881）乳化均勻，再將抗原各以 500 μL 注射至大白兔兩側的大腿肌肉內，其餘則各以 100 μL 注射在背部兩側的皮下組織中。一個月後進行第二次免疫注射，除了佐劑更改為 Freund’s incomplete adjuvant（IFA；Sigma F5506）外，注射劑量及方式皆與第一次注射相同。再兩週後進行第三次注射，抗原劑量、注射方式都與前兩次相同，但不添加任何佐劑，抗原是直接溶在 2 mL 去離子水中，注射後三天即可進行採血。 (C) 抗血清的分離及保存 23.

(28) 將採集自耳部的血液收集於 50 mL 離心管中，於室溫下靜置 1~2 小時後，以細長的金屬藥勺將血塊與離心管內壁分離，並於 4°C 靜置過夜。隔天將離心管取出，於室溫下離心（2,000 xg）20 分鐘，之後收集上清液即為抗血清樣品，再次離心（16,000 xg）澄清後加入 NaN3 至 0.02%，並分裝小管保存於-20°C 凍箱中。 (D) 抗血清效價檢測本研究是藉免疫染色分析實驗來檢測抗血清的效價，首先將水稻細胞培養基蛋白質注入樣品槽為 6.8 cm 寬的 SDS 膠片中，經 SDS-gel 電泳分離後，將蛋白質轉漬到硝化纖維膜上。再以解剖刀將硝化纖維膜切成 3 mm 寬的膜條，估計每片膜條各含有 30 ng Osm10，隨後將抗血清進行一系列稀釋（分別為 3 x 104、1 x 105、3 x 105、1 x 106 倍），做為免疫染色的 1 級抗體，另外也選用 non-immune rabbit serum （NIR）作為負對照組，經過 2、3 級抗體作用及呈色後，將硝化纖維膜風乾並保存。 (E) 抗血清專一性檢測本研究也是藉免疫染色分析實驗來檢測抗血清的專一性，將水稻細胞培養基蛋白質及 cytochrome C 分別注入至 SDS-gel 中，經電泳分離及轉漬於硝化纖維膜後，以本研究生產的兔抗血清與 NIR 進行染 24.

(29) 色比較。十、Osm10 的免疫染色分析（Immunoblotting；Western blotting）將蛋白質樣品以 SDS-PAGE 分離後，從下往上的順序將海綿、濾紙（Whatman #1）、硝化纖維膜（Nitrocellulose，PALL 66485）、電泳膠片、濾紙及海綿進行組疊，再置入含有 electroblotting buffer（192 mM glycine, 25 mM Tris base, 20% methanol）的轉漬電泳槽（Hofer TE 22）內，以 40 V 的電壓進行 30 分鐘轉漬。將轉漬完成的硝化纖維膜浸泡在 ELISA blocking buffer（10 mM Na-phosphate pH 7.4, 140 mM NaCl, 1% BSA, 0.02% NaN3）中 1 小時，隨後以 ELISA wash buffer（10 mM Tris-HCl pH 8, 0.05% Tween-20, 0.01% NaN3）進行 10 分鐘搖洗，總共二次。將硝化纖維膜置於水平石臘膜上，於室溫下加入適量 1 級抗體（兔的抗血清）反應 1 小時，再以 ELISA wash buffer 進行 10 分鐘搖洗兩次，隨後依序進行 2 級抗體［0.3 μg/mL goat anti-rabbit Ig（GAR； Jackson 111-005-003）］反應、搖洗（10 分鐘兩次）及 3 級抗體［3 x 104 倍稀釋的 rabbit anti-goat Ig-AP（RAG-AP；Sigma A4187）］反應、搖洗等步驟。最後將硝化纖維膜浸泡在 Western substrate buffer（100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2）內平衡 15 分鐘，隨後取 25.

(30) 出置於水平的石臘膜上，並加入 AP 受質（BCIP 166 μg/mL, NBT 333 μg/mL in Western substrate buffer）與進行避光呈色反應。當呈色清楚時便將硝化纖維膜移置於清水中沖洗，隨後將硝化纖維膜夾在擦手紙內，並以玻璃板壓平風乾，最終置於護貝膜中保存。十一、植物激素處理水稻細胞將 5 ml 的水稻細胞培養於 45 ml 含 3% (w/v) sucrose、10 μM 2,4-D 的 MS 液態培養基，分別加入水楊酸（SA）、甲基茉莉酸（MeJA）和離層酸（ABA）至其最終濃度為 100 μM，並以等體積的 70% 酒精溶劑處理為對照組，分別在處理 12、48 和 72 小時後，收集 0.5 ml 培養基樣品，進行 SDS-PAGE 及銀染呈色，隨後使用 ImageQuantTL 分析軟體計算 Osm10 的量。十二、水稻培養基蛋白質的 in vitro 抗真菌分析在 PDA 培養基中央接種 Rhizoctonia solani、Fusarium moniliforme、 Bipolaris oryzae 和 Sarocladium oryzae 四種水稻病原真菌，在距離中央 2.5 cm 處放上直徑 6 mm 的濾紙片，分別滴上溶於 80 μl 的 50 mM acetate buffer pH 5.0 的 0、50 和 100 μg 的水稻細胞培養基蛋白質，於 26℃黑暗中培養。. 26.

(31) 参、結果一、Osm10 於水稻懸浮培養細胞的表現特性（A）水稻細胞於液態培養過程中 Osm10 的表現情形本研究以 MS 液態培養基震盪培養水稻細胞，在培養過程中每 2 天固定取出 200 μL 的培養基樣品，直到培養第 14 天止。將這些樣品各取 10 μL 進行 SDS-PAGE 及銀染呈色分析，接著利用 Fujifilm LAS-3000 影像分析儀與影像分析軟體 (Multi Gauge V2.1) 拍攝並分析電泳結果。圖一的結果顯示培養基內的 Osm10 在培養前 4 天內緩慢增加，第 4 – 8 天間增加的速率加快，Osm10 含量與培養時間的線性斜率達到最大，第 8 – 14 天之間可能由於開始缺乏養分，增加的速率開始變慢，斜率逐漸變小，但是仍可看到 Osm10 的含量還在持續增加。由圖一 A 可以看出第 14 天的培養基中 Osm10 的含量多於第 12 天的培養基，但是圖一 B 卻顯示第 12 天與第 14 天的培養基中 Osm10 的含量相當，原因可能是圖一 A 的 SDS-PAGE 結果裡，第 14 天的培養基樣品中的 Osm10 含量超過了影像分析軟體能夠偵測到的最大極限，因此若干低估了第 14 天的培養基樣品中 Osm10 之含量。（B）Osm10 與全部培養基蛋白質的表現量之比例取培養了 7 天的水稻細胞培養基，以 80％硫酸銨飽和度鹽析沉 27.

(32) 澱培養基內的蛋白質，以少量 PBS 回溶後的樣品進行 SDS-PAGE 與 CBB 染色分析（圖二 A），可見 Osm10 是水稻培養基內含量最豐富的蛋白質，為了知道 Osm10 在所有培養基蛋白質當中所佔比例，本研究利用影像分析軟體（Multi Gauge V2.1）將電泳膠上 Osm10 與總蛋白量轉化為單位強度，再將兩者相除以得 Osm10 的比例。為了避免 Osm10 的量超出分析軟體的偵測極限，本研究先行尋找合適的樣品使用量範圍，由圖二 B 結果可知在 15 μg 總蛋白質含量的範圍內，Osm10 的單位強度值與總蛋白量呈線性關係，於是決定取 10 μg 總蛋白量進行 Osm10 的比例分析。經 4 次獨立試驗重複，得知 Osm10 在所有培養基蛋白質當中所占的比例約為 30.7％（圖三、表一）。二、Osm10 基因的鑑定為了進一步鑑定 Osm10 的基因，本研究採用二維膠體電泳方法分離水稻分泌性蛋白質，並以 CBB 染色。圖四的結果顯示，Osm10 蛋白質的 pI 值範圍在 8.1 ~ 10.0 之間，並且大部分蛋白質分布在 pI 值 8.1 ~ 9.2，表示 Osm10 並非單一的蛋白質，於是在 pI 值 8.6、9.2 及 10.0 各取一點膠塊，共三個 Osm10 蛋白質樣品進行蛋白質體學分析，表二的結果顯示此三種 Osm10 蛋白質樣品分別屬於不同的蛋白質，分別為位於第 11 條染色體上的 Os11g0114900（Osm10-I）、第 12 條 28.

(33) 染色體上的 Os12g0114500（Osm10-II）與第 1 條染色體上的 Os01g0822900（Osm10-III），樣品與資料庫蛋白質之間序列符合度 (sequence coverage) 分別是 42%、66%、66%。三、Osm10 的胺基酸序列特徵分析（A）Osm10 的推定物化性質表三的結果為以 SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 分析此三個蛋白質的序列，預測此三個蛋白質 N 端的前 26~27 個胺基酸序列為訊號序列，再利用 ExPASy Proteomics server (http://expasy.org/tools/pi_tool.html) 分析此三個蛋白質完整長度下以及去除訊號序列後（括號內）的分子量與 pI 值，結果 Os10-I 的分子量是 12.00 (9.39) kDa，pI 值是 8.49 (8.20)； Osm10-II 的分子量是 11.98 (9.41) kDa，pI 值是 8.90 (8.52)；Osm10-III 的分子量是 12.09 (9.46) kDa，pI 值是 9.28 (9.07)，此估計的結果與二維電泳的結果正好相符。（B）Osm10 的胺基酸序列比對 Osm10-I 與 Osm10-III 胺基酸序列之間的相同度（identity）只有 39％（37/95），與 Osm10-II 之間的相同度則有 96％（114/119），並且 Osm10-I 與 Osm10-II 序列之間主要的差異在於訊號序列的部分，除了訊號序列以外只有一個胺基酸不同，顯示 Osm10 蛋白質可大致分 29.

(34) 為兩類：Osm10-I 與 Osm10-II 為一類，Osm10-III 則為另一類。此三個蛋白質都是 LTP1，圖五說明這三個蛋白質都具有 LTP 保守性的 8-Cys motif 與 LTP1 的兩段保守性胺基酸序列（T/S-X-X-D-R/K 與 P-Y-X-I-S）(Douliez et al., 2000)。（C）Osm10 與其他功能性植物 LTP 的胺基酸序列比對將此三個蛋白質與其他十一個具有功能性的植物 LTP 進行胺基酸序列的比對，包括七個具有抗真菌活性的 LTP［P29420 (Terras et al., 1992)，Q43871，Q43766，Q43767 (Molina & Garcia-Olmedo, 1993)， Q41258，Q2QYL3 (Cammue et al., 1995)，ABO28527 (Kirubakaran et al., 2008)］、一個是 SAR 訊息傳遞分子的 LTP［Q8W453 (Maldonado et al., 2002)］、一個與形成角質層相關的 LTP［CAA65680 (Hollenbach et al., 1997)］、一個與花粉管生長相關的 LTP［Q9SW93 (Park et al., 2000)］、一個使細胞壁擴張的 LTP［Q03461 (Nieuwland et al., 2005)］， Osm10-I~III 與這些 LTP 之間的序列相同度整理如表四，Osm10-I 及 Osm10-II 除了與 Q41258 及 Q8W453 之間相同度為 27%以下，與大部分 LTP 的相同度達到 46 – 55%之間；而 Osm10-III 同樣與 Q41258 及 Q8W453 之間序列差異較大，相同度為 24%以下，與大部分 LTP 的相同度在 35 – 47%之間。四、Osm10 的立體結構特徵分析 30.

(35) （A）Osm10 的立體結構差異分析本研究利用 SWISS-MODEL Server 模擬 Osm10 的立體結構， Osm10-I 與 Osm10-II 的模板編號都是 1fk5A，與模板的序列相同度分別是 59.14%以及 60.22%；Osm10-III 的模板編號是 2algB，與模板的序列相同度是 48.91%。三個蛋白質都具有四個 α-helix (Osm10-I 與 Osm10-II：H1: C30 – T45, H2: G53 – A65, H3: T69 – A85, H4: P91 – C101；Osm10-III：H1: C31 – A47, H2: R53 – A65, H3: T69 – G85, H4: I92 – C102)，並且四個 α-helix 之間有四個雙硫鍵鍵結。LTP1 的兩段保守性序列之一的 T/S-X-X-D-R/K 位於第三個 α-helix 的最前端，另一段保守性序列 P-Y-X-I-S 則位於第四個 α-helix 之後的 C-terminal tail。 Osm10-I 與 Osm10-III 之間除了 α-helix 之間的連接序列與第四個 α-helix 的彎曲角度有些許差異之外，其餘 α-helix 的位置幾乎相同 (圖六)。雖然 Osm10-I 與 Osm10-III 之間的二級結構特徵幾乎沒有差異，但是完整的立體結構卻有很明顯的差別，結果顯示 Osm10-I 由 C-terminal tail、2nd α-helix C 端一小段、3rd α-helix N 端一小段的序列圍繞出內部疏水性凹陷區域的開口，然而 Osm10-III 在同樣的位置卻由於 R72 與 P107 的側基 (residue) 形成屏蔽而沒有開口 (圖七 A)；相對的，Osm10-III 的輸水性凹陷區域的開口由一整段的 1st α-helix 與 31.

(36) 3rd α-helix C 端半段的序列所圍成，而在同樣的位置 Osm10-I 卻由於周圍胺基酸側基的屏蔽只形成一個很小的開口 (圖七 B)。參考前人的文獻得知 D43、R44 及 Y79 俱為 LTP1 疏水性凹陷區域開口處高保守性的胺基酸 (Yeats & Rose, 2008)，而 Osm10-I 的 D71、R72 及 Y107 與開口之相對位置完全符合前人的研究結果，顯示其為一典型的 LTP1；Osm10-III 則與一般的 LTP1 不同，於 D71、R72 及 Y108 等胺基酸的位置不形成開口，反而在 1st 與 3rd α-helix 處具有一般 LTP1 沒有的開口。此結果表示 Osm10-I 可能和一般 LTP1 的生理功能相同，而 Osm10-III 則可能具備不同於一般 LTP 的特殊生理功能。（B）Osm10 與其他功能性 LTP 的立體結構比對本研究分別自功能為具有抗真菌活性、SAR 訊息傳遞分子以及與花粉管生長相關的 LTP 當中各取一個 LTP1 利用 SWISS-MODEL 模擬立體結構，以 PyMOL 軟體與 Osm10-I~III 進行比對，進行立體結構的相似程度分析，藉由結構的相似程度推測 Osm10 蛋白質的可能生理功能。ABO28527 的模板編號是 1fk5A，與模板的序列相同度是 68.48％；Q8W453 的模板編號是 2rknA，與模板的序列相同度是 100 ％；Q9SW93 的模板編號是 2algB，與模板的序列相同度是 57.14％，分析結果（圖八 A）顯示 Osm10-I~III 與 ABO28527 及 Q9SW93 之間的基本結構類似，與 Q8W453 之間的基本結構有明顯的差別；針對 32.

(37) ABO28527 及 Q9SW93 的立體結構進行比較（圖八 B），發現 Osm10-I & Osm10-II 與 ABO28527 具有相同的立體結構特徵，Osm10-III 則與 Q9SW93 的立體結構特徵相同。五、Osm10 的表現特性分析（A）Osm10 的啟動子序列的 cis-acting elements 分析自 NCBI 搜尋 Osm10-I 與 Osm10-III 基因上游 1500 bp 的 DNA 序列、Osm10-II 基因上游 1000 bp 的 DNA 序列，其中應包含 Osm10-I~III 的啟動子全長序列，利用 PLACE server 判斷 Osm10 基因的啟動子所具有的 cis-acting elements，藉以了解 Osm10 的表現特性。表五說明 Osm10 基因的啟動子除了含有多個種子與胚乳專一性表現以及 1 個花粉專一性表現的 cis-acting elements，還有多個受多種植物激素（auxin、 SA、JA、ethylene、ABA）、病原菌與病原菌感染後產生的誘引劑（elicitor）、鹽、乾旱、低溫等因素所調控的 cis-acting element。（B）Osm10 抗血清的製作本研究將經過 80%飽和濃度的硫酸銨沉澱濃縮的水稻懸浮細胞培養液蛋白質樣品，注入具有寬 6.8 cm 樣品槽的 SDS polyacrylamide 膠片中，經電泳分離及 CBB 染色後，以刀片將含 Osm10 蛋白質的膠條切下，再進行 electroelution 的操作，獲得製備 Osm10 抗血清的蛋白質抗原。 33.

(38) 將上述經 electroelution 再純化的 Osm10 樣品，對兩隻紐西蘭白兔 (兔 A 及兔 B) 進行一系列的免疫注射，經過採血後，兩隻兔子總共分離得到約 21 ml 抗血清。為要測試這些抗血清的效價 (titer)，我們進行免疫轉漬分析。首先將水稻懸浮培養細胞的培養液蛋白質樣品進行電泳分離並轉漬於硝化纖維膜上，再用解剖刀將膜片切成 3 mm 寬的膜條 (估計每一膜條上含有約 30 ng Osm10)，之後將兩隻兔子的抗血清進行系列稀釋，作為免疫染色各膜條的 1 級抗體。圖九顯示，兔 A 以及兔 B 的抗血清能夠偵測到 Osm10 的上限，分別是兔 A 的抗血清稀釋一百萬倍，以及兔 B 的抗血清稀釋十萬倍；而作為副對照組的 non-immune rabbit serum (NIR) 抗血清於相同稀釋倍數之下，不會與 Osm10 起反應。為要了解 Osm10 抗血清的專一性，我們以免疫轉漬實驗來比較抗血清對 Osm10 及 cytochrome C 兩種蛋白質的作用性質差異，圖十顯示 Osm10 抗血清在經三萬倍稀釋後可對 80 ng Osm10 作用良好，但無法與 240 ng cytochrome C 產生任何反應，證明 Osm10 抗血清的作用具有良好的專一性。（C）Osm10 於水稻各部位的表現分析將水稻的根、莖、葉、種子的胚、胚乳以及懸浮培養細胞的培養基蛋白質樣品進行 15％ SDS-PAGE 以及 Osm10 抗血清免疫轉漬分析。 34.

(39) 圖十二顯示在正常生長條件下，只有懸浮培養細胞的培養基蛋白質樣品含有 Osm10，意即在本研究的測試條件下，只有懸浮培養的水稻細胞能偵測到 Osm10 的表現。為了解 Osm10 是否與水稻種子發芽有關，本研究取發芽後三天的水稻種子，分別萃取胚乳、胚芽鞘與胚根的蛋白質樣品，進行 15％ SDS-PAGE 以及 Osm10 抗血清免疫轉漬分析。圖十三顯示不論是胚乳、胚芽鞘與胚根的蛋白質樣品都沒有 Osm10，可能代表 Osm10 在種子的發芽期間不會表現。本研究也自水稻的花和授粉後 14 天的乳熟期種子萃取蛋白質樣品，進行 15％ SDS-PAGE 以及 Osm10 抗血清免疫轉漬分析，以了解 Osm10 是否於水稻開花與種子成熟時期表現，圖十四顯示花與乳熟期種子的蛋白質樣品均不含 Osm10，代表 Osm10 可能不會在水稻開花與種子成熟時期表現。（D）野生稻細胞的 Osm10 表現分析為了瞭解其他亞種的栽培稻、甚至是野生稻的細胞是否也具有 Osm10 基因以及 Osm10 的表現模式是否一致，野生稻（O. alta、O. glaberrima、O. mtipogon、O. nivara、TWR-6）以及不同亞種之栽培稻細胞（秈稻：TZS10，梗稻：TK1、TNG67）的培養基蛋白質樣品進行 15％ SDS-PAGE 以及 Osm10 抗血清免疫轉漬分析。圖十一顯示 35.

(40) 野生稻 O. mtipogon 及 TWR-6 細胞分泌的蛋白質模式與秈稻 TZS10 相似，其餘野生稻細胞分泌的蛋白質模式則與梗稻（TK1 及 TNG67）相似，所有的野生稻與水稻細胞都會表現 Osm10，秈稻 TZS10 細胞的 Osm10 表現量最低，次低的是野生稻 O. mtipogon 及 TWR-6，其餘的野生稻以及梗稻細胞的 Osm10 表現量最多。（E）植物激素對 Osm10 表現的影響分析在進行植物激素處理時，若使用太低濃度的植物激素處理水稻細胞，無法獲得有效的反應，但是若以太高濃度來處理，會對水稻細胞產生毒害，使其褐化甚至死亡。因此本研究參考相關文獻 (Rao et al., 2010, Sobajima et al., 2003, Masuta et al., 1991)，以 100 μM SA、MeJA 和 ABA 對水稻細胞進行處理，由於這些植物激素是以酒精為溶劑，本研究以同體積的酒精來處理水稻細胞，以當作對照組。在各種激素處理 12、48 和 72 小時之後，分別收集水稻細胞培養基，將等量 (10 μL) 的樣品進行 SDS-PAGE 及銀染分析（圖十五 A），再以 Fujifilm LAS 4000 拍攝電泳膠，接著用 ImageQuantTM 分析軟體分析各處理樣品 Osm10 的含量，圖十五 B 表示不論是處理過後 12、48 或 72 小時，對照組與三種植物激素處理組的 Osm10 含量經 ANOVA 分析並無顯著差異（p＞0.05），意即在本研究的處理條件下，SA、MeJA 和 ABA 都不會影響 Osm10 的表現量。 36.

(41) 六、Osm10 的 in vitro 抗真菌活性分析將 0、50 和 100 μg 的水稻細胞培養基蛋白質滴在接種 R. solani、 F. moniliforme、B. oryzae 和 S. oryzae 四種水稻病原真菌的 PDA 固態培養基上，觀察菌絲的生長是否會受到抑制。圖十六顯示這四種水稻病原菌的菌絲生長都不會受到 Osm10 的抑制，意即 Osm10 不具對這些病原真菌的 in vitro 抗病活性。. 37.

(42) 肆、討論一、水稻細胞懸浮培養期間，培養液中成分的變化情形懸浮培養的水稻細胞會分泌蛋白質到液態培養基內，隨著培養的時間增加，因為細胞代謝導致培養基的成分改變，會影響培養基中蛋白質的表現，本研究中在培養細胞第 14 天的培養基與第 12 天時比較起來，數種蛋白質迅速的累積 (圖一)，研判其中包含有一些逆境誘導的蛋白質。有研究指出水稻懸浮培養細胞在缺乏碳源 (carbohydrate starvation) 時，細胞會大量表現並分泌一些額外的蛋白質到培養基中，例如 α-amylase (Yu et al., 1991)，本研究第 14 天的培養基蛋白質樣品中，蛋白質的總量及種類增加，例如有一分子量 44-46 kDa 的蛋白質開始累積，此蛋白質可能即為因缺糖而被誘導的 α-amylase。在正常生長的條件下，被分泌至培養基的蛋白質中，以一分子量為 10 kDa 的蛋白質其含量最為豐富，以持續懸浮培養 7 天的培養基為例，約佔培養基內所有蛋白質的 30.7% (圖三、表一)。本研究對於該蛋白質為何如此大量的分泌到培養基中以及其於細胞生理上是扮演何種生物功能角色感到非常的好奇，因此嘗試鑑定出此蛋白質的基因以及研究其特性。二、Osm10 在最新分類系統中屬於第一型的 LTP 本研究以蛋白質體學分析方法對Osm10進行基因鑑定，發現 38.

(43) Osm10包含三種主要蛋白質：Osm10-I (Os11g0114900)、Osm10-II (Os12g0114500)、Osm10-III (Os01g0822900)，這三種蛋白質都屬於 LTP1 (表二)。傳統上植物的LTP按分子量的大小被分為兩類：LTP1 (約 9 kDa) 與LTP2 (約7 kDa)，近代有些學者按照LTP胺基酸序列的特徵重新分類植物LTP，例如Boutrot等人於2008年整理水稻、小麥與阿拉伯芥的LTP基因資料，推定各個LTP的胺基酸序列，按照LTP的保守性的8個cystine之間胺基酸數目的差異，將LTP分為9型 (Boutrot et al., 2008)；Wang等人於2012年以Boutrot等人提出的分類標準為基礎，將 LTP的分類標準簡化為五型，其中大部分的LTP都是屬於第一或第二型 (517個LTP中，第一型有391個、第二型有102個、第三型有9個、第四型有11個、第五型有4個)，並且歸納出這兩型LTP胺基酸序列的特定模式 (第一型LTP：C X2 V X5-7 C [V, L, I] X Y [L, A, V] X8-13 CC X G X12 D X [Q, K, R] X2 CXC X16-21 P X2 C X13-15C；第二型LTP：C X4 L X2 C X9-11 P [S, T] X2 CC X5 Q X2-4 C[L, F]C X2 [A, L, I] X [D, N] P X10-12 [K, R] X4-5 C X3-4 P X0-2 C) (Wang et al., 2012)，本研究鑑定出的三個Osm10蛋白質皆屬於Wang等人分類標準下的第一型LTP。三、Osm10-I 與 Osm10-III 為首次被發現會被水稻懸浮培養細胞分泌分泌性蛋白質在許多層面控制與調節植物的生理，包括生長發育、細胞分裂與分化、以及抗病與抗逆境反應。由於懸浮培養細胞表現的. 39.

(44) 分泌性蛋白質存在培養基中，要取得分泌性蛋白質非常容易，懸浮培養細胞便成為研究植物的分泌蛋白質體的最佳材料 (Jung et al., 2008)。前人以二維電泳法分析水稻懸浮培養細胞的分泌蛋白質體，鑑定出了30個蛋白質，沒有發現任何LTP (Jung et al., 2008)；Cho et al. (2009) 改以MudPIT (multi-dimensional protein identification technology) 分析水稻細胞分泌蛋白質體，大幅增加了鑑定出的蛋白質種類，共有154個分泌性蛋白質，其中包含6個LTP (Os01g60740、 Os03g02050、Os08g42040、Os11g40530、Os12g02290及Os12g02320)。本研究自水稻細胞分泌性蛋白質中鑑定出3個大量表現的LTP，其中只有Osm10-II (Os12g0114500) 和Cho等人的鑑定結果重複 (Os12g02290)，Osm10-I (Os11g0114900) 與Osm10-III (Os01g0822900) 都是首次被發現會由水稻懸浮培養細胞所分泌，可能是由於培養條件的不同造成不同的蛋白質被誘導表現 (Cho等人：2N6培養基、22℃；本研究：MS培養基、26℃)。四、Osm10-I與Osm10-II可能源於同一基因 Osm10 的三個主要的基因分別位於水稻的第 11 (Osm10-I)、第 12 (Osm10-II) 與第 1 (Osm10-III) 對染色體上，特別是 Osm10-I 與 Osm10-II 兩者非常相似，不僅胺基酸序列相同度高達 96%，甚至基因上游 600 bp 之內的啟動子序列也有高達 87%的相同度 (附錄十)， 40.

(45) 代表這兩個基因可能源於同一個基因，藉由轉位子 (transposon) 的作用自原先的染色體 (例：第 11 對染色體) 複製了相同的基因並插入到相鄰的染色體 (例：第 12 對染色體)，其後經過突變而形成兩個不同的基因。水稻的第 11 與第 12 對染色體總長度為 55.9 Mb，在這兩對染色體之間，同源的基因集中在各自的前 3 Mb 的區域內，顯示這兩對染色體前 3 Mb 的基因經常發生複製與交換 (Anonymous, 2005)， Osm10-I 位於第 11 對染色體上 679,037-679,887 bp 之間、Osm10-II 則位於第 12 對染色體上 722,298-723,223 bp 之間，均位於前 3 Mb 的範圍之內，因此本研究認為 Osm10-I 與 Osm10-II 的分歧可能是同一個 LTP 基因經過複製與突變所造成的結果。五、由一級與三級結構分析Osm10的功能性本研究鑑定出的三個主要的Osm10蛋白質，全都屬於LTP1，但是其中Osm10-I & II與Osm10-III之間的胺基酸序列差異很大，相同度僅有39%，顯示這兩群蛋白質也許有不同的生理功能，本研究將Osm10 與其他植物的11個具有不同生理功能的LTP的胺基酸序列進行相同度的比對，試圖找出胺基酸序列和Osm10高度相同的LTP，以推論 Osm10可能與此LTP有相同的生理功能。序列比對的結果 (表四) 顯示Osm10和這些LTP的序列相同度為23% ~ 55%，這樣的結果表示 Osm10和任一個已知功能的LTP之間胺基酸序列的相同度都不夠高， 41.

(46) 因此無法直接類推Osm10的生物功能。前人的研究已歸納出LTP的保守性胺基酸，例如Douliez et al. (2000) 比對小麥、大麥、水稻、玉米及高梁已知的LTP序列，歸納出T/S-X-X-D-R/K與P-Y-X-I-S兩段保守性序列；Carvalho Ade and Gomes (2007) 比對26種不同物種的LTP，找出V6、Y16、G30、L/I51、K52、A66、V72、I81及S82等保守性胺基酸；Yeats and Rose (2008) 整合阿拉伯芥、水稻及白楊共43個LTP1 的序列，保守性胺基酸的分布也與前述兩份研究相符。雖然已經確定 LTP具有某些保守性胺基酸，但是這些胺基酸實際上與LTP生理功能之間的相關性目前仍無法得知。為了要瞭解Osm10序列的差異是否會造成立體結構的變化，進而影響生理功能，本研究針對Osm10蛋白質進行立體結構的模擬，結果發現Osm10-I與Osm10-III之間在疏水性凹陷區域的開口相對位置上有很大的差異，其中Osm10-I的特徵和典型的LTP1相同，而Osm10-III 則是很特殊的LTP1，顯示Osm10-I可能和一般LTP1的生理功能相同，而Osm10-III則可能具備不同於一般LTP1的特殊生理功能 (圖六、七)。本研究進一步取具抗真菌活性的LTP (ABO28527)、訊息傳遞分子的 LTP (Q8W453) 及與花粉管生長相關的LTP (Q9SW93) 各一個進行立體結構模擬，發現Osm10-I與ABO28527最為相似、Osm10-III與 Q9SW93最為相似、兩者與Q8W453都相差很多 (圖八A)，並且 42.

(47) ABO28527與Q9SW93之間雖然二級結構的特徵很類似，但是疏水性凹陷區域的開口之位置以及大小卻有很明顯的不同 (圖八B)，此結果顯示訊息傳遞分子的LTP具有不同於其他LTP的特殊立體結構，而其他不同生理功能的LTP之間決定性的差異可能在於其疏水性凹陷區域以及其開口的物化特性差異，例如開口的極性差異導致與ligand之間的結合能力產生差距、或是ligand的種類由於疏水性凹陷區域的性質差異而不同，因此本研究推測Osm10-I與Osm10-III之間可能具有不同的生理功能。六、Osm10 可能是懸浮培養細胞專一性表現蛋白質植物 LTP 的功能目前還未有定論，有許多文獻嘗試用各種方法推測 LTP 的功能，包括研究 LTP 的表現模式 (Boutrot et al., 2005)、LTP 的調控因素 (Maghuly et al., 2009)、額外表現或抑制 LTP 基因觀察其帶來的變化 (Sarowar et al., 2009, Robson et al., 2000)，本研究試圖藉由分析 Osm10 的啟動子上的 cis-acting elements 的特徵，推測可能表現 Osm10 的組織以及調控 Osm10 表現的因素。根據資料庫分析的結果，Osm10 的啟動子是種子專一性表現，並且受到多種植物激素與生物及非生物性逆境調控 (表五)，顯示 Osm10 可能兼備輸送胚乳的脂質分子以及抵抗病害的雙重生理功能，但是本研究萃取水稻植株的根、莖、葉、以及種子的胚及胚乳蛋白質，與懸浮細胞的培養基蛋白質樣 43.

(48) 品一起進行 Osm10 的免疫轉漬分析，發現根、莖、葉、胚與胚乳均無 Osm10 的表現，唯有懸浮細胞會表現 Osm10 蛋白質 (圖十一)。此結果顯示 Osm10 可能在成熟種子的胚與胚乳中不表現或含量稀少，原因可能是 Osm10 只會在種子成熟或發芽期間表現，而在已成熟的階段停止表現。Sossountzov et al. (1991) 發現在玉米種子成熟的過程中，LTP 會在胚及胚乳聚集，並且在種子萌發的時期，幼苗的胚芽鞘中 LTP 的表現量也會上升；Boutrot et al. (2005) 研究小麥的 9 種 LTP 也有相同的發現；Sheoran et al. (2005) 研究番茄的發芽種子的胚與胚乳的蛋白質體，發現其中有一個 LTP 與一個 LTP2 前驅物在胚及胚乳當中大量表現。然而本研究自發芽後 3 天的幼苗之胚乳、胚芽鞘與胚根，以及水稻的花與授粉後 14 天的乳熟期種子萃取蛋白質，用免疫染色的方法分析，卻都沒有發現 Osm10 的表現 (圖十二、十三)，顯示 Osm10 可能是懸浮細胞專一性表現蛋白質。前人研究指出水稻葉片細胞壁的 192 個蛋白質與懸浮培養細胞分泌的 30 個蛋白質中只有 6 個重複，原因可能是懸浮培養細胞相較於葉片細胞的生長與分裂週期非常迅速，由於兩者生理狀態的差異而使蛋白質的表現模式也發生改變 (Jung et al., 2008)，因此本研究推測 Osm10 可能同樣是在懸浮培養細胞的生理狀態下才會表現的蛋白質；另一個可能性是 Osm10 雖有表現，但是表現量低於本研究所使用的免疫染色分析法的偵測極限， 44.

(49) 因此無法斷定 Osm10 是否與種子的成熟及萌發相關，或許未來必須改用更敏感的免疫分析偵測方法，才能真正確定 Osm10 的表現特性。七、Osm10基因對稻屬植物而言可能具有演化上的意義生物的種化即遺傳訊息產生改變，當累積的變化量夠多時就會成為一個嶄新的物種，但是若重要的酵素發生突變，則會破壞突變個體的生理機能，使之遭到淘汰。因此在漫長的演化過程中，通過天擇考驗的親緣關係接近的物種之間，對生理機能有著關鍵影響的酵素，其基因的保守性都相當的高，意即這些物種都擁有相同的關鍵酵素。本研究培養五種野生稻與兩種栽培稻亞種的細胞，以免疫轉漬的方法分析這些細胞是否會表現相同的 Osm10 蛋白質，發現不僅栽培稻的兩亞種，連與水稻同屬但不同種的各種野生稻都具有相同的 Osm10 基因，並且野生稻細胞的表現模式與栽培稻細胞一致 (圖十四)，表示 Osm10 基因在稻屬植物種化過程中被保留下來，對於稻屬植物而言可能有著特殊的生理功能。八、Osm10 的表現可能不受抗病反應或逆境相關激素影響有許多文獻證實 LTP 的表現受到植物激素的調控，其中多數會被 SA 與 ABA 誘導 (Federico et al., 2005, Blilou et al., 2000, Vignols et al., 1997)，亦有少數 LTP 的表現會被乙烯/ JA 誘導 (Jung et al., 2003)。本研究在水稻細胞液態培養基中添加 SA、MeJA、ABA 三種植物激素， 45.

(50) 在處理後的一到三天內對培養基的蛋白質樣品以 SDS-PAGE 分析 Osm10 的含量，結果顯示 SA、MeJA 與 ABA 都不會影響 Osm10 的表現 (圖十五)。Osm10 基因的啟動子序列中有與 SA、JA 及 ABA 相關的轉錄因子結合位，以這些植物激素處理應該能影響 Osm10 的表現量，然而結果卻是任一組的植物激素處理和對照組之間 Osm10 的表現量均無顯著差異，原因可能是本研究的研究方法不夠完善，可能性之一是使用的激素量不足，導致無法有效刺激 Osm10 表現：以 SA 的有效劑量為例，雖然 Masuta et al. (1991) 發現 100 μM SA 已經足夠誘導水稻癒傷組織的幾丁質酶表現，但是 Vignols et al. (1997) 及 Federico et al. (2005) 分別以水稻和大麥的幼苗為材料進行激素影響 LTP 表現的研究，所使用的都是 10 mM SA，顯示不同的基因可能對於 SA 的敏感程度不同，或許本研究應該提高 SA 的濃度才能得到正確的結果；另一個可能的原因是檢測方法的敏感度不足，導致激素的作用被忽視：大部份的研究論文檢測 LTP 的 mRNA 表現量，發現 LTP 會受植物激素調控 (Yubero-Serrano et al., 2003, Jung et al., 2003, Vignols et al., 1997)，然而本研究當中以激素處理水稻細胞，Osm10 的蛋白質表現卻沒有顯著差異，可能是蛋白質的表現變化不若 mRNA 明顯的緣故，以致於觀察蛋白質的表現無法明確顯示激素的作用，或許改以 Osm10 的 mRNA 為檢測標的能夠得到更加正確的結果。 46.

(51) 九、Osm10 可能不具 in vitro 抗真菌活性有些LTP具有in vitro的抗真菌活性，不同LTP的isoform之間抗病能力有差異，同一種isoform對抗不同的病原菌的能力也有差別 (Sun et al., 2008)，Kirubakaran et al. (2008) 發現一個小麥的LTP具有抑制 Alternaria屬、Rhizoctonia solani、Curvularia lunata、Bipolaris oryzae、 Cylindrocladium scoparium、Botrytis cinerea與Sarocladium oryzae等真菌的活性；而Wang et al. (2004) 則從綠豆種子中萃取出能夠抑制 Fusarium solani、Fusarium oxysporum、Pythium aphanidermatum與 Sclerotium rolfsii等真菌生長的LTP；本研究測試水稻培養基蛋白質對 R. solani、F. moniliforme、B. oryzae和S. oryzae四種水稻病原真菌的in vitro抗真菌能力，結果發現水稻培養基蛋白質都無法抑制這四種真菌的菌絲生長 (圖十六)。Kirubakaran等人與Wang等人的研究，都是將 LTP溶解於PBS緩衝液當中用以進行in vitro的抗真菌分析，本研究也曾嘗試過使用PBS緩衝液替代醋酸鈉緩衝液溶解水稻培養基蛋白質，但是同樣沒有抗真菌反應 (data not shown)，顯示應該不是由於作用環境的pH值影響了Osm10的抗真菌活性，而可能是Osm10本身不具抑制真菌生長的活性。十、Osm10 的啟動子在基因工程方面的應用潛力為了提升穀物的營養價值，前人利用基因改造的技術增加穀物的 47.

(52) 營養成分，「黃金米」即為一個最有名的例子：Ye et al. (2000) 將一連串 β-胡蘿蔔素生合成途徑的基因轉殖入水稻植株，成功使 β-胡蘿蔔素累積在水稻的胚乳中。後續的學者為了提高轉殖基因生合成的效率，嘗試找出適合的種子專一性表現的啟動子作為基因改造的工具，例如 Zavallo et al. (2010) 研究向日葵的 oleate desaturase 與 LTP 的兩個種子專一性表現啟動子之活性，發現 oleate desaturase 的啟動子之活性與 35S 啟動子相當，認為此一啟動子會是發展種子專一性表現的基因改造工程上良好的應用工具。然而由於現今大眾擔心食用基因改造的作物會對人體健康造成不良影響，以及經過改造的強勢基因會藉由花粉傳播從田間流出、擴散到各處，扼殺天然基因物種的生存空間，造成整個生態環境的浩劫，現行法令仍然禁止基因改造作物的販售，使得將外源基因轉殖於作物表現的發展策略受到阻礙；相對地，懸浮培養的水稻細胞由於既不是食物，不需擔心食用後影響人體健康，也無法在自然環境之下長成完整的植株，沒有散布子代而將基因流出到環境中的風險，因此以懸浮培養的水稻細胞作為生物反應器，來生產高附加價值的外源重組蛋白質成為發展基因轉殖植物的一項替代性方案；此外，以細菌生產重組蛋白質所面臨的最大困難在於重組蛋白質易形成不溶於水的包含體 (inclusion body)，純化重組蛋白質的過程步驟繁瑣，耗費很多的時間 48.

(53) 和人力，且重組蛋白質不易恢復活性；水稻細胞的分泌蛋白質直接溶於培養基中，收集與純化都很方便，並且沒有變性的問題，因此以水稻細胞發展生物反應器的發展潛力優於細菌生物反應器。本研究發現， Osm10 無論在水稻的種子、幼苗、成熟植株、花及發育中的種子都沒被發現有表現，唯獨被懸浮培養的細胞大量地分泌，此專一性且大量表現的特性使 Osm10 基因的啟動子及分泌調控序列在應用於以水稻細胞作為生物反應器的發展上有很好的條件。. 49.

(54) 伍、結論本研究發現 Osm10-I、Osm10-II 及 Osm10-III 於水稻懸浮培養細胞的培養基中大量存在，經由蛋白質體學的鑑定發現這三種 Osm10 蛋白質都有 LTP 的特徵，在前人的水稻細胞分泌蛋白質體研究中，與本研究重複的 LTP 只有 Osm10-II，代表 Osm10-I 及 Osm10-III 均為首次在水稻細胞懸浮培養基當中被發現，由於前人與本研究使用的培養條件不同，或許改變培養的條件就能使水稻細胞分泌的蛋白質種類改變。本研究發現的三種 Osm10 蛋白質的立體結構分為兩種類型，分別與具有抗真菌活性的 LTP 以及與花粉管生長相關的 LTP 相似。雖然這三種 Osm10 蛋白質在 LTP 的分類上都屬於第一型 LTP（LTP1）， Osm10-I 與 Osm10-III 之間還是存在明顯的立體結構差異，因此或許在 LTP 的分類依據上，必須加以考慮立體結構的差異，做出更加詳細、功能更明確劃分的分類。Osm10 基因的啟動子雖具有種子專一性表現的特徵，但是 Osm10 實際於種子、幼苗、成熟植株、花及發育中的種子中的表現，皆遠低於懸浮培養細胞的表現量，顯示在 Osm10 基因的啟動子中可能有未知的 cis-acting elements，其驅動表現的能力非常高，且僅在懸浮培養細胞當中才被活化。未來如果解開此未知 cis-acting elements 的序列以及調控機制，必然在學理以及應用價值上都是很大的突破。以水稻細胞作為生物反應器生產高附加價值的重組 50.

(55) 蛋白質，不僅消除了可能對生態環境造成衝擊的疑慮，並且蛋白質純化的過程比細菌生物反應器還要簡化很多，因此有很高的發展潛力。由於 Osm10 具有在懸浮培養細胞大量表現的特性，Osm10 基因的啟動子及分泌調控序列將會是應用於水稻細胞生物反應器的有利工具。. 51.