QSARs 模式在環境毒物學上的應用

QSARs 模式在環境毒物學上發展應用主要分為兩大類，其一為針對 不同的試驗物種或不同種類的有機物質發展各種形式的 QSARs 模式，其 二則為運用 QSARs 模式對有機物質的分類來作為預測混合毒性效應之基 礎。

Lipnick^[15]的研究中，針對logP QSAR 模式無法準確做毒性預估之反應 性有機物質，依其毒性作用機制不同可分成四大類，其四類分別為：親電 性(electrophile)、前親電性(pro-electrophile)、cyanogenic non-electrolytes 及 multistep multiplem；而本研究所選用之腈類及醛類即屬於 cyanogenic toxicity 及 electrophile toxicity。相關研究如 Cronin and Schultz^[16]選擇非反 應性毒性作用(酮類)及反應性的親電性毒性(醛類)及前親電性毒性(α，β 不飽和醛類)三種作用機制對於Microtox 試驗建立一 QSAR 模式。

腈這類毒性物質主要含有C≡N 基，而其毒性作用方式主要分為兩種：

一種為經由 cyanohydrin-type functionality 的水解作用所釋放出之氰酸離 子，C≡N

-，另一種方式則是經由單氧分解酵素(monooxyg- enase enzymes) 的活化後，釋放出氰離子而造成之毒性。

親電性反應性有機物，其毒性作用機制主要在於所擁有之親電基

(electrophilic group) 能 和 生 物 體 內 大 分 子 上 的 硫 氫 基 等 親 核 部 分 (nucleophilic moiety)，產生取代反應(substitution)或相加反應(addition)，

改變原生物組成，使得原生物功能受到抑制，如抑制酵素功能而形成毒 性。而醛類則為另一類型之親電性毒性作用機制，其所進行之作用為 Schiff-base formation。

以其與胺基進行反應為例：

RCHO + R’NH2 ↔ RCH=NR’+ H2O 其中，RCH=NR’則稱為 Schiff base。

2.5. 腈類及醛類化合物之混合毒性

由於現今化學物質廣泛的被使用，因此在環境中其往往是以混合的方 式存在，而以下之學者則利用了腈類與醛類兩種毒性物質，做一混合毒性 的討論。

Lin et al. ^[17]利用

photobacterium phosphoreum 對 6 種不同的腈類和 8

種不同的醛類做一混合毒性之研究，作者主要目的在於使用實驗得知之 IC50值，作為混合毒性之預測模式，而在實驗中可看出腈類與醛類的混合 毒性試驗，主要呈現協同及相加之作用。

Chen & Chiou^[18]研究反應性與非反應性的混合毒性試驗中發現一個新 的混合毒性之協力作用(joint action)，稱之為 complex joint action，此一作 用主要發生在兩個毒性物質之劑量-反應曲線斜率相差極大時，兩者有較 強烈的毒性減弱之現象，且具有不規則之等效應曲線(isobologram)，可發 現一種毒性物質對另一種毒性物質具解毒功能。而Chen & Yeh 在 1996 時

針對反應性的毒性化學物質之混合毒性上，發現上述之 complex joint action 仍然存在。

而 Chen & Huang^[19]亦利用反應性毒性化學物質腈類與醛類進行 Microtox 的混合毒性試驗，其結果發現當與 malonitrile 混合時主要呈現協 同 作 用 ， 且 與 甲 醛 混 合 時 更 具 有 強 烈毒 性 增 強 之 現 象 ； 反 之 ， 在 與 acetonitrile 混合時，則幾乎都呈現拮抗之作用。造成此結果的主要原因在 於 acetonitrile 屬於劑量-反應曲線斜率斜率大的物質，即表示生物對此類 化合物的最高容忍濃度到完全抑制僅在一狹小範圍內，也由於其劑量-反 應曲線斜率過大，因此在與其他有機物混合時，發生了complex joint action 而導致此結果。另外 Chen^[20]在藻類的毒性試驗中，利用藻類的生長速率 (algal growth rate)及溶氧(dissolved oxygen)的產生來當做其測試終點，亦 發現相同之情形。

針對腈類與醛類混合研究中，Chen & Huang ^[19]利用魚毒試驗與 Microtox 試驗做比較，發現不同的試驗物種其混合毒性之效應是有所不同 的。而Chen & Lu^[21]則利用了

E.coli 做混合毒性的試驗，並與 Microtox test

做比較；以腈類和醛類之單一及混合毒性試驗來說，我們可發現相同的化 學性有機物質在單一毒性試驗中，E.coli 與 Microtox 所表現出來的毒性及 劑量-反應曲線斜率不僅不同，甚至有極大的差異，而在混合毒性試驗中 其結果也因此大相逕庭的。這也說明了對於不同的試驗物種中，其毒性試 驗結果也會有所不同，因此當我們在對化學物質做環境水體的毒性試驗 時，選用多種物種來做試驗是有其意義的。

Lin et al. ^[22]也針對醛類與腈化物做一混合毒性之試驗，並利用HPLC 來做分析進而得知 malononitrile 與 ρ-nitrobenzaldehyde 混合後會產生新的 物質ρ-nitrobenzoic acid，且發現當腈化物與苯甲醛類混合時，其轉換成酸 的能力愈強其協同之效應也越明顯；有趣的是，造成協同作用的現象並非

ρ-nitrobenzaldehyde 來 得 弱 ， 另 外 作 者 也 利 用 ρ-nitrobenzoic acid 與 malononitrile 或 ρ-nitrobenzaldehyde 互相混合以及三者相混，結果皆呈現相 加作用之情況，而 Nakamura^[23]曾提出

photobacterium phosphoreum 之

luciferase 受 pH 的影響，其螢光訊號在 pH6-8.5 時最為穩定，當 pH<6 或 pH>8.5 時，螢光訊號則開始減弱，因此當 ρ-nitrobenzoic acid 產生時，同 時 也 降 低 了 其 pH 值 ， 因 此 抑 制 了 酵 素 之 活 性 ， 故 作 者 認 為 此 為 malononitrile and aldehydes 混合時造成協同作用的主要原因。

由上述學者們的研究中可以了解，在腈類與醛類的混合毒性上，主要 model (CA) 及 Independent action model (IA)。^[24.25] Concentration addition 一般而言即表示毒性物質在生物體上作用於相同之位置且毒性作用機制

而Independent action 則定義為毒性物質在生物體上之作用位置不同。

以數學模式表示如下：

E(c_mix) = E(c

₁

+…+c

_n

) = 1-Π[1-E (c_i)]

其中 E(cmix)代表混合毒性的效應的抑制率，其值介於 0-1 之間，c_{i 表示化} 學物質i 之濃度，E (c_i)則表示化學物質ci 濃度下，在單一毒性試驗中所造 成抑制效應的比率。舉例來說，當 E(ci)=0 時，表示化學物質不產生抑制 效應，因此在混合毒性預測上E(cmix)相對也等於 0。

Lin et al.(2004)利用麻醉性及反應性化學物質，做一混合毒性的研究，

作者認為 CA model 是可展示毒性化學物質混合後的效應。另外，對於反 應性物質互相混合時呈現相加作用，這是由於反應性物質並沒有發生交互 作用。

CA & IA model 常使用在環境風險評估上，用來預測化學物質的混合 毒性效應。Backhaus et al.^[27]選用 14 種殺蟲劑及抗菌劑等，利用生物發光 菌

vibrio fischeri 進行 Microtox 試驗，作者發現利用 CA model 來預測會過

分高估實際毒性，反之，利用IA model 來預測則較符合實際之結果。因此，

作者認為在環境風險評估的預測上，CA model 是較適合被使用的，因為 CA model 是以一個最壞的情況去估計化學物質混合後之毒性。

Olmstead & LeBlanc ^[28]也利用

Daphnia magna 對多環芳香族(PAHs)做

一混合毒性試驗與CA 及 IA model 預測做討論，同樣作者發現，CA model 較易過分高估化學物質混合後之毒性，IA model 則較符合實際結果。不僅 上述作者，Arrhenius et al.^[29]也同樣發現CA model 過分高估毒性，因此認 為CA model 較適合利用在環境風險評估上。另外 Martin et al. ^[30]只選用IA model 來作混合毒性試驗的預測，而 IA model 結果依然是低估了實際的混

合毒性效應，因此作者認為使用 CA model 來預測混合毒性並作為環境評 估是需要進行研究的。

Cedergreen et al.^[31]利用了生物發光菌

vibrio fischeri，水蚤 daphnia，月

芽藻

P.subcapitata 及浮萍 Lemna minor 四種試驗物種，針對 Prochloraz 與

殺蟲劑做混合毒性之研究，作者發現，在預測混合毒性的時候，除了看化 學物質之作用機制與作用位置外還需考慮斜率，此篇研究中，作者選用 log-logistic model^[32]來計算毒性物質之EC50 值，利用 log-logistic model 所 得之個別毒性物質斜率值做分類，當劑量-反應曲線斜率大於1.25 時，CA model 有較佳的預測能力；反之，當劑量-反應曲線斜率小於 1.25 時，IA model 則有較佳之預測能力。而針對生物發光菌 vibrio fischeri 的部分來 說，Prochloraz 與殺蟲劑混合之後，主要呈現協同之作用反應，而在 model 的預測中，也較符合IA model 的預測，在此情況下，IA model 預測之毒性 將大於 CA model 所預測之毒性，而此結果也與以往學者們所提出 CA model 較易高估毒性是有所不同的，因此在探討 CA 與 IA model 的預測能 力時，毒性物質的劑量-反應曲線斜率也將會是影響結果的主要原因之一。

不同於上述作者之描述，本研究利用劑量-反應曲線斜率、相關係數及 相似係數來作為預測混合毒性效應的參數，並將IA model 又細分為 NA、

RM 及 RA model。其中上述學者所使用之 IA model 則為本研究中分類之 RM model。Chen and Huang ^[19]也發現當化學物質其毒性混合效應為協同作 用時，CA model 並不適用於保護水體環境，因此本研究中將探討 CA 及 IA model 在預測混合毒性效應上之適用性。

第三章 基本理論

3.1 毒性物質劑量-反應模式

毒性試驗過程中，實驗物種之某一生命跡象(如螢光發光強度、攝氧 率、移動能力等)造成 50%的抑制率時所需要的毒性物質濃度稱為EC50。劑 量反應曲線為受體生物受到毒性物質作用的時候，隨著毒性物質濃度而呈 現之 S 型曲線關係圖，但由此 S 型曲線來求取EC50並不容易，因此必須藉 由一些模式將此 S 型曲線轉換成直線的型式以便求取。不同的模式根據的 理論基礎不同，因此同一組數據會因不同模式的分析而使結果有所差異，

拿生物試驗來說，不同生物對於毒性物質容忍度也不盡相同，若以不適當 之反應模式計算，可能導致實驗點與理論點間變異過大，所得結果則相當 可議，故處理數據時須判斷最適合之使用模式。一般常見的毒性劑量-反 應模式為 Probit、Weibull 及 logit 三種，Christensen(1985)曾對三種模式做 比較， 此三種模式是依據不同的假設發展而成的，Probit 為假設受體生 物對於毒性物質的容忍度為一常態分布，具有統計上的意義，Weibull 則是 毒性物質與受體生物間產生化學鍵結關係之假設，最後Logit 則是與 Monod Equation 相 似 ， 假 設 毒 性 反 應 形 式 如 同 某 種 酵 素 的 反 應 。 而 針 對

Photobacterium phosphoreum 之劑量-反應關係上的適用性，根據葉(1994)

所做之研究顯示，Probit 模式在三者中有較佳的適用性，本研究則以其來 進行毒性數據之分析。

Probit 模式主要假設為受體生物對於毒性物質的容忍分布呈常態分布 (Log-normal distribution) ， 其 主 要 是 將 S 型 之 劑 量 - 反 應 曲 線 轉 換 成 NED(Normal equivalent devation) scale 上的一直線，原來劑量-反應曲線 50%

反應率之處對應到NED scale 上為 0，84.1%反應率之處對應為 1，而 NED scale 之座標值加 5 極為 Probit 的座標，Probit 單位和反應率與毒性物質劑 量間的轉換關係如下：

Y = a + b logZ (3-1) P ＝ 0.5 [ 1 ＋ erf

( )

2

− 5

Y

] (3-2) Y ＝ NED ＋ 5 (3-3) 其中Y 為 Probit 單位，Z 為毒性物質之劑量濃度，P 為反應率，erf 則為 error function。

3.2 混合毒性理論

3.2.1 非交互作用混合毒性理論

非交互作用混合毒性模式最早由Hewlett & Plackett(1959)所提出，為 一個二維的模式，其限制條件為毒性物質間不能有交互作用產生，意即毒

非交互作用混合毒性模式最早由Hewlett & Plackett(1959)所提出，為 一個二維的模式，其限制條件為毒性物質間不能有交互作用產生，意即毒

在文檔中 以Microtox針對反應性有機物丙烯腈類與醛類做混合毒性之研究 (頁 21-0)