本研究使用 3 種不同濃度之纖維母細胞cDNA來測定引子之結合 效能。結果顯示GADPH之結合效能為-79.8%，R2值為0.973，且有一 濃度數值為N/A (圖 3 - 21)；β-肌動蛋白之結合效能為 119.2%，R2 值為0.974 (圖 3 - 22)；第一型膠原蛋白引子之結合效能為 128%，R2 值為0.97 (圖 3 - 23)；第三型膠原蛋白引子之結合效能為 89.4%，R2 值為0.982 (圖 3 - 24)；纖維連結素引子之結合效能為 28.6%，R2值 為0.998，且有一濃度數值為N/A (圖 3 - 25)。
圖 3 - 21：引子 GADPH 結合效能標準曲線圖
圖 3 - 22：引子β-肌動蛋白結合效能標準曲線圖
圖 3 - 23：引子第一型膠原蛋白結合效能標準曲線圖
圖 3 - 24：引子第三型膠原蛋白結合效能標準曲線圖
圖 3 - 25：引子纖維連結素結合效能標準曲線圖
3-6-2 標準化基因表現量
本研究使用β-肌動蛋白做為Reference gene將纖維母細胞生長 於各基材之基因表現量標準化。結果顯示，細胞生長於不同基材之第 一型膠原蛋白基因表現(圖 3 - 26)呈現聚乙烯醇/幾丁聚醣>聚乙烯醇
>培養皿(p<0.05)；細胞生長於不同基材之第三型膠原蛋白基因表現(
圖 3 - 27)呈現聚乙烯醇/幾丁聚醣>聚乙烯醇>培養皿(p<0.05)；細胞生 長於不同基材之纖維連結素基因表現(圖 3 - 28)呈現聚乙烯醇>培養 皿>聚乙烯醇/幾丁聚醣(p<0.05)。
在單一基材之基因表現量之比較中，結果顯示纖維母細胞生長於 聚乙烯醇細胞支架時(圖 3 - 29)，基因表現量呈現纖維連結素>第三型 膠原蛋白>第一型膠原蛋白 (p<0.05)；細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣 細胞支架時(圖 3 - 30)，基因表現量呈現第三型膠原蛋白>纖維連結素
>第一型膠原蛋白 (p<0.05)；細胞生長於培養皿時(圖 3 - 31)，基因表 現量呈現纖維連結素>第三型膠原蛋白>第一型膠原蛋白 (p<0.05)。
第一型膠原蛋白 烯醇/幾丁聚醣及培養皿三者間互有顯著差異，p<0.05。
(統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定)
第三型膠原蛋白 烯醇/幾丁聚醣及培養皿三者間互有顯著差異，p<0.05。
(統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定)
纖維連結素 /幾丁聚醣及培養皿三者間互有顯著差異，p<0.05。
(統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定)
聚乙烯醇
聚乙烯醇/幾丁聚醣
(統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定)
培養皿
(統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定)
第肆章 討論
第一節 奈米電紡絲之形態學觀察
本研究以電紡技術成功製作出直徑大小為 316±63.4 奈米之聚乙 烯醇奈米纖維與直徑大小為 109.4±16.5 奈米之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈 米纖維。纖維形態方面，聚乙烯醇奈米纖維呈現較大的纖維直徑且較 好的一致性，而聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維則有較小的纖維直徑但 有較多的小珠形成。在Tan等人的研究中指出，影響奈米電紡絲之纖 維直徑大小主要因素為聚合物之溶液濃度及溶液導電性，聚合物之濃 液濃度越低、導電性越高，所產生之纖維直徑大小則越小(圖 4 - 1)，
此研究中也發現纖維直徑越小及聚合物之分子量越小，則越容易產生 小珠之形態(Tan et al., 2005)。然而，本研究所使用之主要溶劑為水，
因此纖維直徑大小不同，可以不用考慮是由於溶液導電性不同之因素 所造成，而本研究所使用的聚乙烯醇之溶液濃度為 8%，聚乙烯醇/
幾丁聚醣之溶液濃度為 6.5%，因此溶液濃度較低應該是聚乙烯醇/幾 丁聚醣纖維直徑較小且較多小珠形成之因。
圖 4 - 1：電紡參數對於奈米纖維形態之變化圖(Tan et al., 2005)
第二節 細胞形態學觀察
以光學顯微鏡觀察生長於聚乙烯醇及聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖 維細胞支架上之纖維母細胞之形態，生長於聚乙烯醇奈米纖維細胞支 架上之纖維母細胞，其形態主要為圓形，在培養 24 小時後，細胞有 明顯的群聚行為。而生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架上 之纖維母細胞，其主要形態為紡錘形，且在培養 24 小時後，細胞有 明顯的攤平現象(圖 4 - 2)。以纖維母細胞正常形態而言，其貼附於基 材上時應呈現紡錘形態。過去的研究中指出，纖維母細胞在若在貼附 時 呈 現 圓 形 形 態 ， 表 示 此 基 材 與 纖 維 母 細 胞 之 生 物 相 容 性 (biocompatibility)可能較差，甚至是含有毒性之物質(Balto, 2004)。本 研究所使用之基材聚乙烯醇(PVA)，本身並無生物毒性，所以可能是 因為該基材與纖維母細胞之相容性較差，才呈現圓形之細胞形態。相 較之下，纖維母細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架 時，其形態則呈現正常之紡錘形，且呈現攤平之現象，這表示纖維母 細胞與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架間有良好之生物相容 性。
圖 4 - 2：纖維母細胞生長於聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維 之形態
然而，細胞支架在經過第一型膠原蛋白表面改質處理之後，細胞 形態並無顯著之變化，由此可知第一型膠原蛋白表面改質處理對於細 胞形態之影響並不大。
在掃描式電子顯微鏡之觀察下，纖維母細胞生長於聚乙烯醇奈米 纖維細胞支架中時，其第1 天之細胞形態(圖 3 - 5)，雖然細胞有伸出 偽足抓附於纖維上，但細胞形狀仍以圓形為主，直到第3 天的觀察(圖 3 - 6)，細胞形態才由圓形轉變為紡錘形。而纖維母細胞生長於聚乙 烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架上時，在第 1 天就呈現紡錘形且細
胞也攤平於基材之上，細胞之偽足也抓附於奈米纖維之上(圖 3 - 7)，
在第 3 天的觀察時，細胞也由於迅速的增生，完全佈滿於基材之上。
因此，以細胞之形態來看，聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架對 於纖維母細胞之形態表現比聚乙烯醇奈米纖維還要好，顯示出聚乙烯 醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架有較好之生物相容性。
第三節 細胞貼附性測試
由於纖維母細胞本身必需在貼附之後，經由胞內訊息之傳遞，而 造成細胞生長之行為，因此細胞貼附對於纖維母細胞之生長扮演著一 個重要的角色。本研究之結果顯示，在培養 2 小時後，纖維母細胞於 聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維上之貼附率比聚乙烯醇奈米纖維與聚氯 乙烯膜來得高；在培養 4 小時及 24 小時後，聚乙烯醇奈米纖維與聚 乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維之貼附率皆比聚氯乙烯膜來得高；在培養 6 小時及8 小時後，貼附率則呈現聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維>聚乙烯 醇奈米纖維>聚氯乙烯膜之現象(圖 3 - 9)。整體來說，聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維細胞支架對於纖維母細胞之細胞貼附性是優於聚乙烯 醇奈米纖維細胞支架，而由於聚氯乙烯膜本身為一疏水性材料，細胞 本身與之貼附不易，因此一直維持在 10%左右之貼附率。在Chen等 人的研究中指出，聚己內酯(PCL)奈米纖維之纖維直徑大小會影響纖 維母細胞之貼附率，結果顯示，當纖維直徑越小時，纖維母細胞之貼 附率會上升(Chen et al., 2007)。因此，本研究使用的聚乙烯醇/幾丁聚 醣奈米纖維細胞支架在細胞貼附表現性之所以優於聚乙烯醇奈米纖 維細胞支架，其主要原因除了前者之生物相容性優於後者之外，前者 之纖維直徑較小於後者也是可能之因素。
當奈米纖維細胞支架經過第一型膠原蛋白表面改質處理後，其結
果出現了戲劇性之變化，尤其以聚乙烯醇奈米纖維細胞支架之差異最 為顯著，在經過表面改質處理後之聚乙烯醇奈米纖維細胞支架，其細 胞之貼附率在第4、6、8 小時均顯著成長(圖 3 - 11)，而經過表面改 質處理後之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架，其細胞貼附率僅 在第4 小時有顯著之成長(圖 3 - 12)。因此在比較表面改質之聚乙烯 醇奈米纖維細胞支架及表面改質之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞 支架時(圖 3 - 10)，除了第 2 小時之外，在第 4、6、8、24 小時之貼 附率，兩者之間並無差異，表示此時細胞對於聚乙烯醇奈米纖維細胞 支架之相容性，在第一型膠原蛋白表面改質之後獲得改善。在Rho等 人的研究中，使用不同細胞外基質之主要蛋白質對於膠原蛋白奈米纖 維進行表面改質，包括有第一型膠原蛋白、纖維連結素及基底層素 (Laminin)，結果顯示僅第一型膠原蛋白及纖維連結素對於人類角質細 胞之細胞貼附率有幫助(Rho et al., 2006)，主要是由於此兩者皆包含 RGD序列，此一序列可與細胞膜外之整合素(Integrin)接受器連結，因 此而造成細胞之貼附行為(Anselme, 2000)。本研究所使用之聚乙烯醇 /幾丁聚醣奈米纖維細胞支架，由於其擁有較好之生物相容性，在無 第一型膠原蛋白表面改質時，就表現出不錯之細胞貼率，因此在表面 改質之後並無太大之差異。
在本研中亦觀察到另一個現象，就是在聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米
纖維細胞支架(含第一型膠原蛋白表面改質)及第一型膠原蛋白表面 改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞支架，在培養第 24 小時，其細胞貼附 率與第8 小時比較有下降之趨勢，在過去的一些研究中(He, Yong et al., 2005; Serrano et al., 2004; Xu et al., 2004)，也得到與本研究類似之 結果，造成此一現象之機轉並不是十分的明確，但這表示細胞在第8 小時與第 24 小時之間發生細胞脫離貼附於基材之行為，有可能是細 胞與細胞之間傳遞著某些訊息，以控制細胞在基材上的總細胞數與密 度。
第四節 細胞攤平性測試
當纖維母細胞攤平時，細胞將呈現一較為穩定之狀態，此時細胞 才能充分發揮其本身之功能，如增生、分泌胞外基質等。因此細胞攤 平對於纖維母細胞之功能表現具有一定的重要性，在本研究之結果指 出，無論有無經過第一型膠原蛋白表面改質處理，纖維母細胞在聚乙 烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架上之攤平率不管在第 2、4、6、8 或 24 小時，皆比聚乙烯醇奈米纖維細胞支架還要來得高(圖 3 - 13、圖 3 - 14)。表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞支架在培養第 4 小時時，其 細胞攤平率比無表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞支架來得高(圖 3 - 15)，而表面改質對於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架之細胞
當纖維母細胞攤平時，細胞將呈現一較為穩定之狀態，此時細胞 才能充分發揮其本身之功能，如增生、分泌胞外基質等。因此細胞攤 平對於纖維母細胞之功能表現具有一定的重要性，在本研究之結果指 出，無論有無經過第一型膠原蛋白表面改質處理，纖維母細胞在聚乙 烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架上之攤平率不管在第 2、4、6、8 或 24 小時，皆比聚乙烯醇奈米纖維細胞支架還要來得高(圖 3 - 13、圖 3 - 14)。表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞支架在培養第 4 小時時，其 細胞攤平率比無表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞支架來得高(圖 3 - 15)，而表面改質對於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架之細胞