以電紡奈米纖維紡絲技術製作組織工程細胞支架; Fabricate a nanofibrous scaffold for tissue engineering using electrospinning
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(3) 中文摘要 研究背景與目的：電紡為一種紡織技術，可用來製造出直徑為數十到 數百奈米大小的纖維。許多具有生物可降解性之高分子聚合物，包括 天然聚合物及人工合成聚合物，皆可使用電紡之方式製作出奈米纖維 細胞支架。本研究使用兩種聚合物做為材料，聚乙烯醇為一水溶性、 無毒、且具生物相容性之高分子聚合物；幾丁聚醣為一天然高分子聚 合物，具有生物可降解性、生物相容性及抗菌性，此兩種材料在過去 皆廣泛應用於細胞支架之研究。然而，大部分的研究都只採用單一高 分子聚合物來製作奈米纖維細胞支架。因此，本研究之目的為以電紡 技術製作出適合組織工程應用之聚乙烯醇及聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米 纖維細胞支架並觀察基材對細胞之相容性。 材料與方法：以電紡技術製作出不織布形態之聚乙烯醇及聚乙烯醇/ 幾丁聚醣奈米纖維細胞支架。細胞支架以第一型膠原蛋白進行表面改 質處理，將 3T3 纖維母細胞培養於細胞支架中，以光學顯微鏡及電子 顯微鏡觀察細胞之形態，使用 H&E 染色技術來計算出細胞貼附與攤 平之比例，利用 MTS 測試量測出細胞生長於細胞支架時之細胞活 性，細胞之基因表現以即時聚合酶鏈鎖反應測試。 結果與討論：以電紡製作出直徑大小為 316±63.4 奈米之聚乙烯醇奈. -I-.
(4) 米纖維及直徑大小為 109.4±16.5 奈米之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖 維，生長於聚乙烯醇奈米纖維之細胞形態主要為圓形，生長於聚乙烯 醇/幾丁聚醣奈米纖維之細胞形態主要為紡錘形。在細胞對於基材之 貼附性、攤平性、細胞活性、胞外基質分泌的表現，聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維都比聚乙烯醇奈米纖維來得好。而第一型膠原蛋白表面 改質處理，對於細胞貼附率有明顯之提升，但對於長期之細胞活性變 化並無影響。 結論：本研究認為聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米電紡絲本身對於纖維母細 胞擁有非常好之相容性。在未來研究中，將針對建立系統性參數、收 集器之改良、加強基材強度、研發生物反應器及動物試驗做更進一步 之研究。. 關鍵字：電紡、奈米纖維、細胞支架、聚乙烯醇、幾丁聚醣、纖維母 細胞。. - II -.
(5) Abstract Background and purpose: Electrospinning is one of the process techniques to produce fiber in nanoscale diameter. Various biodegradable polymers were used to develop nanoscaffolds including natural and synthetic type. Poly(vinyl alcohol) (PVA) is a non-toxic, hydrophilic, and biocompatible material. Chitosan is a natural polymer, which is biodegradable, biocompatible, and antibacterial. In the previous studies, PVA and chitosan have been used for many tissue engineering applications. However, most of the studies use only single polymer to fabricate nanofibers. Therefore, the purpose of this study is to fabricate PVA and PVA/Chitosan nanofiber scaffold for further tissue engineering applications. Materials and methods: PVA and PVA/Chitosan were used as the material to fabricate scaffold. The 3D nanofiber scaffold was produced via electrospinning. Surface of nanofiber scaffolds were modified using Type I collagen coating. NIH 3T3 fibroblast cell line was used as the cell source in this study. Fibroblast cells were seeded onto 3D scaffolds for different time points. Cellular morphology characterization was observed using inverted light microscopy and scanning electron microscopy. The cell adhesion and spreading rate were determined by H&E Stain. The cell viability was determined by MTS assay. RT-PCR was used to examine the cellular gene expression after culturing for 5 days. Results and discussion: PVA nanofiber of 316±63.4 nm in diameter and PVA/Chitosan nanofiber of 109.4±16.5 nm in diameter were obtained. - III -.
(6) The fibroblast cell was attached with round shape on the PVA nanofiber scaffold and with spindle shape on the PVA/Chitosan nanofiber scaffold. The result shows that the fibroblast exhibit excellent cell adhesion rate, spreading rate, cell viability and gene expression on the PVA/Chitosan nanofiber scaffold. The cell adhesion rate was increased when matrices coated with Type I collagen. Conclusion: In present study, PVA/Chitosan nanofiber scaffold shows better biocompatibility than PVA nanofiber scaffold. Further coating collagen on nanofiber scaffold does not display further improvement in cell compatibility except cell adhesion rate. Future study will focus on systematic parameter setting, platform modification, increase strength of scaffold, bioreactor, and in-vivo experiment.. Keywords:. electrospinning, nanofiber, scaffold, PVA, Chitosan,. fibroblast.. - IV -.
(7) 誌謝 本篇論文若只靠我一己之力是絕對無法完成的，一路上我獲得不少人 的幫助，必需感謝與感激的人非常多。首先我要感謝我的指導教授許弘昌 老師、葉明龍老師及蘇芳慶老師，沒有你們的指導與協助，我的論文是無 法順利完成的。再來要感謝影響我最深的兩位老師，吳鴻文老師感謝你這 些年來對我的栽培，帶領我進入研究的領域；吳昇光老師感謝你教導了我 許多做研究應有的態度，讓我更堅定走研究這條路。 在執行實驗的過程中，我得到許多貴人的協助。崑山科大的粘譽薰老 師、政保及維寧，感謝你們不眠不休的幫我製作實驗用的基材；成大醫工 所的小鳳學姐、詩屏學姐、明哲學長及僅評，感謝你們提供我儀器的協助 及技術上的指導；張怡雯老師、林秀貞老師、羅震宇老師、周立偉醫師、 楊佩瑜醫師及謝文逸醫師，感謝你們提供我擔任助教與兼任研究助理的機 會，讓我有足夠的收入養活我自己。 能夠實現自己從事研究的夢想，家人的支持絕對功不可沒，感謝我的 父母從小到大給予我自由不受限的發展空間，也感謝阿花老哥、平芳大嫂 與小嘉芸給予我的資助與鼓勵。 最後我要感謝兩個實驗團隊的夥伴們，中國醫大動作分析實驗室的沙 西米(奕宏)、一姐(曉蕙)、姐姐(雅凌)，感謝你們協助實驗室的運作，讓我 可以無後顧之憂的完成自己的論文研究；成大醫工所奈微生物力學實驗室 的俊毅、方璵、登凱、育民、國銘、政鑫、乃仁、凱翔、婉婷及君豪，研 究路上有你們相伴真好，能夠認識你們是我的福氣。 在此為每一位曾經幫助過我的人獻上最深的祝福，接下來我將在成大 醫工所繼續攻讀博士班，能夠在自己熟悉的環境下繼續從事研究是件非常 幸福的事，也希望將來我的研究成果能夠為整個醫療界貢獻一份心力。. -V-.
(8) 目錄 中文摘要 .................................................................................................... I 英文摘要 ..................................................................................................III 誌謝............................................................................................................V 目錄.......................................................................................................... VI 圖目錄........................................................................................................X 表目錄................................................................................................... XIV 第壹章. 緒論........................................................................................1. 前言：近年來細胞支架發展之趨勢 .................................................1 第一節. 研究背景與研究動機.....................................................2. 1-1-1. 細胞外基質之構造.........................................................2. 1-1-2. 基材之化學、表面形貌及軟硬度對細胞生長之影響.2. 1-1-3. 細胞支架之設計.............................................................3. 1-1-4. 奈米纖維細胞支架對細胞反應之影響.........................4. 1-1-5. 電紡技術 .........................................................................4. 1-1-6. 電紡技術在組織工程上之應用.....................................7. 1-1-7. 聚乙烯醇(Poly(vinyl alcohol), PVA)材料簡介 ...........12. 1-1-8. 幾丁聚醣(Chitosan)材料簡介......................................13. 1-1-9. 基材對於細胞反應之影響...........................................13 - VI -.
(9) 1-1-10 研究動機 .......................................................................14 第二節 研究目的..............................................................................15 第貳章. 材料與方法..........................................................................16. 第一節. 實驗架構 .......................................................................16. 第二節. 研究材料與儀器設備...................................................17. 第三節. 奈米電紡絲製作與電紡平台參數設置.......................19. 第四節. 奈米電紡絲表面改質處理...........................................20. 第五節. 細胞培養 .......................................................................20. 第六節. 細胞形態觀察 ...............................................................20. 2-6-1. 光學顯微鏡觀察...........................................................20. 2-6-2. 掃描式電子顯微鏡觀察...............................................21. 第七節. 細胞貼附性研究...........................................................21. 第八節. 細胞攤平性研究...........................................................22. 第九節. 細胞活性(MTS assay)之研究 ......................................23. 第十節. 即時聚合酶鏈鎖反應測試(Real-Time PCR) ..............24. 2-10-1 RNA萃取.......................................................................24 2-10-2 cDNA 合成...................................................................24 2-10-3 引子合成(Primer Synthesis).........................................25 2-10-4 Real-Time PCR放大 .....................................................25. - VII -.
(10) 第十一節 第參章. 統計分析 .......................................................................26. 研究結果..............................................................................27. 第一節. 奈米電紡絲之形態學觀察...........................................27. 第二節. 細胞形態學觀察...........................................................27. 3-2-1. 光學顯微鏡觀察...........................................................27. 3-2-2. 掃描式電子顯微鏡觀察...............................................33. 第三節. 細胞貼附性測試...........................................................38. 第四節. 細胞攤平性測試...........................................................42. 第五節. 細胞活性測試 ...............................................................45. 第六節. Real-Time PCR基因表現測定 .....................................48. 3-6-1. 引子之結合效能分析...................................................48. 3-6-2. 標準化基因表現量.......................................................51. 第肆章. 討論......................................................................................55. 第一節. 奈米電紡絲之形態學觀察...........................................55. 第二節. 細胞形態學觀察...........................................................57. 第三節. 細胞貼附性測試...........................................................60. 第四節. 細胞攤平性測試...........................................................63. 第五節. 細胞活性測試 ...............................................................64. 第六節. Real-Time PCR基因表現測定 .....................................66. - VIII -.
(11) 主要研究限制 ...............................................................68. 第七節 4-7-1. 電紡平台參數設置.......................................................68. 4-7-2. 小珠形成 .......................................................................68. 4-7-3. 材料性質 .......................................................................68. 4-7-4. 基材強度不足 ...............................................................69. 4-7-5. 細胞來源 .......................................................................69. 第伍章. 結論與未來方向..................................................................70. 第一節. 結論 ...............................................................................70. 第二節. 未來方向 .......................................................................71. 5-2-1. 建立系統性參數...........................................................71. 5-2-2. 收集器之改良 ...............................................................71. 5-2-3. 材料選擇 .......................................................................72. 5-2-4. 加強基材強度及力學評估...........................................73. 5-2-5. 生物反應器 ...................................................................73. 5-2-6. 幹細胞培養 ...................................................................73. 5-2-7. 動物試驗 .......................................................................74. 參考文獻 ..................................................................................................75. - IX -.
(12) 圖目錄 圖 1 - 1：電紡基本配置圖(Teo et al., 2006)............................................6 圖 1 - 2：聚乙烯醇之化學結構圖 .........................................................12 圖 1 - 3：幾丁聚醣之化學結構圖 .........................................................13 圖 2 - 1：實驗流程圖 .............................................................................16 圖 2 - 2：(A) 高壓直流電源供應器；(B) 定量式注射幫浦..............18 圖 2 - 3：樣本細胞計數方式示意圖 .....................................................22 圖 3 - 1：聚乙烯醇奈米纖維電子顯微鏡影像.....................................29 圖 3 - 2：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維電子顯微鏡影像....................30 圖 3 - 3：纖維母細胞於聚乙烯醇奈米纖維(A1-A5)與表面改質處理之 聚乙烯醇奈米纖維(B1-B5)生長之形態.........................................31 圖 3 - 4：纖維母細胞於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維(A1-A5)與表面改 質處理之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維(B1-B5)生長之形態........32 圖 3 - 5：纖維母細胞於聚乙烯醇奈米纖維上生長之形態(第 1 天) ..34 圖 3 - 6：纖維母細胞於聚乙烯醇奈米纖維上生長之形態(第 3 天) ..35 圖 3 - 7：纖維母細胞於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維上生長之形態 ...........................................................................................................36 圖 3 - 8：纖維母細胞於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維上生長之形態 ...........................................................................................................37 -X-.
(13) 圖 3 - 9：聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞貼附率變化圖 ...........................................................................................................40 圖 3 - 10：表面改質之聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞貼 附率變化圖 ......................................................................................40 圖 3 - 11 ：聚乙烯醇奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞 貼附率折變化圖 ..............................................................................41 圖 3 - 12：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維細胞貼附率折變化圖 ..............................................41 圖 3 - 13：聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞攤平率變化圖 ...........................................................................................................43 圖 3 - 14：表面改質之聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞攤 平率變化圖 ......................................................................................43 圖 3 - 15：聚乙烯醇奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞貼 附率折變化圖 ..................................................................................44 圖 3 - 16：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維細胞貼附率折變化圖 ..............................................44 圖 3 - 17：聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞活性變化圖 ...........................................................................................................46 圖 3 - 18：表面改質之聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞活 性變化圖...........................................................................................46 圖 3 - 19：聚乙烯醇奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞活 - XI -.
(14) 性變化圖...........................................................................................47 圖 3 - 20：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維細胞活性變化圖 ......................................................47 圖 3 - 21：引子 GADPH 結合效能標準曲線圖 ...................................48 圖 3 - 22：引子 β-肌動蛋白結合效能標準曲線圖............................49 圖 3 - 23：引子第一型膠原蛋白結合效能標準曲線圖.......................49 圖 3 - 24：引子第三型膠原蛋白結合效能標準曲線圖.......................50 圖 3 - 25：引子纖維連結素結合效能標準曲線圖...............................50 圖 3 - 26：第一型膠原蛋白標準化基因表現量...................................52 圖 3 - 27：第三型膠原蛋白標準化基因表現量...................................52 圖 3 - 28：纖維連結素標準化基因表現量 ...........................................53 圖 3 - 29：纖維母細胞生長於聚乙烯醇細胞支架之標準化基因表現量 ...........................................................................................................53 圖 3 - 30：纖維母細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣細胞支架之標準化基 因表現量...........................................................................................54 圖 3 - 31：纖維母細胞生長於培養皿之標準化基因表現量...............54 圖 4 - 1：電紡參數對於奈米纖維形態之變化圖.................................56 圖 4 - 2：纖維母細胞生長於聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維 之形態...............................................................................................58 圖 5 - 1：(a)滾輪式電紡裝置；(b)金屬線圈式電紡裝置；(c)圓盤式電 - XII -.
(15) 紡裝置。...........................................................................................72 圖 5 - 2：平行排列連續電紡絲線之電紡裝置.....................................72. - XIII -.
(16) 表目錄 表 2 - 1：主要藥品、材料 .....................................................................17 表 2 - 2：主要儀器設備 .........................................................................18 表 2 - 3：引子合成序列 .........................................................................25. - XIV -.
(17) 第壹章 緒論 前言：近年來細胞支架發展之趨勢 細胞支架(scaffold)已廣泛的應用於許多組織工程與再生醫學的 研究中，其應用方式主要可分為：組織誘導(tissue induction)、細胞移 植(cell transplantation)、前血管化(prevascularization)、in situ 重合法(in situ polymerization) 及 生 物 活 化 分 子 投 遞 (delivery of bioactive molecules)(Ratner et al., 2004)。無論是哪一種應用方式，在材料的選 擇上都環繞著相同的概念，也就是生物相容性(biocompatible)及生物 可降解性(biodegradation)，這是因為細胞支架需植入於體內，生物相 容性可減少植入之材料在體內產生排斥、發炎反應，而生物可降解性 可使植入之材料於體內降解並代謝掉，不需再開刀取出植入物。由於 細胞支架主要用於暫時取代體內細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)的功能，使細胞得以正常生長進而產生新的細胞外基質並進行 重建(remodeling)，因此近年來細胞支架的設計都以仿生物體內細胞 外基質的構造來開發，以營造出類似體內細胞生長的環境(Ge et al., 2006)。. -1-.
(18) 第一節 1-1-1. 研究背景與研究動機 細胞外基質之構造. 細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)為一存在於許多種類的動 物組織之構造，其主要成分為蛋白質(主要為膠原蛋白)，為纖維所構 成之多孔洞結構，此一構造可提供細胞外基質內的細胞貼附與生長， 而這些纖維直徑大小約為 50-500nm。除此之外，細胞外基質對於細 胞形狀與活動方面扮演著主要的調節角色。這是由於在細胞外基質中 有許多蛋白質會與細胞膜外接受器產生鍵結，進而影響細胞的功能表 現(Karp, 2005)。. 1-1-2. 基材之化學、表面形貌及軟硬度對細胞生長之影響. 在過去的研究中發現，在人工的基材上塗佈上某些種類的細胞外 基質蛋白質後，可以明顯增加細胞對基材的貼附與增生能力(Castner et al., 2002; Gaudet et al., 2003)。另外，若改變基材表面形貌的形狀 (topography)，生長於此基材上的細胞也會有排列及形狀上的改變， 甚至會影響細胞的功能表現(Curtis et al., 1997; Lee et al., 2005)。近年 來，開始有一些研究針對基材的軟硬度對於幹細胞分化之影響。結果 指出，幹細胞生長於不同軟硬度之基材後會分化成不同種類的細胞 (Engler et al., 2006)。而這些研究都證實了細胞外基質對於細胞功能表. -2-.
(19) 現之重要性。. 1-1-3. 細胞支架之設計. 因此，以人工方式所製作出的細胞支架必須以仿照細胞外基質構 造來設計。在材料選擇方面，可分為天然與人工材料，天然材料以膠 原蛋白(collagen)為主(Bellincampi et al., 1998; Dunn et al., 1995)，這是 由於膠原蛋白是細胞外基質內含量最多的蛋白質。而在人工材料方 面 ， 大 多 採 用 高 生 物 相 容 性 (biocompatible) 且 具 有 生 物 可 降 解 性 (biodegradable)的高分子聚合物，如：聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、 左旋型聚乳酸(PLLA)、聚己內酯(PCL)等(J. A. Cooper et al., 2005; Lin et al., 1999; Lu et al., 2005; Middleton et al., 2000)。而在細胞支架結構 方面，主要可分為四種類型。第一種類型為微米級多孔型細胞支架， 製 作 的 方 式 主 要 為 溶 劑 鑄 造 / 鹽 析 法 (solvent casting / particulate leaching)、相分離法(phase separation)及冷凍乾燥法(freeze drying)，孔 洞大小約為數十至數百微米(Karageorgiou et al., 2005)。第二種為水膠 型細胞支架，以化學或是溫度改變的方式使聚合物溶液凝膠，為一無 孔洞之構造(Elisseeff et al., 2005; Noth et al., 2005)。第三種為微米纖維 細胞支架，製作方式為傳統的紡織技術，纖維直徑大小約為數十微 米，以編織或是交聯 (cross-linking)的方式製作出所需要的形狀及大. -3-.
(20) 小的細胞支架(Altman et al., 2002; J. A. Cooper, Jr. et al., 2006)。第四種 為本研究所要採用的奈米纖維細胞支架，製作的方式有自組裝 (self-assemble)、相分離法(phase separation)及電紡(electrospinning)， 所製作出之纖維直徑大小約為數十到數百奈米(Barnes et al., 2007)。而 奈米纖維細胞支架相較於其他兩者更近似於細胞外基質內纖維直徑 的大小。. 1-1-4. 奈米纖維細胞支架對細胞反應之影響. 由於奈米纖維細胞支架具有高孔洞率及高表面積對體積的比例 的特性，且擁有與細胞外基質相似的纖維直徑大小(Lee et al., 2005)， 因此許多研究便針對奈米纖維細胞支架對細胞反應影響去做探討，結 果顯示奈米纖維細胞支架對於細胞的功能表現確實優於其他種類的 細胞支架。Sahoo 等人之研究指出，骨髓幹細胞生長於聚乳酸-甘醇酸 (PLGA)奈米纖維細胞支架上之增生及產生細胞外基質表現明顯比聚 乳酸-甘醇酸微米纖維細胞支架好(Sahoo et al., 2006)。而在 Lee 等人 的研究中，發現纖維母細胞生長於平行排列的奈米纖維比亂數排列的 奈米纖維產生出更多與韌帶相關的細胞外基質(Lee et al., 2005)。. 1-1-5. 電紡技術. 電紡技術簡史 -4-.
(21) 電紡是一種紡織技術，有別於傳統的紡織技術，可製作出直徑大 小為數十至數百奈米的纖維。而電紡的原始構想始於 1930 年代早期 發展出來，之後由 Formhals 在 1934 年申請第一個美國專利(Formhals, 1934)。在之後的數十年，也有許多不同型式的電紡技術發展出來， 也陸續的申請專利，但當時由於電紡並無實質上的應用價值，所以並 沒有受到重視。近年來，由於電子顯微鏡的發明與奈米科技的進步， 研究學者開始將電紡技術應用於醫學工程的領域之中。. 電紡構造及基本原理 電紡主要構造包含有三個部份：注射器、高電壓電源供應器及金 屬收集器(圖 1 - 1)(Teo et al., 2006)。電紡抽絲主要是以靜電力的概 念，利用高壓電源供應在溶液表面施以高電壓(15~25kV)，而與金屬 接收器(0V或帶負電)之間形成一電場，所產生之靜電力將奈米纖維從 溶液表面抽出(Subbiah et al., 2005)。而奈米纖維絲成形主要分為兩個 階段：第一個階段為噴發起始期(jet initiation)，主要是由於高壓電場 所產生的靜電力大於溶液末端的表面張力時，纖維絲從溶液表面抽出 (Taylor, 1969)。第二階段為彎曲不穩定期(bending instability)，當纖維 絲從溶液抽出後，在纖維絲落在金屬收集器之前會呈現彎曲且方向不 穩定的狀態，Yarin等人認為是由於充滿電荷的纖維絲所產生的排斥. -5-.
(22) 力所導致(Yarin et al., 2001)。因此，金屬收集器上的奈米纖維是以亂 數排列的方式呈現。 Solution. High Voltage power supply. Electrospinning jet. 圖 1 - 1：電紡基本配置圖(Teo et al., 2006). 電紡參數對於奈米纖維形態學之影響 影響奈米纖維形態的參數可分為三大類：第一類為溶液的特性， 包括有黏性(viscosity)、聚合物濃度(polymer concentration)、聚合物的 分子量(molecular weight of polymer)、導電性(electrical conductivity)、 彈性(elasticity)及表面張力(surface tension)。第二類為儀器設置狀態， 包 括 有 施 加 電 壓 大 小 (applied voltage) 、 針 與 金 屬 收 集 器 之 距 離 (distance from needle to collector)、注射器流速(volume of feed rate)及 針的直徑(needle diameter)。第三類為大氣狀態，包括有溫度、溼度及 大氣壓力(Tan et al., 2005)。在過去的研究中已成功製作出直徑大小為 -6-.
(23) 5 奈米的電紡奈米纖維(Hou et al., 2002)。因此，若能有效的控制以上 的參數，便可以製作出穩定的奈米纖維形態。 一般而言，電紡奈米纖維形態可分為兩種：一致性(uniform)和非 一致性(non-uniform)。一致性為正常形態的電紡纖維，也就是所有的 纖維都呈現絲狀且有相近的直徑大小，而非一致性又分為兩種類型： 第一種為小珠(bead)形態，在纖維絲的周圍有小珠狀的形態，一般都 是在製作比較細的纖維時出現，主要是在彎曲不穩定期形成。第二種 為纖維直徑呈現雙峰分佈(bimodal)，所製作出的纖維有粗細不均的現 象，一般都是在製作比較粗的纖維時出現，主要是在噴發起始期形 成。過去研究中指出小珠形態的纖維絲會使細胞增生的態力下降，因 此，在製作電紡絲時應儘量避免小珠形態的產生(Chen et al., 2007)。. 1-1-6 電紡技術在組織工程上之應用 由於電紡可製作出直徑為數十到數百奈米之纖維，且為多孔洞之 構造，由於近似於體內細胞外基質之構造，因此近年來許多學者開始 將電紡奈米纖維應用於細胞支架之組織工程研究，目前所已應用之領 域包括有硬骨、軟骨、韌帶、肌腱、血管、神經及皮膚組織工程。 硬骨組織工程：Tuzlakoglu 等人混合使用微米纖維與奈米纖維並利用 纖維交聯的方式製作出立體澱粉/聚己內酯(starch/PCL) (30:70) 細胞. -7-.
(24) 支架。結果顯示，有混合電紡奈米纖維的細胞支架對於 SaOs-2 細胞 株及骨髓幹細胞的貼附與鹼性磷酸脢(alkaline phosphatase)活性表現 都比沒有混合電紡奈米纖維的細胞支架還要好(Tuzlakoglu et al., 2005)。Yoshimoto 等人將新生鼠之間葉幹細胞培養於聚己內酯(PCL) 奈米纖維細胞支架 4 週。培養第一週時，細胞穿過細胞支架生長並產 生大量的細胞外基質；於第四週時觀察到多層細胞生長於表面、礦化 作用(mineralization)及第一型膠原蛋白的生成。顯示出聚己內酯奈米 纖維細胞支架在骨組織工程之應用有發展之潛力(Yoshimoto et al., 2003)。 軟骨組織工程：Li 等人使用老鼠纖維母細胞及間葉幹細胞研究電紡聚 乳酸-甘醇酸(PLGA)細胞支架，作者認為聚乳酸-甘醇酸細胞支架所提 供的力學特性適合做為軟骨組織工程之應用(W. J. Li et al., 2002)。 Shields 等人研究電紡第二型膠原蛋白(type II collagen)奈米纖維細胞 支架(分為有交聯處理及無交聯處理)。在培養人類骨節軟骨細胞(T/C 28a2)7 天後，在有交聯處理的細胞支架上顯示出較好的細胞貼附、增 生及移動能力，利用免疫組織化學的分析也發現較多細胞外基質的分 泌(Shields et al., 2004)。將 TGF-β1 加入培養於聚己內酯(PCL)奈米纖 維的成人間葉幹細胞的培養基中後，可以促進間葉幹細胞分化為軟骨 細胞，並顯示出特定的軟骨基因表現及分泌出與軟骨相關的細胞外基. -8-.
(25) 質(M. Y. Li et al., 2005)。 韌帶/肌腱組織工程：將人類韌帶纖維母細胞培養於平行排列的聚氨 酯(PU)奈米纖維上 3 天後，發現細胞呈現紡錘形狀且順著奈米纖維的 方向生長排列。將細胞培養於亂數排列的奈米纖維上則無此特性。培 養於平行排列的細胞在 7 日後呈現類似組織成束的構造且高密度細 胞生長於纖維表面，而此現象並沒有出現在亂數排列的奈米纖維之 中。細胞膠原蛋白的分泌在平行排列的奈米纖維上也顯著較多。平行 排列的奈米纖維對於長軸方向的力學剌激也有較敏感的現象。根據此 研究，平行排列的奈米纖維具有發展韌帶組織工程應用的潛力(Lee et al., 2005)。 由於奈米纖維基材缺乏足夠的力學強度，對於韌帶及肌鍵組織工 程的應用會造成限制。因此，若能將電紡奈米纖維與力學強度高的細 胞支架結合，也許可以達到足夠的強度提供肌鍵/韌帶組織工程使 用。Sahoo 等人將聚乳酸-甘醇酸(PLGA)奈米纖維覆蓋在聚乳酸-甘醇 酸針織細胞支架的表面(Sahoo et al., 2006)，將豬骨髓幹細胞培養於有 聚乳酸-甘醇酸奈米纖維覆蓋及無覆蓋的聚乳酸-甘醇酸針織細胞支 架中。 經過 36 小時培養後，細胞貼附性在兩組之間並無差異；在培 養 1 週後，培養在有聚乳酸-甘醇酸奈米纖維的細胞支架細胞貼附及 細胞增生情形比無奈米纖維的細胞支架還要好，而在與韌帶組織有關. -9-.
(26) 的基因表現，如第一型膠原蛋白(type I collagen)、膠原沉積抑制因子 (decorin)及雙醣(biglycan)，也在有聚乳酸-甘醇酸奈米纖維這一組有較 好的表現。 血管組織工程：He 等人使用膠原蛋白/PLLA-CL 混合物做為奈米纖維 備製之材料，在培養人類冠狀動脈內皮細胞後，發現在細胞活性、貼 附性、及基因表現都有所提升。 (He, Yong et al., 2005) He 等人提出 在 有 塗 佈 膠 原 蛋 白 (collagen-coated) 的 結 構 可 以 增 進 endothelialization，且此細胞支架可提供很好的力學強度，有潛力發展 為血管植體(He, Ma et al., 2005)。在研究聚己內酯 (PCL)、塗佈膠原 蛋白的聚己內酯奈米纖維及膠原蛋白奈米纖維三種不同基材對於人 類冠狀動脈平滑肌細胞生長影響的實驗中指出，平滑肌細胞會順著纖 維的方向生長，且細胞的貼附性、移動與增生會與 α-actin filaments 的形態有關聯(Venugopal et al., 2005)，而有塗佈膠原蛋白的纖維被認 為是最適合應用在血管組織工程的研究(Ma et al., 2005)。 神經組織工程：平行排列的纖維對於神經組織工程帶來許多的好處。 Yang 等人發現平行排列的左旋型聚乳酸(PLLA)奈米/微米纖維細胞支 架可引導新生鼠小腦 C17.2 幹細胞的生長。細胞呈現伸長(elongation) 形態且軸突延著纖維的方向向外生長。細胞分化的速率於奈米纖維比 微米纖維還要來得高，表示平行排列的左旋型聚乳酸(PLLA)奈米纖. - 10 -.
(27) 維細胞支架可提供神經組織工程應用的潛力(Yang et al., 2005)。另 外，Yang 等人也發展出提供神經組織工程的電紡奈米纖維細胞支 架，製作出平均直徑為 272nm、孔洞大小為 21μm 及表面組糙度為 172nm 的奈米纖維細胞支架。當幹細胞培養於此細胞支架上，61.4% 的細胞在 2 個小時後貼附於基材上，70%的細胞在 1 天後便分化呈現 紡錘形(Yang et al., 2004)。雖然左旋型聚乳酸(PLLA)奈米纖維細胞支 架對於幹細胞的生長與分化有不錯的表現，但左旋型聚乳酸(PLLA) 本身屬於疏水性(hydrophobic)材質，並不屬於細胞喜愛貼附的形式， 然而細胞貼附對於細胞生長與分化上扮演著一個重要的角色，因此若 將基材的表面做一些處理將可以增進此細胞支架對於細胞貼附的效 率。 皮膚組織工程：Sun 等人使用人類皮膚角質細胞(keratinocytes)、纖維 母細胞及內皮細胞研究單一細胞培養及共同培養(co-culture)於電紡 polystyrene 奈米細胞支架的影響，結果指出不論何種細胞的單一培養 顯示出低的存活率，使用共同培養的方式顯示出高的細胞存活率(Sun et al., 2005)。Zhang 等人使用兩種不同的兩種不同型式的聚己內酯 (PCL) 奈 米 纖 維 ： 第 一 種 為 同 軸 電 紡 技 術 (coaxial electrospinning technique)製作出塗佈膠原蛋白的聚己內酯奈米纖維；另一種為將聚 己內酯奈米纖維浸泡於膠原蛋白溶液內，製作出粗略的塗佈膠原蛋白. - 11 -.
(28) 的聚己內酯奈米纖維。將人類真皮纖維母細胞培養於這兩種基材 6 天 後，細胞密度在粗略塗佈膠原蛋白的聚己內酯奈米纖維中呈現較低的 現象，而獨立塗佈膠原蛋白的奈米纖維與促進細胞移動至基材內部有 關聯，雖然本研究主要是在探討兩種不同的基材並非組織工程，但若 能善加應用，對於組織工程的應用將有很大的幫助 (Zhang et al., 2005)。. 1-1-7 聚乙烯醇(Poly(vinyl alcohol), PVA)材料簡介 聚乙烯醇為一高分子聚合物(圖 1 - 2)，為一水溶性、無毒、且具 生物相容性之高分子聚合物，過去在組織工程上的應用包括人工角 膜、關節軟骨等(Gu et al., 1998; Miyashita et al., 2006)。然而這些研究 大多將聚乙烯醇製作為水膠(hydrogel)形式的細胞支架(Scaffold)來做 細胞/組織培養。由於價格比天然聚合物如膠原蛋白便宜許多，因此 許多組織工程細胞支架使用此高分子聚合物做為材料。. 圖 1 - 2：聚乙烯醇之化學結構圖 - 12 -.
(29) 1-1-8 幾丁聚醣(Chitosan)材料簡介 幾丁聚醣為(圖 1 - 3)一天然高分子聚合物，其擁有極佳的生物特 性，如生物可降解性、生物相容性、抗菌性及傷口癒合活性(Khor et al., 2003; No et al., 2002; Ueno et al., 2001)。除此之外，幾丁聚醣能幫助止 血及促進組織再生(Malette, 1985)。因此，將幾丁聚醣應用於組織工 程細胞支架將具有無窮之潛力。在過去的研究中，幾丁聚醣可應用的 泛圍非常之廣，包括有皮膚、硬骨、軟骨、肝臟、神經及血管組織工 程(Kim et al., 2008)。. 圖 1 - 3：幾丁聚醣之化學結構圖. 1-1-9 基材對於細胞反應之影響 細胞生長於基材上時，其生長現象可以直接反映出此一基材之生 物相容性，而生長反應之現象可利用一些檢測方式來評估，常見的檢 測方式包括有細胞形態學、貼附性、攤平性、活性及基因表現。不同. - 13 -.
(30) 種類之細胞其生長之形態也不盡相同，而生長形態之正常與否將會影 響細胞活性及其功能表現。以纖維母細胞為例，其正常之生長形態為 紡錘形(spindle shape)。細胞之生長行為如貼附與攤平會影響細胞內部 之訊息傳遞有關，而這些訊息傳遞多與細胞增生與功能表現有關。細 胞活性的檢測方式為利用一些特定的藥劑(如：MTT、MTS、WST-1)， 而這些藥劑可與某些只有活細胞分泌的分子做鍵結，而藥劑在與這些 分子鍵結之後會產生瑩光，而以吸光值來測定細胞活性之多寡，而細 胞活性也可間接的表示出細胞數量之多寡，因此許多細胞增生的研究 都以細胞活性做為測定之工具。細胞之基因表現可代表其功能表現的 狀態，目前基因表現所使用測定的方式 多以聚合酶鏈鎖反應測試 (Polymerase chain reaction，PCR)為主。. 1-1-10 研究動機 在過去的研究中，雖然太多數都還是處於實驗室階段，但可以確 定的是電紡技術可以廣泛的應用於不同的領堿之中並擁有強大之研 究潛力。然而，過去電紡所使用之材料多以單一高分子聚合物為主， 較少使用複合材料來製作奈米電紡絲。因此，本研究將使用合成與天 然高分子聚合物結合之複合材料來製作奈米電紡絲，並探討合成高分 子聚合物在添加天然高分子聚合物之後對於細胞生長反應之影響。. - 14 -.
(31) 第二節 研究目的 本研究之目的希望能以電紡奈米纖維紡絲技術製作適合做為組 織工程使用之細胞支架，可分為三個部分：(1)以電紡技術備製出聚 乙烯醇(Poly(vinyl alcohol), PVA)及聚乙烯醇/幾丁聚醣(Chitosan)奈米 不織布電紡絲；(2)評估聚乙烯醇(Poly(vinyl alcohol), PVA)及聚乙烯醇 /幾丁聚醣(Chitosan)奈米不織布電紡絲對於纖維母細胞生長反應之影 響；(3)評估電紡絲經由表面塗佈第一型膠原蛋白後對於細胞生長反 應之影響。. - 15 -.
(32) 第貳章 材料與方法 第一節 實驗架構. 建立最佳化之電紡系統參數. 製備聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣 不織布奈米電紡絲. 奈米纖維形態學觀察. 奈米電紡絲表面改質處理 z. 塗佈第一型膠原蛋白處理. 纖維母細胞培養於聚乙烯醇、聚乙烯 醇/幾丁聚醣奈米纖維. 1.. 細胞型態觀察. 2.. 細胞貼附性測試. 3.. 細胞攤平性測試. 4.. 細胞活性測試. 5.. Real-Time PCR 基因表現測定. 圖 2 - 1：實驗流程圖 - 16 -.
(33) 第二節 研究材料與儀器設備 表 2 - 1：主要藥品、材料 名稱. 廠牌. 聚乙烯醇(Poly(vinyl alcohol), PVA). Showa, Japan. 幾丁聚醣(Chitosan). SIGMA-ALDRICH, Inc.. 第一型膠原蛋白 (Type I collagen). SIGMA-ALDRICH, Inc.. Dulbecco’s modified Eagle’s medium. SIGMA-ALDRICH, Inc.. 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum). JRH. 盤尼西林 (Penicillin). SIGMA-ALDRICH, Inc.. Trypsin. SIGMA-ALDRICH, Inc.. 戊二醛 (Glutaraldehyde). Fluka. 福馬林 (Formaldehyde). Riedel-de Haën. 鋨酸 (OsO4). SIGMA-ALDRICH, Inc.. 磷酸緩衝溶液(Phosphate buffer. SIGMA-ALDRICH, Inc.. solution, PBS) Hematoxylin. SIGMA-ALDRICH, Inc.. Eosin. SIGMA-ALDRICH, Inc.. MTS reagent. Promega Corporation. SV Total RNA Isolation System. Promega Corporation. iScriptTMcDNA Synthesis Kit. Bio-Rad Laboratories, Inc.. iQ Supermix. Bio-Rad Laboratories, Inc.. - 17 -.
(34) 表 2 - 2：主要儀器設備 名稱 高壓直流電源供應器(圖 2 - 2 A). 廠牌 Glassman High Voltage, Inc., High Bridge, NJ. 定量式注射幫浦(圖 2 - 2 B). 台製. 倒立式光學顯微鏡. Motic/AE31. CO2 臨界點乾燥機. TOUSIMIS/815B. 掃描式電子顯微鏡(Scanning. Zeiss/EVO50、Hitachi/S-3000H. electron microscope, SEM) 酵素免疫分析儀(Enzyme-linked. Bio-Tek. immunoassay, ELISA) 即時聚合酶鏈鎖反應測試. Bio-Rad/iQ5. (Real-Time PCR). (A). (B). 圖 2 - 2：(A) 高壓直流電源供應器；(B) 定量式注射幫浦. - 18 -.
(35) 第三節 奈米電紡絲製作與電紡平台參數設置 本研究使用高分子聚合物聚乙烯醇(PVA，聚合度：2,000，分子 量：88,000 道耳吞) (Showa, Japan)及幾丁聚醣(Chitosan，黏度： 200~800cp) (Sigma)來製作細胞支架。聚乙烯醇溶液製作方式，使用 加熱至 80℃的水配製出 8 % (w/w)聚乙烯醇溶液；聚乙稀醇/幾丁聚醣 溶液製作方式，先將幾丁聚醣溶於醋酸中配製出 2% (w/v)幾丁聚醣溶 液，以聚乙烯醇:幾丁聚醣混合比例為 3:1 (w:w)備製出 6.5% (w/w)聚 乙烯醇/幾丁聚醣混合溶液。 將溶液載入針頭直徑大小 0.7mm 的注射器內，以 0.06 毫升/小時 的速率流出，高電壓電源供應器(Glassman High Voltage, Inc., High Bridge, NJ)電壓設定為 15kV，將 6 公分×6 公分大小的聚氯乙烯 (Polyvinyl chloride, PVC)透明薄膜置於金屬收集器上，針頭與聚氯乙 烯膜之間的距離為 16 公分，進行電紡絲收集約 24 小時後，在聚氯乙 烯膜表面會形成一層不纖布結構的細胞支架。使用掃描式電子顯微鏡 觀察奈米纖維之形態，並使用 Photoshop 軟體計算奈米電紡絲之直徑 大小。. - 19 -.
(36) 第四節 奈米電紡絲表面改質處理 將奈米電紡絲裁切為 1 公分×1 公分大小，置於 24 孔培養盤中， 將 200μl 濃度為 50μg/ml 之第一型膠原蛋白(Sigma)溶液注入樣本培養 槽中，靜置於 4℃冰箱一夜後。以磷酸緩衝溶液(PBS)清洗兩次後， 將樣本以紫外線滅菌 20 分鐘。. 第五節 細胞培養 本研究使用 NIH 3T3 纖維母細胞(Fibroblast)細胞株進行培養，將 細胞株自液態氮桶中取出後，迅速解凍至 37℃後，將細胞培養於 75cm2 的 T75 培養瓶中，所使用的培養基為 Dulbecco’s modified Eagle’s medium 加上 10%的胎牛血清及 1%的盤尼西林，細胞培養於 37℃， 二氧化碳濃度為 5%的培養箱中，每 2 天更換一次培養基。當細胞數 量約佔培養瓶底面積 8 成時，則進行繼代培養。. 第六節 細胞形態觀察 2-6-1. 光學顯微鏡觀察. 將 1×105 3T3 纖維母細胞注入 1cm×1cm 的不織布奈米纖維細胞 支架中(n=1)，置於 37℃，5% CO2 的培養箱中觀察 2、4、6、8、24 小時。首先將樣本移至新的 24 孔培養盤中，以磷酸緩衝溶液(PBS) 沖洗兩次以移除未貼附之細胞，樣本以 10%福馬林固定 15 分鐘，再 - 20 -.
(37) 以磷酸緩衝溶液(PBS)沖洗兩次。使用 H&E Stain 方式染色，透過光 學顯微鏡觀察細胞之形態。染色步驟如下：首先將樣本浸泡於 95% 的酒精 3 分鐘，再以去離子水浸泡 3 分鐘移除酒精，浸泡 Hematoxylin 染劑 5 分鐘，以去離子水清洗數次，再將樣本浸泡於 95%酒精 3 分鐘， 浸泡 Eosin 染劑 2 分鐘，最後以去離子水清洗數次移除多餘的染劑。. 2-6-2. 掃描式電子顯微鏡觀察. 將 1×105 3T3 纖維母細胞注入 1cm×1cm 的奈米纖維細胞支架中 (n=1)，於培養第 1 天及第 3 天時，首先將樣本移至新的 24 孔培養盤 中，以磷酸緩衝溶液(PBS)沖洗兩次以移除未貼附之細胞後，浸泡於 2.5 ％戊二醛 1 小時以進行前固定。前固定完成後再以磷酸緩衝溶液 (PBS)清洗數次，再將細胞浸泡於 1％鋨酸(OsO4) 後固定 1 小時。後 固定完成後再以磷酸緩衝溶液清洗數次依次浸泡 30％、50％、75％、 90％、95％、100％ 酒精各 15 分鐘進行脫水步驟。脫水完成後立即 以臨界點乾燥機將樣品乾燥以避免細胞塌陷，將乾燥後之樣本鍍金後 再以掃描式電子顯微鏡觀察。. 第七節 細胞貼附性研究 將 1×105 3T3 纖維母細胞注入 1cm×1cm的不織布奈米纖維細胞支 架中(n=3)，對照組為 1cm×1cm大小的聚氯乙烯膜 (n=3)，置於 37℃， - 21 -.
(38) 5% CO2 的培養箱中觀察 2、4、6、8、24 小時。首先將樣本移至新的 24 孔培養盤中，以磷酸緩衝溶液(PBS)沖洗兩次以移除未貼附之細 胞，樣本以 10%福馬林固定 15 分鐘，再以磷酸緩衝溶液(PBS)沖洗兩 次。使用H&E Stain方式染色，透過光學顯微鏡計算細胞數量，染色 步驟與細胞形態觀察相同。細胞計算方式(圖 2 - 3)如下：將樣本分為 四個象限，光學顯微鏡使用 10 倍物鏡，於每一個象限中央以CCD拍 攝一張圖片，於每一張圖片中央繪製 1mm×1mm之方框，計算每個方 框內之細胞總數，進而推算出每一樣本之細胞總數。. 圖 2 - 3：樣本細胞計數方式示意圖. 第八節 細胞攤平性研究 將 1×105 3T3 纖維母細胞注入 1cm×1cm 的不織布奈米纖維細胞 支架中(n=3)，置於 37℃，5% CO2 的培養箱中觀察 2、4、6、8、24 小時。首先將樣本移至新的 24 孔培養盤中，以磷酸緩衝溶液(PBS) - 22 -.
(39) 沖洗兩次以移除未貼附之細胞，樣本以 10%福馬林固定 15 分鐘，再 以磷酸緩衝溶液(PBS)沖洗兩次。使用 H&E Stain 方式染色，透過光 學顯微鏡計算細胞攤平貼附之比例，染色步驟與細胞形態觀察相 同。攤平比例計算方式與細胞貼附性研究類似：將樣本分為四個象 限，光學顯微鏡使用 20 倍物鏡，於每一個象限中央以 CCD 拍攝一 張圖片，於每一張圖片中央繪製 500μm×500μm 之方框，計算每個 方框內之細胞攤平之比例，進而推算出每一樣本之總細胞攤平比 例，細胞需伸出其偽足且呈現紡錘形(Spindle Shape)才可被認定為該 細胞已攤平。. 第九節 細胞活性(MTS assay)之研究 將 1×105 3T3 纖維母細胞注入 1cm×1cm 的不織布奈米纖維細胞 支架中(n=3)，另設對照組為空的培養盤(n=3)。於培養第 1、3、7、 14 天時，樣本取出後，首先將不織布奈米纖維細胞支架移至新的 24 孔培養盤中，樣本以磷酸緩衝溶液(PBS)沖洗兩次以移除未貼附之細 胞，將樣本浸泡於 0.5ml 之 20% 無血清 MTS reagent (Promega)溶液 中，置於培養箱中靜置 2 小時，再將每個樣本中反應完成的 MTS reagent 分 5 次注入 96 孔盤中(0.1ml/well)，將 96 孔盤放入酵素免疫分 析儀(ELISA)中進行吸光值讀取，吸光值波長設定為 490nm。細胞活. - 23 -.
(40) 性分析方式為採用第 1 天培養於空培養盤之吸光值為基準，對所有數 據進行標準化。. 第十節 即時聚合酶鏈鎖反應測試(Real-Time PCR) 2-10-1 RNA 萃取 將 4×105 3T3 纖維母細胞注入 2cm×2cm 的不織布奈米纖維細胞 支架中(n=6)。於培養第 5 天時，將樣本取出，以磷酸緩衝溶液(PBS) 清洗兩次，將樣本浸泡於 1ml 10% Trypsin 中 1 分鐘使細胞脫離細胞 支架，加入 2ml 培養基停止 Trypsin 之反應，將細胞液取出以 1,000 轉離心 5 分鐘，將上清液拋棄留下離心管底部之細胞團塊。 將纖維母細胞取出後，使用 SV Total RNA Isolation System (Promega)，以 RNA Lysis Buffer 將細胞打破，再來加入 RNA Dilution Buffer 稀釋後，以 12,000 轉離心 10 分鐘，將上清液取出置於 Spin Basket Assembly 中以 12,000 轉離心 1 分鐘，加入 DNase incubation mix 於室溫下放置 15 分鐘，加入 DNase Stop Solution 停止 DNase 之反應， 再以 RNA Wash Solution 清洗兩次，最後以 Nuclease-Free Water 取得 細胞內之 total RNA。. 2-10-2 cDNA 合成 本研究使用 iScriptTMcDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)合成 cDNA， - 24 -.
(41) 首先將 5× iScript Reaction Mix 4μl、iScript Reverse Transcriptase 1μ l、RNA 15μl 均勻混合，RT 反應之參數設定為 25℃反應 5 分鐘，42 ℃反應 30 分鐘，85℃反應 5 分鐘，4℃反應 10 分鐘，取得之 cDNA 先以無菌水稀釋 10 倍，保存於-20℃冰箱。. 2-10-3 引子合成(Primer Synthesis) 本研究所要偵測之蛋白質合成表現包括有第一型膠原蛋白、第三 型膠原蛋白、纖維連結素(Fibronectin)、β-肌動蛋白及GADPH (表 2 3)，其中β-肌動蛋白及GADPH為Reference Gene。. 表 2 - 3：引子合成序列 第一型膠原蛋白 第三型膠原蛋白 纖維連結素 β-肌動蛋白 GAPDH. Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse. 5’-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3’ 5’-GTTCGGGCTGATGTACCAGT-3’ 5’-AGGCTGAAGGAAACAGCAAA-3’ 5’-TAGTCTCATTGCCTTGCGTG-3’ 5’-ACAGAAATGACCATTGAAGG-3’ 5’-TGTCTGGAGAAAGGTTGATT-3’ 5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’ 5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’ 5’-TCCGCCCCTTCTGCCGATG-3’ 5’-CACGGAAGGCCATGCCAGTGA-3’. 2-10-4 Real-Time PCR 放大 於滅菌後的 96 孔盤內依序加入無菌水、iQ Supermix、primer 及 cDNA，先以 95℃反應 3 分鐘徹底 denature，接著進入 Real-Time PCR - 25 -.
(42) cycle (95℃ 10 秒、48℃ 30 秒，40 個循環)，在每個循環結束時儀器 會讀取一次樣本之螢光值，PCR cycle 結束後以 1℃/分鐘的速度上升 到 95℃取得 Melting Curve 之資訊。. 第十一節. 統計分析. 本研究採用 One-way ANOVA 及 Tukey 事後檢定來分析不同基材 間 3T3 纖維母細胞貼附性、攤平性、細胞活性及基因表現之差異性； 使用獨立樣本 t 檢定來分析第一型膠原蛋白表面處理對於 3T3 纖維母 細胞貼附性、攤平性及細胞活性之影響，以及不同基材對於 3T3 纖維 母細胞基因表現之影響。當 p 值<0.05 時，認定為有顯著差異。. - 26 -.
(43) 第參章 研究結果 第一節 奈米電紡絲之形態學觀察 以掃描式電子顯微鏡觀察奈米電紡絲之形態，聚乙烯醇奈米纖維 (圖 3 - 1)與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維(圖 3 - 2)之纖維走向皆呈現 亂數分佈之不纖布形態。聚乙烯醇奈米纖維之纖維直徑大小為 316± 63.4 奈米，且形態一致性(uniform)高。而聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖 維之纖維直徑大小為 109.4±16.5 奈米。聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維 在形態上有較多的小珠形成。. 第二節 細胞形態學觀察 3-2-1. 光學顯微鏡觀察. 將纖維母細胞培養於奈米電紡絲細胞支架中，於培養 2、4、6、 8、24 小時後，將細胞以H&E Stain染色，並使用光學顯微鏡觀察細 胞形態。細胞生長於聚乙烯醇奈米纖維細胞支架中時，觀察第 2、4、 6、8 小時之細胞形態(圖 3 - 3，A1-A4、B1-B4)，無論細胞支架有無 經過第一型膠原蛋白表面改質處理，細胞形態皆以圓形形態為主；觀 察第 24 小時之細胞形態(圖 3 - 3，A5、B5)，無論細胞支架有無經過 第一型膠原蛋白表面改質處理，部分細胞開始呈現紡錘形形態，但大. - 27 -.
(44) 多數細胞仍呈現圓形形態，且纖維母細胞多以群聚的方式生長於細胞 支架上。 細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架中時，觀察第 2、4、6、8 小時之細胞形態(圖 3 - 4，A1-A4、B1-B4)，無論細胞支 架有無經過第一型膠原蛋白表面改質處理，細胞形態皆以紡錘形形態 為主；觀察第 24 小時之細胞形態(圖 3 - 4，A5、B5)，無論細胞支架 有無經過第一型膠原蛋白表面改質處理，細胞形態皆為紡錘形形態， 且細胞呈現較大的攤平面積。. - 28 -.
(45) 圖 3 - 1：聚乙烯醇奈米纖維電子顯微鏡影像. - 29 -.
(46) 圖 3 - 2：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維電子顯微鏡影像. - 30 -.
(47) 圖 3 - 3：纖維母細胞於聚乙烯醇奈米纖維(A1-A5)與表面改質處理 之聚乙烯醇奈米纖維(B1-B5)生長之形態. - 31 -.
(48) 圖 3 - 4：纖維母細胞於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維(A1-A5)與表面 改質處理之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維(B1-B5)生長之形態. - 32 -.
(49) 3-2-2. 掃描式電子顯微鏡觀察. 將纖維母細胞培養於奈米電紡絲細胞支架中，於培養第 1、3 天 時，將細胞與細胞支架以掃描式電子顯微鏡觀察細胞生長於細胞支架 中之形態。細胞生長於聚乙烯醇奈米纖維細胞支架中時，觀察第 1 天 之細胞形態(圖 3 - 5)，細胞多以群聚方式生長於細胞支架上，單顆細 胞之形態，雖然細胞有伸出偽足抓附於纖維上，但細胞形狀仍以圓形 為主。觀察第 3 天之細胞形態(圖 3 - 6)，細胞仍以群聚方式生長於細 胞支架上，但單顆細胞形態已由圓形轉變為紡錘形，細胞偽足也抓附 於纖維上。 細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架中時，觀察第 1 天之細胞形態(圖 3 - 7)，細胞形狀呈現紡錘形且攤平，由電子顯微鏡 圖片可看出其攤平之面積比聚乙烯醇奈米纖維細胞支架上之細胞大 上許多，而細胞之偽足也抓附於奈米纖維之上。觀察第 3 天之細胞形 態(圖 3 - 8)，細胞形狀與貼附情形與第 1 天差異不大，由於此時細胞 密度非常的高，所以在電子顯微鏡的觀察中只能看到細胞之部分，聚 乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維幾乎觀察不到。. - 33 -.
(50) 圖 3 - 5：纖維母細胞於聚乙烯醇奈米纖維上生長之形態(第 1 天). - 34 -.
(51) 圖 3 - 6：纖維母細胞於聚乙烯醇奈米纖維上生長之形態(第 3 天). - 35 -.
(52) 圖 3 - 7：纖維母細胞於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維上生長之形態 (第 1 天). - 36 -.
(53) 圖 3 - 8：纖維母細胞於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維上生長之形態 (第 3 天). - 37 -.
(54) 第三節 細胞貼附性測試 將纖維母細胞培養於奈米電紡絲細胞支架以及聚氯乙烯膜，於培 養 2、4、6、8、24 小時後，將細胞以H&E Stain染色，並使用光學顯 微鏡觀察並計算細胞之貼附率。比較聚乙烯醇奈米纖維、聚乙烯醇/ 幾丁聚醣奈米纖維及聚氯乙烯膜之細胞貼附率(圖 3 - 9)，結果顯示在 培養 2 小時後，纖維母細胞於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維(38.3±3%) 上之貼附率比聚乙烯醇奈米纖維(23.2±9.1%)與聚氯乙烯膜(9.6±4.4%) 來得高(p<0.05)，而聚乙烯醇奈米纖維貼附率雖比聚氯乙烯膜高，但 並無統計上之意義；在培養 4 小時及 24 小時後，聚乙烯醇奈米纖維 (40.6±7.2%，51.6±4.5%)與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維(37.6±2.9%， 57.1±12.6%)之貼附率皆比聚氯乙烯膜(8.1±4.3%，7.6±2.3%)來得高 (p<0.05)；在培養 6 小時及 8 小時後，貼附率則呈現聚乙烯醇/幾丁聚 醣奈米纖維(75.4±4.4%，69.1±1.9%)>聚乙烯醇奈米纖維(53.6±4.7%， 54±2%)>聚氯乙烯膜(7.5±4.4%，6.2±4.7%) (p<0.05)。 比較第一型膠原蛋白表面改質處理之聚乙烯醇奈米纖維與聚乙 烯醇/幾丁聚醣奈米纖維以及聚氯乙烯膜之細胞貼附率(圖 3 - 10)。結 果顯示在培養 2 小時後，纖維母細胞於表面改質之聚乙烯醇/幾丁聚 醣奈米纖維(43.4±5.1%)上之貼附率比表面改質之聚乙烯醇奈米纖維 (26±12.7%)以及聚氯乙烯膜(9.6±4.4%)來得高(p<0.05)，而表面改質之. - 38 -.
(55) 聚乙烯醇奈米纖維貼附率雖比聚氯乙烯膜高，但並無統計上之意義； 在培養 4、6、8 及 24 小時後，表面改質之聚乙烯醇奈米纖維(55.3± 4.3%，71.1±9.8%，71±9.1%，56.6±6.8%)與表面改質之聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維(52.1±5%，70.3±11%，64.5±1.5%，53.2±6.1%)之貼附率 皆比聚氯乙烯膜(8.1±4.3%，7.5±4.4%，6.2±4.7%，7.6±2.3%)來得高 (p<0.05)，而表面改質之聚乙烯醇奈米纖維及聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米 纖維之間並無統計上之差異。 比較第一型膠原蛋白表面改質對於纖維母細胞之貼附率之影 響，結果顯示，聚乙烯醇奈米纖維在第一型膠原蛋白表面改質處理 後，在第 4、6、8 小時之細胞貼附率皆比無表面改質處理之聚乙烯醇 奈米纖維還要來得高(圖 3 - 11) (p<0.05)。而聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米 纖維在第一型膠原蛋白表面改質處理後，在第 4 小時之細胞貼附率比 無表面改質處理之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維來得高(圖 3 - 12) (p<0.05)。. - 39 -.
(56) 聚乙烯醇 90 80. 聚乙烯醇/幾丁聚醣 ＊＃＆. 聚氯乙烯膜 n=3 ＊＃＆ ＃＆. 貼附率 (%). 70 60 ＊＆. 50 40 30. ＃＆. 20 10 0 2小時. 4小時. 6小時. 8小時. 24小時. 圖 3 - 9：聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞貼附率變化圖 ＊：聚乙烯醇奈米纖維與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維間有顯著差異，p<0.05 ＃：聚乙烯醇奈米纖維與聚氯乙烯膜間有顯著差異，p<0.05 ＆：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與聚氯乙烯膜間有顯著差異，p<0.05 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定). 貼附率 (%). 聚乙烯醇 (表面改質) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0. 聚乙烯醇/幾丁聚醣(表面改質). 聚氯乙烯膜 n=3. ＃＆. ＃＆. ＃＆. ＃＆. ＊＆. 2小時. 4小時. 6小時. 8小時. 24小時. 圖 3 - 10：表面改質之聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞貼 附率變化圖 ＊：聚乙烯醇奈米纖維與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維間有顯著差異，p<0.05 ＃：聚乙烯醇奈米纖維與聚氯乙烯膜間有顯著差異，p<0.05 ＆：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與聚氯乙烯膜間有顯著差異，p<0.05 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定) - 40 -.
(57) 貼附率 (%). 聚乙烯醇. 聚乙烯醇 (表面改質) n=3. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0. ＊. ＊. 6小時. 8小時. ＊. 2小時. 4小時. 24小時. 圖 3 - 11 ：聚乙烯醇奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞 貼附率折變化圖。＊：p<0.05 (統計分析：獨立樣本 t 檢定). 聚乙烯醇/幾丁聚醣. 聚乙烯醇/幾丁聚醣(表面改質) n=3. 90 80 貼附率 (%). 70. ＊. 60 50 40 30 20 10 0 2小時. 4小時. 6小時. 8小時. 24小時. 圖 3 - 12：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維細胞貼附率折變化圖。＊：p<0.05 (統計分析：獨立樣本 t 檢定). - 41 -.
(58) 第四節 細胞攤平性測試 在細胞攤平性測試中，比較纖維母細胞於不同基材之中，細胞攤 平之比例，測試之時間點為培養第 2、4、6、8、24 小時。在比較聚 乙烯醇奈米纖維與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維之細胞攤平率後(圖 3 - 13)，結果顯示，在培養第 2、4、6、8、24 小時，纖維母細胞在聚 乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架上之攤平率皆比聚乙烯醇奈米纖 維細胞支架還要來得高(p<0.05)。而比較第一型膠原蛋白表面改質之 聚乙烯醇奈米纖維細胞支架及聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架 也有相同之結果(圖 3 - 14) (p<0.05)。而在比較第一型膠原蛋白表面 改質對於基材之影響，結果顯示表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞支 架在培養第 4 小時時，其細胞攤平率比無表面改質之聚乙烯醇奈米纖 維細胞來得高(圖 3 - 15) (p<0.05)，其他則無顯著差異。而聚乙烯醇/ 幾丁聚醣奈米纖維細胞支架無論有無表面改質處理，其細胞攤平率皆 無顯著差異(圖 3 - 16)。. - 42 -.
(59) 聚乙烯醇. 聚乙烯醇/幾丁聚醣 n=3. 110 ＊. 100. 攤平率(%). 70. ＊. ＊. 90 80. ＊. ＊. 60 50 40 30 20 10 0 2小時. 4小時. 6小時. 8小時. 24小時. 圖 3 - 13：聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞攤平率變化 圖。＊：p<0.05 (統計分析：獨立樣本 t 檢定) 聚乙烯醇(表面改質). 聚乙烯醇/幾丁聚醣(表面改質). 110 100. ＊. ＊. ＊. 6小時. 8小時. ＊. n=3. 90. 攤平率(%). 80 70. ＊. 60 50 40 30 20 10 0 2小時. 4小時. 24小時. 圖 3 - 14：表面改質之聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞攤 平率變化圖。＊：p<0.05 (統計分析：獨立樣本 t 檢定). - 43 -.
(60) 聚乙烯醇. 聚乙烯醇(表面改質) n=3. 50. 攤平率(%). 40. 30. 20. ＊. 10. 0 2小時. 4小時. 6小時. 8小時. 24小時. 圖 3 - 15：聚乙烯醇奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞貼 附率折變化圖。＊：p<0.05 (統計分析：獨立樣本 t 檢定) 聚乙烯醇/幾丁聚醣. 聚乙烯醇/幾丁聚醣(表面改質) n=3. 110 100 90. 攤平率(%). 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2小時. 4小時. 6小時. 8小時. 24小時. 圖 3 - 16：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維細胞貼附率折變化圖 (統計分析：獨立樣本 t 檢定). - 44 -.
(61) 第五節 細胞活性測試 在細胞活性測試中，本研究使用MTS測試纖維母細胞培養於奈米 電紡絲細胞支架第 1、3、7、14 天第細胞活性。在比較纖維母細胞培 養於聚乙烯醇奈米纖維細胞支架、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞 支架以及 24 孔培養盤(well)時(圖 3 - 17、圖 3 - 18)，結果顯示，無 論奈米電紡絲有無使用第一型膠原蛋白表面改質處理，在第 1 天時， 細胞培養於培養盤之細胞活性比培養於聚乙烯醇奈米纖維及聚乙烯 醇/幾丁聚醣奈米纖維之細胞還要來得高(p<0.05)；培養第 3 天時，細 胞培養於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架與培養盤之細胞活性 皆比培養於聚乙烯醇奈米纖維之細胞還要高(p<0.05)，而聚乙烯醇/幾 丁聚醣奈米纖維與培養盤上所培養的細胞之細胞活性並無差異。 在比較奈米電紡絲細胞支架在經過第一型膠原蛋白表面改質之 後細胞活性之變化(圖 3 - 19、圖 3 - 20)。結果顯示，纖維母細胞無 論是培養於聚乙烯醇奈米纖維細胞支架或是聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米 纖維細胞支架，第一型膠原蛋白表面改質處理後其細胞活性並無明顯 之改變。. - 45 -.
(62) 聚乙烯醇. 聚乙烯醇/幾丁聚醣. 培養盤. 標準化相對MTS. n=3 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2. ＊＃ ＃＆. 第1天. 第3天. 第7天. 第14天. 圖 3 - 17：聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞活性變化圖 ＊：聚乙烯醇奈米纖維與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維間有顯著差異，p<0.05 ＃：聚乙烯醇奈米纖維與培養盤間有顯著差異，p<0.05 ＆：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與培養盤間有顯著差異，p<0.05 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定). 標準化相對MTS. 聚乙烯醇(表面改質) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2. 聚乙烯醇/幾丁聚醣(表面改質). 培養盤 n=3. ＊＃. ＃＆. 第1天. 第3天. 第7天. 第14天. 圖 3 - 18：表面改質之聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞活 性變化圖 ＊：聚乙烯醇奈米纖維與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維間有顯著差異，p<0.05 ＃：聚乙烯醇奈米纖維與培養盤間有顯著差異，p<0.05 ＆：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與培養盤間有顯著差異，p<0.05 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定) - 46 -.
(63) 聚乙烯醇. 聚乙烯醇(表面改質) n=3. 1.0. 標準化相對MTS. 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2. 第1天. 第3天. 第7天. 第14天. 圖 3 - 19：聚乙烯醇奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇奈米纖維細胞活 性變化圖 (統計分析：獨立樣本 t 檢定) 聚乙烯醇/幾丁聚醣. 聚乙烯醇/幾丁聚醣(表面改質) n=3. 標準化相對MTS. 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2. 第1天. 第3天. 第7天. 第14天. 圖 3 - 20：聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維與表面改質之聚乙烯醇/幾丁 聚醣奈米纖維細胞活性變化圖 (統計分析：獨立樣本 t 檢定). - 47 -.
(64) 第六節 Real-Time PCR 基因表現測定 3-6-1. 引子之結合效能分析. 本研究使用 3 種不同濃度之纖維母細胞cDNA來測定引子之結合 效能。結果顯示GADPH之結合效能為-79.8%，R2 值為 0.973，且有一 濃度數值為N/A (圖 3 - 21)；β-肌動蛋白之結合效能為 119.2%，R2 值為 0.974 (圖 3 - 22)；第一型膠原蛋白引子之結合效能為 128%，R2 值為 0.97 (圖 3 - 23)；第三型膠原蛋白引子之結合效能為 89.4%，R2 值為 0.982 (圖 3 - 24)；纖維連結素引子之結合效能為 28.6%，R2 值 為 0.998，且有一濃度數值為N/A (圖 3 - 25)。. 圖 3 - 21：引子 GADPH 結合效能標準曲線圖. - 48 -.
(65) 圖 3 - 22：引子β-肌動蛋白結合效能標準曲線圖. 圖 3 - 23：引子第一型膠原蛋白結合效能標準曲線圖. - 49 -.
(66) 圖 3 - 24：引子第三型膠原蛋白結合效能標準曲線圖. 圖 3 - 25：引子纖維連結素結合效能標準曲線圖. - 50 -.
(67) 3-6-2. 標準化基因表現量. 本研究使用β-肌動蛋白做為Reference gene將纖維母細胞生長 於各基材之基因表現量標準化。結果顯示，細胞生長於不同基材之第 一型膠原蛋白基因表現(圖 3 - 26)呈現聚乙烯醇/幾丁聚醣>聚乙烯醇 >培養皿(p<0.05)；細胞生長於不同基材之第三型膠原蛋白基因表現( 圖 3 - 27)呈現聚乙烯醇/幾丁聚醣>聚乙烯醇>培養皿(p<0.05)；細胞生 長於不同基材之纖維連結素基因表現(圖 3 - 28)呈現聚乙烯醇>培養 皿>聚乙烯醇/幾丁聚醣(p<0.05)。 在單一基材之基因表現量之比較中，結果顯示纖維母細胞生長於 聚乙烯醇細胞支架時(圖 3 - 29)，基因表現量呈現纖維連結素>第三型 膠原蛋白>第一型膠原蛋白 (p<0.05)；細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣 細胞支架時(圖 3 - 30)，基因表現量呈現第三型膠原蛋白>纖維連結素 >第一型膠原蛋白 (p<0.05)；細胞生長於培養皿時(圖 3 - 31)，基因表 現量呈現纖維連結素>第三型膠原蛋白>第一型膠原蛋白 (p<0.05)。. - 51 -.
(68) 第一型膠原蛋白 n=6. ＊. 標準化基因表現量. 2.5E-03 2.0E-03 1.5E-03 1.0E-03 5.0E-04 0.0E+00 聚乙烯醇. 聚乙烯醇/幾丁聚醣. 培養皿. 圖 3 - 26：第一型膠原蛋白標準化基因表現量。＊：聚乙烯醇、聚乙 烯醇/幾丁聚醣及培養皿三者間互有顯著差異，p<0.05。 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定). 第三型膠原蛋白 n=6. ＊. 1.4E-01. 標準化基因表現量. 1.2E-01 1.0E-01 8.0E-02 6.0E-02 4.0E-02 2.0E-02 0.0E+00 聚乙烯醇. 聚乙烯醇/幾丁聚醣. 培養皿. 圖 3 - 27：第三型膠原蛋白標準化基因表現量。＊：聚乙烯醇、聚乙 烯醇/幾丁聚醣及培養皿三者間互有顯著差異，p<0.05。 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定). - 52 -.
(69) 纖維連結素 n=6. ＊. 3.0E-01. 標準化基因表現量. 2.5E-01 2.0E-01 1.5E-01 1.0E-01 5.0E-02 0.0E+00 聚乙烯醇. 聚乙烯醇/幾丁聚醣. 培養皿. 圖 3 - 28：纖維連結素標準化基因表現量。＊：聚乙烯醇、聚乙烯醇 /幾丁聚醣及培養皿三者間互有顯著差異，p<0.05。 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定). 聚乙烯醇 n=6. ＊ 3.0E-01. 標準化基因表現量. 2.5E-01 2.0E-01 1.5E-01 1.0E-01 5.0E-02 0.0E+00 第一型膠原蛋白. 第三型膠原蛋白. 纖維連結素. 圖 3 - 29：纖維母細胞生長於聚乙烯醇細胞支架之標準化基因表現 量。＊：第一型膠原蛋白、第三型膠原蛋白及纖維連結素三者間互有顯著差異，p<0.05。 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定) - 53 -.
(70) 聚乙烯醇/幾丁聚醣 n=6. ＊ 1.4E-01 標準化基因表現量. 1.2E-01 1.0E-01 8.0E-02 6.0E-02 4.0E-02 2.0E-02 0.0E+00 第一型膠原蛋白. 第三型膠原蛋白. 纖維連結素. 圖 3 - 30：纖維母細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣細胞支架之標準化基 因表現量。＊：第一型膠原蛋白、第三型膠原蛋白及纖維連結素三者間互有顯著差異，p<0.05。 (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定) 培養皿 n=6. ＊. 標準化基因表現量. 1.8E-01 1.6E-01 1.4E-01 1.2E-01 1.0E-01 8.0E-02 6.0E-02 4.0E-02 2.0E-02 0.0E+00 第一型膠原蛋白. 第三型膠原蛋白. 纖維連結素. 圖 3 - 31：纖維母細胞生長於培養皿之標準化基因表現量。＊：第一型 膠原蛋白、第三型膠原蛋白及纖維連結素三者間互有顯著差異，p<0.05。. (統計分析：One-way ANOVA，Tukey 事後檢定). - 54 -.
(71) 第肆章 討論 第一節 奈米電紡絲之形態學觀察 本研究以電紡技術成功製作出直徑大小為 316±63.4 奈米之聚乙 烯醇奈米纖維與直徑大小為 109.4±16.5 奈米之聚乙烯醇/幾丁聚醣奈 米纖維。纖維形態方面，聚乙烯醇奈米纖維呈現較大的纖維直徑且較 好的一致性，而聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維則有較小的纖維直徑但 有較多的小珠形成。在Tan等人的研究中指出，影響奈米電紡絲之纖 維直徑大小主要因素為聚合物之溶液濃度及溶液導電性，聚合物之濃 液濃度越低、導電性越高，所產生之纖維直徑大小則越小(圖 4 - 1)， 此研究中也發現纖維直徑越小及聚合物之分子量越小，則越容易產生 小珠之形態(Tan et al., 2005)。然而，本研究所使用之主要溶劑為水， 因此纖維直徑大小不同，可以不用考慮是由於溶液導電性不同之因素 所造成，而本研究所使用的聚乙烯醇之溶液濃度為 8%，聚乙烯醇/ 幾丁聚醣之溶液濃度為 6.5%，因此溶液濃度較低應該是聚乙烯醇/幾 丁聚醣纖維直徑較小且較多小珠形成之因。. - 55 -.
(72) 圖 4 - 1：電紡參數對於奈米纖維形態之變化圖(Tan et al., 2005). - 56 -.
(73) 第二節 細胞形態學觀察 以光學顯微鏡觀察生長於聚乙烯醇及聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖 維細胞支架上之纖維母細胞之形態，生長於聚乙烯醇奈米纖維細胞支 架上之纖維母細胞，其形態主要為圓形，在培養 24 小時後，細胞有 明顯的群聚行為。而生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架上 之纖維母細胞，其主要形態為紡錘形，且在培養 24 小時後，細胞有 明顯的攤平現象(圖 4 - 2)。以纖維母細胞正常形態而言，其貼附於基 材上時應呈現紡錘形態。過去的研究中指出，纖維母細胞在若在貼附 時呈現圓形形態，表示此基材與纖維母細胞之生物相容性 (biocompatibility)可能較差，甚至是含有毒性之物質(Balto, 2004)。本 研究所使用之基材聚乙烯醇(PVA)，本身並無生物毒性，所以可能是 因為該基材與纖維母細胞之相容性較差，才呈現圓形之細胞形態。相 較之下，纖維母細胞生長於聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架 時，其形態則呈現正常之紡錘形，且呈現攤平之現象，這表示纖維母 細胞與聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架間有良好之生物相容 性。. - 57 -.
(74) 圖 4 - 2：纖維母細胞生長於聚乙烯醇、聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維 之形態. 然而，細胞支架在經過第一型膠原蛋白表面改質處理之後，細胞 形態並無顯著之變化，由此可知第一型膠原蛋白表面改質處理對於細 胞形態之影響並不大。 在掃描式電子顯微鏡之觀察下，纖維母細胞生長於聚乙烯醇奈米 纖維細胞支架中時，其第 1 天之細胞形態(圖 3 - 5)，雖然細胞有伸出 偽足抓附於纖維上，但細胞形狀仍以圓形為主，直到第 3 天的觀察(圖 3 - 6)，細胞形態才由圓形轉變為紡錘形。而纖維母細胞生長於聚乙 烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架上時，在第 1 天就呈現紡錘形且細 - 58 -.
(75) 胞也攤平於基材之上，細胞之偽足也抓附於奈米纖維之上(圖 3 - 7)， 在第 3 天的觀察時，細胞也由於迅速的增生，完全佈滿於基材之上。 因此，以細胞之形態來看，聚乙烯醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架對 於纖維母細胞之形態表現比聚乙烯醇奈米纖維還要好，顯示出聚乙烯 醇/幾丁聚醣奈米纖維細胞支架有較好之生物相容性。. - 59 -.
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