serovar Enteritidis (O : 1, 9, 12) ++ ++ + + － － －
Salmonella enterica (－)
serovar Typhimurium (O : 4, 5, 12) ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++
Salmonella enterica (－)
serovar Typhimurium (O : 4, 12) ++ ++ ++ ++ － － －
註：在同次 ELISA 實驗中，訊號高於 1.5 者標為「+++」，介於 1.5 至 0.5 之間者標文「++」，介於 0.5 至 0.1 者為「+」，訊號低於 0.1 者 標為「－」
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Heavy chain Light chain
I-1 IgM κ 粒再次離心，並取上層的 SDS sample buffer 進行 SDS-PAGE 分 離及電泳轉漬操作，以 5000 倍稀釋之 RAM-AP 進行免疫染色。
若我們的抗體會與細菌表面的抗原結合，則在進行 PBS 清洗的 過程中，抗體會因吸附於細菌表面而不會隨 PBS 被移除，最後 在進行免疫轉漬實驗時，則會在重鏈（約 50 kDa）與輕鏈（約 25 kDa）的位置產生訊號［圖六：(a)］；反之，若抗體辨識的為
43 果顯示：III-2、IV-1、IV-2 及 IV-3 四株抗體所辨識的樣式（pattern）
相似，皆為在 60～110 kDa 的範圍內的多個條帶；而 II-1 及 III-1 前人研究(Ronholm et al., 2011)可知，此階梯狀條帶的分布樣示為 細菌細胞壁上 O 抗原的典型特徵；此外，I-1、II-1 及 III-1 三株 抗體皆無法對萃取的 LPS 作用，故可推論此三種抗體的抗原與 LPS 無關。
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(5) 沙門氏菌單株抗體間的表位競爭性分析
我們也想知道本研究所生產的單株抗體，其所辨識的表位是 否相同或是非常接近，另外也為了確認未來應用於偵測方法的開 發時，可否將不同抗體混合使用，以增強偵測的訊號強度，我們 於是設計 competitive ELISA 的實驗來進行分析。
在 competitive ELISA 實驗中，我們先 coating 經超音波破菌 處理的沙門氏菌（106 CFU/mL，使用 50 μL/well），一級抗體則 分別由沙門氏菌單株抗體（1 μg/mL，50 μL/well）單獨進行反應，
或將測試的抗體兩兩混合作用。結果可用圖九的示意圖進行推論，
故有可能辨識相近的抗原表位；III-2、IV-1、IV-2 及 IV-3 四株抗 體辨識的皆是 O 抗原，雖然 III-2 所認的與其餘三株不同，但 O12 與 O5 的結構間有相當的重疊，故也可能會互相競爭。
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表五、沙門氏菌單株抗體間的競爭作用結果
註：「N」代表對應兩抗體間無競爭抗原的情況；「Y」指兩抗體間會 有競爭抗原的情況；標示「**」者代表兩抗體間競爭訊號與無競爭之 理論值相差 5%以上；標示「*」者代表兩抗體間競爭訊號與無競爭之 理論值間雖有顯著差異，然而訊號相差在 5%以內。各組 competitive ELISA 結果詳見圖十
(6) 沙門氏菌單株抗體的效價分析
為瞭解本研究生產之單株抗體對沙門氏菌的作用強度，我們 利用 coating 固定抗原濃度（經超音波破菌處理之菌液，濃度為 108 CFU/mL，使用 50 μL/well），但改變抗體的濃度（0.01 μg/mL 至10 μg/mL），來比較七株抗體與抗原的結合能力。由圖十一的 結果可見， I-1 及 III-1 兩株抗體的濃度減少至 0.1 μg/mL 時，其 訊號即與負對照組接近，其餘五株抗體的濃度則在降為 0.01 μg/mL 時，才與負對照組的訊號相似。七株抗體的使用濃度為 1 μg/mL 時，其對抗原的作用訊號皆已到達飽和，其中 I-1、II-1 及 III-1 三株抗體的飽和訊號較低，約在 0.5 至 0.7 之間，而 III-2、
IV-1、IV-2 及 IV-3 四株抗體的飽和訊號較高，約為 2.5 至 3.0 之 間。
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(2) Mircrofuge tube immunoassay 的分析結果
除了 Direct ELISA 的分析之外，本研究也試圖開發更為簡便 的細菌免疫偵測法──Microfuge tube immunoassay。本偵測法的
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操作方法如圖十九，我們將細菌樣品加入於微量離心管中，再藉 離心方式將細菌顆粒沉澱管底，隨後倒去上層液，再同時加入我 們生產的單株抗體、GAM-A 及 RAG-AP 進行反應，最後經過三 次離心與清洗後，加入 pNPP 受質呈色。
由結果（圖二十）可以看到 Microfuge tube immunoassay 方 法在偵測 104 CFU/mL 的細菌樣品時，其呈現之訊號仍有顯著差 異且大於負對照組之 3 倍數值，然而在偵測 103 CFU/mL 的樣品 時訊號已與負對照阻無顯著差異（p<0.05），故我們認為此 Microfuge tube immunoassay 可將偵測極限降至 104 CFU/mL。
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波處理 80 秒的時間已足夠使大部份細菌破碎，所以之後對小鼠 的免疫注射，即採用超音波破菌處理 80 秒後的細菌樣品做為抗 原。由實驗結果（圖七）可見，第二次與第三次細胞融合實驗所 篩選出的抗體（II-1、III-1、III-2、IV-2 及 IV-3）多辨識細菌細胞 表面的抗原。
比較兩種抗原製備的方法（表六），Triton X-100 的溶出法可 得的抗原量較超音波破菌處理少，且製備所需的時間也較長。
表六、兩種抗原製備法的比較
Triton X-100 溶出法 超音波破菌處理
目標抗原 細胞壁抗原 細菌全抗原
取得的抗原總量
（每 100 mL 菌液）
1.8 mg 26.5 mg
抗原製備時間 3 日 1.5 日
在抗原的免疫注射劑量方面，我們從參考文獻中得知，若直 接注射細菌（經煮沸或紫外光照射等殺菌處理）所需使用的劑量 約在 5×106～109 CFU 之間（表七）。我們原本以每隻小鼠 7.5×108 CFU 的劑量進行免疫注射，但在注射第一針的一週後，免疫注射 之小鼠即全數死亡，我們推測其原因可能是沙門氏菌的內毒素含 量過高所致；隨後，我們將注射劑量降低至 108 CFU，小鼠便不 再有死亡的情況。
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表七、細菌抗原的免疫注射劑量比較
目的 注射菌種 劑量
(CFU)
處理方法 文獻
疫苗注射 Salmonella enterica 109 煮沸 (Germanier & Furer, 1971)
製造抗體 Salmonella enteric 108 紫外光照射 (Fehr et al., 1997)
製造抗體 Escherichia coli 5×106 煮沸 (Ghosh et al., 2006)
製造抗體 Salmonella enterica 109 0.3%福馬林 處理
(Ronholm et al., 2011)
製造抗體 Vibrio cholerae 5×106 煮沸 (Pengsuk et al., 2011)
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52 能將該抗體製做成親和性吸附管柱（affinity column），並用以吸附 細菌成分，則可鑑定出該保守性成分為何，甚至可將該保守性成 分用於菌種間親源關係的探討。
(2) 第 II 群抗體──可辨識部份腸菌科菌種
抗體 II-1 在菌種專一性的測試中，能與腸菌科的 Shigella sonnei、Escherichia coli 及 Salmonella enterica 作用，但卻不會與 同為腸菌科之 Klebsiella pneumoniae 反應［圖五、(b)］。前人曾藉 比對 16s rRNA 的基因序列(Sproer et al., 1999; Anzai et al., 2000)或 是 elongation factor Tu 的基因序列(Paradis et al., 2005)，來分析腸 菌科中不同菌種的親源關係，結果顯示 Shigella sonnei、Escherichia coli、及 Salmonella enterica 三者之間的親源關係較為接近，而 Klebsiella pneumoniae 則與上述三種菌種的親源關係較為疏遠（圖 二十二），或許 II-1 抗體所辨識之表位恰為 Klebsiella 與其他三菌 種差異較大的序列。根據免疫染色的結果（圖八），我們已知 II-1 辨識的沙門氏菌的一分子量低於 15 kDa 之抗原分子，或許該分子 可作為腸菌科細菌的親源指標分子，而 II-1 抗體恰巧辨識該親源 指標分子上之區隔表位，因此可與 Shigella sonnei、Escherichia coli
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及 Salmonella enterica 等親源關係較為接近的細菌作用，而不會與 親源關係較疏遠的 Klebsiella pneumoniae 反應。雖然我們目前尚無 法確知該小分子蛋白質的身份（identity），但根據免疫沉澱實驗的 以考慮以噬菌體表現技術（phage-display technology）(Kindt 2011) 大腸桿菌表現技術(Ward, 1993)、或植物基因工程技術(Weintraub et al., 2005)來表現生成 II-1 抗體的抗原結合部位（Fab region），一方 面降低抗體生產的成，本另一方面也可以測試將此抗體發展成功 能性食品的添加物，以降低食物中毒的機率。
(3) 第 III 群抗體──可專一辨識沙門氏菌但不具血清型專一性 在本研究所生產的七株抗體中，有四株除了沙門氏菌之外，
並不會辨識其他的菌種，這四株抗體中，III-1 及 III-2 兩株抗體在 沙門氏菌的不同血清型測試中，對 Typhimurium 的兩種亞型和 Enteritidis 的一一種亞型均可反應，顯現出可專一辨識沙門氏菌但
54 structure（含 inner core 及 outer core）則僅含有約 11 個糖基(Nnalue, 1999)。前人的研究顯示(Bravo et al., 2011)，若抗體辨識的是 Lipid A 或 core structure 的部份，則免疫染色的訊號將會分布於 10 kDa 以下的分子量範圍；然而在我們的免疫染色實驗中，抗體 III-2 的 染色結果呈現梯狀條帶（ladder）訊號，且條帶的分子量多遠大於 10 kDa 以上［圖八、(b)］，此一結果排除了 III-2 抗體辨識 Lipid A 或 core structure 的可能性；反之，根據前人的研究(Ronholm et al., 2011)，該 ladder 訊號應表徵抗體 III-2 是辨識 LPS 的 O 抗原部份。
由於我們所選用作為免疫注射的菌株為沙門氏菌的
Typhimurium 血清型，查其 O 抗原為「4, 5, 12」，而我們進行菌種
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專一性測試所使用的除了這株菌之外，尚有同為 Typhimurium 血 清型但 O 抗原為「4, 12」的菌株及 O 抗原為「1, 9, 12」的 Enteritidis 血清型。抗體 III-2 可以辨識此三種菌株，由此推論其辨認的表位 應為 O12。從圖二十三可以看出，O12 是由 D-Mannose、L-Rhamnose 及 D-Galactose 三個糖連結而成的主鏈，許多其他的 O 抗原皆是在 O12 上進行側鏈的修飾而成，故許多沙門氏菌血清型的 O 抗原上 都有此結構。未來我們若要更加確認此株抗體是否為 O12 專一性 的抗體，可以再選擇其他同樣含有 O12 的血清型（如 Heidelberg）
進行測試，或是選擇不含 O12 的血清型（如 Newport）做為對照。
在應用上，III-2 抗體應僅適用於偵測有 O12 抗原的沙門氏菌 血清型，而不適用於不含 O12 抗原的血清群。根據 Institut Pasteur 於 2007 年所公布的沙門氏菌血清型資料中，許多對人類致病的血 清型如 Typhi、Paratyphi A 及 Paratyphi B 等皆含有 O12 的結構，
美國 CDC 在 2009 年公告食物中毒事件中常見的五種血清型 Enteritidis（O : 1, 9, 12）、Typhimurium（O : 1, 4, [5], 12）、Newport
（O : 6, 8, 20）、Javiana（O : 1, 9, 12）及 Heidelberg（O : 1, 4, [5], 12）
中，除了 Newport 之外其餘四者也都含有 O12 抗原，是以本研究 所生產的 III-2 抗體應有潛力應用於食品中沙門氏菌免疫偵測法的 開發。雖然 III-2 抗體在辨識不同血清型之沙門氏菌時其訊號強度 不一，如在辨識 Typhimurium（O : 4, 5, 12）時訊號明顯是辨識 Typhimurium（O : 4, 12）訊號的 1.5 倍左右，更是辨識 Enteritidis 的 5 倍左右，然而我們現行的國家標準對沙門氏菌的規範為「不 得檢出」，故雖然 III-2 的抗體或許無法對沙門氏菌所有的血清型進 行準確定量，但在定性分析樣品中是否含有沙門氏菌之目的則應 是足夠的。此外，有研究顯示，當可辨識 O 抗原的抗體與其抗原
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作用，但卻無法辨識 Typhimurium（O : 4, 12）及 Enteritidis（O : 1, 9, 12），比對此三種菌株在 O 因子組成上的差異， O5 抗原是 IV-1、 個 3, 6-dideoxy-D-galactose（Abe）的取代糖基，而 O5 抗原則是在 O4 的 Abe 糖基上進行兩個乙醯化（acetylation）後的產物。在沙 門氏菌的 O 抗原中，此種不一定會出現的 O 因子通常分為兩種，
一種是因噬菌體感染而編碼的 O 因子（在標示時會加底線為記，
如 O1 及 O27 等），另一種則與嗜菌體的編碼無關（在標示時會加 中括號為記，如 O5）(CDC, 2006)。由文獻中我們得知，在
Typhimurium 血清型中，本存在有將 Abe 乙醯化的酵素基因存在，
當此基因發生突變時 Abe 就無法進行乙醯化，而維持 O4 的結構。