ETS ITS1 ITS2 ETS
IGS
18S 5.8S 26S 18S
ITS5P ITS8P
Transcription Repeat
ETS ITS1 ITS2 ETS
IGS
18S 5.8S 26S 18S
ITS5P ITS8P
引子名稱 引子序列 ITS5P
ITS8P
GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G CAC GCT TCT CCA GAC TAC A
trnK n3914F matK ER matK 3MF trnK 2R
200 bp
5’ trnK matK 3’ trnK
trnK n3914F matK ER matK 3MF trnK 2R
200 bp
5’ trnK matK 3’ trnK
(a)
(b)
圖一. matK和trnK 葉綠體基因結構圖和引子所在位置及引子序列 （Kurashige et al., 2001）。
(a) matK和trnK 基因結構圖。
(b) 引子序列。
(a)
(b)
圖二. rDNA 結構圖（Soltis et al., 1998）和引子所在位置及引子序列（Moller et al., 1997）。
(a) rDNA 基因結構圖。18S，5.8S 和 26S 為 ribosomal RNA genes。
ITS-1 和 ITS-2 為兩個 internal transcribed spacer（ITS）片段。IGS 是intergenic spacer，ETS 是 external transcribed spacr。
引子名稱 引子序列 2F
3R
GAA CCT GAC CTA CTC ATC TCC ATT TCG GAT ACA TAA GCA TAT TTG TTG G
2F 3R
1342 bp 2.8kb
2 3
1 4 6 7 9 12
14 16 22 23 24 25
2F 3R
1342 bp 2.8kb
2 3
1 4 6 7 9 12
14 16 22 23 24 25
(a)
(b)
圖三. RPB2-i 基因結構圖和引子所在位置及引子序列（Goetsch et al., 2005）。 (a) 外顯子（exon 以方格代表）；內含子（intron 以黑色的線條代表）；
基因上方的箭頭表示引子的所在位置，其上為引子的名稱。
(b) 引子序列。
(3) T-A 選殖（cloning）：
a. 接合作用（ligation）
使用RBC Bioscience Cloning System 的 T&A Cloning Kit。反 應試劑總體積10
μ
L，各試藥之濃度、所需體積及最終之反應試劑 濃度如下：2 μL PCR 產物，1 μL ligation buffer A，1 μL，ligation buffer B，1 μL T&A vector，1 μL T4
DNA ligase，4 μL ddH2O。混合均 勻後，在22℃室溫且避光下靜置 20 分鐘後，放入 4℃冰箱隔夜，使vector 和 PCR 產物接和效率達到最高。
b. 轉型作用（heat-shock transformation）
(Ⅰ) 將勝任細胞（ECOS
TM
competent cell）由-70℃冰箱中取出，以流動的水沖洗解凍約1/3 至 1/2 後，迅速插入冰上。
(Ⅱ) 取 50
μ
L 的勝任細胞加入 2μ
L 的 PCR 產物，震盪一秒鐘使 之混合均勻，隨即將之放入42℃水浴槽中 45 秒，再置於冰 上3 分鐘以上。(Ⅲ) 將已轉型完成的勝任細胞以 L 型玻璃棒均勻塗在含有
Ampicillin（50
μ
g/mL）以及 ITPG（200μ
g/mL）和 X-gal（20μ
g/mL）的培養基上，靜置於 37℃培養箱中 12-16 小時。c. 菌落（colony）聚合脢連鎖反應
(Ⅰ) 將培養基上的菌落進行藍白挑選，用牙籤挑起轉型成功的白 色菌落（藍色的菌落代表沒有轉型成功），放入已準備好的 聚合脢連鎖反應混合溶液中，混合液的配方如下：10X PCR
buffer，2 μM dNTP mixture，10 uM M13F/M13R primers，
VioTag DNA polymerase。
(Ⅱ) 聚合脢連鎖反應反應條件同前
(Ⅲ) 菌落聚合脢連鎖反應結果檢測方法同前 (4) DNA 定序：
將聚合脢連鎖反應產物或是菌落PCR 檢測有轉型成功且接合成功 的菌落送交基隆米克斯生物科技股份有限公司（Taipei, Taiwan）以 ABI3730 DNA 自動定序儀（DNA automated sequencer）進行定序。
(5) DNA 的序列整理及分析：
將定序所得到的檔案以Sequencher 4.5（GeneCodes）進行人工判 讀。再用BioEdit 7.0.5（Hall, 1999）將所有的序列比對並進行多重序列 排序（multiple sequence Alignment）。由於RPB2-i序列有之部分個體有 兩段插入或刪除（indel），其中一段為13 bp，另一段為25 bp，將這些位
點視為一次演化事件，因此在做最大簡約性親緣關係樹（maximun parsimony tree：MP tree）前，利用人為方式將有插入或刪除的部分進 行刪除。
(6) 親緣關係樹的建立：
使用MEGA 3 軟體（Kumar et al., 2004），設定 Kimura’s（1980）
two-parameter model以及pairwise deletion建構鄰近連接法分析樹
（neighbor joining tree：NJ tree），樹型分枝的信賴程度（bootstrap）以 預設值1000次特徵重取進行評估。利用PAUP* 4.0b軟體（Swofford, 1998）建構最大簡約性親緣關係樹，將空格（gap）設成new state，利 用誘導式搜尋（heuristic search），進行100次重複的random stepwise addtion找尋，所得樹型圖每個分枝的的信賴程度以100次特徵重取進行 評估。另外再利用modeltest 3.7（Posada & Crandall 1998），以log似然性
（likelihood）邏輯選取適合的模式，所選出為HKY+G模型，gamma的 K值為5，gamma distribution α值為0.015，以此參數利用mrbayes 3.1.2
（Ronquist & Huelsenbeck, 2003）進行貝葉氏導出式分析（Bayesian inference analysis）方式建立樹型圖的建立並計算事後機率（posterior distribution）。
(7) 遺傳歧異度計算
以 RPB2-i 內含子 2 序列所做出的親緣關係圖為依據，使用 DnaSP4.0(Rozas et al., 2003)將樣品歸群後，計算族群單型歧異度
（haplotype diversity）、核甘酸歧異度（nucleotide diversity）、族群分化
(8) 分化和共祖時間計算
物種分化時間以t = 2N = θ/2μ公式計算。t代表物種的分化時間，N 為有效族群數（effective population size），θ為遺傳分化指數參數，代表 一個世代（generation）中的平均突變數量的兩倍，μ代表一個世代一位 點的平均突變數量，核基因平均值為2.815ｘ10
-8
（曾發表的值範圍:3.3ｘ10
-9
~5.3ｘ10-8
）（Provan et al., 1999）。Coalescence（溯祖）的原理是利用現有的序列資料，建立基因 genealogy 譜系圖，回溯族群共祖的時間點（TMRCA: Time to the Most Recent Common Ancestor）。共祖時間的計算使用 BEAST v.1.4.6 軟體 (Drummond & Rambaut, 2007)，對不同歸群的物種利用溯祖概念以及貝
葉氏(bayesian)事後機率統計方式，推測不同類群的共祖時間點。使用 modeltest 3.7（Posada & Crandall 1998）所選出的參數：HKY+G 模型，
gamma 種類數目 K 值為 5，嚴格的分子鐘（strict molecular clock）之平 均取代速率（substitution rate）設為 2.815*10
-8
，Markov chain Monte Carlo (MCMC) chain 設定為一千萬次，整個過程重複兩次。兩次的結果以 Tracer v1.4 (Drummond & Rambaut, 2007)軟體進行組合以及讀取。四、結果
（一）親緣關係樹建立
葉綠體DNA 片段 trnK-matK 兩段內含子合併的單型見附錄二、三，RPB2-i 內含子2 序列原始矩陣見附錄四，依據不同序列所建構的親緣關係樹型圖的結果 分別如下：
1. 葉綠體 matK 和 trnK 內含子片段所建構的親緣關係結果
葉綠體基因 matK 和 trnK 內含子片段所使用的樣本數共 34 個個體（表三、
表四），其中內群有25 個個體，兩段內含子合併，序列排序後的總長度為 1462 bp，
具有簡約意義資料的位點（parsimony informative site）有 20 個位點，singleton 有9 個位點，內外群物種所使用的樣品資料詳見表三和表四。以鄰近連接法方式 所建構的親緣關係樹，此組杜鵑可分為三大群（圖四）：與外群親緣關係較接近 的為 R. oldhamii，接下來又再分為兩群，第一群包含 R. simsii、R. nakaharai、
R. longiperulatum、R. noriakianum 和 R. kanehirai，第二群（信賴程度值為 87）
包含 R. taiwanalpinum、R. breviperulatum、R. lasiostylum 和 R. rubropilosum。
三群之間僅有四個具有簡約意義資料的位點，分別在171、370、1219、1376 四個位點（附錄一)，表示此十種杜鵑花在葉綠體基因 matK 和 trnK 內含子片段 上的差異很小。雖然變異小，但卻可以很清楚的將此組杜鵑花分為上述支持度中 等以上的的三群，群間有明顯的界線，群內無種間差異。