探討台灣映山紅組杜鵑的親緣關係
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(4) 目次 目次..............................................................................................................................Ⅰ 附表目次......................................................................................................................Ⅱ 附圖目次......................................................................................................................Ⅲ 中文摘要......................................................................................................................Ⅳ 英文摘要......................................................................................................................Ⅴ 一、前人研究..................................................................................................................1 二、研究目的..................................................................................................................9 三、材料與方法............................................................................................................10 四、結果......................................................................................................................18 五、討論......................................................................................................................35 六、結論......................................................................................................................48 七、參考文獻................................................................................................................49 附錄一、樣本編號與採集號對照表............................................................................55 附錄二、trnK 到 matK 的合併的 haplotye....................................................................56 附錄三、樣本 trnK 到 matK haplotype 對照表.............................................................57 附錄四、RPB2-i intron 2 原始資料矩陣……………………………………………..58. I.
(5) 附表目次 表一.. 台灣映山紅組（Sect. Tsutsusi）杜鵑花種類列表………………………….3. 表二.. 樣本編號與採集地……….............................................................................11. 表三.. 台灣映山紅組杜鵑花以及 R. tashiroi 之分子資料結果..............................19. 表四.. 本研究使用之外群之分子資料結果.............................................................20. 表五.. ITS 在台灣映山紅組杜鵑中有變異的位點..................................................23. 表六:. 以 RPB2-i intron 2 序列資料為依據的族群遺傳歧異度分析......................32. 表七:. 以 RPB2-i intron 2 序列資料為依據的共祖時間估計..................................34. II.
(6) 附圖目次 圖一.. matK 和 trnK 葉綠體基因結構圖和引子所在位置及引子序列…………...13. 圖二.. rDNA 結構圖和引子所在位置及引子序列……...................................…...13. 圖三.. RPB2-i 基因結構圖和引子所在位置及引子序…….....…............................14. 圖四.. 葉綠體 DNA matK 和 trnK intron 片段以 Neighboring joining 建構之樹型 圖……………………………………………………………………….…...21. 圖五.. ITS 多型性判定標準……...….......................................................................24. 圖六.. 台灣映山紅組杜鵑花 nrITS 序列以保守方式 coding 所建構之 MP tree..…25. 圖七.. 台灣映山紅組杜鵑花 nrITS 序列以多型性方式 coding 所建構之 MP tree..26. 圖八.. 核 RPB2-i intron 2 基因以 Neighboring joining 建構之樹型圖.....................28. 圖九.. 核 RPB2-i intron 2 基因以 Bayesian inference 方式建構之樹型圖...............29. 圖十.. 核 RPB2-i intron 2 基因以 Maximum parsimony 方式建構之樹型圖….......30. 圖十一.. R. rubopilosum 可能之起源示意圖............................................................40. 圖十二.. 台灣映山紅組杜鵑花親緣關係示意圖…….............................................41. 圖十三. R. rubropilosum、 R. taiwanalpinum、R. breviperulatum 以及 R. noriakianum 分布圖………………………………………………….....45. III.
(7) 中文摘要 台灣的映山紅組杜鵑花（Rhododendron sect. Tsutsusi） ，約十個物種，外表形態 上皆極為相近。這些形態相近的類群中，除了唐杜鵑（R. simsii）之外，都屬於台 灣特有種，許多例子指出，物種在新形成的年輕島嶼中常有快速演化，進而種化 的現象。台灣的映山紅組杜鵑花特有種的比例如此高，加上台灣屬於年輕型島嶼， 推測這些形態極為相近的杜鵑可能是近期快速演化的結果。本研究利用母系遺傳 之葉綠體基因 matK 和 trnK 的內顯子（intron）片段以及核基因 RPB2-i intron 2 和 ITS 片段，探討台灣產杜鵑花屬映山紅組植物的親緣關係及演化歷史。 葉綠體基因 matK 和 trnK intorn 片段建構的親緣關係圖結果，將台灣映山紅 組杜鵑花歸為主要的三群；RPB2-i intron 2 片段建構的基因樹將十種杜鵑花歸為主 要的兩大群，此片段中除了 R. oldhamii 以外，其他種類 RPB2-i 基因片段都帶有兩 個 copies 的現象，且 R. rubropilosum 的不同 copy 分別歸到不同的兩個大群中；而 ITS 片段所建構的親緣關係圖在本組杜鵑中無解析力。以上親緣關係結果、加上 R. rubropilosum 的遺傳歧異度最高，再加上共祖時間的計算比較，確認 R. rubropilosum 為一雜交起源種。 利用葉綠體以及多 copy 的核基因片段，本研究最後將台灣映山紅組的十種杜 鵑花歸為四群：第一群包含 R. simsii、R. longiperulatum、R. nakaharai、 R. kanehirai 和 R. noriakianum；第二群包含 R. taiwanalpinum、R. breviperulatum 和 R. lasiostylum；第三群為 R. oldhamii；第四群為 R. rubropilosum，此結果與 Yamazaki(1996)形態分類研究結果比較，除了 R. rubropilosum 在本研究中發現為 一獨立的雜交起源種之外，其他物種的親緣關係與其形態的歸群結果相吻合，因 此配合分子研究的結果，更能詳盡的解釋台灣映山紅組杜鵑花的親緣關係。 最後，以本研究結果推測台灣映山紅祖杜鵑花可能有三個以上的來源，但由 於未蒐集到此組分布在鄰近地區的物種，所以此推測的證據並不足。未來若想要 探討台灣映山紅組杜鵑花的更詳盡的演化歷史，應詳盡蒐集此組杜鵑花所有的物 種以及使用，才能更進一步的了解台灣映山紅組杜鵑花起源與分化。 IV.
(8) English abstract Rhododendron sect. Tsutsusi in Taiwan comprises of 10 species. These species are very similar morphologically and are all endemic except R. simsii. Many examples point out that rapid evolution and subsequent speciation are often occurred on newly formed island. The endemic feature of these species and the newly formed island feature of Taiwan suggest that Rhododendron sect. Tsutsusi in Taiwan may be a result of fast evolution. This study uses cpDNA matK and trnK intron sequences and nuclear DNA RPB2-i intron 2 and ITS sequences to investigate the phylogenetic relationship of these closely related species . Phylogeny tree constructed by matK and trnK intron sequence shows three major groups; and which constructed by RPB2-i intron 2 sequence shows two major groups. The author discovers that RPB2-i sequences of all species have two copies except R. oldhamii, besides, different copies of R. rubropilosum are separately grouped into two different groups. However, phylogenetic tree constructed by ITS sequences is not well resolved. From the results above, the highest genetic diversity of R. rubropilosum, and the comparison of coalescent time together, the author infers that R. rubropilosum is a hybrid origin. Combine the phylogenetic results of cpDNA trnK-matK intron and low copy number RPB2-i intron 2 sequenses, Rhododendron sect. Tsutsusi in Taiwan can be classified into four groups: the first group comprises of R. simsii, R. longiperulatum, R. nakaharai,R. kanehirain, and R. noriakianum; the second group comprises of R. taiwanalpinum, R. breviperulatum; and R. lasiostylum; the third group comprises of R. oldhamii; and the last group comprises of R. rubropilosum. Phylogenetic relationship based on molecular data is coincident with the morphological treatment, except R. rubropilosum. Therefore, the results based on molecular data can unmask more inconspicuous information to infer the phylogenetic of Rhododendron sect. Tsutsusi in Taiwan. V.
(9) Finally, based on the results, the author speculates there may be at least 3 independent origins of these closely related species. However, the author cannot ascertain that the speculation is accurate since the lack of samples of Rhododendron sect. Tsutsusi . Therefore, collecting more samples and using more sensitive markers in the future are necessary to study more about the origin and the divergence of Rhododendron sect. Tsutsusi in Taiwan.. VI.
(10) 一、前人研究 （一）杜鵑花屬以及映山紅組杜鵑花的背景資料 杜鵑花屬（Rhododendron）是杜鵑花科（Ericaceae）最大的屬，廣泛分佈於 歐洲、亞洲、北美洲，東亞和南亞是兩個分佈中心（Hsu, 1973）。Good（1953） 認為目前世界杜鵑花屬植物是由喜馬拉雅山系起源，分別往 3 個方向拓展：第一 個方向往西，經由西亞，南歐，一直到葡萄牙；第二個方向往南，經由印度，馬 來西亞，到緬甸、泰國、中國，再延伸到爪哇、婆羅洲、菲律賓、和新幾內亞； 第三個方向往東經由東亞和東北亞到台灣、日本，甚至延伸至北美洲。 杜鵑花屬也是中國和喜馬拉雅植物區系中最大的一屬，此屬種類約有 900 種，但有些學者認為甚至有更多種（何, 1994） ，造成分類意見差異的因素可能是 因為杜鵑花很容易有雜交種的出現（Richard et al., 1999, 2003） 。雜交頻繁導致形 態變異高，物種區分不易，這種現象可由杜鵑花有許多人工培育的園藝種現象看 得出來。 中國植物志依據 Sleumer（1949）的系統概念和 Gray 的觀點（1878），將大 陸和台灣地區的杜鵑花屬分為九個亞屬，其中映山紅亞屬（Subgen. Tsutsusi）底 下的映山紅組（Sect. Tsutsusi）包含了 80 幾個物種。Yamazaki（1996）針對日本、 台灣、韓國以及俄國東部的庫頁島的杜鵑花屬植物進行訂正，台灣的映山紅組杜 鵑花在 Yamazaki 的分類處理中，屬於映山紅亞屬中的映山紅組，與中國植物志 的處理一致，然而若再將此組杜鵑花細分，台灣映山紅組杜鵑花又分屬於不同的 亞組當中（表一） 。台灣植物誌（Flora of Taiwan）第一版依據 Li（1978）之觀點， 將台灣的映山紅組杜鵑花處理為十個類群（表一），其包含 R. simsii、 R. longiperulatum、R. nakaharai、R. noriakianum、R. kahenirai、R. rubropilosum、 R. taiwanalpinum、R. breviperulatum、R. lasiostylum 以及 R. oldhamii，然而在台 灣植物誌第二版中依據 Lu & Yang（1998）的處理，此組杜鵑僅有七個類群，包 括六個種其中包含兩個變種，與台灣植物誌第一版的處理的不同在於. 1.
(11) R. longiperulatum 和 R. nakaharai 在台灣植物誌第二版中被處理為 R. simsii 之同 物異名，R. lasiostylum 為 R. breviperulatum 之同物異名，R. taiwanalpinum 為 R. rubropilosum 下的變種 R. rubropilosum var. taiwanalpinum。 由以上可見，各分類學者對台灣映山紅組杜鵑花的分類地位的觀念不一致， 這可能是因為此組杜鵑花在種間形態差異不明顯有關。本研究中採取最細的分類 群基準進行採樣以及分析，希望可以將所有可能為映山紅組杜鵑的類群都囊括在 本研究中，因此使用台灣植物誌第一版所處理的的映山紅組杜鵑共十個分類群為 基準（表一）。 此外，台灣植物誌遺漏之 R. tashiroi，其形態介於映山紅亞屬的映山紅組和 輪生葉組（Sect. Brachycalyx）之間，Sleumer（1949）將其單獨成立為假映山紅 組（Sect. Tsutsiopsis） ，Yamazaki（1996）則將其置入輪生葉組，依據 Kurashige et al.（2001）利用葉綠體 matK 和 trnK 內含子（intron）片段和 Gao et al.（2002） 利用 nrITS（nuclear Internal Transcribed Spacer）對於杜鵑花分類系統關係的研 究，若排除 R. tashiroi 後，映山紅組為一個支持度高的單系群，且 Gao et al.（2002） 依據分子證據之結果支持 Yamazaki 之觀點，將 R. tashiroi 置入輪生葉組。以上 顯示 R. tashiroi 與映山紅組杜鵑形態上和分子上皆極為相近，為其姊妹群，因此 在本研究中以 R. tashiroi 當外群。. 2.
(12) 表一.. 台灣映山紅組（Sect. Tsutsusi）杜鵑花種類列表。Yamazaki（1996）與本研究所使用的 Li（1978）之物種名稱對照表。. Yamazaki（1996）分類系統. Li（1978）. Lu & Yang（1998）. Subsection. Series. Taxa. Corrifolia. Coriifolia. R. taiwanalpinum Ohwi. R. taiwanalpinum Ohwi. R. rubropilosum Hayata var. taiwanalpinum (Ohwi). R. rubropilosum Hayata var. rubropilosum. R. rubropilosum Hayata. R. rubropilosum Hayata var. rubropilosum. R. rubropilosum Hayata var. breviperulatum (Hayata) Yamazaki. R. breviperulatum Hayata. R. breviperulatum Hayata. R. rubropilosum Hayata var.grandiflorum Yamazaki. R. lasiostylum Hayata. （R. lasiostylum Hayata 為同物異名）. R. oldhamii Maxim.. R. oldhamii Maxim.. R. oldhamii Maxim.. R. kanehirai Wilson. R. kanehirai Wilson. R. kanehirai Wilson. R. nakaharai Hayata. R. nakaharai Hayata. R. simsii Planch. （ R. longiperulatum Hayata 為同物異名）. R. longiperulatum Hayata. Kaempferia. R. simsii Planchon. R. simsii Planchon. Serpyllifolia. R. noriakianum T. Suzuki. R. noriakianum T. Suzuki. Scabra Tsutsusi. Tsutsusi. 3. R. noriakianum T. Suzuki.
(13) （二）杜鵑屬之分子研究 1.. 緒言 Goetsch et al.（2005）利用核 RPB2-i 基因序列研究杜鵑花屬下不同亞屬間的. 關係，探討依據外表形態所認定的亞屬是否為一單系群（monophyly） ，研究顯示， 映山紅亞屬的關係雖最為相近，但此亞屬並非自成一群的單系群，然而 Kurashige et al.（2001）利用 matK 和 trnK 的內含子片段研究杜鵑花屬內不同亞屬以及不同 組間的關係，顯示映山紅亞屬為一單系群，且其下的映山紅組也為一單系群。 此外，有關台灣杜鵑花的相關研究也有很多，在親緣關係以及種間區分的探 討上，蔡等人（1999）利用 nrITS 片段探討台灣映山紅組種間區分，發現台灣灌 木類的杜鵑 R. oldhamii、R. kanehirai、R. lasiostylum、R. nakaharai、 R. longiperulatum、R. simsii 和 R. rubropilosum 序列相似，僅有 1-2 個核苷酸差異， 顯示 nrITS 在此組杜鵑花中序列相似性很高，種間的界線不清楚。Tsai et al. （2003） 同樣利用 nrITS 序列探討台灣原生種杜鵑的遺傳組成的關係，將上述的物種再加 上 R. taiwanalpinum，R. breviperulatum 歸為一大群，顯示台灣映山紅組杜鵑花是 極為相似的類群。黃&徐（2001）利用葉綠體 trnF-trnL 核酸序列探討台灣八種杜 鵑花枝分子親緣關係，台灣映山紅組杜鵑 R. oldhamii 和 R. kanehirai 的親緣關係 較近。范等人（2003）利用 RAPD（random amplified polyomrphic DNA）分析方 法，評估台灣其中 11 種杜鵑的遺傳距離，研究結果顯示不同地區所採集的 R. oldhamii 遺傳距離小且同種歸在一起，而 R. simsii、R. kanehirai、 R. noriakianum、R. rubropilosum 和 R. breviperulatum 另為一群遺傳距離相近的物 種。Gao et al.（2002）利用 nrITS 序列探討杜鵑屬映山紅亞屬的組間關係，台灣 映山紅組杜鵑花 R. oldhamii、R. lasiostylum、R. longiperulatum、 R. simsii、R. breviperulatum 與大陸映山紅組杜鵑花 R. kaempferi 以及 R. kiusianum 間無解析力，共同為一支持度很高的類群，此結果與上述研究結果相比較，台灣 映山紅組杜鵑的關係與鄰近地區的映山紅組杜鵑在 nrITS 資料中無明顯種間差 異。 4.
(14) 由以上有關台灣映山紅組杜鵑花的分子實驗結果種間的區分不易，可以與此 組杜鵑花在形態上極為相似之特徵相印證，此外，上述研究中不管使用哪一種標 記做研究，在台灣映山紅組杜鵑花的種類蒐集上都不夠完全，因此本研究會再針 對此做更詳盡的物種蒐集。. 2.. 葉綠體 DNA（chloroplast DNA: cpDNA）以及核 DNA（nuclear DNA）在探 討親緣關係上的應用 自1990年代以來，在探討物種間的親緣關係時，分子資料即扮演很重要的角. 色（Wendel & Doyle, 1998）。使用植物細胞核以及葉綠體的基因體（genome）， 兩者常建構出不一致的物種關係（Goncalves et al., 2007） ，當不一致的狀況發生 時，代表所選的片段顯示物種不同方面的演化歷史，葉綠體片段主要可以追溯母 本的物種，而核片段可以提供父本和母本雙方的資訊（Wendel & Doyle, 1998）。 在植物物種演化的過程中，除了同物種內，因環境和時間而漸變的的演化之外， 網狀演化（reticulate evolution），也扮演很重要的角色，不同種類之間，甚至不 同屬的植物都有可能藉由雜交而產生有生殖能力的子代，同屬內相近物種雜交情 況則更加普遍。核基因通常是雙套，雙系遺傳，而雜交後代常同時帶有兩親本的 基因型（genotype），所以可藉由核基因研究，補足葉綠體片段無法呈現的親緣 關係資訊。 因此，欲探討物種的演化歷史以及物種間的親緣關係，葉綠體以及核DNA 片段都應該使用，本研究呈上述前人分子研究中在杜鵑花屬植物所使用葉綠體 matK和trnK的內含子片段和核基因ITS及RPB2-i內含子片段，分別對這三種片段 做比較與簡介：. 5.
(15) 葉綠體 DNA: matK-trnK 葉綠體序列的應用範圍很廣，在種或是種階級以上，不同片段的解析力各有 不同，因此常被拿來做親緣關係的探討（Sharma & Sharma, 2005）。一般而言， 葉綠體基因體的演化速度較核基因體的演化速度慢，因此在探討較低階的親緣關 係上常有解析力不足的情況。然而，葉綠體基因體在大部分的植物中為單套、母 系遺傳，此特性使的葉綠體 DNA 片段在親緣關係的應用上較核 DNA 片段單純。 Kurashige et al.（2001）使用葉綠體 matK 和 trnK 內含子片段探討杜鵑花屬 內各亞屬間的親緣關係上的解析力高，因此本研究選用此片段當做葉綠體 DNA 的分子標記，探討台灣映山紅組杜鵑花的親緣關係。. 核 DNA: nuclear ribosomal internal transcribed spacer（nrITS） rDNA 是核的片段，來自親本雙方，其結構如圖三所示。18S，5.8S 和 26S 在植物的基因體中是很保守的區域，而介於期間的 ITS 部分演化速度則較快，因 此常使用在較低階層的親緣關係探討中。rDNA 在植物體中可以有幾千次 repeats，為數眾多的重複片段使 rDNA 在植物的基因體約佔 10%（Soltis et al., 1998），而個體內不同的拷貝（copy）間經由協同演化（concerted evolution）機 制（例如：基因轉變 gene conversion，不平等互換 unequal crossing over...等等）， 使不同拷貝的序列會漸漸趨向一致（Soltis et al., 1998），此特性也適合在親緣關 係的研究上應用。 然而近幾年的研究發現，許多物種其rDNA的協同演化並不完全，可能有更 複雜的機制，所以在個體內看到不同拷貝間的序列存有差異。特別是在雜交的物 種，由於協同演化沒有完全將兩親本提供的ITS序列同質化（homogenization） ， 因此同個個體內常可以找到兩類不同的序列分別來自於兩親本。Kim et al.（2008） 發現蓼科植物中sect. Eupersicaria，葉綠體DNA與nrITS所建構的親緣關係樹型圖 不一致，作者再配合染色體數目，形態特徵以及地理分佈等資訊，發現其中的10 個物種的起源是經由種間雜交產生。Moody et al.（2002）利用nrITS序列發現北 6.
(16) 美洲入侵種Watermilfoil（Myriophyllum屬）同時帶有當地原生物種以及入侵種的 ITS片段。以上的特性，又使得nrITS成為一個方便且有力的材料來看雜交問題。. 核 DNA: RPB2-i 內含子 2 近來，RPB2 基因應用在很多物種的親緣關係探討上，Popp et al.（2008）即 利用 RPB2 基因序列和其他片段對非洲石竹科（Caryophyllaceae）物種 Eurasian lychnis 的起源關係作討論。 RPB1 以及 RPB2 分別是 RNA polymerase II 的最大以及次大的次單元 （subunit） ，且在真菌、動物，以及一些種類的植物中是單套的（Luo et al., 2007） 。 但在許多開花植物當中，RPB2 基因序列卻有兩套拷貝的情形（Oselman et. al., 2004; Pfeil et al., 2004） 。Luo et al.（2007）使用 APG（Angiosperm Phylogeny Group） II 系統，發現 RPB2 基因在核心真雙子葉植物（core eudicot）演化初期已經發生 複製（duplication） （RPB2-i 以及 RPB2-d） ，除此之外，在不同類群當中，RPB2-i 以及 RPB2-d 還分別持續進行複製事件，有些類群最後會保留其複製品 （duplicate），有些類群的複製品則消失，但杜鵑花科植物並沒有發現此兩拷貝 還分別進行複製事件（Luo et al., 2007） ，故本研究使用此片段。此外，Goetsch et al.（2005）曾針對杜鵑花科 RPB2-i 序列設計專一性的引子，對杜鵑花屬親緣關 係探討提供很大的便利。. （三）台灣的生物地理 台灣的地質年代相當年輕，據估計，台灣經由歐亞大陸板塊以及菲律賓海板 塊擠壓隆起的時間約在距今兩百五十萬年前，大約是第三紀上新世 （Tertiary-Pliocene）與第四紀更新世（Quaternary-Pleisotocene）的交界時間（沈， 1996），自此之後，地球反覆出現許多次的冰期以及間冰期，陸上的植物隨著氣 溫的變化，南北移動或者是經由陸橋東西遷移。台灣地處中國大陸東南緣，與大 陸之間僅隔著深度小於 200 公尺的台灣海峽，在冰河時期，大陸棚露出形成天然 7.
(17) 的陸橋，使植物有機會由中國大陸播遷進入台灣，而間冰期時，台灣又與大陸阻 隔，使進入台灣的物種與大陸的物種產生分化。在這反覆的冰期與間冰期的循環 下，物種不斷的進入以及不斷的產生分化，使得台灣目前的植物種類多樣且複 雜。然而，在第四紀兩百五十萬年的時間尺度下，未有足夠時間讓台灣與大陸地 區物種產生較高層級的分化，因此分化的程度以種、亞種階級為主（沈，1997）。 由於地理隔離之因素，島嶼的形成常伴隨著物種的快速種化，進而與來源地 區的物種產生分化而使島嶼上的特有種比例高的現象（Hatushima, 1980），以台 灣為例，特有種占維管束植物的 25%左右，其中映山紅組杜鵑花除了 R. simsii 為廣分佈種之外，其他九的類群皆為特有種。位於北非西北部大西洋上的 Canary Islands 包含 7 個島嶼，地理位置近非洲大陸，此群島第三紀晚期曾與地中海附近 陸塊相連，因此地中海附近提供此群島上動植物的來源，有研究指出，在此群島 上的菊科植物伴隨著微棲地的不同，有快速適應演化的現象（Javier et al., 1995）；愛琴海列島彼此之間以及與大陸之間的隔離時間大約在五百二十萬年前 左右，作者利用生長在島嶼上且與鄰近大陸地區已產生分化的毛茛科 Nigella 屬 的物種進行研究，希望了解到底是遺傳漂變（genetic drift）還是選天澤（natural selection）何者才是主要因素造成此分化現象（Comes et al., 2008）；此外，位於 太平洋中央屬於海洋性島嶼的夏威夷群島上的菊科植物為例，北美洲的兩親本物 種經過雜交後在夏威夷群島形成新的物種（Barrier et al., 1999） ，上述的例子皆顯 示島嶼與大陸因為長期的隔離，使其上的物種與來源地區產生分化的現象。 台灣特殊的地理位置以及形成年代使得其上的物種可能與鄰近地區（例如中 國大陸）的物種產生分化，進而快速種化的現象。本研究中的映山紅組杜鵑花特 有種比例高的特性，使其成為一個很好的研究材料。. 8.
(18) 二、研究目的 在前人研究中提到，杜鵑花屬以喜馬拉雅山系為起源中心，分別向西、南以 及東邊三個方向拓展，而台灣的杜鵑花屬物種，除了 R. kawakamii 之外，皆經由 往東的路徑，由中國進入台灣（Hsu, 1973），台灣映山紅組杜鵑花共十種，形態 以及分子上的特徵皆極為相近，除了 R. simsii 之外，皆為特有種，特有種比例高 的特殊現象可能是由於台灣為新形成的大陸型島嶼，物種在冰河時期由中國大陸 進入台灣，並且在間冰期由於隔離而與大陸物種產生分化，因此本研究即對此十 種杜鵑花進行較詳盡的物種採樣（表一），利用分子標記希望可以更詳盡的了解 台灣映山紅組杜鵑花的親緣關係以及演化歷史。. 9.
(19) 三、材料與方法 （一）研究材料 參考標本館之採集記錄及相關文獻資料後，至台灣全島各地採集新鮮材料， 部份材料用矽膠乾燥，部份製成證據標本。本研究之採集物種、樣品編號和採集 地詳見表二，樣品編號與作者採集號對照表見附錄一。. （二）研究方法 1.. 取樣 每個族群，約 5-10 公尺取一個樣本，共取 5-10 個樣本。以矽膠乾燥， 為 DNA 萃取用。. 2.. 分子技術 (1). DNA 萃取 使用 CTAB 抽取（Doyle & Doyle, 1990），略作修改: a. 取約 0.5 g 的植物葉片，加入液態氮後研磨至細粉末狀，並移至 2 mL 之離心管中。 b.. 加入 1000 μL 預熱好的 CTAB extraction buffer（100 mM pH8.2 Tris-Cl，1.4M NaCl，20 mM pH8 EDTA，2% CTAB），置於 65℃ 乾浴機 30-40 分鐘。. c. 回到室溫後，加入 1000 μL 的 chloroform/isoamylalcohol（24:1）溶 液至離心管中，混合均勻。 d.. 室溫下，經轉速 8,000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液至乾淨的 2 mL 離心管中。. e. 重複步驟 c 和 d，共三次。 f.. 加入冰 1000 μL 的 isopropanol，放在冰上或 4℃冰箱 30 分鐘。. g.. 室溫下，經轉速 8,000 rpm 離心 5 分鐘後，將 DNA 沉澱在離心管底. 10.
(20) 表二.. 樣本編號與採集地。. 物種學名. 樣本編號為學名簡寫加編號. R. simsii 唐杜鵑. R. sim 74(屏東縣南仁山)，R. sim76(屏東縣南仁山). R. nakaharai 中原氏杜鵑. R. nak 170(台北市七星池)，R. nak 171(台北市七星池)， R. nak 183(台北市七星山)，R. nak 187(台北市七星山)， R. nak 328(台北縣獅頭山)，R. nak 377(台北縣烏來山)， R. nak 391(台北縣皇帝殿). R. longiperulatum 大屯杜鵑. R. lon 312(台北市大屯山)，R. lon 317(台北市大屯山). R. kanehirai 烏來杜鵑. R. kan 117(栽培)，R. kan 118(栽培). R. oldhamii 金毛杜鵑. R. old 20(台北市菜公坑)，R. old 86(台北縣雙溪)， R. old 163(花蓮縣能高越嶺道東段)， R. old 337(台北縣獅頭山). R. noriakianum 細葉杜鵑. R. nor 130(花蓮縣致遠山莊)，R. nor 141(宜蘭縣思源啞口)， R. nor 239(宜蘭縣桃山)，R. nor 240(宜蘭縣桃山). R. rubropilosum 紅毛杜鵑. R. rub 137(南投縣能高越嶺道西段)，R. rub 180(屏東與台東縣 北大武山)，R. rub 232(台東與高雄縣庫哈諾辛山)， R. rub 258(台東與高雄縣關山嶺山)，R. rub 265(台東與高雄縣 關山嶺山). R. breviperulatum 南澳杜鵑. R. bre 123(南投縣台 14 甲)，R. bre 124(南投縣台 14 甲)， R. bre 129(南投縣能高越嶺古道西段)，R. bre 175(花蓮縣新白 楊)，R. bre g7(南投縣能高越嶺古道西段). R. lasiostylum 埔里杜鵑. R. las 445(南投縣蕙孫林場). R. taiwanalpinum 台灣高山杜鵑. R. tai 164(南投縣能高越嶺古道)，R. tai 246(宜蘭縣桃山)， R. tai 360(宜蘭與台中縣南湖大山). R. tashiroi 大武杜鵑. R. tas 405(屏東縣姑子崙山)，R. tas 415(屏東縣姑子崙山). R. formosanum 台灣杜鵑. R. for S1(宜蘭縣思源啞口)，R. for GW1(新竹縣觀霧)， R. for F1(南投縣鳳凰山). R. rubropunctum 紅星杜鵑. R. rub R1(台北市菜公坑)，R. rub R2(台北市菜公坑)， R. rub R3(台北市菜公坑). R. morii 森氏杜鵑. R. mor 40(嘉義縣玉山). R. pseudochrysanthum 玉山杜鵑. R. pse 167(花蓮縣能高越嶺古道東段). R. hyperythrum 南湖杜鵑. R. hyp 356(宜蘭與台中縣南湖大山). R. mariesii 守城滿山紅. R. mar 172(台北市七星池). R. ellipticum 西施花. R. ell W1(台北市七星山). R. chilanshanense 棲蘭山杜鵑. R. chi 11(宜蘭縣棲蘭山). 11.
(21) 層，倒掉上清液。 h.. 加入 1000 μL 70%至 75%的 ethanol，輕彈離心管使 DNA 沉澱漂起， 再以 13,000 rpm 離心 2-3 分鐘後，倒掉 ethanol。. i. 若 DNA 中色素殘留量還是很高，重複步驟 h。 j. 室溫下，讓 ethanol 揮發掉。 k.. 加入 200 μL 的二次水，使 DNA 溶解。. l. 將 DNA 置於-20℃冰箱中保存。 (2) 聚合脢連鎖反應（PCR：Polymerase Chain Reaction） a. 引子選擇 葉綠體 DNA 片段所使用的是 matK 到 trnK 的內含子片段（圖 一），核 DNA 片段，使用 ITS 片段（圖二）以及 RPB2-i 內含子 2 片段（圖三）。 b.. 聚合脢連鎖反應的反應試藥與濃度 每個 PCR 反應試劑總體積為 20 μL，各試藥之濃度、所需體積 及最終之反應試劑濃度如下：10X PCR buffer(15 mM MgCl2， Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM EDTA，1 mM DTT, 1% Triton X-100，50% glycerol)，2 mM dNTP mixture，0.2 mM primer，VioTag DNA polymerase。. c. 聚合脢連鎖反應反應條件 先以 94 ℃處理 5 分鐘，使雙股 DNA 變性。再以 94 ℃一分鐘、 94 ℃鏈合溫度一分鐘、72 ℃延長溫度兩分鐘，進行 35 次的擴增循 環。最後保持 72 ℃處理 5~10 分鐘。反應產物溫度降至室溫或 4℃ 保存。 d.. 聚合脢連鎖反應結果檢測 以 1X TBE buffer 所配製成之 1% agarose gel（內含 0.25 μg/mL 之 EtBr 染劑）在 120V 條件下，進行電泳約 15 分鐘後，隨即以紫 外燈上觀察及記錄 PCR 產物的分子量、濃度及產物條帶是否單一。. 12.
(22) (a) matK ER. trnK n3914F. matK 3MF. 5’ trnK. trnK 2R. matK. 3’ trnK. 200 bp. (b). 圖一.. 引子名稱. 引子序列 5’序列到 3’序列. trnk n3914F matK ER. GGG GTT GCT AAC TCA AC TTT TGG GGT TAT CAA ATC AT. marK 3MF trnK 2R. GTG GTC TCA ACC AAG AAG G AAC TAG TCG GAT GGA GTA G. matK 和 trnK 葉綠體基因結構圖和引子所在位置及引子序列 （Kurashige et al., 2001）。 (a) matK 和 trnK 基因結構圖。 (b) 引子序列。. (a). ITS5P. ITS8P. 5.8S. 18S. ETS. ITS1. IGS. 26S. ITS2. 18S. ETS. Transcription. Repeat. (b). 圖二.. 引子名稱. 引子序列. ITS5P ITS8P. GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G CAC GCT TCT CCA GAC TAC A. rDNA 結構圖（Soltis et al., 1998）和引子所在位置及引子序列（Moller et al., 1997）。 (a) rDNA 基因結構圖。18S，5.8S 和 26S 為 ribosomal RNA genes。 ITS-1 和 ITS-2 為兩個 internal transcribed spacer（ITS）片段。IGS 是 intergenic spacer，ETS 是 external transcribed spacr。 (b) 引子序列。 13.
(23) (a). 2F 1. 3R 3. 2 2.8kb. 圖三.. 6 7. 12. 9. 1342 bp 14. (b). 4. 16. 22. 23. 24. 25. 引子名稱. 引子序列. 2F 3R. GAA CCT GAC CTA CTC ATC TCC ATT TCG GAT ACA TAA GCA TAT TTG TTG G. RPB2-i 基因結構圖和引子所在位置及引子序列（Goetsch et al., 2005） 。 (a) 外顯子（exon 以方格代表） ；內含子（intron 以黑色的線條代表）； 基因上方的箭頭表示引子的所在位置，其上為引子的名稱。 (b) 引子序列。. 14.
(24) (3). T-A 選殖（cloning）： a. 接合作用（ligation） 使用 RBC Bioscience Cloning System 的 T&A Cloning Kit。反 應試劑總體積 10 μL，各試藥之濃度、所需體積及最終之反應試劑 濃度如下：2 μL PCR 產物，1 μL ligation buffer A，1 μL，ligation buffer B，1 μL T&A vector，1 μL T4 DNA ligase，4 μL ddH2O。混合均 勻後，在 22℃室溫且避光下靜置 20 分鐘後，放入 4℃冰箱隔夜， 使 vector 和 PCR 產物接和效率達到最高。 b.. 轉型作用（heat-shock transformation） (Ⅰ). 將勝任細胞（ECOSTM competent cell）由-70℃冰箱中取出， 以流動的水沖洗解凍約 1/3 至 1/2 後，迅速插入冰上。. (Ⅱ). 取 50 μL 的勝任細胞加入 2 μL 的 PCR 產物，震盪一秒鐘使 之混合均勻，隨即將之放入 42℃水浴槽中 45 秒，再置於冰 上 3 分鐘以上。. (Ⅲ). 將已轉型完成的勝任細胞以 L 型玻璃棒均勻塗在含有 Ampicillin（50 μg/mL）以及 ITPG（200 μg/mL）和 X-gal（20 μg/mL）的培養基上，靜置於 37℃培養箱中 12-16 小時。. c. 菌落（colony）聚合脢連鎖反應 (Ⅰ). 將培養基上的菌落進行藍白挑選，用牙籤挑起轉型成功的白 色菌落（藍色的菌落代表沒有轉型成功） ，放入已準備好的 聚合脢連鎖反應混合溶液中，混合液的配方如下：10X PCR buffer，2 μM dNTP mixture，10 uM M13F/M13R primers， VioTag DNA polymerase。. (4). (Ⅱ). 聚合脢連鎖反應反應條件同前. (Ⅲ). 菌落聚合脢連鎖反應結果檢測方法同前. DNA 定序： 將聚合脢連鎖反應產物或是菌落 PCR 檢測有轉型成功且接合成功 的菌落送交基隆米克斯生物科技股份有限公司（Taipei, Taiwan）以 ABI3730 DNA 自動定序儀（DNA automated sequencer）進行定序。. 15.
(25) (5). DNA 的序列整理及分析： 將定序所得到的檔案以Sequencher 4.5（GeneCodes）進行人工判 讀。再用BioEdit 7.0.5（Hall, 1999）將所有的序列比對並進行多重序列 排序（multiple sequence Alignment）。由於RPB2-i序列有之部分個體有 兩段插入或刪除（indel） ，其中一段為13 bp，另一段為25 bp，將這些位 點視為一次演化事件，因此在做最大簡約性親緣關係樹（maximun parsimony tree：MP tree）前，利用人為方式將有插入或刪除的部分進 行刪除。. (6) 親緣關係樹的建立： 使用 MEGA 3 軟體（Kumar et al., 2004），設定 Kimura’s（1980） two-parameter model以及pairwise deletion建構鄰近連接法分析樹 （neighbor joining tree：NJ tree） ，樹型分枝的信賴程度（bootstrap）以 預設值1000次特徵重取進行評估。利用PAUP* 4.0b軟體（Swofford, 1998）建構最大簡約性親緣關係樹，將空格（gap）設成new state，利 用誘導式搜尋（heuristic search），進行100次重複的random stepwise addtion找尋，所得樹型圖每個分枝的的信賴程度以100次特徵重取進行 ，以log似然性 評估。另外再利用modeltest 3.7（Posada & Crandall 1998） （likelihood）邏輯選取適合的模式，所選出為HKY+G模型，gamma的 K值為5，gamma distribution α值為0.015，以此參數利用mrbayes 3.1.2 （Ronquist & Huelsenbeck, 2003）進行貝葉氏導出式分析（Bayesian inference analysis）方式建立樹型圖的建立並計算事後機率（posterior distribution） 。 (7) 遺傳歧異度計算 以 RPB2-i 內含子 2 序列所做出的親緣關係圖為依據，使用 DnaSP4.0(Rozas et al., 2003)將樣品歸群後，計算族群單型歧異度 （haplotype diversity） 、核甘酸歧異度（nucleotide diversity）、族群分化 指數 theta（θ）值，族群間的固定差距（fix differences）。 16.
(26) (8) 分化和共祖時間計算 物種分化時間以t = 2N = θ/2μ公式計算。t代表物種的分化時間，N 為有效族群數（effective population size） ，θ為遺傳分化指數參數，代表 一個世代（generation）中的平均突變數量的兩倍，μ代表一個世代一位 點的平均突變數量，核基因平均值為2.815ｘ10-8（曾發表的值範 圍:3.3ｘ10-9 ~5.3ｘ10-8）（Provan et al., 1999）。 Coalescence（溯祖）的原理是利用現有的序列資料，建立基因 genealogy 譜系圖，回溯族群共祖的時間點（TMRCA: Time to the Most Recent Common Ancestor）。共祖時間的計算使用 BEAST v.1.4.6 軟體 (Drummond & Rambaut, 2007)，對不同歸群的物種利用溯祖概念以及貝 葉氏(bayesian)事後機率統計方式，推測不同類群的共祖時間點。使用 modeltest 3.7（Posada & Crandall 1998）所選出的參數：HKY+G 模型， gamma 種類數目 K 值為 5，嚴格的分子鐘（strict molecular clock）之平 均取代速率（substitution rate）設為 2.815*10-8，Markov chain Monte Carlo (MCMC) chain 設定為一千萬次，整個過程重複兩次。兩次的結果以 Tracer v1.4 (Drummond & Rambaut, 2007)軟體進行組合以及讀取。. 17.
(27) 四、結果 （一）親緣關係樹建立 葉綠體 DNA 片段 trnK-matK 兩段內含子合併的單型見附錄二、三，RPB2-i 內含子 2 序列原始矩陣見附錄四，依據不同序列所建構的親緣關係樹型圖的結果 分別如下：. 1.. 葉綠體 matK 和 trnK 內含子片段所建構的親緣關係結果 葉綠體基因 matK 和 trnK 內含子片段所使用的樣本數共 34 個個體（表三、. 表四） ，其中內群有 25 個個體，兩段內含子合併，序列排序後的總長度為 1462 bp， 具有簡約意義資料的位點（parsimony informative site）有 20 個位點，singleton 有 9 個位點，內外群物種所使用的樣品資料詳見表三和表四。以鄰近連接法方式 所建構的親緣關係樹，此組杜鵑可分為三大群（圖四）：與外群親緣關係較接近 的為 R. oldhamii，接下來又再分為兩群，第一群包含 R. simsii、R. nakaharai、 R. longiperulatum、R. noriakianum 和 R. kanehirai，第二群（信賴程度值為 87） 包含 R. taiwanalpinum、R. breviperulatum、R. lasiostylum 和 R. rubropilosum。 三群之間僅有四個具有簡約意義資料的位點，分別在 171、370、1219、1376 四個位點（附錄一)，表示此十種杜鵑花在葉綠體基因 matK 和 trnK 內含子片段 上的差異很小。雖然變異小，但卻可以很清楚的將此組杜鵑花分為上述支持度中 等以上的的三群，群間有明顯的界線，群內無種間差異。. 18.
(28) 表三.. 台灣映山紅組杜鵑花以及 R. tashiroi 之分子資料結果。分子資料結果包 含葉綠體 DNA 所採用之樣本，RPB2-i 內含子 2 序列的殖株數目以及 nrITS 的多型性位點數目。. 物種. R. simsii 唐杜鵑 R. nakaharai 中原氏杜鵑. R. longiperulatum 大屯杜鵑 R. kanehirai 烏來杜鵑 R. oldhamii 金毛杜鵑. R. noriakianum 細葉杜鵑. R. rubropilosum 紅毛杜鵑. R. breviperulatum 南澳杜鵑. R. lasiostylum 埔里杜鵑 R. taiwanalpinum 台灣高山杜鵑. R. taishiroi 大武杜鵑. 樣本編號. R. sim 74 R. sim 76 R. nak 170 R. nak 171 R. nak 183 R. nak 187 R. nak 328 R. nak 377 R. nak 391 R. lon 312 R. lon 317 R. kan 117 R. kan 118 R. old 20 R. old 86 R. old163 R. old 337 R. nor130 R. nor 141 R. nor 239 R. nor 240 R. rub 137 R. rub 180 R. rub 232 R. rub 258 R. rub 265 R. bre 123 R. bre 124 R. bre 129 R. bre 175 R. bre g7 R. las 445 R. tai 164 R. tai 246 R. tai 360 R. tai 405 R. tai 415. 葉綠體 DNA. ITS 多型. RPB2 個體內. 使用的樣本. 性位點數. haplotype 數. ˇ ˇ ˇ. 0 0 0 0. 4 2 3 3 2 4 2 2 3 3 2 2 2 1 1 1 1 3 2 3 2 3 3 2 1 3 1 2 1 4 2 2 2 1 2 2 2. ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ. ˇ ˇ ˇ ˇ. ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ 19. 0 0 1 0 0 0 3 0 0 2 1 4 0 0 3 3 2 1 3 1 2 1 4 2 2 2 1 2 2.
(29) 表四.. 本研究使用之外群之分子資料結果。包含葉綠體 DNA 所採用之樣本以 及 nrITS 的多型性位點數目. 物種. 樣本編號. 葉綠體 DNA. ITS 多型性位點數. 使用的樣本 R. formosanum 台灣杜鵑. R. rubropunctum 紅星杜鵑. R. morii 森氏杜鵑 R. pseudochrysanthum 玉山杜鵑 R. hyperythrum 南湖杜鵑 R. mariesii 守城滿山紅 R. ellipticum 西施花 R. chilanshanense 棲蘭山杜鵑. R. for S1 R. for GW1 R. for F1 R. rubp R1 R. rubp R2 R. rubp R3 R. mor 40 R. pse 167 R. hyp 356 R. mar 172 R. ell W1 R. chi 11. 20. ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ. 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 2.
(30) R. tai 164 R. tai 246 R. tai 360 R. bre 123 R. bre 175 R. las 445 R. rub 180 R. rub 258 R. rub 265 R. sim 74 R. sim 76 R. nak 170 R. nak 328 R. lon 312 R. lon 317 R. nor 239 R. nor 141 R. kan 117 R. kan 118 R. nak 377 R. old 20 R. old 163 R. old 337 R. tas 405 R. tas 415 R. mar 172 R. ell 1 R. for GW1 R. for S1 R. rubp R2 R. hyp 356 R. mor 40 R. rubp R1 R. pse 167. R. nakaharai (R.nak) R. longiperulatum (R.lon) R. simsii (R.sim) R. noriakianum (R.nor) R. oldhamii (R.old) R. kanehirai (R.kan) R. breviperulatum (R.bre) R. lasiostylum R. taiwanalpinum (R.tai) R. rubropilosum (R.rub). 圖四.. 葉綠體 DNA matK 和 trnK intron 片段以 Neighboring joining 建構之樹型 圖。 分支的數字代表 bootstrap 值，樣品編號以學名簡寫加上編號表示。 右下角為不同物種所標示的標記。主要分為三大群，與外群親緣關係較 接近的為 R. oldhamii，接下來又再分為兩群，第一群包含 R. simsii、 R. nakaharai、R. longiperulatum、R. noriakianum 和 R. kanehirai，第二群 包含 R. taiwanalpinum、R. breviperulatum、R. lasiostylum 和 R. rubropilosum。 21.
(31) 2.. nrITS 片段所建構的親緣關係結果 nrITS 片段所使用的樣本數共 46 個個體，其中內群有 34 個個體，序列排序. 後的總長度為 681 bp，個體內多型性位點數目見表三、表四，所有樣本的變異位 點見表五。以 Sequencher 4.5 軟體將所有個體的序列同時進行多型性判讀，多型 性的峰（peak）小於主要的峰三分之一以下者以 N 做編碼（coding），而有兩個 一樣高的峰之多型性位點以 IUPAC 標準方式做編碼，判定標準以圖五為例。 R. rubropilosum 在第 44 與第 364 的位點有多型性（R），而 R. noriakianumm 與 R. taiwanalpinum 在此兩位點少數個體也有多型性，但不明顯；此外，R. norikianum 與 R. taiwanlpinum、R. breviperulatum 和 R. lasiostylum 在第 122 位點有相同的多 型性，R. rubropilosum 則沒有（表五）。 若將編碼為 N 的位點以較保守的方式重新做編碼，以圖五為例，將 R. norikianum 141 個體第 44 位點的 N 改編碼成峰較高的 A，以此類推，將序列 的 N 都以較保守的方式改變後，做 ITS 的親緣關係樹（圖六） ；仿此，將 N 以多 型性的方式重新編碼，同樣以圖五為例，將 R. norikianum 141 個體第 44 位點的 N 改編碼成 R，得到的親緣關係樹如圖七。不論以哪種方式編碼所做出的親緣關 係樹，都顯示台灣映山紅组杜鵑花為支持度很高的類群（信賴程度值為 100）， 但組內無種間差異。. 22.
(32) 表五:. ITS 在台灣映山紅組杜鵑中有變異的位點。R. rubropilosum 在第 44 與第 364 的位點有多型性，而 R. noriakianum 與 R. taiwanalpinum 在此兩位點 少數個體也有多型性，但不明顯。. sample. 17. 44. 62. 86. 107. 122. 137. 171. 364. 423. 430. 439. 467. 511. 545. 580. R. old 86. C. A. A. A. A. T. C. G. G. G. G. C. C. C. T. T. R. old20. -. -. -. -. -. -. -. R. -. -. -. -. Y. -. Y. -. R. old163. -. -. -. -. -. -. -. -. A. -. -. -. -. -. C. -. R. old337. -. -. -. -. -. -. -. N. Y. -. C. -. R. kan 117. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. kan 118. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. sim 74. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. sim 76. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. nak 170. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. R. nak 171. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. R. nak328. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. R. nak187. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. R. nak377. -. -. -. -. -. -. Y. -. -. -. -. -. -. Y. C. -. R. lon 312. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. R. nor 130. -. -. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. nor 141. -. N. -. -. -. W. -. -. R. -. -. -. -. -. C. -. R. nor 239. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. nor 240. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. rub 137. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. rub 232. -. R. -. -. -. -. -. -. R. -. -. -. -. -. C. -. R. rub 258. -. R. -. -. -. -. -. -. R. -. -. -. -. -. C. -. R. rub 265. -. R. -. -. -. -. -. -. R. -. -. -. -. -. C. -. R. rub 180. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. tai 246. -. N. -. -. -. -. -. -. R. -. -. -. -. -. C. -. R. tai 164. -. N. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. tai 360. -. -. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. bre 175. -. -. -. -. -. N. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. bre 129. -. -. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. bre 123. -. -. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. bre 124. -. -. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. bre g7. -. -. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. las 445. -. -. -. -. -. W. -. -. -. -. -. -. -. -. C. -. R. tas 405. T. -. G. -. G. -. -. -. A. T. C. T. -. -. C. C. R. tas 415. T. -. G. -. G. -. -. -. A. T. C. T. -. -. C. C. 23.
(33) R. rubropilosum 141：N ITS5P. ITS8P. R. rubropilosum 232：R ITS5P. ITS8P. 圖五.. ITS 多型性判定標準。以 R. noriakianum 141 以及 R. rubropilosum 232 為例， 多型性位點以箭號標示，ITS5P 和 ITS8P 分別代表兩端定序的波形圖。多型 性的峰小於主要的峰三分之一以下者以 N 做編碼，兩個一樣高的峰之多型性 位點以 IUPAC 標準方式做編碼。. 24.
(34) R.mariesii R. mar 172172. 99. R.chilanshanense 11 R. chi 11 R.tashiroi R. tas 405405. 69. R.tashiroi R. tas 415415. R. old 20 20 R.oldhamii R. old 86 86 R.oldhamii R. old 163 163 R.oldhamii R. old 337 337 R.oldhamii R. kan 117 117 R.kaneharai R. kan 118 118 R.kaneharai R. sim 74 R.simsii 74 R. sim 76 R.simsii 76 R. nak 170 170 R.nakaharai R. nak 171 171 R.nakaharai R. nak 328 328 R.nakanharai R.nakaharai R. nak 187 187 R.nakaharai R. nak 377 377 R.longiperulatum 312 R. lon 312 R.noriakianum 130 R. nor 130. 100. R.noriakianum 141 R. nor 141 R.noriakianum 239 R. nor 239 R.noriakianum 240 R. nor 240 R.rubropilosum 137 R. rub 137 R.rubropilosum 232 R. rub 232 R.rubropilosum 258 R. rub 258 R.rubropilosum 265 R. rub 265 R.rubropilosum 180 R. rub 180 R.taiwanalpinum 246 R. tai 246 R.taiwanalpinum 164 R. tai 164 R.taiwanalpinum 360 R. tai 360 R.breviperulatum 175 R. bre 175 R.breviperulatum 129 R. bre 129 R.breviperulatum 445 R. bre 123 R.breviperulatum 123 R. bre 124 R.breviperulatum 124 R. bre g7 R.breviperulatum g7 R. las 445 R.ellipticum R. ell W1 W1. 92. 94. R.formosanum S1 R. for S1 R.formosanum GW1 R. for GW1 R.formosanum F1 R. for F1 R.rubropuntum R1 R. rubp R1. 100. R.rubropuntum R2 R. rubp R2. 85. R.rubropuntum R3 R. rubp R3 R.morii R. mor 40 R.pseudochrysanthum 167 R. pse 167 R.hyperythrum 356 R. hyp 356. 圖六.. 台灣映山紅組杜鵑花 nrITS 序列以保守方式編碼所建構之 MP tree。 分支的數字代表 bootstrap 值，樣品編號為學名加上作者編號。 CI=0.946，RI=0.989。 25.
(35) R.mariesii R. mar 172172. 98. R.chilanshanense 11 R. chi 11 R.tashiroi R. tas 405405. 66. R.tashiroi R. tas 415415 R.oldhamii R. old 163 163 R.oldhamii R. old 20 20 R.oldhamii R. old 337 337 R.kaneharai R. kan 117 117 R.kaneharai R. kan 118 118 R.simsii R. sim 7474 R.simsii R. sim 7676. 100. R.nakaharai R. nak 377 377 R.noriakianum 130 R. nor 130 R.noriakianum 141 R. nor 141 R.noriakianum 239 R. nor 239 R.noriakianum 240 R. nor 240 R.rubropilosum 137 R. rub 137 R.rubropilosum 232 R. rub 232 R.rubropilosum 258 R. rub 258 R.rubropilosum 265 R. rub 265 R.rubropilosum 180 R. rub 180 R.taiwanalpinum 246 R. tai 246 R.taiwanalpinum 164 R. tai 164 R.taiwanalpinum 360 R. tai 360 R.breviperulatum 175 R. bre 175 R.breviperulatum 129 R. bre 129 R.breviperulatum 445 R. las 445 R.breviperulatum 123 R. bre 123 R.breviperulatum 124 R. bre 124 R.breviperulatum g7 R. bre g7 R.oldhamii R. old 86 86 R.nakaharai R. nak 170 170. 51. R.nakaharai R. nak 171 171 R.nakanharai R. nak 328 328 R.nakaharai R. nak 187 187 R.longiperulatum 312 R. lon 312 R.ellipticum R. ell W1 W1. 93. 93. R.formosanum S1 R. for S1 R.formosanum GW1 R. for GW1 R.formosanum F1 R. for F1 R.rubropuntum R1 R. rubp R1. 100. R.rubropuntum R2 R. rubp R2. 90. R.rubropuntum R3 R. rubp R3 R.morii R. mor 40 R.pseudochrysanthum 167 R. pse 167 R.hyperythrum 356 R. hyp 356. 圖七.. 台灣映山紅組杜鵑花 nrITS 序列以多型性方式編碼所建構之 MP tree。 分支的數字代表 bootstrap 值，樣品編號為學名加上作者編號。 CI=0.978，RI=0.993。 26.
(36) 3.. 核基因 RPB2-i 內含子 2 片段所建構的親緣關係結果 核基因 RPB2-i 內含子 2 片段的聚合脢連鎖反應產物經由定序後，多型性位. 點有兩個以上的序列則再進行選殖，每個個體選殖後，取 5-10 個接和成功的菌 落送定序。排序後的總長度為 622 bp，經由選殖後所得到的序列的 singleton 有 16 個位點，具有簡約意義資料的位點有 45 個位點，所使用的樣品資料以及殖株 （clones）數目詳見表三。除了 R. oldhamii 的序列沒有多型性現象之外，其他物 種皆有多型性，R. kanehirai、R. taiwanalpinumu 和 R. tashiroi 樣品中，同一個體 有一至兩型的殖株；R. simsii、R. longiperulatum、R. nakaharai、R. noriakianum、 R. rubropilosum、R. breviperulatum 和 R. lasiostylum，同一個體有一至四型的殖株 （表三） 。鄰近連接法分析（圖八） 、貝葉氏導出式分析（圖九）和最大簡約性（圖 十）三種方式所建構的基因樹所顯示的物種歸群狀態以及各分支的支持度很一 致，因此之後僅拿鄰近連接法分析樹型圖做之後的結果呈現以及討論。 RPB2-i 內含子 2 片段可以將物種大致歸類為兩大群和一大類型，第一群（信 賴程度值為 75）包含 R. simsii、R. longiperulatum、R. nakaharai、R. noriakianum、 R. kanehirai 和 R. oldhamii；第二群（信賴程度值為 53）包含 R. taiwanalpinum、 R. breviperulatum 和 R. lasiostylum；而另一大類型僅有 R. rubropilosum，相同個 體內不同殖株的序列會分別歸在第一群和第二群中，且 R. rubropilosum 的殖株散 落在不同的物種的分化支（clade）內。 （圖八）。 此外，在 RPB2-i 內含子 2 序列中有幾個個體有例外的情況出現（圖八）。 R. noriakianum 239 個體應屬於第一群物種，但其中的 R.nor 239_5 殖株卻與第二 群物種歸群在一起（星號） ，R. breviperulatum 123 個體應屬於第二群物種，但卻 與第一群物種歸群在一起（星號） ，R. taiwanalpinum 164 個體應屬於第二群物種， 但 R.tai 164_15 殖株卻歸群在第一群和第二群物種之外（星號），這些例外個體 會在討論中做更深入的探討。. 27.
(37) R.nak 170-10 R.nak 187-5 5 8 R.nak 183-12 R.nak 187-2 71 R.nor 141-3 R.nak 171-2 30 R.nak 170-2 51 R.nak 171-3 40 R.nak 187-6 R.nak 170-1 R.nak 171-11 43 R.nak 377-2 R.nor 130-3 R.nor 141-10 R.nak 187-4 R.nor 130-4 6 7 R.nor 130-5 R.nor 239-8 22 R.nor 240-2 R.lon 317-3 R.nak 391-12 6 5 R.lon 317-1 R.nor 240-1 25 R.sim 74-10 R.sim 74-2 58 R.sim 76-2 26 R.nak 183-3 R.nak 328-2 R.nor 239-4 11 R.rub 180-9 13 3 7 R.rub 137-3 R.nak 328-10 R.nak 391-11 R.nak 391-5 77 R.lon 312-3 67 R.lon 312-9 24 R.nak 377-3 95 R.rub 180-6 R.rub 265-20 R.rub 258 2 2 R.kan 117-8 R.kan 118-6 9 8 R.sim 74-7 7 R.sim 76-7 44 R.sim 74-4 74 R.old 337 63 R.kan 117-1 23 R.kan 118-7 R.bre 123 2 9 R.old 163 R.rub 137-5 49 28 R.old 86 R.old 20 R.lon 312-2 R.rub 265-2 R.nor 239-5 91 R.bre 445-4 26 R.bre 445-5 R.rub 265-11 55 5 8 R.bre 175-3 67 R.bre 175-1 25 R.bre 175-31 48 63 R.bre 124-6 R.rub 232-3 R.rub 137-1 67 R.bre 129 4 4 R.bre 124-9 3 3 R.bre g7-1 10 R.rub 180-10 88 R.rub 232-1 8 20 R.tai 360-6 19 R.bre 175-2 R.bre g7-2 14 R.tai 246 65 R.tai 164-7 R.tai 360-4 R.tai 164-15 R.tas 405-1 R.tas 405-8 99. R. nakaharai (R.nak) R. longiperulatum (R.lon) R. simsii (R.sim) R. noriakianum (R.nor) R. oldhamii (R.old) R. kanehirai (R.kan) R. breviperulatum (R.bre) R. lasiostylum R. taiwanalpinum (R.tai) R. rubropilosum (R.rub). 0.005. 圖八.. 核 RPB2-i 內含子 2 基因以 Neighboring joining 建構之樹型圖。 分支的數字代表 bootstrap 值，樣品編號以學名簡寫加上作者編號 及其殖株編號。此片段可以將物種大致歸類為兩大群和一大類型，分 別以不同符號標示（右下角圖示） 。除了 R. oldhamii 同一個體內的 RPB2-i 基因為單型外，其他所有物種的同一個體內的殖株都包含兩型至四型。 R.nor 239-5 殖株、R.bre 123 個體以及 R.tai164-1 殖株為例外的樣品。 28.
(38) R. tas 405-1 R.tas 405 1 R.tas 405 8 R. tas 405-8. 1.00 1.00. R. tai 164-15 R.tai 164 15 R. old 20 R.old 20 R. old 86 R.old 86 R. old 163 R.old 163 R. old 337 R.old 337 R. nak 328-10 R.nak 328 10 R. lon 312-2 R.lon 312 2 R. rub 265-2 R.rub 265 2 R. rub 137-5 R.rub 137 5 R.bre 123 R. bre 123 R. kan117-8 R.kan 117 8 R. kan118-6 R.kan 118 6 1.00 1.00 R.sim R. sim 74-4 74 4 R.sim 74 7 R. sim 74-7 R. sim 76-7 R.sim 76 7 0.67 R. kan117-1 R.kan 117 1 0.67 R. kan118-7 R.kan 118 7 R. nak 170-1 R.nak 170 1 R. nak 171-3 R.nak 171 3 R. nak 171-11 R.nak 171 11 R. nak 183-3 R.nak 183 3 R. nak 187-4 R.nak 187 4 R. nak 187-6 R.nak 187 6 R. nak 328-2 R.nak 328 2 R. nak 377-2 R.nak 377 2 R.lon 317 3 R. lon 317-3 0.95 R.nor 239 4 R. nor 239-4 0.95 R. nor 239-8 R.nor 239 8 R.nor 141 10 R. nor 141-10 R.nor R. nor 240-1 240 1 R. nor 240-2 R.nor 240 2 R. R.nor nor 130-3 130 3 0.61 0.61 R.rub 180 9 R. rub 180-9 R.rub 137 3 R. rub 137-3 R. sim 74-2 R.sim 74 2 0.89 0.89 R. sim 74-10 R.sim 74 10 R. sim 76-2 R.sim 76 2 R. nak 170-2 R.nak 170 12 R. nak 170-10 R.nak 170 10 R. nak 171-2 R.nak 171 2 1.00 1.00 R. nak 183-12 R.nak 183 12 R. nak 187-5 R.nak 187 5 R. nak 187-2 R.nak 187 2 R. nor 141-3 R.nor 141 3 0.64 R. nak 391-12 R.nak 391 12 0.64 R. lon 317-1 R.lon 317 1 0.61 R. nor 130-4 R.nor 130 4 0.61 R. nor 130-5 R.nor 130 5 0.94 R. nak 391-11 R.nak 391 11 0.94 R. nak 391-5 R.nak 391 5 R.rub R.rub180-6 180 6 R. rub 265-20 R.rub 265 20 0.76 rub 258 0.76 R. R.rub 258 R. nak 377-3 R.nak 377 3 0.87 0.87 R. lon 312-3 R.lon 312 3 R. lon 312-9 R.lon 312 9 R. rub 180-10 R.rub 180 10 R. rub 265-11 R.rub 265 11 R. rub 137-1 R.rub 137 1 R. bre 175-2 R.bre 175 2 R. bre 129 R.bre 129 R. bre g7-1 R.bre g7 1 R. bre 124-9 R.bre 124 9 R. nor 239-5 R.nor 239 5 0.59 0.59 0.88 R. las 445-4 R.bre 445 4 0.95 0.88 R. las 445-5 R.bre 445 5 0.95 R. rub 232-3 R.rub 232 3 R. bre 175-3 R.bre 175 3 0.66 0.66 R. bre 124-6 R.bre 124 6 R. bre 175-31 0.64 R.bre 175 31 0.64 R. bre 175-1 R.bre 175 1 1.00 R. rub 232-1 R.rub 232 1 1.00 R. tai 360-6 R.tai 360 6 R.tai R. tai 246 246 9 0.92 R.tai 164 7 0.92 R. tai 164-7 R.tai 360 4 R. tai 360-4 R.bre g7 2 R. bre g7-2. R. longiperulatum (R.lon) R. simsii (R.sim) R. noriakianum (R.nor) R. oldhamii (R.old) R. kanehirai (R.kan) R. breviperulatum (R.bre) R. lasiostylum R. taiwanalpinum (R.tai) R. rubropilosum (R.rub). 0.1. 圖九:. R. nakaharai (R.nak). 核 RPB2-i 內含子 2 基因以 Bayesian inference 方式建構之樹型圖。 分支的數字代表 bootstrap 值，樣品編號以學名簡寫加上作者編號 及其殖株編號。此片段可以將物種大致歸類為兩大群和一大類型，分 別以不同符號標示（右下角圖示） 。除了 R. oldhamii 同一個體內的 RPB2-i 基因為單型外，其他所有物種的同一個體內的殖株都包含兩型至四型。 R.nor 239-5 clone、R.bre 123 個體以及 R.tai164-15 clone 為例外的樣品。. 29.
(39) R.tashiroi 405-1 R.tashiroi 405-8 R.tai 164-15 R.rub 265-2 R.nak 328-10 R.old 20 R.old 86 R.old 163 R.old 337 R.lon 312-2 R.rub 137-5 R.bre 123 R.kan 117-1 R.kan 118-7 R.kan 117-8 R.kan 118-6. 87. R.sim 74-4 R.sim 74-7 R.sim 76-7 R.rub 180-9 R.rub 137-3 R.nak 183-3 R.nak 187-4. 100. R.nak 328-2 R.lon 317-3 R.nor 239-4 R.nor 239-8 R.nor 141-10 R.nor 240-1 R.nor 240-2 R.nor 130-3. 61. R.sim 74-2 R.sim 74-10 R.sim 76-2. 65. R.nak 170-1 R.nak 171-11 R.nak 377-2 R.nak 171-3 R.nak 187-6 R.nak 170-2 R.nak 170-10 R.nak 171-2 R.nak 183-12 R.nak 187-5. 68. R.nak 187-2 R.nor 141-3. 76 86. R.nak 391-12 R.lon 317-1 R.nor 130-4 R.nor 130-5. 74. R.nak 391-11 R.nak 391-5 R.rub 180-6 R.rub 265-20. 87. R.rub 258. 56. R.nak 377-3. R. nakaharai (R.nak) R. longiperulatum (R.lon) R. simsii (R.sim). R.lon 312-3 R.lon 312-9 R.bre 129. R. noriakianum (R.nor). R.bre g7-1 R.bre 124-9 R.rub 180-10 R.rub 137-1 R.nor 239-5 R.rub 265-11 R.rub 232-3 R.bre 124-6. 58. R.bre 175-31 R.bre 175-3 R.bre 175-1. 83. R.bre 175-2 R.rub 232-1 R.tai 360-6 R.tai 246. 59. R. oldhamii (R.old) R. kanehirai (R.kan) R. breviperulatum (R.bre) R. lasiostylum R. taiwanalpinum (R.tai). R.tai 164-7 R.tai 360-4. 89. R.bre g7-2 R.las 445-4. R. rubropilosum (R.rub). R.las 445-5. 圖十.. 核 RPB2-i 內含子 2 基因以 Maximum parsimony 方式建構之樹型圖。 分支的數字代表 bootstrap 值，樣品編號以學名簡寫加上作者編號 及其殖株編號。此片段可以將物種大致歸類為兩大群和一大類型，分 別以不同符號標示（右下角圖示）。除了 R. oldhamii 同一個體內的 RPB2-i 基因為單型外，其他所有物種的同一個體內的殖株都包含兩型至四型。 R.nor 239-5 clone、R.bre 123 個體以及 R.tai164-15 clone 為例外的樣品。. 30.
(40) （二）遺傳歧異度分析 依據核基因 RPB2-i 內含子 2 片段得到的親緣關係樹，大致將物種分為兩大 群和一大類型(圖八)，第一群包含 R. simsii、R. longiperulatum、R. nakaharai、 R. noriakianum、R. kanehirai 和 R. oldhamii；第二群包含 R. taiwanalpinum、 R. breviperulatum 和 R. lasiostylum；而另一大類型僅有 R. rubropilosum；然而在 葉綠體 DNA trnK-matK 片段所建構的親緣關係樹中（圖四）可以看出 R. oldhamii 與其他九個物種親緣關係較遠，所以不列入遺傳歧異度分析；此外，在 RPB2-i 內 含子 2 片段建構的親緣關係樹型圖中例外個體 R. noriakianum 239、 R. breviperulatum 123 和 R. taiwanalpinum 164 也不納入分析。扣除以上的樣品 後，依據 RPB2-i 內含子 2 基因樹的結果將物種以 A、B、C 三群做區分，A 群 包含 R. simsii、R. nakaharai、R. longiperulatum、R. noriakianum 以及 R. kanehirai 共五個物種，41 條序列；B 群包含 R. breviperulatum、R. lasiostylum 和 R. taiwanalpinum 共兩個物種，14 條序列；C 群僅有 R. rubropilosum 一物種，12 條序列（表六）。 單型歧異度（h） ，A、B 和 C 群分別為 0.951、0.835 及 0.97；核甘酸歧異度 Pi（π） ，A、B 和 C 群分別為 0.00701、0.00346 及 0.00946；族群分化指數 θ（π） ， A、B 和 C 群分別為 0.00708、0.00348 及 0.00958（表六） ，以上結果中 C 群的數 值都明顯的高於 A，B 兩群，表示 C 群內的遺傳歧異度高於 A、B 兩群。族群間 平均每個位點的核酸替換（Dxy）在 A 與 B 之間的值為 0.01369，大於 A 與 C （0.01147）和 B 與 C（0.01034）之間，此外，有 6 個族群間的固定差距在 A 與 B 兩群之間（表六） ，此顯示 A、B 群之間的遺傳距離較遠。. 31.
(41) 表六.. 以 RPB2-i 內含子 2 序列資料為依據的族群遺傳歧異度分析。N=number of sequences，h=number of haplotypes，Hd=haplotype diversity，Pi（π）=nucleotide diversity，θ（π）=θper site from π，Dxy=average number of nuc. Subs. Per site between population， F=number of fixed differences。. group. A. B. R. simsii, R. nakaharai, R. longiperulatum,. R. breviperulatum,. R. noriakianum, R. kanehirai. R. taiwanalpinum. N. 41. 14. 12. h. 21. 6. 10. Hd Pi（π）. 0.951. 0.835. 0.97. 0.00701. 0.00346. 0.00946. θ（π）. 0.00708. 0.00348. 0.00958. species. C. A vs B A vs C B vs C. R. rubropilosum. Dxy. 0.01369. 0.01147. 0.01034. F. 6. 0. 0. 32.
(42) （三）分化和共祖時間計算 承遺傳歧異度所使用的歸群方式，使用 t = 2N = θ/2μ 公式計算之分化時間見 表七。A 群共祖時間平均值為 13 萬年；B 群共祖時間平均值為 6 萬年；C 群共 祖時間平均值為 17 萬年；A 與 B 群合併（AB）的共祖時間平均值為 21 萬；A 與 C 群合併（AC）共祖時間平均值為 16 萬年；B 與 C 群合併（BC）共祖時間 平均值為 15 萬年；A、B 與 C 群合併（ABC）共祖時間平均值為 21 萬年；A 與 C 類群（僅有在 RPB2-i 內含子 2 基因樹型圖中與 A 類群歸在一起的序列：AC(A)） 合併共祖時間平均值為 12 萬年；B 與 C 群（僅有在 RPB2-i 內含子 2 基因樹型圖 中與 B 類群歸在一起的序列：BC(B)合併共祖時間平均值為 7 萬年 此外，使用貝葉氏導出式分析方式所算出的共祖時間平均值和中間值見表 七，A 群共祖時間平均值為 17 萬年，中間值為 16 萬年；B 群共祖時間平均值為 10 萬年，中間值為 7 萬年；C 群共祖時間平均值為 23 萬年，中間值為 22 萬年； AB 共祖時間平均值為 36 萬年，中間值為 35 萬年；AC 共祖時間平均值為 29 萬 年，中間值為 28 萬年；BC 共祖時間平均值為 24 萬年，中間值為 24 萬年；ABC 類群共祖時間平均值為 33 萬年，中間值為 32 萬年；AC(A)共祖時間平均值為 17 萬年，中間值為 16 萬年；BC(B)共祖時間平均值為 10 萬年，中間值為 16 萬年。 以上兩種方式算出的共祖時間一致，AB 共祖時間大於 AC 或 BC，AB 共祖 時間大於 AC(A)或 BC(B)。由於平均值容易受到極端值的影響，所以在之後的討論 部分以貝葉氏導出式分析方式所算出的中間值做探討。. 33.
(43) 表七.. 以 RPB2-i intron 2 序列資料為依據的共祖時間估計。T：以 t = 2N = θ/2μ 公式計算之分化時間（範圍），Tμ：以 Bayesian 式 計算出的平均 TMRCA（95%CI），TM：以 Bayesian inference 方式計算出的 TMRCA 之中間值。單位為千年(KY BP.)。. group. A. B. C. AB. AC. BC. AC(A). BC(B). ABC. T (range). 126. 62. 170. 210. 156. 149. 121. 67. 207. (67-1072). (33-527). (90-1451). (111-1788). (83-1333). (79-1268). (64-1033). (36-571). (110-1765). 171. 95. 232. 359. 290. 243. 170. 100. 329. (77-284). (31-177). (108-371). (194-555). (144-457). (118-389). (78-278). (37-179). (176-503). 163. 86. 224. 350. 280. 235. 161. 93. 319. Tμ (95%CI) TM. 34.
(44) 五、討論 （一）葉綠體 trnK-matK 內含子片段以及核片段 ITS 和 RPB2-i 內含子 2 在映山 紅組杜鵑花的應用比較 1.. nrITS 在台灣映山紅組杜鵑花變異少 nrITS 所建構的親緣關係樹中，台灣映山紅組杜鵑花種間無解析力（圖 六、圖七） ，與 Tsai et al.（2006）研究結果類似，此片段僅能表示此組杜鵑 花有極為相近的親緣關係，因此對本篇研究欲探討台灣映山紅組杜鵑的親緣 關係沒有很大幫助。. 2.. RPB2-i 序列多拷貝現象為 partial gene duplication Luo et al.（2007）研究發現，RPB2-i 基因片段在不同類群中有持續複製 事件發生（(不論是經由多倍體化 polyploidization 或是 partial genome duplication） ，利用親緣關係樹型圖發現，有些類群最後會保留其複製品，有 些類群的複製品則消失，而在杜鵑花科植物以往之研究中，並沒有發現 RPB2-i 基因有複製現象（Luo et al., 2007） 。然而，本研究發現，台灣映山紅 組杜鵑花許多種類都有多拷貝的現象，顯示杜鵑花科植物的複製事件還是持 續發生，此與 Luo et al.（2007）的研究結果不相符合。 表三以及圖八中 RPB2-i 內含子 2 片段，除了 R . oldhamii 以外，其他 物種同一個個體中都有一至四型的單型，顯示此片段在這些物種內至少有兩 套，這兩套的組成可能是因為多倍體化導致整個基因體增加或是僅此片段複 製所造成的，根據現有資料顯示台灣杜鵑花植物的染色體數皆相同（2n=26） （Hsu，1972），因此並不支持多倍體化的可能性，RPB2-i 核基因片段在這 些物種內應是屬於 partial gene duplication。. 35.
(45) 3.. 多拷貝的核基因 RPB2-i 在台灣映山紅組杜鵑花親緣關係探討的優點 葉綠體 DNA 以及 nrITS 片段在親緣關係的探討上應用很廣，但由於葉 綠體基因體大部分為母系遺傳、nrITS 有協同演化，用來探討親緣關係時較 簡單且單純，但若僅使用此兩種類型的片段，無法顯示被子植物核基因體複 雜演化機制的結果，因此會喪失許多親緣關係的資訊（Oxelman et al., 2004） 。Kim et al.（2008）利用核中多拷貝的 LEAFY 基因第二個內含子，發 現 Persicaria 屬（Polygonaceae）有 15 個物種是異源多倍體，比之前只使用 葉綠體和 nrITS 片段還多種，造成 nrITS 低估異源多倍體物種數之因是因為 個體內的 ITS 已經被均質化（homogenize） ，而趨向母本的的序列。 以本篇研究為例，nrITS 在此組杜鵑花種間無解析力，無法幫助解釋台 灣映山紅組杜鵑花的親緣關係，而利用經由 partial gene duplication、多拷貝 的核 RPB-i 片段所建構的基因樹，再配合葉綠體 DNA 片段所建構的親緣關 係樹，比單單只有使用葉綠體 DNA 或 nrITS 片段更可清楚的顯現台灣映山 紅組杜鵑花複雜的親緣關係。因此以下則使用葉綠體 trnK-matK 內含子 片段以及核 RPB2-i 內含子 2 片段對台灣映山紅組杜鵑花親緣關係做探討。. 36.
(46) （二）台灣映山紅組杜鵑花的親緣關係探討 1.. 台灣映山紅組杜鵑花主要分為四群 核 RPB2-i 片段以及葉綠體 DNA 片段都顯示台灣地區的映山紅組杜鵑 種類的差異很小，許多類群之間並無明顯的界限，以葉綠體 DNA 片段建構 之親緣關係樹型圖結果顯示，台灣映山紅組杜鵑花大致可以歸為三大群（圖 四）：與外群親緣關係較接近的為 R. oldhamii；接下來又再分為兩群，第一 群包含 R. simsii、R. nakaharai、R. longiperulatum、R. noriakianum 和 R. kanehirai，第二群包含 R. taiwanalpinum、R. breviperulatum、R. lasiostylum 和 R. rubropilosum；RPB2-i 內含子 2 基因樹顯示的結果則與葉綠體片段所顯 示的結果不盡相同（圖八） ，RPB2-i 內含子 2 主要將台灣映山紅組杜鵑花歸 為兩大群和一大類型：第一群包含 R. simsii、R. longiperulatum、R. nakaharai、 R. noriakianum、R. kanehirai 和 R. oldhamii；第二群包含 R. taiwanalpinum、 R. breviperulatum 和 R. lasiostylum；而另一大類型僅有 R. rubropilosum，相 同個體內不同殖株的序列會分別歸在第一類群和第二類群中，且 R. rubropilosum 的殖株散落在不同的物種內。 綜合以上分子資料結果，台灣映山紅組杜鵑花十個物種大致可以歸為四 大群，第一類群包含的物種有 R. simsii、R. longiperulatum、R. nakaharai、 R. kanehirai 和 R. noriakianum；第二類群包含 R. breviperulatum、 R. lasiostylum 和 R. taiwanalpinum ，第三類群為 R. oldhamii；第四類群為 R. rubropilosum。. 37.
(47) 2.. R. rubropilosum 為雜交起源物種 R. rubropilosum 在 RPB2-i 內含子 2 片段中同時帶有兩大類型的拷貝， 且這些殖株”散落”在兩大群中，各與不同物種歸在一起（圖八），且利用核 基因 RPB2-i 內含子 2 片段計算遺傳歧異度，R. rubropilosum 的遺傳歧異度 也大於其他兩大群物種（表六） ，造成此結果之原因有以下兩種推測（圖十 一）： (1) R. rubropiloslum 帶有 ABC 三大群分化之前的祖先型（即 R. rubropilosum 個體內不同型的的拷貝是在祖先時複製的結果)，而 A，B 兩大群分別 往不同方向分化。 (2). R. rubropilosum 物種可能是在 A，B 兩大群各自分化之前的祖先雜交產 生。 若 R. rubropilosum 是帶有祖先型序列的物種，其葉綠體 DNA 序列. 應該隨機的與 A 群或是 B 群歸在一起（也就是 A 群或是 B 群都可以當母 本），然而在圖四中葉綠體的親緣關係樹型圖中，R. rubropilosum 完全與 B 群的物種歸在一起。此外，若 R. rubropilosum 是帶有祖先型序列的物種，所 計算的 AB 共祖時間應該幾乎等於 AC 或是 BC 的共祖時間，然而在表七中， AB 群的共祖時間（35 萬年）遠大於 AC（28 萬年）或 BC（24 萬年）的共 祖時間。 若 R. rubropilosum 是雜交起源物種，則 AB 的共祖時間（35 萬年）應 大於 AC(A)（16 萬年）或是 BC(B)（9 萬年）的共祖時間，分析結果也符合 此推論（表六）。由以上的推測，R. rubropilosum 為雜交起源物種，且由葉 綠體 DNA 片段建構之親緣關係樹型圖結果得知其母本來自 A 群物種的祖先 （圖四）。根據以上的結果，推測台灣映山紅組杜鵑花親緣關係示意圖（圖 十二）。 承上，依據圖十一中 R. rubropilosum 雜交起源的結果以及討論一中提到 RPB2-i 核基因片段應是屬於 partial gene duplication 的結果，推測 RPB2-i 核 38.
(48) 基因片段發生複製的時間點有以下兩種可能（圖十一），第一：複製發生在 Ａ、Ｂ群分化之前；第二：複製在 A 和 B 群祖先獨自發生。若是第一種狀 況，Ａ、Ｂ群個體內帶有的拷貝狀況應該一致，若是第二種狀況，A 群同個 體內的拷貝會與 A 群其他個體的序列較相近，B 群同個體內的拷貝會與 B 群其他個體的序列較相近。由圖八 RPB2-i 基因樹型圖的結果顯示 A 群個體 內的拷貝大部分皆與 A 群個體歸在一起，B 群個體內的拷貝也大部分皆與 B 群個體歸在一起，因此排除第一種可能性，複製應獨自發生在 A 和 B 群的 祖先。. 39.
(49) (a). (b) 2. A. A. 1. C. C. B. 圖十一.. AB=AC/BC. B. R. breviperulatum R. lasiostylum R. taiwanalpinum. C. R. rubropilosum. B 2. KY BP.. A. R. nakaharai R. longiperulatum R. simsii R. noriakianum R. kanehirai. KY BP.. AB>AC(A)/BC(B). 以 RPB2-i 內含子 2 序列建構之基因樹型圖為基準的 R. rubopilosum 可能之起源示意圖。右為 A、B、C 組分別所包含的物 種，橫軸代表共祖時間，以千年為單位。(a)R. rubropilosum 帶有祖先型序列。(b)R. rubropilosum 為 A 與 B 群的祖先雜交起 源之物種，數字 1 和 2 代表 RPB2-i intron 2 序列發生複製之可能時間點，數字 1 代表複製發生在Ａ、Ｂ群分化之前；數字 2 代表複製在 A 和 B 群祖先獨自發生。. 40.
(50) R. simsii R. longiperulatum R. nakaharai R. kanehirai R. noriakianum R. oldhamii R. rubropilosum R. taiwanalpinum R. lasiostylum R. breviperulatum KY BP... 圖十二.. 350. 163. A. C B. 86. 台灣映山紅組杜鵑花親緣關係示意圖。 横軸代表物種共祖距今時間。R. simsii、R. longiperulatum、 R. nakahara、R. noriakianumi 和 R. kanehirai 為一大群；R. oldhamii 自成一群；R. breviperulatum、R. lasiostylum 和 R. taiwanalpinum 為另 一大群；R. rubropilosum 是由 A 群的杜鵑花和 B 群的杜鵑花祖先雜 交而產生，父本以虛線表示。. 41.
(51) 3.. R. rubropilosum 為同倍體種化（homoploid speciation）的例子 前人研究顯示台灣杜鵑花植物的染色體數皆為2n=26（Hsu，1972）， 因此本研究中的R. rubropilosum是一個同倍體種化的例子。然而同倍體種化 一般來說比異源多倍體種化（alloploidy speciation）發生的機率低很多，主 要是因為異源多倍體種化可藉由多倍體化使子代與親代產生生殖隔離，且使 其在行減數分裂時的染色體配對不會有問題，因此具有生殖力（Rieseberg， 2001），但近幾年的研究發現有許多物種是經由同倍體種化所產生的，而這 些物種可以利用環境產生的隔離或者是染色體重排（chromosomal rearrangement）的方式使其可以建立同倍體的雜交物種（Rieseberg，2001）。 Zhang et al.（2007）利用形態再配合分子證據發現杜鵑花科植物 Rhododendron agastum是同倍體種化起源的物種，Milne et al.（1999）和Milne et al.（2004）利用分子以及形態特徵研究土耳其境內共域的杜鵑花物種雜交 現象，發現其中分佈在Tiryal Daga的雜交種Rhododendron x sochadzeae（R. ponticum x R. caucasicum）也為同倍體。 本研究中R. rubropilosum為另一個同倍體種化的例子，然而是何種特殊 染色體機制以及環境因子造成此雜交種的建立還必須做更進一步的探討。. 42.
(52) （三）R. rubropilosum在nrITS序列與核基因RPB2-i內含子2序列資料多型性現 象不同之可能性 在先前討論的第一點中提到，nrITS 在台灣映山紅組杜鵑花中種間無區別， 對親緣關係的探討沒有幫助，因此本研究在探討親緣關係時無使用 nrITS 的結 果，然而 nrITS 序列中的多型性現象與 RPB2-i 內含子 2 序列所顯現的多型性現 象不盡相同，在此提出來做討論。 RPB2-i 內含子 2 序列資料中，R. rubropilosum 兩種型的拷貝可分別在兩大群 中找到（圖八） ，而 ITS 序列資料中，R. rubropilosum 第 44 與第 364 多型性位點 （R）只有一個型（A）可以在內群中找到（表五） 。這與我們研究之初所預期的， 可以在 ITS 序列資料中看到雜交起源種 R. rubropilosum 會有不同兩親本拷貝的推 測不符合。 ITS 雖然在親緣關係的應用很廣，但有以下的缺點使得當使用 ITS 做親緣關 係探討時，必須將之要考慮進去（Alvarez & Wendel, 2006）。當雜交或是多倍體 化時，個體內同時帶有來自兩親本物種不同的 ITS 片段，當時間不夠長足夠進行 concerted evolution，同個個體內即會有兩個不同型的 ITS 序列，此外，同源或者 非同源的片段之間的重組現象也會混亂 ITS 在親緣關係上的探討（Álvarez et al., 2003）。另有研究指出，雜交個體的 ITS 經由協同演化後，體內的 ITS 序列會往 一方偏移，趨向某一親本種，因此在親緣關係的探討上，即喪失了另一親本種的 資訊（Wendel et al., 1995）。 當所探討的物種沒有雜交或是異源多倍體的情況時，經過同質化的 ITS 序列 可以是很好的材料來探討親緣關係，反之，ITS 則無法顯現複雜的物種關係。反 過來說，當雜交物種的 ITS 保留有兩種型的親本 ITS 序列，則可以幫助我們判定 物種間的起源關係。以上有關 ITS 在親緣關係探討的適用性與 ITS 協同演化事 件是否完全及聚合脢連鎖反應擴增出的產物是否同源有關。 本研究中，R. rubropilosum 為 A 與 B 群的祖先雜交而起源的物種，而 A 或 B 群的祖先在 ITS 序列中帶有何種型的拷貝的情況並不清楚，此外，上述 ITS 在 43.
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