利用SSR 標誌進行番椒雜交種子純度之檢測
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(2) SSR 標誌檢測番椒雜交種子純度. 出 同 質 基 因 型 或 異 質 基 因 型， 特 別 適 合 雜 交 種之鑑定；如簡單重複序列 (simple sequence repeat; SSR) 標誌，因其廣泛分布於生物基因 組 (Condit & Hubbell 1991; Wang et al. 1994; Kumpatla & Mukhopadhyay 2005)，僅需微量 DNA 樣品，且分析方法簡便，目前已應用於 茄 子 (Arun Kumar et al. 2014)、 花 椰 菜 (Ida et al. 2008) 以 及 水 稻 (Komori & Nitta 2004) 等作物的雜交種之遺傳純度鑑定。 番 椒 (Capsicum) 為 茄 科 一 或 多 年 生 果 菜、 香 辛 作 物， 栽 培 面 積 僅 次 於 馬 鈴 薯 和 番 茄。 依 據 2010 年 聯 合 國 糧 農 組 織 (Food and Agriculture Organization of the United Nations; FAO) 生 產 年 報 統 計， 全 世 界 番 椒 栽 培 面 積 為 185 萬 公 頃， 亞 洲 地 區 約 占 總 生 產 面 積 60% 以上。依 2011 年台灣農業年報統計， 國內栽培面積 2,087 ha，為重要經濟蔬菜，其 中 彩 色 甜 椒 (Capsicum annuum) 富 含 花 青 素 與 胡 蘿 蔔 素 等， 是 高 營 養、 高 產 值 的 蔬 菜 新 寵。目前彩椒商業品種幾乎全為一代雜交種， 並以亞洲地區為重要採種據點。番椒為高價採 種作物，其 F 1 種子售價偏高 (約新台幣 10 元 /粒)。商業生產雜交種子常利用雄不稔親本或 以人工去雄後進行雜交授粉；鑑於雄不稔基因 的不穩定或人工去雄未盡完善，時而導致採種 純度下降；故需進行雜交種子遺傳純度檢定， 避免母本自交種子汙染，已成為 F1 種子生產 上必要之品管工作。本研究針對亞洲地區重要 採種作物─番椒一代雜交種之純度檢測，擬建 立精確、簡便的 DNA 鑑定平台，篩選共顯性 的 SSR 分 子 標 誌， 提 供 種 苗 業 界 進 行 親 本 暨 F 1 品 種 純 度 之 快 速 檢 測。 建 立 之 核 心 SSR 分 子標誌或 DNA 檢定流程，期透過產學合作將 相關技術轉移至種苗業者，以提升台灣採種產 業在國際市場之競爭力。. 材料與方法 植物材料與 DNA 萃取 由中興大學園藝系提供與亞蔬合作選育 的 彩 色 甜 椒 (Capsicum annuum) F 1 品 種「興 亞 3 號」(‘CA3’) 標 準 品 1 個， 包 含 父 本 (♂). 407. 1 個、 母 本 (♀) 3 個 重 複 性 樣 品； 另 由 一 個 商 業採種公司提供 F1 品種 ‘360’ 之標準品 1 個， 以及父本、母本各 1 個樣品。以上 2 個雜交組 合，計 8 個樣品之葉片，參考 Iqbal et al. (1995) 方 法 進 行 genomic DNA 萃 取， 提 取 之 DNA 經 NANODROP 1000 (Thermo Scientific) 定量， 以 OD260/OD280 值 1.7–1.9 作 為 PCR (polymerase chain reaction) 分析用樣品；DNA 濃度稀釋為 25 ng μL -1，提供多型性 SSR marker 之篩選。 另 由 出 口 採 種 業 者 提 供 3 個 待 檢 測 F1 種 子純度的雜交組合 No. 5、No. 6、No. 7 一批， 包 含 父 本 (5P、6P、7P)、 母 本 (5M、6M、 7M) 等， 各 品 系 約 150 粒 種 子， 進 行 高 訊 息 SSR 分 子 標 誌 (informative SSR markers) 之 量化測試。3 組待測試的雜交組合種子依組合 分 批 次 播 種， 於 幼 苗 期 採 嫩 葉 進 行 genomic DNA 萃 取， 萃 取 方 法 同 於 Iqbal et al. (1995) 之 DNA 萃取流程。. SSR 分子標誌分析 進 行 番 椒 雜 交 種 SSR-PCR 分 析 的 374 組 SSR 引子序列資料，參考自前人文獻 (Lee et al. 2004; Minamiyama et al. 2006; Yi et al. 2006; Minamiyama et al. 2007; Portis et al. 2007; Lee et al. 2009; Ince et al. 2010)，部 分 訊 息 則 由 世 界 蔬 菜 中 心 AVRDC 的 分 子 遺 傳 系 Dr. Roland 提 供 (引 子 編 號 為 AVRDCPP1–PP101)。 以 上 引 子 由 日 本 Invitrogen 公 司 合 成。PCR 分 析 之 反 應 液 體 積 為 25 μL： 包 含 DNA 50 ng、1U Taq polymerase (HOT FIRE, Solis BioDyne)、1× PCR buffer、2.0 mM MgCl 2、200 μM dNTP 及 引 子 0.4 μM， 反 應 引 子 為 上 述 374 組 SSR 引 子， 進 行 多 型 性 SSR 標 誌 之 篩 選。 聚 合 酵 素 連 鎖 反 應 儀 器 為 Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler 9700， 反 應 溫 度 設 定 為：95℃ 12 min； 接 續 95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min 30 s，35 個 循 環；最後 72℃ 8 min；反應完成後保持於 4℃。 PCR 產物取 10 μL 加入 6× 電泳追蹤染劑 (6× loading buffer: 0.25% bromophenol blue, xylene cyanol; 40% w/v sucrose)，以 6% 聚丙醯 胺膠體電泳 (polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)，電泳緩衝液為 0.5× TBE buffer (40.
(3) 408. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. mM Tris acetate, pH 8.0; 1 mM EDTA)；電 泳 槽 為 MGV-202-33C (C. B. S. Scientific)， 電 壓 設 定 100 V， 電 泳 時 間 約 100 min。 完 成 電 泳 之 膠 體 以 1 µg mL -1 ethidium bromide 染 色； 再 於 UV 下 檢 視 膠 體 上 多 型 性 之 等 位 基 因 (alleles) 片 段， 並 照 相、 貯 存 影 像 於 IS 2000 Digital Imaging System (Alpha Innotech Corporation) 系 統。 反 應 產 物 以 Gen 50 DNA ladder (GeneMark Technology Co., Taiwan) 計 算各等位基因片段大小。. 高 訊 息 SSR 標 誌 (informative SSR markers) 與 F1 種子純度之鑑定 依 據 2 個 雜 交 種 組 合 (‘360’、‘CA3’) 篩 選 374 組 SSR 引子的 PCR 分析結果，搜尋在 父、母本與 F 1 間具有共顯性 (co-dominant) 的 多型性分子標誌，取易於判讀者，建立 10 個 以 上 的 高 訊 息 SSR 標 誌， 作 為 量 化 純 度 檢 定 之核心標誌。以出口採種業界提供的 3 批次商 業雜交種 (No. 5、No. 6、No. 7) 及相關親本， 進 行 核 心 SSR 標 誌 之 測 試； 再 依 據 3 個 雜 交 種 SSR-PCR 的分析結果，分別取得 2–3 個關 鍵性標誌 (key markers)。3 個商業雜交種 (No. 5、No. 6、No. 7) 各檢測 150 個樣品，依 SSR profile 取 得 各 雜 交 組 合 之 異 型 (off-type) 株 號，並計算各批次 F 1 種子的遺傳純度百分率。 經 SSR-PCR 檢定獲得之異型株，連同親本株 (父 本、 母 本)、 標 準 F 1 等 各 1–2 株， 繼 續 種 植 於 溫 室 至 結 果 期， 期 間 進 行 園 藝 性 狀 記 錄 拍照，以及果實外觀等 GOT 調查，用以對照 SSR 分子標誌分析之結果。. 結果 篩選多型性 SSR 基因座 (SSR loci) 用於 番椒雜交種之鑑定 利 用 2 個 番 椒 (Capsicum annuum) 雜 交 種 組 合 (‘360’、‘CA3’)， 進 行 374 組 SSR 引 子 的 SSR-PCR 分 析， 搜 尋 在 父、 母 本 與 F 1 間 具 有 共 顯 性 (co-dominant) 的 多 型 性 SSR 分 子標誌，初步建立 12 個高訊息且容易判讀之 核心 SSR 標誌，核心標誌的 PCR 產物範圍為. 84–401 bp (圖 1、表 1)。歸納此 12 個 SSR 基 因 座 之 重 複 基 序 (repeat motif) 顯 示， 其 中 8 個 基 因 座 為 三 核 甘 酸 重 複 序 列 (tri-nucleotide repeats motif) 型， 另 3 個 基 因 座 屬 於 二 核 甘 酸 重 複 (di-nucleotide repeats motif) 型，1 個 為四核甘酸重複 (tetra-nucleotide repeats motif) 型 (表 1)。. 篩選關鍵性 SSR 標誌利用於番椒雜交種 之遺傳純度鑑定 利 用 12 對 核 心 SSR 引 子 組 進 行 3 個 商 業 雜 交 種 之 純 度 測 試 結 果， 獲 得 其 中 3 個 SSR 基 因 座 (AV R D C - P P 8 3 、 E P M S - 7 4 7、 BM59622) 可用於 No. 5 雜交種之鑑定 (表 2)； 2 個 SSR 基 因 座 (AVRDC-PP83、CAMS-340) 可用於 No. 6 雜交種之鑑定 (表 3)；2 個 SSR 基因座 (CAMS-340、EPMS-712) 適用於 No. 7 雜交種之鑑定 (表 4)。綜合 3 個番椒商業雜交 種 SSR-PCR 分析結果，共計取得 5 個關鍵性 SSR 基 因 座， 分 別 為 AVRDC-PP83、EPMS747、BM59622、AVRDC-PP83、CAMS-340 與 EPMS-712。 利 用 SSR 分 子 標 誌 進 行 No. 5 雜 交 種 子 純 度 之 檢 測： 以 AVRDC-PP83 基因座進行 No. 5 雜交種子純度檢測結果，獲得 2 個等位基因 (alleles) 產物合計 4 個 SSR 片段 (191、203、248 及 257 bp)，其中 AVRDC-PP83(191 bp) 為 No. 5 雜 交 種 父 本 的 專 一 性 等 位 基 因 片 段，AVRDCPP83 (203 bp) 為 No. 5 雜交種母本的專一性等位 基 因 片 段， 而 No. 5 雜 交 種 則 具 有 AVRDCPP83 (191, 203, 248, 257 bp) 4 個片段 (圖 2、表 2)。依 AVRDC-PP83 基因座之純度檢測結果，120 個 No. 5 雜交種的發芽苗株中，編號 64 的苗株與 母 本 的 SSR profile 相 同， 可 能 為 母 本 自 交 汙 染， 編 號 103 的 苗 株 無 SSR-PCR 產 物， 經 計 算雜交種子純度為 98.3% (圖 2、表 2)。 以 SSR X, Y (EPMS-747 基因座) 進行 No. 5 雜 交 種 子 純 度 檢 測 結 果， 獲 得 2 個 等 位 基 因 產 物 合 計 4 個 SSR 片 段 (270、286、326 及 351 bp)， 其 中 EPMS-747(270 bp) 為 No. 5 雜 交 種 母 本 的 專 一 性 等 位 基 因 片 段，EPMS-747(286 bp) 為父本的專一性等位基因片段，而 No. 5 雜交.
(4) SSR 標誌檢測番椒雜交種子純度. 409. (A) ♀♂ F1 ♀♂ F1. M. M. ♀♂ F1. M 300 bp. 300 bp 200 bp 100 bp. 100 bp. 50 bp. Primer: AVRDC-PP88; Hpms2-24. (B). M. ♂♀ ♀ F1 ♀. Prime: BM59622. ♂♀ ♀ F1 ♀ M. ♂♀ ♀ F1 ♀. M. 300 bp. 200 bp. 250 bp. 350 bp 300 bp 250 bp. 200 bp. 150 bp. Primer: EPMS-712; AVRDC-PP79. Prime: CAMS-327. 圖 1. 以番椒 F1 品種 ‘360’ 與 ‘CA3’ 連同親本 (♀、♂) 篩檢適用於雜交種子純度檢定的共顯性 SSR 標誌。 Fig. 1. Representative co-dominant SSR markers selected from pepper hybrid lines of ‘360’ and ‘CA3’. The SSR markers that produce distinguishable PCR products in parental lines and their F1 hybrid are marked with black boxes. Co-dominant SSR markers, AVRDC-PP88, Hpms2-24, and BM59622 selected from hybrid ‘360’ (A) and co-dominant SSR markers, EPMS-712, AVRDC-PP79, and CAMS-327 selected from hybrid ‘CA3’ (B) are shown. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark. 表 1. 自 374 個候選 SSR 基因座篩選出 12 個高訊息 SSR 標誌及其 PCR 產物特性。 Table 1. Characteristics of the 12 selected informative SSR markers and their PCR products. Locus (accession no.). Repeat motif. CAMS-327. (TC)7. Expected size (bp) 243. Product size (bp) 255–325. CAMS-340. (TA)3...(AG)13. 250. 264–300. CAMS-885. (GAA)28. 248. 230–372. AVRDC-PP79. (ATT)8. 218. 227–251. AVRDC-PP83. (GAC)7. 191. 191–257. AVRDC-PP88. (CAA)8. 114. 126–186. EPMS-709. (GAG)6. 272. 260–401. EPMS-712. (GCA)6. 148. 151–175. EPMS-747. (TTCT)5. 274. 270–351. Hpms2-24. (CT)17(CA)5A21. 205. 195–213. BM59622. (CTT)3(CAT)9. 90. 84–120. AGi056. (AGA)9. 240. 234–347. 種則具有 EPMS-747 (270, 286, 326, 351 bp) 4 個片段 (圖 2、 表 2)。120 個 No. 5 雜 交 種 的 發 芽 苗 株 經. EPMS-747 基 因 座 檢 測 結 果， 編 號 25 苗 株 的 SSR-PCR 產物不清晰，編號 64 的苗株與母本.
(5) 410. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. 表 2. 利用 3 個關鍵性 SSR 標誌鑑定 120 個 No. 5 雜交種之遺傳純度。 Table 2. Summary of genetic purity testing of 120 individuals from hybrid No. 5 by three identifiable SSR markers. Female parent specific band (bp). Male parent specific band (bp). F1 profile (bp). Putative false hybrid (plant no.). Putative hybrid. Purity (%). AVRDC-PP83. 203. 191. 191, 203, 248, 257. 64. 119. 99.2. EPMS-747. 270. 286. 270, 286, 326, 351. 64. 119. 99.2. BM59622. 84. 96. 84, 96, 120. 64. 119. 99.2. SSR primer. 表 3. 利用 2 個關鍵性 SSR 標誌鑑定 120 個 No. 6 雜交種之遺傳純度。 Table 3. Summary of genetic purity testing of 120 individuals from hybrid No. 6 by two identifiable SSR markers. Female parent specific band (bp). Male parent specific band (bp). F1 profile (bp). Putative false hybrid (plant no.). Putative hybrid. Purity (%). AVRDC-PP83. 191. 202. 191, 203, 248, 257. 81, 85. 118. 98.3. CAMS-340. 300. 264. 264, 300. 81, 85. 118. 98.3. SSR primer. 表 4. 利用 2 個關鍵性 SSR 標誌鑑定 120 個 No. 7 雜交種之遺傳純度。 Table 4. Summary of genetic purity testing of 120 individuals from hybrid No. 7 by two identifiable SSR markers. SSR primer. Female parent specific band (bp). Male parent specific band (bp). CAMS-340. 264. 276. EPMS-712. 157. 151. Putative false hybrid (plant no.). Putative hybrid. Purity (%). 264, 276, 290. 49, 68, 77, 81, 96, 119. 114. 95.0. 151, 157, 166, 175. 49, 68, 81, 96, 119. 114. 95.0. F1 profile (bp). 的 SSR profile 相 同， 可 能 為 母 本 自 交 汙 染， 經計算其雜交種子純度為 98.3% (圖 3、表 2)。 以 BM59622 基 因 座 進 行 No. 5 雜 交 種 子 純 度 檢 測 結 果， 獲 得 2 個 等 位 基 因 產 物 合 計 3 個 SSR 片 段 (84、96 及 120 bp)， 其 中 BM59622 (84 bp) 為 No. 5 雜 交 種 母 本 的 專 一 性 等 位 基 因 片 段，BM59622 (96 bp) 為 父 本 的 專 一 性 等 位 基 因 片 段， 而 No. 5 雜 交 種 則 具 有 BM59622 (84, 96, 120 bp) 3 個 片 段 ( 圖 4、 表 2)。 120 個 No. 5 雜交種的發芽苗株經檢測結果， 編號 64 的苗株與母本的 SSR profile 相同，可 能 為 母 本 自 交 汙 染 (圖 4)。 依 BM59622 基 因 座 PCR 分析產物，經計算其雜交種子純度為 99.2% (圖 4、 表 2)。 故 綜 合 AVRDC-PP83、 EPMS-747、BM59622 基 因 座 之 SSR-PCR 分 析結果，No. 5 雜交種子之遺傳純度為 99.2% (表 3)。另依據果實等園藝性狀之 GOT 鑑定結 果，亦發現編號 64 的異型株確實與正常的 F 1 植株 (編號 53) 性狀相異，但較近似於母本 (圖 5)。. 利 用 SSR 分 子 標 誌 進 行 No. 6 雜 交 種 子 純 度 之 檢 測： 以 AVRDC-PP83 基 因 座 進 行 No. 6 雜交種子純度檢測結果，獲得 2 個等位 基 因 產 物 合 計 4 個 SSR 片 段 (191、203、248 及 257 bp)，其中 AVRDC-PP83 (191 bp) 為 No. 6 雜交種母本的專一性等位基因片段，AVRDCPP83 (203 bp) 為父本的專一性等位基因片段，而 No. 6 雜交種具有 AVRDC-PP83 (191, 203, 248, 257 bp) 4 個片段 (圖 6、表 3)。依據 AVRDC-PP83 基 因座檢測結果，120 個 No. 6 雜交種的發芽苗 中， 編 號 81 和 編 號 85 的 苗 株 與 母 本 的 SSR profile 相同，可能為母本自交汙染，經計算其 雜交種子純度為 98.3% (圖 6、表 3)。 以 CAMS-340 基 因 座 進 行 No. 6 雜 交 種 子純度檢測結果，產物為 2 個等位基因合計 3 個 SSR 片段 (264、300 bp)，其中 CAMS-340 (264 bp) 為 No. 6 雜交種母本的專一性等位基因 片 段，CAMS-340 (300 bp) 為 父 本 的 專 一 性 等 位 基 因 片 段， 而 No. 6 雜 交 種 為 CAMS-340 (264, 300 bp) 3 個 片 段 (圖 7、 表 3)。120 個 No. 6 雜.
(6) SSR 標誌檢測番椒雜交種子純度. M ♀: Line1–10. 411. ♂: Line11–18 Individual F1 plant 1–18. M. 300 bp 203 bp 191 bp 150 bp. M. Individual F1 plant 19–54. M. M. Individual F1 plant 55–90. M. M. Individual F1 plant 91–120. M. 圖 2. 以 SSR 標誌 (AVRDC-PP83) 進行番椒 No. 5 的雜交種子純度之檢測。 Fig. 2. PCR results of 120 hybrid seeds of No. 5 and their parental lines (♀ and ♂) using AVRDC-PP83 SSR marker. F1 individual #64 (indicated by arrow) shows the same product pattern as that of female parent represents a progeny produced from selfing. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark.. 350 bp. M: ♂Line1–10. ♀: Line11–18. Individual F1 plant 1–18. M. 286 bp 270 bp. M. Individual F1 plant 19–54. M. M. Individual F1 plant 55–90. M. M. Individual F1 plant 91–120. M. 圖 3. 以 SSR 標誌 (EPMS-747) 進行番椒 No. 5 的雜交種子純度之檢測。 Fig. 3. PCR results of 120 hybrid seeds of No. 5 and their parental lines (♀ and ♂) using EPMS-747 SSR marker. F1 individual #64 (indicated by arrow) shows the same product pattern as that of female parent represents a progeny produced from selfing. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark..
(7) 412. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. 150 bp. M ♀: Line1–10. ♂: Line11–18. M. Individual F1 plant 19–54. M. M. Individual F1 plant 55–90. M. Individual F1 plant 1–18. M. 96 bp 84 bp 50 bp. M. Individual F1 plant 91–120. M. 圖 4. 以 SSR 標誌 (BM59622) 進行番椒 No. 5 的雜交種子純度之檢測。 Fig. 4. PCR results of 120 hybrid seeds of No. 5 and their parental lines (♀ and ♂) using BM59622 SSR marker. F1 individual #64 (indicated by arrow) shows the same product pattern as that of female parent represents a progeny produced from selfing. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark.. (A). (B). (C). (D). 圖 5. 番椒雜交種 No. 5 與其親本的外觀性狀 (A) No. 5 的母株；(B) No. 5 的父株；(C) 正確的 No. 5 之 F1 株； (D) 異型的 No. 5 F1 株 (off-type F1)。 Fig. 5. Morphological comparisions of matured pepper from typical F1 (C), off-type F1 (D) hybrids of No. 5 and parental plants (A: female parent; B: male parent).. 交 種 的 發 芽 苗 株 經 CAMS-340 基 因 座 檢 測 結 果， 編 號 81 和 編 號 85 的 苗 株 與 母 本 的 SSR profile 相同，可能為母本自交汙染，經計算其 雜 交 種 子 之 遺 傳 純 度 為 98.3% (圖 7、 表 3)。 故 綜 合 AVRDC-PP83、CAMS-340 基 因 座 之. SSR-PCR 分析結果，No. 6 雜交種子之遺傳純 度為 98.3% (表 4)。另依據果實等園藝性狀之 GOT 鑑 定 結 果， 亦 發 現 編 號 81 和 編 號 85 的 異型株確實與正常的 F 1 植株 (編號 24) 性狀相 異 (圖 8)。.
(8) SSR 標誌檢測番椒雜交種子純度. 300 bp. 413. M ♀: Line1–10. ♂: Line11–18. M. Individual F1 plant 19–54. M. M. Individual F1 plant 55–90. M. Individual F1 plant 1–18. M. 202 bp 191 bp. M. Individual F1 plant 91–120. M. 圖 6. 以 SSR 標誌 (AVRDC-PP83) 進行番椒 No. 6 的雜交種子純度之檢測。 Fig. 6. Assessment of seed purity in hybrid No. 6 and respective parental lines (♀ and ♂) using the SSR marker of AVRDC-PP83. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark; F1 plant numbers of 81 and 85 (arrow) represent selfed plants. M. ♀: Line1–10. ♂: Line11–18. Individual F1 plant 1–18. M. 350 bp 300 bp 264 bp. M. Individual F1 plant 19–54. M. M. Individual F1 plant 55–90. M. M. Individual F1 plant 91–120. M. 圖 7. 以 SSR 標誌 (CAMS-340) 進行番椒 No. 6 的雜交種子純度之檢測。 Fig. 7. Assessment of seed purity in hybrid No. 6 and respective parental lines (♀ and ♂) using the SSR marker of CAMS-340. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark; F1 plant number 81 and 85 (arrow) represents selfed plants.. 利用 SSR 分子標誌進行 No. 7 雜交種子純. 交種子純度檢測結果，獲得 2 個等位基因產物. 度之檢測：以 CAMS-340 基因座進行 No. 7 雜. 合計 3 個 SSR 片段 (264、276 及 290 bp)，其.
(9) 414. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. (A). (C). (B). (D). (E). 圖 8. 番椒雜交種 No. 6 與其親本的外觀性狀 (A) No. 6 的母株；(B) No. 6 的父株；(C) 正確的 No. 6 之 F1 株； (D)、(E) 異型的 No. 6 F1 株 (off-type F1)。 Fig. 8. Morphological comparisions of matured pepper from typical F1 (C), off-type F1 (D and E) hybrids of No. 6 and parental plants (A: female parent; B: male parent).. 中 CAMS-340 (264 bp) 為 No. 7 雜 交 種 母 本 的 專 一 性 等 位 基 因 片 段，CAMS-340 (290 bp) 為 父 本 的專一性等位基因片段，而 No. 7 雜交種則為 CAMS-340 (264, 276, 290 bp) 3 個片段 (圖 9、表 4)。 120 個 No. 7 雜交種的發芽苗株經 CAMS-340 基因座檢測結果，編號 77 苗株的 SSR-PCR 產 物 未 能 清 晰 判 讀， 而 編 號 49、68、81、96、 119 等 5 個苗株均與母本的 SSR profile 相同， 可 能 為 母 本 自 交 汙 染； 依 據 CAMS-340 基 因 座的 PCR 分析產物結果，計算其雜交種子純 度為 95.0% (圖 9、表 4)。 以 EPMS-712 基因座進行 No. 7 雜交種子 純度檢測結果，產物為 2 個等位基因合計 4 個 SSR 片 段 (151、157、166 及 175 bp)， 其 中 EPMS-712 (151 bp) 為 No. 7 雜交種父本的專一性 等位基因片段，EPMS-712 (157 bp) 為母本的專一. 性等位基因片段，而 No. 7 雜交種則為 EPMS712 (151, 157, 166, 175 bp) 4 個片段 (圖 10、表 4)。120 個 No. 7 雜交種的發芽苗株經 EPMS-712 基因 座檢測結果，編號 77 的苗株無 SSR-PCR 產物 ( 圖 10)； 編 號 49、68、81、96、119 等 5 個 苗 株 均 與 母 本 的 SSR profile 相 同， 可 能 為 母 本自交汙染，經計算其雜交種子純度為 95.0% (圖 10、表 4)。綜合 CAMS-340 和 EPMS-712 基因座之 SSR-PCR 分析結果，No. 7 雜交種子 之遺傳純度為 95.0% (表 4)。對照果實等園藝 性狀之 GOT 檢定結果，亦發現編號 77 和編號 119 的 異 型 株 確 實 與 正 常 的 F 1 植 株 (編 號 80) 性狀相異 (圖 11)。. 討論 栽培種番椒的染色體組 2n = 2x = 24，基.
(10) SSR 標誌檢測番椒雜交種子純度. M. ♀: Line1–10. ♂: Line11–20. 415. Individual F1 plant 1–16. M. 300 bp 279 bp 264 bp. M. Individual F1 plant 17–52. M. M. Individual F1 plant 53–88. M. M. Individual F1 plant 89–120. M. 圖 9. 以 SSR 標誌 (CAMS-340) 進行番椒 No. 7 的雜交種子純度之檢測。 Fig. 9. Assessment of seed purity in hybrid No. 7 and respective parental lines (♀ and ♂) using the SSR marker of CAMS-340. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark; F1 plant number 49, 68, 81, 96 and 119 (arrow) represent the selfed plants; F1 plant number 77 (star) represent a mixture plant.. 200 bp. M. ♀: Line1–10 ♂: Line11–20. Individual F1 plant 1–16 M. 157 bp 151 bp. M. Individual F1 plant 17–52. M. M. Individual F1 plant 53–88. M. M. Individual F1 plant 89–120. M. 圖 10. 以 SSR 標誌 (EPMS-712) 進行番椒 No. 7 的雜交種子純度之檢測。 Fig. 10. Assessment of seed purity in hybrid No. 7 and respective parental lines (♀ and ♂) using the SSR marker of EPMS-712. M: 50 bp DNA Ladder from GeneMark; F1 plant number 49, 68, 81, 96, and 119 (arrow) represent the selfed plants..
(11) 416. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. (A). (C). (B). (D). (E). 圖 11. 番椒雜交種 No. 7 與其親本的外觀性狀 (A) No. 7 的母株；(B) No. 7 的父株；(C) 正確的 No. 7 之 F1 株； (D)、(E) 異型的 No. 7 F1 株 (off-type F1)。 Fig. 11. Morphological comparisions of matured pepper from typical F1 (C), off-type F1 (D and E) hybrids of No. 7 and parental plants (A: female parent; B: male parent).. 因 組 大 小 約 3.3 Gb (Moscone et al. 2007)， 全 基 因 組 於 2014 年 完 成 定 序 (Cheng et al. 2014)。目前針對番椒特定性狀的遺傳連鎖圖 譜， 以 SSR 標 誌 最 為 廣 泛， 如 用 於 探 索 花 期 相關的 QTL (quantitative trait locus) 圖譜，係 以 InDel 標誌和 SSR 標誌共同建構 (Tan et al. 2015)。Ince et al. (2010) 則 利 用 番 椒 的 根、 莖、 葉、 花、 果、 種 子 等 不 同 組 織， 並 以 不 同發育階段的 cDNA，探勘 genic-SSR 結果顯 示，相關於組織專一性的基因 (tissue-specific genes) 以 dinucleotide 雙 核 苷 重 複 基 序 較 多，而管家型基因 (housekeeping genes) 則以 trinucleotide 重 複 基 序 較 多。Minamiyama et al. (2007) 又以 SSR-based 圖譜進行番椒疫病 (Phytophthora capsicum) 抗 性 之 QTL 分 析。 鑑 於 SSR 存 在 基 因 組 的 豐 富 性 與 多 型 性， 加. 上其遺傳分析的技術門檻較低，極適合作為例 行性的種子遺傳純度檢定之利用。本研究自前 人 探 勘 的 番 椒 SSR 標 誌 中， 選 取 種 間 或 種 內 具 多 型 性 的 候 選 引 子 374 組， 測 試 8 個 F 1 品 種純度之檢測 (有 3 個 F 1 品種之檢測數據未列 於本文)，初步已建立核心引子 12 組，可提供 商業雜交種子純度檢測之利用。 歸 納 前 人 對 番 椒 基 因 組 的 SSR 基 序 分 析 結 果， 以 三 核 甘 酸 序 列 重 複 最 為 普 遍， 其 次 為 二 核 甘 酸 序 列 重 複； 而 三 核 甘 酸 重 複 基 序 (trinucleotide repeat motif) 中又以 GAA/AGA/ AAG (CTT/TTC/TCT) 出現頻度較高；二核甘 酸 重 複 基 序 (dinucleotide repeat motif) 則 以 AG/GA (TC/CT) 出現頻度較高 (Minamiyama et al. 2006; Yi et al. 2006; Lu et al. 2011; Ahn et al. 2013)。本研究針對番椒雜交種鑑別而建.
(12) SSR 標誌檢測番椒雜交種子純度. 立的 12 個高訊息 SSR 標誌，其中 3 個屬於二 核 甘 酸 重 複 序 列 且 基 序 為 AG (TC/CT)， 另 3 個三核甘酸重複基序則為 AGA/GAA (CTT)， 與前人針對番椒基因組之 SSR 分析結果吻合。 唯針對 SSR-PCR 多型性產物的判讀能力，以 三核甘酸重複基序或組合型核甘酸重複基序 (compound perfect repeat motif) 的多型性片段 差異性較大於二核甘酸序列重複基序的產物， 較利於判讀，可利用 Agarose 或 PAGE 膠體電 泳方式，提供例行性檢定之利用。 種 苗 公 司 生 產 高 價 的 F 1 種 子， 必 需 確 保 出售的 F 1 種子純度達於標準 (98%) 或以上， 而異型種子來源不外乎自交種子汙染，或是考 種、包裝期間的外來種原混雜汙染。為確保或 提 升 採 種 品 質， 必 須 釐 清 種 子 汙 染 的 緣 由， 以判斷是否需要加強雄不稔性狀穩定性的監 測，或去雄操作的確實性，或嚴格掌控種子調 製的潔淨度等環節。分子標誌正是快速檢測與 評估異型種子基因型的優選工具，有助於品管 人員發覺種子汙染來源，進一步針對缺失而改 善 之。GOT 是 ISTA 等 國 際 種 苗 組 織 與 業 界 傳統使用的純度檢查方法，首先得建立正確且 具有代表性的標準品 (雜交種) 之園藝性狀資 料庫，再依個別作物發生自交的頻度，分別取 100–1,000 個雜交種之抽樣檢定樣品，進行對 照栽培比較，依其性狀差異性說明 off-type 發 生的情形與比率，並取得各批次種子之純度。 目前國際間開發多種快速、簡便的 DNA 分子 標 誌 (RAPD、SSR、ISSR 以 及 SNP 等)， 可 提供雜交種鑑定或種子純度之檢測；其中 SSR 分子標誌分析兼具簡易、穩定、精確性等多項 優 點， 所 需 檢 測 時 程 僅 需 1–2 wk， 相 較 於 傳 統 1–3 mo 的 GOT 方 式 更 節 省 人 力、 物 力 成 本，可爭取出貨時效；其檢測材料可使用單粒 種子或發芽苗等微量樣品 (5–20 mg)，配合操 作簡易的 DNA 萃取技術，即可提供 SSR-PCR 分析用，迅速取得各採種批次之種子純度，是 現代商業種苗生產品管上實務應用之利器。. 誌謝 本研究承蒙農委會農糧領域科技計畫 (103 農科-9.1.1-農-C5) 經費補助，謹此致謝。. 417. 引用文獻 Ahn, Y., S. Tripathi, Y. Cho, J. Kim, H. Lee, D. Kim, J. Woo, and M. Cho. 2013. De novo transcriptome assembly and novel microsatellite marker information in Capsicum annuum varieties Saengryeg 211 and Saengryeg 213. Bot. Stud. 54:58–67. Arun Kumar, M. B., M. Dadlania, R. Kumarb, and S. R. Jacob. 2014. Identification and validation of informative SSR markers suitable for ensuring the genetic purity of brinjal (Solanum melongena L.) hybrid seeds. Sci. Hortic. 171:95–100. Ballester, J. and de V. M. Carmen. 1998. Determination of F1 hybrid seed purity in pepper using PCR-based markers. Euphytica 103:223–226. Cheng, Q., C. Yu, Y. Shen, X. Fang, L. Chen, J. Min, J. Cheng, S. Zhao, M. Xu, Y. Luo, Y. Yang, Z. Wu, L. Mao, H. Wu, C. Ling-Hu, H. Zhou, H. Lin, S. Gonzalez-Morales, D. L. Trejo-Saavedra, H. Tian, X. Tang, M. Zhao, Z. Huang, A. Zhou, X. Yao, J. Cui, W. Li, Z. Chen, Y. Feng, Y. Niu, S. Bi, X. Yang, W. Li, H. Cai, X. Luo, S. Montes-Hernandez, M. A. LeyvaGonzalez, Z. Xiong, X. He, L. Bai, S. Tang, D. Liu, J. Liu, S. Zhang, M. Chen, L. Zhang, Y. Zhang, M. Wang, X. Lv, B. Wen, H. Liu, H. Luan, Y. Zhang, S. Yang, X. Wang, J. Xu, X. Li, S. Li, J. Wang, A. Palloxi, P. W. Bosland, Y. Li, A. Krogh, R. F. RiverBustamante, L. Herrera-Estrella, Y. Yin, J. Yu, K. Hu, and Z. Zhang. 2014. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5135–5140. Condit, R. and S. P. Hubbell. 1991. Abundance and DNA sequence of two-base repeat regions in tropical tree genomes. Genome 34:66–71. Crockett, P. A., P. L. Bhalla, C. K. Lee, and M. B. Singh. 2000. RAPD analysis of seed purity in a commercial hybrid cabbage (Brassica oleracea var. capitata) cultivar. Genome 43:317–321. Gong, L. and Z. Geng. 2010. EST-SSR markers for gerbera (Gerbera hybrida). Mol. Breeding 26:125–132. Hashizume, T., I. Shimamoto, and M. Hirai. 2003. Construction of a linkage map and QTL analysis of horticultural traits for watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai] using RAPD, RFLP and ISSR markers. Theor. Appl. Genet. 106:779–785. Hashizume, T., I. Shimamoto, I. Y. Harushima, M. Yui, T. Sato, T. Imai, and M. Hirai. 1996. Construction of a linkage map for watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai] using random amplified polymorphic DNA (RAPD). Euphytica 90:265–273. Ida, A. A., J. A. Plummer, R. A. Lancaster, and G. Yan. 2008. Identification of ‘Sib’ plants in hybrid cau-.
(13) 418. 台灣農業研究 第 65 卷 第 4 期. liflowers using microsatellite markers. Euphytica 164:309–316.. L. Stein. 2002. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.). DNA Res. 9:199–207.. Ince, A. G., M. Karaca, and A. N. Onus. 2010. Differential expression patterns of genes containing microsatellites in Capsicum annuum L. Mol. Breeding 25:645– 658.. Minamiyama, Y., M. Tsuro, and M. Hirai. 2006. An SSRbased linkage map of Capsicum annuum. Mol. Breeding 18:157–169.. Iqbal, M. J., D. W. Paden, and A. L. Rayburn. 1995. Assessment of genetic relationships among rhododendron species, varieties and hybrids by RAPD analysis. Sci. Hortic. 63:215–223.. Minamiyama, Y., M. Tsuro, T. Kubo, and M. Hirai. 2007. QTL Analysis for resistance to Phytophthora capsici in pepper using a high density SSR-based map. Breeding Sci. 57:129–134.. Jang, I., J. H. Moon, J. B. Yoon, J. H. Yoo, T. J. Yang, Y. J. Kim, and H. G. Park. 2004. Application of RAPD and SCAR markers for purity testing of F1 hybrid seed in chili pepper (Capsicum annuum). Mol. Cell 18:295–299.. Moscone, E. A., M. A. Scaldaferro, M. Grabiele, N. M. Cecchini, Y. Sánchez García, R. Jarret, J. R. Daviña, D. A. Ducasse, G. E. Barboza, and F. Ehrendorfer. (2007). The evolution of chili peppers (Capsicum Solanaceae): A cytogenetic perspective. Acta Hortic. 745:137–170.. Komori, T. and N. Nitta. 2004. A simple method to control the seed purity of japonica hybrid rice varieties using PCR-based markers. Plant Breed. 123:549–553. Kumpatla, S. P. and S. Mukhopadhyay. 2005. Mining and survey of simple sequence repeats in expressed sequence tags of dicotyledonous species. Genome 48:985–998. Lee, H., I. Bae, S. Park, H. Kim, W. Min, J. Han, K. Kim, and B. Kim. 2009. Construction of an integrated pepper map using RFLP, SSR, CAPS, AFLP, WRKY, rRAMP, and BAC end sequences. Mol. Cell 27:21–37. Lee, J. M., S. H. Nahm, Y. M. Kim, and B. D. Kim. 2004. Characterization and molecular genetic mapping of microsatellite loci in pepper. Theor. Appl. Genet. 108:619–627. Liu, L. W., Y. Wang, Y. Q. Gong, T. M. Zhao, G. Liu, X. Y. Li, and F. M. Yu. 2007. Assessment of genetic purity of tomato (Lycopersicon esculentum L.) hybid using molecular markers. Sci. Hortic. 115:7–12. Lu, F., M. Yoon, Y. Cho, J. Chung, K. Kim, M. Cho, S. Cheong, and Y. Park. 2011. Transcriptome analysis and SNP/SSR marker information of red pepper variety YCM334 and Taean. Sci. Hortic. 129:38–45. McCouch, S. R., L. Teytelman, Y. Xu, K. B. Lobos, K. Clare, M. Walton, B. Fu, R. Maghirang, Z. Li, Y. Xing, Q. Zhang, I. Kono, M. Yano, R. Fjellstrom, G. DeClerck, D. Schneider, S. Cartinhour, D. Ware, and. Mujaju, C., J. Sehic, G. Werlemark, L. Garkava-Gustavsson, M. Fatih, and H. Nybom. 2010. Genetic diversity in watermelon (Citrullus lanatus) landraces from Zimbabwe revealed by RAPD and SSR markers. Hereditas 147:142–153. Portis, E., I. Nagy, Z. Sasvári, A. Stágel, L. Barchi, and S. Lantari. 2007. The design of Capsicum spp. SSR assays via analysis of in silico DNA sequence, and their potential utility for genetic mapping. Plant Sci. 172:640–648. Tan, S., J. Cheng, L. Zhang, C. Qin, D. Nong, W. Li, X. Tang, Z. Wu, and K. Hu. 2015. Construction of aninterspecific genetic map based on InDel and SSR for mapping the QTLs affecting theinitiation of flower primordia in pepper (Capsicum spp.). PloS One 10:e119389. doi:10.1371/journal.pone.0119389. Wang, Z., J. L. Weber, G. Zhong, and S. D. Tanksley. 1994. Survey of plant short tandem DNA repeats. Theor. Appl. Genet. 88:1–6. Wöhrmann, T. and K. Weising. 2011. In silico mining for simple sequence repeat loci in a pineapple expressed sequence tag database and cross-species amplification of EST-SSR markers across Bromeliaceae. Theor. Appl. Genet. 123:635–647. Yi, G., J. M. Lee, S. Lee, D. Choi, and B. Kim. 2006. Exploitation of pepper EST-SSRs and an SSR-based linkage map. Theor. Appl. Genet. 114:113–130..
(14) SSR 標誌檢測番椒雜交種子純度. Analysis of Seed Purity for the Bell Pepper (Capsicum annuum) Hybrid Using SSR Markers Jau-Yueh Wang1,*, Da-Gin Lin2, and Feng-Chyi Lin3. Abstract Wang, J. Y., D. G. Lin, and F. C. Lin. 2016. Analysis of seed purity for the bell pepper (Capsicum annuum) hybrid using SSR markers. J. Taiwan Agric. Res. 65(4):406–419.. Identification of seed purity of F1 hybrids is a critical factor of quality control in the production of hybrid seeds. The grow out test (GOT) is based on the morphological characters of plants grown to maturity. However, GOT may influence by the environment and is time consuming, there is necessary to identify a rapid and reliable test like DNA based assay for this purpose. The objective of this study was to generate specific and co-dominant SSR (simple sequence repeat) markers for discrimination of parental lines and the subsequent assessment of seed purity in pepper hybrids. Genomic DNA from two hybrids and their parental lines were screened with 374 SSR primer pairs and 12 informative SSR markers were identified. Among the informative SSR markers, five key markers were selected for seed purity test for No. 5, No. 6, and No. 7 hybrids. A total of 120 hybrid individuals from each hybrid were tested using the identified markers, and results showed the seed purity rate for the three hybrid seed lots were 99.2, 98.3 and 95.8%, respectively. The contamination of inbred seeds obtained by SSR-PCR analysis was comparable to the GOT method. These results indicated that SSR markers could be used as a rapid and efficient tool in testing the seed purity of the commercial pepper hybrid. Key words: Capsicum annuum, Simple sequence repeat, Hybrid seed purity.. Received: December 17, 2015; Accepted: March 1, 2016. * Corresponding author, e-mail: [email protected] 1 Assistant Research Fellow, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 2 Associate Research Fellow, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 3 Associate Research Fellow, Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC.. 419.
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