IR:Item 987654321/6336
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(2) 謝誌 首先，我要感謝我的爸爸和媽媽，謝謝我的家人給予求 學過程的支持與鼓勵。在求學的一路上您們全力地支持我， 讓我順利完成最後的學業。在台灣體育學院這幾年來從一般 全職碩班學生到休學當兵並取得工作，短短幾年進而轉成在 職身份的學生，無形中增添的許多困難與壓力但仍然一一克 服。 首先我要感謝指導教授陳裕鏞老師，謝謝陳老師指導我 這幾年的研究學習，老師的博學多聞更讓我在文章閱讀及研 究方向中都有了相當的廣大的見解與進步，更同時增添了許 多知識。同時在論文上給予我許多的建議與指導，在論文上 的審閱跟糾正上更是仔細與審慎。您從中鼓勵我去解決問 題，讓研究的精神深植我心。 感 謝 其 他 身 旁 朋 友，謝 謝 俊 傑、柏 言，謝 謝 你 們 陪 我 度 過 研究所的難忘歲月。謝謝我的女友，麗容。在我最迷惘絕望 的時候，讓可以突破接踵而來的考驗並勇敢面對，讓我打消 放 棄 的 念 頭 ， 亦 耐 心 傾 聽 。 謝 謝 妳 !謝 謝 大 家 、 謝 謝 ， 感 恩 ! 陳捷. 謹致.
(3) 論 文 名 稱 :藉 由 單 核 球 細 胞 免 疫 反 應 抑 制 人 類 B型 肝 炎 病 毒 表 面抗原作用探討老年人之自行車運動對免疫力提升效果之研 究 總 頁 數 :52 頁 院 校 所 組 別 :國 立 臺 灣 體 育 學 院 體 育 研 究 所 畢 業 時 間 及 提 要 別 :九 十 九 學 年 度 第 一 學 期 碩 士 提 要 研 究 生 :陳 捷. 指 導 教 授 :陳 裕 鏞. 摘. 要. 研 究 背 景 在 研 究 具 習 慣 性 自 行 車 運 動 的 老 年 人 (HCE， Habitual cycling exercise)藉 由 每 日 清 晨 低 強 度 的 運 動 ， 經 實 驗 控 制 ， 與 對 照 組 ( S C， S e d e n t a r y c o n t r o l ) 相 比 之 下 ， 而 表 現 出 較 高 抗 B 型 肝 炎 病 毒 的 免 疫 活 性。其 方 法 利 用 植 物 血 凝 集 素 ( P H A， P h y t o h e m a g g l u t i n ) 刺 激 後 表 現 之 人 類 週 邊 血 單 核 球 細 胞 加 入 可 表 現 B 型 肝 炎 病 毒 的 Hep-3B 細 胞 培 養 基 下 ， 觀 察免疫抑制情形。 結果發現為經由實驗設計與控制後的受試者表現情形， • 在 自 行 車 運 動 計 劃 過 程 中 觀 察 到 VO2 max 最 高 峰 可 達 到 4 3 . 5 4 % ， H R m a x 可 達 到 6 0 . 1 2 %。 因 此 認 為 H C E 對 於 老 年 人 是屬於一種有氧之中低強度運動。在此過程中所表現出之細 胞 激 素 (Cytokine)像 是 IFN-γ， TNF-α和 IFN-α， 在 培 養 基 的 表 現 情 形 ， 具 有 運 動 習 慣 之 HCE 組 較 優 於 SC 組 。 而 在 相 同 濃 度 的 P H A 刺 激 之 下，觀 察 兩 者 對 於 抑 制 B 型 肝 炎 病 毒 的 表 現 ， 其 中 HCE 為 64.7%， 而 SC 為 81.5%。 然 而 下 降 的 抑 制 率在細胞激素中和試驗下，可以推測其關鍵的證據是由於細 胞 激 素 的 作 用 而 造 成 HCE-MNC-CM 對 於 HBS Ag 表 現 抑 制 情. I.
(4) 形。 結論為透過數據顯示出具自行車運動習慣的老年人與正 常 無 運 動 習 慣 的 老 年 人 相 比 下，觀 察 經 由 P H A 刺 激 B 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 表 現 過 程 中 之 單 核 球 細 胞 免 疫 反 應 情 形 ， HCE 組 較 優 於 SC 組 。. 關 鍵 字 : 自 行 車 運 動、免 疫 抑 制、B 型 肝 炎 病 毒、低 強 度 運 動 、 B 型肝炎病毒表面抗原. II.
(5) C h e n , J a y. ( 2 0 1 0 ) . M i d d l e - a g e d s u b j e c t s w i t h habitual low-speed cycling exercise have greater mononuclear cell responsiveness against. Unpublished master thesis, National Taiwan College of Physical Education, Taichung. Abstract Background:Whether elderly with habitual cycling exercise (HCE), at lower intensity in the morning, have higher immunity against hepatitis B virus than sedentary controls (SC) was a health care issue for elderly.Methods:The conditioned media were prepared by stimulating the isolated human peripheral blood mononuclear cells with phytohemagglutinin (PHA) for assessment of the inhibitory effects on hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in human hepatoma Hep3B cells. • Results:By the detected % VO2peak at about 43.54 % and % HRmax at about 60.12% during cycling exercise program in present study, we can considered HCE as an aerobic and low to moderate exercise for elderly. The concentrations of secreted cytokines such as IFN-γ, TNF-α and IFN-α were greater in the MNC-CM from the HCE group than those from the SC group. The inhibitory rates of HCE group’MNC-CM against the HBsAg expression were greater than that of SC group. In the same stimulating concentration of PHA (at 10 µg/ml), the relative HBsAg expression in HCE group’ MNC-CM was 64.7 % versus 81.5 % of SC group. The decline of inhibitory rates. III.
(6) in cytokine neutralization experiments suggest that the crucial roles played by these cytokines for inhibitory effect of HCE-MNC-CM against HbsAg expression. Conclusion:The results reveal that the immune response of MNC, which are stimulated with PHA to suppress HBsAg expression in elderly with habitual cycling exercise at lower speed, is greater than that in sedentary controls.. K e y w o r d s : C y c l i n g e x e r c i s e ; I m m u n o d u l a t o r y ; H B V; Low intensity; HBs Ag. IV.
(7) 目. 錄. 中 文 摘 要 ···········································I 英 文 摘 要 ··········································II 表 目 錄 ···········································VII 圖 目 錄 ··········································VIII 第一章. 緒論. 第 一 節 研 究 動 機 與 目 的 ··························1 第 二 節 研 究 問 題 與 假 設 ··························2 第 三 節 研 究 限 制 ································3 第四節. 重 要 名 詞 解 釋 ····························4. 第二章 文獻探討 第 一 節 老 化 與 運 動 ······························6 第 二 節 運 動 型 式 與 免 疫 細 胞 調 控 之 現 象 ············7 第 三 節 免 疫 表 現 與 抗 病 毒 作 用 之 關 係 ·············12 第三章 研究方法 第一節. 研 究 架 構 ·······························16. 第 二 節 研 究 實 施 程 序 ···························16 第 三 節 研 究 方 法 ·······························19 第四章. 結果. • 第 一 節 受 試 者 身 體 質 量 指 數 測 量 與 VO2peak測 定 ····25 第 二 節 HCE與 SC受 試 群 經 PHA-MNC-CM模 式 刺 激 週 邊 血 液 細 胞 對 於 Hep3B細 胞 株 於 HBs Ag表 現 程 度 之 比 較 ·····························29 第三節. 細 胞 激 素 對 於 Hep3B細 胞 株 產 生 之 HBs抗 原 的 影 響 ····································31. V.
(8) 第五章. 結 論 ·······································33. 第六章. 討 論 ·······································36. 參 考 文 獻 ··········································37 附錄一. 受 試 者 身 體 檢 查 表 ···························50. VI.
(9) 表. 目. 錄. • 表 4-1: 受 試 者 身 體 質 量 指 數 測 量 與 VO2peak 測 定 ·······26 表 4-2: 習 慣 性 自 行 車 運 動 前 後 血 中 乳 酸 濃 度 與 能 量 消 耗 之 比 較 ·······································28 表 4-3: 經 PHA 刺 激 單 核 球 細 胞 條 件 培 養 基 與 細 胞 激 素 抗 體 中 和 作 用 後 對 於 B 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 的 影 響 ···30 表 4-4: 經 PHA 刺 激 單 核 球 細 胞 條 件 培 養 基 分 泌 出 之 細 胞 激 素 表 現 情 形 ·································32. VII.
(10) 圖. 目. 錄. 圖 3-1: 研 究 實 施 程 序 ·······························17. VIII.
(11) 第一章. 緒論. 本章共分為四節，包含研究動機與目的、研究問題與假 設、研究限制、重要名詞解釋等，茲分述如下：. 第一節. 研究動機與目的. 壹、 研究動機 隨著社會的變遷，石油缺乏所帶來之能源危機以及環境保 護 的 議 題 趨 使，使 得 自 行 車 運 動 不 但 具 有 休 閒 及 交 通 運 輸 的 用 途，更 對 身 體 保 健 的 提 升，有 著 相 當 程 度 的 影 響。在 自 行 車 有 氧 的 運 動 過 程 中，運 動 強 度 由 輕 度 至 中 度 的 漸 進 變 化，更 可 以 作為老年人的健康照護方式，同時避免其足部與膝關節的損 傷。 在 過 去 的 文 獻 上 可 以 發 現 ， 每 週 3小 時 的 自 行 車 運 動 與 無 運 動 之 受 試 者 相 較 之 下 可 以 降 低 約 40%的 死 亡 率 (Andersen, 2 0 0 0 )。 在 芬 蘭 ， 老 年 人 平 均 具 有 1 5 - 2 9 分 鐘 的 走 路 或 騎 駛 自 行 車 之 習 慣，研 究 觀 察 到 心 血 管 疾 病 所 造 成 之 死 亡 率 有 明 顯 的 降 低 ( B a r e n g o , 2 0 0 4 )。 每 星 期 約 6 0 分 鐘 的 規 律 性 中 強 度 運 動 持 續 12個 月 ， 會 增 強 唾 液 中 的 黏 膜 免 疫 球 蛋 白 IgA之 濃 度 與 分 泌 之 速 率 ( A k i m o t o , 2 0 0 3 )。 從 目 前 研 究 結 果 ， 顯 示 運 動 的 強 度 與 與 免 疫 功 能 是 有 關 的 (Nieman, 1994)。 部 份 研 究 文 獻 則 提 及 老 年 人 運 動 會 影 響 細 胞 內 免 疫 功 能 的 作 用 (Shephard, 1995 & Flynn,1999 & Mazzero, 1994 & Houston, 1997 )。 舉 例 而 言 ， 具有運動習慣的老年人與無運動習慣的老年人相較之下在冷 凍切片檢查中可以發現具有運動習慣的老年人其組織細胞內 會 表 現 出 較 多 的 T細 胞 (Shinkai, 1995)。 進 一 步 的 研 究 更 發 現 老 年 女 性 在 介 入 16週 的 耐 力 運 動 訓 練 相 較 於 無 運 動 訓 練 之 下 1.
(12) 會 表 現 出 較 佳 的 NK cell活 性 (Crist, 1989)。 而 動 物 實 驗 中 ， 老 鼠 在 中 強 度 運 動 之 下 會 表 現 出 對 H S V- 1 有 較 佳 的 抵 抗 力 ( D a v i s , 2003)。 細 胞 激 素 在 受 刺 激 作 用 下，可 表 現 出 對 病 毒 的 免 疫 抵 抗 作 用 。 IFN-γ會 經 由 人 類 週 邊 血 液 單 核 球 細 胞 (Human peripheral blood mononuclear cells， PBMNC)所 分 泌 出 ， 此 分 泌 的 IFN-γ 對 H B V 的 表 現 具 有 抑 制 作 用 ( S u r i , 2 0 0 1 )。 T N F - α 可 經 由 細 胞 對 於 抗 H B V 病 毒 的 機 轉 作 用 所 活 化。造 成 其 機 轉 最 主 要 的 影 響 來 自 於 TNF-α表 現 量 的 增 加 (Hsu, 1999)。 透 過 中 強 度 運 動 的 過 程 ， 血 液 中 可 以 表 現 出 TNF-α的 生 成 (Moldoveanu, 2000)。 因此研究論文設計透過規律化的有氧自行車運動的老人 受測者，評估其週邊單核細胞，所增進之免疫活性對於經由 PHA 植 物 血 凝 集 素 刺 激 Hep-3B 細 胞 抗 病 毒 的 表 現 。 評 估 具 有習慣性自行車運動的老年人相較於無習慣性運動的控制 組，其 對 於 抵 抗 HBV 表 現 的 免 疫 反 應 之 差 異，本 實 驗 利 用 分 離 之 人 類 週 邊 單 核 球 細 胞，並 體 外 培 養 其 細 胞 再 藉 由 P H A 刺 激免疫反應等體外試驗觀察因人類週邊單核血細胞分泌的細 胞激素對於抗病毒的效應。. 第二節. 研究問題與假設. 壹、研究問題 依據研究動機及研究目的，本研究將探討下列問題： 一、具自行車運動習慣之老年人，其週邊單核球血細胞於體 外實驗對於 B 型肝炎病毒抑制之表現？ 二、於無運動習慣之老年人，其週邊單核球血細胞於體外實. 2.
(13) 驗對於 B 型肝炎病毒抑制之表現？ 貳、研究假設 依據研究動機及研究目的，本研究將驗證下列假設： 假設一：運動習慣（自行車運動）有無，其週邊單核球細胞 在 抑 制 HBV 作 用 上 是 有 顯 著 的 差 異 。 假 設 二：因 運 動 習 慣 所 分 泌 之 細 胞 激 素 對 於 H B V 抑 制 上 是 有 顯著差異。. 第三節. 研究限制. 壹、研究方法的限制 本研究以細胞培養之體外試驗為主，由於受試者為非 HBV 帶 原 者，則 以 病 毒 細 胞 株 培 養 作 為 模 擬 感 染 病 毒 之 受 試 者，故體外實驗無法與人體實際研究結果相互比較差異是本 研究方法限制之一。. 貳、取樣的限制 本研究取樣以老年人為範圍，以自願參與研究方式為 主，無法涵蓋全面性，取樣誤差為本研究限制之二。. 參、研究推論的限制 本 研 究 以 特 定 病 毒 細 胞 株 培 養 (Hep3B)模 擬 人 體 免 疫 表 現方式為研究範圍，對於不同種類之病毒細胞培養於免疫表 現之推論有其限制，為本研究限制之三。. 3.
(14) 第四節. 重要名詞解釋. 壹、老人 臺 灣 於 1 9 8 0 年 通 過 的 老 人 福 利 法 第 二 條 規 定「 本 法 所 稱 老 人 ， 係 指 年 滿 65歲 以 上 之 人 ， 因 而 本 研 究 敘 述 之 老 人 ， 是 將 65 歲以上者定義之。. 貳 、 B 型 肝 炎 病 毒 (HBV， Heptitis B virus) B 型 肝 炎 病 毒 (Hepatitis B virus)簡 稱 為 B 肝 病 毒 (HBV)。 屬 DNA 病 毒 ， 分 類 為 肝 炎 DNA 病 毒 科 （ hepadnavividae） 。 為 4 2 n m 大 之 雙 股 去 氧 核 醣 核 酸（ D o u b l e strand-DNA） 病 毒 ； 由 27 nm 大 小 之 核 心 所 組 成 （ HbcAg & H b e A g ）， 外 層 為 脂 蛋 白 外 套 ， 此 外 套 包 含 B 型 肝 炎 表 面 抗 原 （ H B s A g ）。 表 面 抗 原 （ H B s A g ）： 為 B 型 肝 炎 病 毒 之 外 套 蛋 白分子，存在於肝細胞或血清內表現時，則表示為感染 B 型 肝 炎 。 核 心 抗 原 （ HBcAg） 為 B 型 肝 炎 病 毒 核 心 中 的 蛋 白 抗 原 ， 存 在 於 病 毒 複 製 活 躍 的 肝 細 胞 中 。 e 抗 原 （ HBeAg） 亦 存在於病毒核心中，通常出現在表面抗原高的病人血清中， 它 的 存 在 表 示 病 毒 仍 進 行 活 躍 的 複 製，此 時 血 清 B 型 肝 炎 病 毒的傳染力強。. 參 、 植 物 血 球 凝 集 素 (Phytohaemagglutini、 PHA) 植 物 血 凝 素 (Phytohaemagglutinin)是 一 種 有 絲 分 裂 原 ， 主 要 用 於 激 活 免 疫 細 胞 。 淋 巴 細 胞 為 干 擾 素 (Interferon)誘 導 劑，不 但 可 以 刺 激 組 織 產 生 間 白 素 - 2 ( I L - 2 ) 和 干 擾 素 以 及 促 進 身體形成非特異性抗體。. 4.
(15) 肆 、 細 胞 激 素 (Cytokine) 細胞激素為分子量在. 8 ∼ 2 5 k D 大 小 的 醣 蛋 白，其 分 子 具. 多樣性，能傳遞訊息予淋巴球、吞噬細胞與身體其他細胞。 它 們 是 由 Th 細 胞 受 到 刺 激 時 而 釋 放 出 來 ， 活 化 B 細 胞 ， 除 了作用至免疫細胞，其他細胞如內皮細胞，神經細胞，腦部 都會受到影響，細胞激素作用方式可以是自我調控方式 ( a u t o c r i n e )， 影 響 到 其 他 週 遭 細 胞 的 方 式 ( p a r a c r i n e )， 不 同 細 胞 激 素 之 間 可 以 利 用 加 成 作 用 (synergy)， 連 續 作 用 ( s e q u e n t i a l ) 或 拮 抗 作 用 ( a n t a g o n i s m ) 等 不 同 的 方 式 彼 此 作 用。 常 見 之 細 胞 激 素 種 類 有 幾 種 ， 如 :干 擾 素 (Interferons, IFNs) 、 間 白 素 (Interleukins, ILs) 、 株 落 刺 激 因 子 (Colony stimulating factor s, CSFs) 、 腫 瘤 壞 死 因 子 (Tumor necrosis factors, TNF-α、 β) 與 轉 化 生 增 殖 子 -β(Transforming growth factor-β, TGF-β)等 細 胞 作 用 因 子 (Ivan Roitt, Jonathan Brostoff, David Male, 1999)。. 5.
(16) 第二章. 文獻探討. 本節旨在瞭解老年人經由自行車運動後所產生的免疫作 用與理論對. B 型肝炎病毒表面抗原的影響，其中相關的研. 究，以下分述之。. 第一節、老化與運動 台灣人口老化速度冠於全球，老人已占總人口 1 0 . 6 3 % ( 內 政 部 , 2 0 1 0 )， 世 界 各 國 之 中 如 芬 蘭 、 日 本 和 台 灣 均 是人口快速老化的國家，國內老人醫療支出不但已占去家庭 醫 療 總 支 出 的 20%， 亦 耗 費 3 成 以 上 的 醫 療 資 源 ， 不 僅 顯 示 台灣老人身心健康與生命品質情況普遍不佳，亦突顯出國內 健保經費大多花費在疾病治療部分，應多增加於「保健、疾 病預防」之比例。幫助老人做適當的運動，使老人更健康， 進而減少醫療上的經費支出。老化和遺傳因子、生活環境及 心理狀況等有關，也和生理機能的代謝過程有關。透過運動 可以增加全身血液循環，讓身體組織保持活性及增加細胞修 復 功 能（ 細 胞 修 復 功 能 隨 著 年 紀 增 大，會 變 較 差 ） ，增 強 肌 力 、 耐力、柔軟度及心肺功能，協調平衡能力，讓身體處在高效 率 的 生 理 狀 態。 同 時，運 動 有 降 低 血 糖、降 低 休 息 時 的 血 壓 、 降低血脂肪的三低作用，很適合老人。而且，運動可以使身 心舒暢、增加青春活力，使人保有積極樂觀的心理，如此更 可延緩老化。 牟 鍾 福 (2010)於 我 國 老 人 運 動 政 策 報 告 書 中 調 查 指 出 65歲 以 上 老 人 參 與 程 度 最 高 的 休 閒 運 動 ， 前 五 項 依 序 為 ： 散 步 、 健 行 、 郊 遊 /旅 遊 、 爬 山 、 伸 展 運 動 。 55~64歲 年 輕 老 人 參. 6.
(17) 與程度最高的休閒運動，前五項依序為：散步、健行、郊遊/ 旅遊、爬山、自行車。最喜歡參與的休閒運動依序為：散步、 健 行 、 爬 山 、 自 行 車 、 慢 跑 、 郊 遊 /旅 遊 、 養 身 運 動 、 伸 展 運 動、游 泳 及 舞 蹈 運 動。間 接 反 應 出 老 年 人 參 與 之 休 閒 運 動 皆 趨 向 於 低 強 度 至 中 強 度 運 動 類 型。因 而 老 年 人 運 動 計 劃 定 訂 則 需 考量為輕、中強度運動為佳。 文 獻 建 議 其 運 動 型 態 可 包 含 健 身 房 用 腳 踏 車，運 動 強 度 則 由 輕 度 運 動 強 度 開 始，並 僅 需 中 等 運 動 強 度 對 老 年 人 就 能 促 進 健 康 等 建 議 事 項 (Chih-Chin Hsu & Alice May-Kuen Wong, 2003)， 因 而 本 研 究 計 劃 定 訂 則 選 擇 具 自 行 車 運 動 習 慣 之 老 年 人為測驗模式。. 第二節、運動型式與免疫細胞調控之現象 由 運 動 所 表 現 出 的 免 疫 現 象 已 日 趨 重 要，其 中 包 含 運 動 過 程中對於骨質或軟組織所產生的損傷反應進而由身體免疫系 統 下 表 現 的 徵 兆 與 現 象。其 中 細 胞 內 表 現 的 免 疫 作 用，則 稱 為 細 胞 性 免 疫，由 發 炎 反 應 所 造 成 的 免 疫 刺 激，促 使 細 胞 分 泌 多 種 不 同 型 式 的 細 胞 型 式，最 常 見 的 是 身 體 組 織 由 血 液 中 釋 出 白 血 球 (White Blood Cell或 Blood Mononulear cells)再 經 由 活 化 白 血 球 釋 出 細 胞 激 素。本 段 主 在 解 釋 因 運 動 所 表 現 出 免 疫 細 胞 調控之現象。 舉例而言，如馬拉松運動，其特性則包含有高強度、長 時 間 等 特 性，因 此 對 於 身 體 系 統 造 成 的 壓 力，更 是 值 得 注 意 。 其中內分泌系統與免疫系統因壓力所產生的變化，對免疫反 應產生的影響。研究表示競技性馬拉松運動是具有極大的壓. 7.
(18) 力，同時對身體生理系統造成顯著性的影響，在過程中會出 現脫水、體重降低、腸胃問題、體溫過高與肌肉損傷等問題 ( P e t e r, E l e n a e t a l . , 2 0 0 3 ) 。 Fournier(1997)和 O’Connor(1995)研 究 指 出 耗 竭 性 與 耐 力的運動因素可能影響細胞藉由體液性的免疫反應而影響神 經內分泌系統。神經內分泌系統活化則因馬拉松運動的特性 所 形 成 之 壓 力 反 應 則 會 下 視 丘 -腦 下 垂 體 -腎 上 腺 軸 ( H y p o t h a l a m u s - P i t u i t a r y - A d r e n a l A x i s , H PA ) 的 活 化 。 Peter (2003)研 究 以 7 位 選 手 參 與 馬 拉 松 競 賽 活 動 ， 結 果 顯示賽後血液中會產生顯著性的白血球分佈情形改變，並影 響免疫系統與內分泌系統的平衡。研究指出當運動時因身體 所產生的壓力會使得腎上腺素分泌加速，並觀察到週邊血液 之 腎 上 腺 素 濃 度 上 升 ， 使 得 因 含 有 β-腎 上 腺 素 受 體 之 細 胞 ， 如 L y m p h o c y t e ( 淋 巴 細 胞 ) 、 T- c e l l ( T 細 胞 ) 和 N e u t r o p h i l s ( 嗜 中 性 球 )由 脾 臟、肝 臟 等 器 官 中 釋 出 而 進 入 週 邊 血 液 循 環，而 生長激素分泌增加使得嗜中性球的數量亦跟著增加 ( P e r d e r s e n , 1 9 9 7 )。 而 R a b i n ( 1 9 9 6 ) 與 P e r d e r s e n ( 1 9 9 7 ) 指 出 皮 質類脂醇影響血管中內皮細胞附著分子的改變，同時使得淋 巴球細胞、單核球細胞、嗜酸性白血球、嗜中性白血球與自 然殺手細胞出現減少情形。 當運動強度增強時，淋巴細胞的濃度於運動期間為顯著 性 的 增 加 ， 運 動 過 後 顯 著 性 的 下 降 (含 CD8+毒 殺 型 T 細 胞 、 CD4+輔 助 型 T 細 胞 、 CD19+B 細 胞 等 )。 當 運 動 壓 力 所 形 成 之免疫反應，包含了免疫細胞類型與數目的改變、細胞激素 的 調 節 ( Ve n k a t r a m a n & P e n d e r g a s t , 1 9 9 8 )。 邱 亦 涵 等 人 ( 2 0 0 3 ) 指出長時間運動對免疫系統有重大的影響。在急性運動後，. 8.
(19) 初 級 免 疫 細 胞 ， 如 自 然 殺 手 細 胞 (nature killer cell, NK cell)、 單 核 球 (monocyte)與 嗜 中 性 球. (neutrophil)， 不 論 在. 數量或功能上均有所變化。 文 獻 指 出 ， 耗 竭 性 運 動 (strenuous exercise) 導 致 身 體 產 生發炎反應，發炎反應則表現出如同組織受傷或感染形成的 急 性 期 反 應 (acute phase response) 兩 者 現 象 有 許 多 相 類 似 之 處 (Camus et al., 1994)。 Davidson, Robertson 與 Maugha n 等 人 (1987)以 113 位 選 手 參 加 馬 拉 松 賽 ， 完 成 比 賽 平 均 時 間 為 240.5 分 鐘 為 跑 完 步 時 週 邊 血 液 之 平 均 顆 粒 白 血 球 濃 度 增 加 接 近 200%。 Garbriel 等 人 ， 以 9 位 受 試 者 以 100 公 里 之 超 級 馬 拉 松 的 方 式 跑 完 全 程 ， 平 均 完 成 時 間 為 487 分 鐘 ， 週 邊 血 液 之 嗜 中 性 白 血 球 平 均 增 加 3 1 0 %。M a r i a R . ( 2 0 0 2 ) 以 8 位 受 試 者 參 與 1 9 9 9 年 巴 勒 莫 馬 拉 松 賽 ， 平 均 完 成 時 間 為 207 分 鐘 ， 嗜 中 性 白 血 球 濃 度 上 升 至 150%。 Galun 等 人 (1987)， 認 為 運 動 所 產 生 的 血 球 變 化 主 要 受 內 分 泌 荷 爾 蒙 的 影 響，其 中 包 括 皮 質 醇 與 兒 茶 酚 胺。 由於運動壓力所形成的刺激而使得細胞激素增加而使得 身體各器官中的白血球釋出而造成循環血液中的濃度升高。 但由於荷爾蒙刺激源消失後而使得兒茶酚胺類之腎上腺素、 正腎上腺素因壓力下降後，濃度減少，因此白血球的濃度亦 跟 著 減 少 ( M c C a r t h y, 1 9 8 8 ) 。 Rainwater(1995)於 2.5 小 時 之 treadmill 跑 步 運 動 之 研 究 ， 運 動 後 淋 巴 細 胞 經 由 Con-A 刺 激 ， 以 形 成 增 殖 現 象 然而運動過量，或從事長時間且高強度運動後。血液中 免 疫 系 胞 會 出 現 下 降，進 而 影 響 免 疫 系 統 的 表 現。P e t e r s ( 1 9 9 7 ) 與 Nieman(1990)以 流 行 病 學 調 查 發 現 當 耐 力 型 運 動 競 賽 後 兩. 9.
(20) 星 期 內 ， 上 呼 吸 道 感 染 (upper respiratory tract infections; U R T I ) 機 率 會 上 升。N i e m a n , J o h a n s e e n , L e e 與 A r a b a t z i s ( 1 9 9 0 ) 以 1987 年 洛 杉 磯 馬 拉 松 競 賽 前 後 所 產 生 的 感 染 情 形 作 一 分 析，結果表示完成馬拉松賽選手於賽後一星期內上呼吸道感 染 情 形 有 12.9%。 Mars 等 人 (1998)發 現 耐 力 運 動 性 的 選 手 當 運 動 至 衰 竭 情 形 ， 便 會 開 始 出 現 細 胞 凋 亡 (apoptosis)， 比 率 有 明 顯 增 加 的 趨 勢 。 徐 台 閣 、 徐 廣 明 、 蘇 文 和 、 張 永 政 (2001)以 TUNEL(terminal-deoxynucleotidy-transferase-mediate dUTP biotin nick end labeling stain)當 馬 拉 松 賽 後 ， 以 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 經 由 綠 色 螢 光 所 染 色 之 淋 巴 細 胞，而 由 a p o p t o s i s 所 增 加 之 比 率 於 賽 後 3 0 分 鐘 比 率 增 加 至 2 3 %。研 究 結 果 表 示 馬 拉 松 賽會造成淋巴細胞自發性死亡，而使得淋巴細胞數減少。 文獻整理進一步發現運動對於自然殺手細胞的作用，自 然 殺 手 細 胞 (Natural Killer cell)簡 稱 NK cell， 屬 於 淋 巴 細 胞 的一種，可直接殺死癌細胞與感染病毒的細胞，可以同時進 行 專 一 與 非 專 一 的 免 疫 機 制 ， 目 前 已 知 最 多 的 NK cells 標 記 為 CD56、 CD16， 而 CD16 功 能 為 參 與 NK cells 的 活 化 ， 其 中 NK cells 的 活 化 可 以 經 由 細 胞 激 素 (IL-2、 IL-12、 Interferon-α 與 Interferon-β)刺 激 所 產 生 ， 受 到 刺 激 與 活 化 的 NK 細 胞 可 以 釋 出 Interferon-γ 與 GM-CSF 等 細 胞 激 素 。 當運動特性開始表現長時間，且強度增強時，如馬拉松 運動。在運動過後一小時內自然殺手細胞出現大量的減少與 毒 殺 活 性 降 低 。 身 體 內 形 成 之 巨 大 壓 力 進 而 影 響 NK cells 的 活化情形，主要因. NK cells 受 到 細 胞 激 素 (Interleukin-2、. Interleukin-12)與 荷 爾 蒙 刺 激 等 因 素 的 作 用 。. 10.
(21) Ya m a d a ( 2 0 0 2 ) 以 1 2 位 男 性 選 手 ( w i n t e r - s p o r t ) 於 treadmill 上 進 行 最 大 運 動 能 力 試 驗 (Maximal exercise test)直 至 衰 退 ， 而 運 動 後 與 運 動 前 相 較 之 下 ， G-CSF、 IL-6 顯 著 上 升 約 210%。 Shinkai(1993)以 三 項 鐵 人 運 動 經 由 運 動 2~3 小 時 ， 其 血 液中單核球濃度出現出現增加。血液中呈現單核球活化與增 多，大多情形出現於衰竭性運動中。而影響單核球細胞活化 的影響因素則包括了細胞激素，內分泌系統。因衰竭性運動 過後會早成發炎現象，故因此造成嗜中性球與單核球趨向受 傷 區 域 ， 白 血 球 同 時 會 分 泌 出 I L - 1、 I L - 6 與 T N F - α 等 。 同 樣 的 情 形 在 Ostrowki(1999)以 10 位 男 性 選 手 參 與 哥 本 哈 根 馬 拉 松 賽，平 均 完 成 時 間 為 3 小 時 27 分，血 液 中 單 核 球 與 嗜 中 性 球 活 性 與 分 泌 於 血 液 中 時 間 增 加 ， 細 胞 激 素 IL-1β、 IL-6 與 TNFα 等 均 於 馬 拉 松 賽 後 升 高 ， 促 使 單 核 球 與 嗜 中 性 球 活 性 與分泌於血液中時間增加。 運動後所形成免疫系統與細胞的現象，會因運動強度、 時間長短因素，而有所差異。形成耗竭性運動的過程中，造 成身體內組織的傷害與強烈發炎反應。當運動強度提高時， 在運動期間會造成血液中細胞大量分泌並形成訊息使得細胞 激素釋出，而使得淋巴細胞數出現降低，並出現發炎前與抗 發炎激素的分泌等。另外，針對老人運動的時間也應避免過 長。因長時間運動過後會使得免疫力出現下降的問題，是需 要 注 意，因 運 動 後 所 造 成 之 上 呼 吸 道 感 染 現 象，使 身 體 組 織 ， 感染疾病機率大為提高而使得身體健康受影響。由上述文獻 探討藉此了解與發現運動與免疫細胞作用之關係，進而形成 一推論於本實驗中觀察老人藉由運動所表現出之免疫反應。. 11.
(22) 第三節、免疫表現與抗病毒作用之關係 免 疫 反 應 初 期 探 討 來 自 於 病 原 體 的 感 染 。 病 原 體 (pathogen) 包 括 細 菌 ( b a c t e r i u m )、 病 毒 ( v i r u s )、 真 菌 ( f u n g i ) 以 及 寄 生 蟲 (parasite)等 。 當 身 體 出 現 感 染 時 ， 免 疫 作 用 則 會 低 下 。 當 免 疫反應作用時會釋出許多吞噬細胞 中的嗜中性球. (phagocyte) 如 循 環 血 液. ( n e u t r o p h i l )、 單 核 球 ( m o n o c y t e ) 以 及 週 邊 組. 織 中 的 巨 噬 細 胞 ( m a c r o p h a g e )。 促 使 巨 噬 細 胞 活 化 以 對 抗 外 來病原，而降低其對體內之傷害。一般來說，對抗免疫反應 的 表 現 為 藉 由 內 毒 素 （ endotoxin） 刺 激 巨 噬 細 胞 時 ， 其 產 物 有 ： ( 1 ) 高 反 應 性 含 氧 分 子 （ r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s , R O S ）： 如 一 氧 化 氮 （ n i t r i c o x i d e , N O ）。 ( 2 ) 脂 質 衍 生 物 ： 白 三 烯 素 （ l e u k o t r i e n e s ）、 前 列 腺 素 （ p r o s t a g l a n d i n s ） 及 血 栓 凝 集 素 （ t h r o m b o x a n ）。 ( 3 ) 蛋 白 質 ： 通 常 是 I n t e r l e u k i n （ 如 I L - 1、 I L - 6、 I L - 8 ）、 T N F - α、 I F N - γ， 其 中 I L - 1、 I L - 6 及 T N F - α 為 促 發 炎 細 胞 激 素 （ p r o - i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s ）， 並 在急性發炎反應中扮演重要角色。 常見細胞激素之作用如下: 一 、 IL-1(介 白 質 -1):由 許 多 不 同 的 細 胞 ， 包 括 單 核 球 、 巨 噬 細 胞 及 寡 樹 突 細 胞 所 分 泌 ， 以 IL-1α及 IL-1β兩 種 形 式 存 在 ， IL-1 主 在 誘 導 急 性 期 蛋 白 質 之 產 生 、 刺 激 T及 B細 胞 的 活 化等。 二 、 IL-6(介 白 質 -6):屬 多 功 能 之 細 胞 激 素 ， 為 巨 噬 細 胞 、 T細 胞 、 纖 維 母 細 胞 及 內 皮 細 胞 等 分 泌 形 成 ， 為 刺 激 T細 胞 的 活 化 及 刺 激 B 細 胞 產 生 抗 體 等 (Chia-Wen Liang, Yi-Chung Lai and Yan-Hwa Chu, 2004)。. 12.
(23) 三 、 T N F - α（ 腫 瘤 壞 死 因 子 - α ） : 從 單 核 球 及 巨 噬 細 胞 中 所 產 生 出 來，其 功 能 可 以 誘 導 單 核 白 血 球 及 巨 噬 細 胞 分 化、活 化 巨噬細胞、刺激補體及凝血系統。在脂多醣體 （ lipopolysaccharide, LPS） 誘 導 的 發 炎 反 應 中 ， 誘 導 IL-1、 IL-6 及 IL-8 的 產 生 ， 誘 導 感 染 區 域 血 管 促 進 黏 附 分 子 聚 集，使 內 皮 細 胞 產 生 血 小 板 活 化 因 子，以 催 化 血 液 凝 結 ， 防 止 病 原 菌 擴 散 (Peter P, 2000)。 四、I F N ( 干 擾 素 ) : 干 擾 素 具 有 抗 病 毒 及 免 疫 調 節 的 作 用 ( R i c o M A , 2 0 0 1 )。 透 過 複 雜 的 作 用 機 制 ， 干 擾 素 降 低 肝 細 胞 支 援病毒複製的能力，產生有助於清除感染的宿主蛋白 質，並 且 強 化 毒 殺 型 T 細 胞 及 自 然 殺 手 細 胞 對 於 病 毒 抗 原 的 攻 擊 能 力 ， 以 達 到 清 除 病 毒 的 能 力 (Harari A. Et al., 2006 ; Savoldo B. Et al., 2006 ; Me i e r UC. et al., 2005)。 干 擾 素 可 分 為 α-、 β-及 γ-三 種 形 式 ， 干 擾 素 α 是 由 白 血 球纖維母細胞或活化的 B 淋巴球所分泌的一種蛋白質； 干擾素 β 是由纖維母細胞合成，兩者都是由感染病毒的 細胞產生。而干擾素 γ 是由 T 淋巴球及自然殺手細胞所 產 生 ， 可 活 化 巨 噬 細 胞 (Kota RS. et al., 2006 & Fujiwara N. et al.,2006) 免疫系統經由訊息交換與傳遞是可以互相調控的。而調 控各個訊息環節的免疫因子在受到刺激時，便會啟動免 疫防禦機制。以現代研究中影響起始的正向作用因素多 為運動與藥物等刺激模式。 運 動 就 是 影 響 免 疫 系 統 的 一 個 例 子 (Gabriel & Kindermann, 1997; Nieman, 1997; Shinkai, Konishi, &. 13.
(24) Shephard, 1997)。 上 述 文 獻 曾 探 討 提 過 ， 白 血 球 的 生 物 活 性 包括淋巴細胞的增殖測試、自然殺手細胞的毒殺能力以及黏 膜 組 織 抗 體 IgA 都 將 因 為 劇 烈 運 動 後 而 有 所 降 低 ， 而 IL-1、 IL-6 以 及 TNF -α 在 血 液 中 的 濃 度 則 會 上 升 (Pedersen et al., 2 0 0 0 )。 但 其 免 疫 表 現 ， 如 免 疫 細 胞 數 改 變 、 細 胞 激 素 濃 度 增 減皆發生於人體，並無詳細探討其作用機制。 因而可利用細胞或動物實驗的模式研究其相關機轉。影 響免疫因素對於人類腫瘤細胞關係，目前皆為探討增殖或抑 制 現 象 ， 文 獻 指 出 運 動 對 於 NK cell 的 調 節 作 用 ， 經 過 身 體 訓 練 模 式 (Physical exercise training,PET) 後 其 實 驗 組 血 液 中 NK cell 表 現 出 的 毒 殺 腫 瘤 細 胞 (Cytotoxic)的 能 力 有 顯 著 上 升 (Crist, Mackinnon, Thompson, Atterbom & Egan, 1989)。 利 用 結 合 碳 水 化 合 物 (Carbohydrate)與 運 動 可 以 發 現 降 低 H S V- 1 的 感 染 ( E . A n g e l a M u r p h y, J . M a r k D a v i s & Martin D. Carmichael, 2009)。 部 份 動 物 實 驗 觀 察 到 ， 老 鼠 運 動 到 疲 勞 後 ， 其 組 織 內 巨 噬 細 胞 對 於 H S V- 1 抗 病 毒 作 用 則 會 下 降 。 細 胞 激 素 中 IFN 的 生 成 目 前 是 已 知 抗 病 毒 最 重 要 的 防 禦 機 制 ， ISG15 為 其 抗 病 毒 之 蛋 白 質 ， 並 可 藉 由 IFN 的 分 泌 進 而 抵 抗 I n f l u e n z a、h e r p e s 與 S i n d b i s v i r u s e s 的 感 染 ( D e b o r a h J . e t a l . , 2 0 0 7 )。細 胞 激 素 對 於 抗 病 毒 作 用 的 情 形，除 了 於 H I V 的 感 染 的 患 者 中 發 現 ， 亦 可 以 在 EBV 急 性 感 染 期 中 觀 察 到 IFN-γ IL-10, TNF-α 與 IL-6 的 表 現 (Cecilia. et al.,1996)。 然 而，部 份 研 究 以 動 物 實 驗 模 式 將 基 因 轉 殖 鼠 注 射 I L - 1 2 與 IL-18 可 以 觀 察 到 HBV 複 製 情 形 明 顯 被 抑 制 (Cavanaugh et al.,1997 ; kimura et al., 2002)。 另 有 細 胞 試 驗 之 模 式 進 行 細 胞 激 素 活 化 後 對 H B V 作 用 之 探 討，具 運 動 習 慣 的 中 年 受 試 者. 14.
(25) 與 正 常 作 息 之 控 制 組 從 事 太 極 拳 運 動 (中 強 度 運 動 )， 可 以 觀 察 到 具 運 動 習 慣 的 控 制 組 所 採 集 之 PBMNC 經 由 PHA 刺 激 分 泌 的 細 胞 激 素 可 以 抑 制 H B V 的 抗 表 現 情 形 ( C h e n Y. Y, e t a l . , 2008)。 根據上述所探討的免疫表現與作用之關係，了解免疫反 應可以經由運動的刺激而生成，並經由細胞激素的分泌表現 而形成抗病毒的初級免疫作用。綜合上述三段文獻探討在於 了解運動行為會影響免疫系統的作用，影響的因素在於運動 種類、時間、強度等。再透過老人醫學的觀點，藉由運動提 升免疫力進而降低外來病原的感染作為選定研究主題的方 向。. 15.
(26) 第三章. 研究方法. 本章根據研究動機及目的，輔以相關文獻探討的結果， 作為研究的架構依據。本研究以體外為主要之研究方法，首 先針對受試對象以問卷調查所得到之結果進行統計分析，將 分析之結果陳列出，之後再結和文獻探討之方式，將研究結 果與相關文獻進行探討，以探究研究架構所含的研究問題； 茲就本研究方法分為研究架構、研究實施程序及進度管制、 研究對象、研究工具及資料處理等項，依序分節敘述. 第一節. 研究架構. 本研究主要目的在探討台灣老年人經運動習慣的持續經 血液細胞與混合 B 型肝炎病毒株培養透過分泌之細胞激素觀 察 對 於 HBV 抗 原 抑 制 表 現 情 形 。. 第二節. 研究實施程序. 本研究之進行其程序分為：一、收集分析文獻；二、決 定研究主題；三、實驗方法擬定；四、實驗資料收集；五、 電 腦 資 料 處 理 ； 六 、 撰 寫 論 文 報 告 。 如 圖 3-1 所 示 ：. 16.
(27) 文獻蒐集分析. 確立研究主題. 實驗方法擬定. 實驗資料收集. 電腦資料處理. 撰寫研究報告. 圖 3-1. 研究實施程序. 一、收集分析文獻 利用中華民國期刊論文索引系統、中文期刊電子服務（ C E P S ）、 P u b - m e d 、 P r o Q u e s t 、 H i g h w i r e 、 C o c h r a n e 等 系 統 ， 針對國內外相關文獻資料進行廣泛蒐集及評讀並經分析、整 理與實驗室接續性研究，以形成研究主題。. 二、決定研究主題 經廣泛蒐集及研讀相關文獻後，對老人醫學、運動免疫 、B 型肝炎病及體外試驗等相關研究條件並加上實驗室內系. 17.
(28) 統化接續性之研究方向，而確立此研究主題。. 三、實驗方法擬定 發展問卷作為研究工具以符合研究需要。在發展工具過 程中主要分成兩個步驟，其一：以研究主題，對相關人員進 行調查，了解研究主題實務層面的現況，其二：結合文獻理 論，作為編製工具的基礎。依研究之需要，結合理論分析資 料，編製研究工具。 五、電腦資料處理 基本背景資料問卷回收後，檢視背景資料數據並予以分 類後，輸入電腦建檔處理，並登錄問卷施測結果，再進行資 料分析，並以統計考驗研究假設，以了解研究結果。. 六、撰寫論文報告 將研究結果撰寫論文，提出研究結論與建議，已完成研 究論文。. 18.
(29) 第三節. 研究方法. 壹、 研究樣本 本 次 實 驗 共 收 集 2 9 位 老 年 男 性 參 與 本 次 研 究，其 中 有 關 身 體 質 量 組 成 由 中 國 文 化 大 學 所 提 供 檢 測，1 5 位 男 性 受 試 者 為 具 有 清 晨 自 行 車 運 動 習 慣 ， 其 頻 率 每 日 為 2小 時 ， 每 週 至 少 2次 ， 其 運 動 歷 程 至 少 2年 以 上 ， 因 此 定 義 為 具 自 行 車 運 動 習 慣 實 驗 組 ( H C E g r o u p， H a b i t u a l c y c l i n g e x e r c i s e )。 另 外 1 4 位 男 性 在 本 次 研 究 之 前 並 不 具 有 任 何 與 身 體 活 動 有 關 之 習 慣，因 此 定 義 為 靜 態 控 制 組 (SC group， Sedentary group)。 所 有 的 收 試 者 皆 接 受 臨 床 身 體 檢 查，受 試 者 本 身 無 肌 肉 損 傷、肺 炎、心 血 管 及 手 術 治 療 等 病 史。在 研 究 期 間 需 進 行 血 液 檢 體 採 集 與 分 析 ， 受 試 者 背 景 需 注 意 不 得 為 HBV帶 原 者 或 HBs Ag為 陽 性 。 在 血 液 檢 體 採 集 之 前 ， HCE group 需 接 受 HCE 計 劃 2 個 月。此計劃為一星期二次，從清晨 5 點至 8 點進行自行車運 • 動，過 程 中 行 車 速 度 需 等 同 於 32% VO2peak 。另 一 組 受 試 者 在研究期間禁止從事任何身體活動。 所 有 的 受 試 者 於 自 行 車 運 動 前 30分 鐘，營 養 控 制 上，可 食 用 肉 品 與 3片 白 吐 司 、 1顆 蛋 、 240C.C的 牛 奶 。 研 究 開 始 前 4週 及 研 究 期 間，限 制 受 試 者 攝 取 任 何 加 入 咖 啡 因 的 飲 料、喝 酒 、 服藥、抽煙與維生素飲用等行為。 每 位 受 試 者 需 接 受 相 同 的 運 動 強 度 試 驗，其 中 包 括 心 跳 率 計 數 使 用 (使 用 Polar pacer heart rate)， 使 用 過 程 為 HCE計 劃 中，為由運動到筋疲力竭再回復至安靜休息的狀態。 血 液 檢 體 採 集，從 實 驗 前 48小 時，其 中 包 含 受 試 者 食 用 肉 類 之 前 與 靜 止 休 息 狀 態 等 ， 採 集 時 間 點 在 早 上 8點 至 9點 。 19.
(30) 所 有 的 受 試 者 (HCE和 SC組 )， 受 試 者 平 均 年 齡 為 66 ± 5.6 years (區 間 在 59至 69 years)， 受 試 者 平 均 身 高 為 164.2 ± 8.3 cm， 受 試 者 平 均 體 重 為 62.1 ± 9.5 kg， 以 上 兩 群 (HCE和 SC組 ) 所測得之所有的基本背景變項並無顯著差異。. 貳、 受試者心肺適能測定 每一位受試者分別進行兩種初步之測驗，第一種試驗為 • 測 量 V O 2 p e a k 和 氧 氣 之 消 耗，第 二 種 測 量 其 進 行 H C E 運 動 速 • • 度 達 到 32% VO2peak 。 VO2peak 和 氧 氣 之 消 耗 使 用 respiratory system 做 為 監 測 (為 respiratory system， Q-plus IW/Corival 400， Seattle， WA， USA)， 受 試 者 使 用 電 子 自 行 車 ergometer進 行 漸 增 運 動 模 擬 (Lode Excalibur， Quinton Instruments， Seattle， WA， USA)， 本 次 最 大 需 氧 運 動 試 驗 從 研 究 期 間 前 一 個 月 便 開 始 完 整 進 行 記 錄。記 錄 過 程 為 受 試 者 熱 身 之 後 ， 開 始 進 行 負 荷 式 的 運 動 ， 一 開 始 為 2分 鐘 75W， 開 始 增 加 負 荷 ， 每 階 段 負 荷 為 2分 鐘 75W直 到 疲 勞 為 止 。. 參、 肝癌細胞株培養 研 究 過 程 使 用 H e p 3 B / C 1 6 ( H e p 3 B c e l l l i n e ) 細 胞 株，此 細 胞 株 為 人 類 肝 細 胞 癌 細 胞 珠 ， 其 細 胞 株 内 之 染 色 體 嵌 入 HBV基 因 ， 此 細 胞 株 能 穩 定 表 現 HBs Ag， 產 生 HBV複 製 (Knowles, 1980 ; Twist, 1981)。 本 次 研 究 中 ， 一 開 始 將 Hep-3B細 胞 培 養 於 3 0 % M N C - C M ( 人 類 單 核 細 胞 條 件 培 養 基 ) 中，3 0 % M N C - C M 內 有 新 鮮 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DEMM)。 將 Hep3B， 置 於 37℃ ， 5%CO2的 培 養 箱 中 培 養 。. 20.
(31) Hep3B細 胞 株 培 養 於 DMEM中 ， 其 DMEM生 長 細 胞 密 度 為 1x106 cells/ml， 培 養 液 含 有 10%胎 牛 血 清 (FBS， fetal bovine s e r u m )， 1 0 0 m g / l S t r e p t o m y c i n， 1 0 0 0 µ M / l L - g l u t a m i n e 和 1 x 1 0 5 I.U./l penicillin等 成 分 ， 培 養 於 濕 度 固 定 ， 37℃ ， 5%CO2培 養 箱 中 。 培 養 過 程 所 需 之 成 分 不 會 直 接 影 響 HBs抗 原 的 表 現 及 經 10µg/ml之 PHA刺 激 之 MNC-CM培 養 的 Hep3B細 胞 存 活 情 形 。 研 究 過 程 中 使 用 tetrazolium dye染 色 ， 以 MTT試 驗 檢 測 細 胞 存 活 率 (Mosmann, 1983)。 以 PBS清 洗 細 胞 表 層 ， PBS中 含 有 10µg/ml的 PHA， 清 洗 過 後 再 更 換 新 的 MNC-CM培 養 液 ， 細 胞 存 活 率 以 MTT試 驗 分 析 。 研 究 結 果 在 計 算 經 HCE運 動 後 所 抽 取 的 MNC-CM處 理 之 Hep3B比 較 未 經 運 動 所 抽 取 的 MNC-CM處 理 之 Hep3B細 胞 存 活 率之差異。. 肆 、 人 類 單 核 球 細 胞 條 件 培 養 液 之 製 備 (Preparation of. Human Peripheral Blood Mononuclear) PHA為 一 種 自 然 T細 胞 的 分 裂 原 ， 其 主 要 作 用 啟 動 免 疫 刺 激 作 用 。 同 樣 的 刺 激 作 用 亦 可 藉 由 藥 物 所 誘 發 (Chen, 2004 & C h e n , 1 9 9 7 )。人 類 週 邊 血 液 單 核 球 細 胞 ( P B M N C ) 是 從 人 類 血 液 所 分 離 的 。 於 此 研 究 中 透 過 10µg/ml之 PHA所 刺 激 ， 藉 由 此 免 疫 反 應 形 成 一 作 用 模 式。研 究 中 以 藉 由 運 動 產 生 免 疫 調 控 的 模 式 作 為 實 驗 基 礎 (Chiang, 2000 ; Lio, 2006)。 MNC取 自 於 人 類 週 邊 血 細 胞 ， 經 淋 巴 細 胞 分 離 液 (Ficoll-Hypaque solution， 1.077 g/mL; Pharmacia Biotech， Uppsala， Sweden)處 理 並 經 密 度 離 心 400G， 30min(Chiang, 2000)。 MNC使 用 PBS(Phosphate-buffered saline)清 洗 細 胞 3次. 21.
(32) 之 後 再 加 入 RPMI-1640培 養 基 (Gibco/BRL， Grand Island)， 培 養 基 成 分 含 有 10% heat-inactivated autoserum(熱 純 化 自 體 血 清 )， 然 後 將 RPMI-1640 Medium培 養 於 培 養 皿 中 。 MNC培 養 於 10% heat-inactivated fectal calf autoserum (熱 純 化 胎 牛 自 體 血 清，H y c l o n e，L o g a n，U T T ) 以 1 × 1 0 6 c e l l s / m l / w e l l 的 細 胞 密 度 種 植 並 加 入 1,000µmole/l L-glutamine (Gibco/BRL)、 100 mg/l Streptomycin(Gibco/BRL)、 50 mg/l penicillin(Gibco/BRL)和 RPMI-1640 medium(含 有 10µg/ml之 PHA， Sigma-Aldrich)， 於 37℃， 5%CO2恆 溫 培 養 箱 中 培 養 24 小 時 後 使 用 0.45µ membrane移 去 MNC細 胞，移 除 後 之 培 養 基 稱 之 為 C o n d i t i o n e d m e d i a ， 再 將 此 冷 凍 於 - 8 0 ℃ 冰 箱 中 ( Wa n g , 1997)。 使 用 PHA-MNC-CM模 組 ， 其 中 經 由 PHA培 養 及 刺 激 24小 後 ， 觀 察 HBs抗 原 在 Hep-3B細 胞 株 之 表 現 情 形 。 收 集 SC和 HCE 受 試 群 的 MNC-CM以 測 定 分 泌 的 細 胞 激 素 。 從 MNC-CM中 收 集 與抗病毒及抗腫瘤免疫表現等相關的細胞激素，如 IFN-γ(Interferon-γ)、 TNF-α(Tumor necrosis factor)及 Interferon-α(IFN-α)。. 伍 、 細 胞 激 素 之 分 析 與 測 定 (Asssay for cytokine) 研 究 中 受 測 族 群 ， HCE-PHA-MNC-CM先 孵 育 於 含 有 多 種 不 同 細 胞 激 素 中 和 抗 體 中 ， 包 含 anti-IFN-γ(30.0µg/mL)、 anti-TNF-α (2.4µg/mL)、 anti-IFN-α (1.0µg/mL)與 anti-interleukin (IL)-1β antibodies (5.1µg/mL)， 孵 育 在 37°C， 90分 鐘。將 此 混 合 有 中 和 抗 體 及 週 邊 血 細 胞 之 混 合 液 取 出，加 在 Hep3B細 胞 株 上 ， 再 添 加 細 胞 激 素 的 專 一 性 抗 體 孵 育 48小. 22.
(33) 時，分 析 細 胞 激 素 濃 度 使 用 ELISA Kits套 組，其 中 包 括 IFN-γ、 I F N - α、 T N F - α、 I L - 1 β ( R & D S y s t e m s， m i n n e a p o l i s， M N， I S A ) 。 分 析 波 長 為 450nm， 分 析 由 PHA-MNC-CM所 分 泌 出 之 C y t o k i n e ， 方 法 沿 用 Wa n g ( 1 9 9 7 ) 。 結 果 將 與 標 準 曲 線 相 比 較 之 下 ， 所 得 此 4種 細 胞 激 素 之 相 關 係 數 (correlation coefficients) 為 0.998-0.999。. 陸 、 B 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 之 分 析 (Assay for Relative HBs Ag) HBV帶 原 或 感 染 者 其 HBs Ag在 血 清 中 可 以 反 應 出 近 期 H B V 感 染 程 度 與 表 現 形 成 肝 硬 化 與 肝 細 胞 癌 的 機 率。而 H B s A g 也 成 為 一 種 檢 視 HBV病 毒 活 動 力 的 指 標 (Czaja, 1979 & Chisari, 1997 & Lee, 1997& Yang, 2002)。 Hep3B細 胞 株 培 養 在 DMEM 混 合 10%胎 牛 血 清 蛋 白 增 殖 24小 時 後 ， 使 其 生 長 密 度 為 1 ×106cells/ml， 之 後 再 轉 移 到 無 血 清 之 DMEM或 不 含 30%MNC-CM 1 ×106cells/ml培 養 48小 時 ， 然 後 再 使 用 ELISA套 組 試 劑 去 測 得 培 養 液 ( 細 胞 分 離 液 ) 所 分 泌 之 H B s A g。 在 實 驗 中 所 應 用 之 PHA劑 量 在 過 去 研 究 中 並 不 會 干 擾 ELISA對 於 HBs Ag的 濃 度 。 結 果 為 ELISA(Enzyme-linked)所 測 得 之 OD值 。 HBs Ag表 現 情 形 則 使 用 MTT去 處 理 HCE並 比 較 SC組 經 PHA刺 激 後 細 胞 培 養 基 所 測 得 之 細 胞 表 現 情 形 。. 柒 、 統 計 處 理 與 分 析 (Statistical Analysis) 研 究 結 果 表 示 以 平 均 值 ± S E M， 結 果 以 S t u d e n t ’ s t t e s t 比 較 測 試 族 群 間 之 組 成 差 異 ， 信 賴 區 間 為 5%( p <0.05 )作 為 顯 著 性. 23.
(34) 評估。. 24.
(35) 第四章. 結果. • 第 一 節 、 受 試 者 身 體 質 量 指 數 測 量 與 VO2peak測 定 H C E 受 試 群 平 均 年 齡 為 6 7 . 6 ± 5 . 4 歲 ( 範 圍 ， 4 9 ~ 7 8 歲 )、 平 均 體 重 為 59.4±9.2公 斤 ， 平 均 為 身 高 162.5公 分 ±10.1公 分 。 體 脂 肪 比 率 為 28.5±7.3%。 SC受 試 群 平 均 年 齡 為 66.3±5.8歲 (範 圍 ， 51~76歲 )、 平 均 體 重 62.4±9.1公 斤 、 平 均 身 高 162.9公 分 ±8.2公 分 。 體 脂 肪 比 率 為 30.3±6.4%。 兩 群 受 試 者 並 無 身 體 質 量 測 量 上 之 差 異 (p >0.05)。 • HCE 受 試 群 之 VO2peak 為 25.6 ±7.1ml/kg． min-1 與 SC 群 類 似 (24.2 ± 6.71ml/kg． min-1) ， 詳 如 表 4-1。. 25.
(36) • 表 4-1、 受 試 者 身 體 質 量 指 數 測 量 與 VO2peak 測 定 HCE(n=15). SC(n=14). Age(years). 67.6±5.4. 66.3±5.8. Height(cm). 162.5±10.1. 162.9±8.2. We i g h t ( k g ). 59.4±9.2. 62.4±9.1. Body Fat(%). 28.5±7.3. 30.3±6.4. 25.6±7.1. 24.2±6.7. • VO2. peak(ml/[kg x min]). *Data are expressed as mean±standard error of the mean. • HCE=habitual cycling exercise; SC=sedentary control; VO2 peak=peak oxygen uptake.. 26.
(37) Respiratory exchange ratios 在 HCE 計 劃 受 測 前 與 受 測 後 並 無 明 顯 改 變 。 血 清 中 的 乳 酸 濃 度 變 化 情 形 由 1.68 增 加 至 1 . 9 8 m m o l / L， 統 計 學 上 並 無 顯 著 差 異 。 H C E 在 運 動 強 度 出 現 • 小 幅 度 的 變 化 ， 如 VO2peak 由 21.26%±12.73%至 45.52%±13.28%， 最 大 心 跳 率 (Maximal heart rate)由 49.87±6.82%變 化 至 68.58%±6.71%。 基 礎 代 謝 當 量 (metabolic equivalents)於 運 動 前 後 數 值 由 1.3±1.1至 4.3±1.3， 並 無 明 顯 差 異 ， 詳 如 表 4-2。. 27.
(38) 表 4-2、 習 慣 性 自 行 車 運 動 前 後 血 中 乳 酸 濃 度 與 能 量 消 耗 之 比 較 Before HCE. During HCE. Blood lactate (mmol/L). 1.98 ± 0.39. 1.68 ± 0.46. %HRmax (%) • % VO2peak (%). 49.87 ± 6.82. 68.58 ± 6.71. 21.26 ± 12.73. 45.52 ± 13.28. MET. 1.3 ± 1.1. 4.3 ± 1.3. RER. 0.76 ± 0.08. 0.75 ± 0.08. *Data are expressed as mean ± standard error of the mean. %HRmax= percent of maximal heart rate achieved during • incremental exhaustive exercise; % VO2peak=percent of peak oxygen uptake;MET = metabolic equivalent; RER = respiratory exchange ratio. 28.
(39) 第 二 節 、 HCE與 SC受 試 群 經 PHA-MNC-CM模 式 刺 激 週 邊 血 液 細 胞 對 於 Hep3B細 胞 株 於 HBs Ag 表現程度之比較 兩 群 受 試 模 組 經 PHA刺 激 之 後 ， HCE-PHA-MNC-CM出 現 較 優 於 SC-PHA-MNC-CM的 抗 原 抑 制 表 現 情 形 ， 其 中 較 為 明 顯 的 部 份 為 HCE-PHA-MNC-CM刺 激 之 Hep3B細 胞 株 中 的 HBs Ag 其 表 現 情 形 為 6 4 . 7 %，而 S C - P H A - M N C - C M 刺 激 之 H e p 3 B 細 胞 株 中 的 HBs Ag表 現 為 81.5%， 如 表 4-3。 其 HCE-PHA-MNC-CM所 表 現 出 之 B型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 抑 制 率 較 高。然 而 S C 受 試 群 經 P H A - M N C - C M 刺 激 之 H e p 3 B 細 胞 株 中 的 HBs Ag並 無 明 顯 抑 制 情 形 。 細 胞 株 培 養 過 程 中 ， 兩 群 細 胞 模 組 所 使 用 之 P H A 的 濃 度 皆 為 1 0 u g / m l，以 確 保 H e p 3 B 細 胞 株不會有明顯死亡情形。. 29.
(40) 表 4-3、 經 PHA刺 激 單 核 球 細 胞 條 件 培 養 基 與 細 胞 激 素 抗 體 中 和 作 用 後 對 於 B型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 的 影 響 Relative HBsAg. MTT cell. MTT cell. Viability. expression (%). assay (%). Untreated control. 100. 100. SC-PHA-MNC-CM. 81.5 ± 13.7. 99.1 ± 12.4. HCE-PHA-MNC-CM†. 64.7 ± 12.8. 97.5 ± 13.3. + anti-IL-1β antibodies‡. 67.3 ± 12.5. 97.2 ± 11.8. + anti-IFN-γ antibodies§. 82.5 ± 11.7. 99.1 ± 11.4. + anti-IFN-α antibodies||. 78.7 ± 13.8. 97.3 ± 12.8. + anti-TNF-α antibodies¶. 79.3 ± 13.2. 99.1 ± 13.5. 87.1±11.4. 98.2±11.3. +anti-TNF-α¶+anti-IFN-α||+ anti-IFN-γ antibodies§. *Triplicated data from separate experiments are expressed as mean ± standard error of the mean; †aliquots were preincubated, with or without cytokine-neutralizing antibodies, at 37°C for 90 minutes before addition to Hep3B cell culture; ‡5.1 µg/mL; §30.0 µg/mL; ||1.0µg/mL; ¶2.4 µg/mL. MTT = (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide); SC = sedentary control; HCE = habitual cycling exercise; IL-1β = interleukin 1β; IFN-γ = interferon gamma; IFN-α= interferon alpha; TNF-α= tumor necrosis factor-α.. 30.
(41) 第 三 節 、 細 胞 激 素 對 於 Hep3B細 胞 株 產 生 之 HBs抗 原 的 影 響 經 PHA刺 激 分 泌 後 形 成 的 細 胞 激 素 ， 如 IL-1β， TNF-α， IFN-γ和 IFN-α在 HCE受 試 群 所 測 得 之 濃 度 ， 分 別 為 876±211 p g / m L， 1 2 9 3 ± 2 8 9 p g / m L， 7 1 2 ± 1 2 5 p g / m L 及 1 0 5 7 ± 2 2 9 p g / m L 。 而 S C 受 試 群 為 3 1 2 ± 1 3 4 p g / m L， 6 2 1 ± 2 5 1 p g / m L， 3 8 7 ± 9 8 p g / mL 及 3 6 3 ± 1 5 8 p g / m L /， 兩 者 相 比 下 ， H C E 受 試 群 出 現 較 明 顯 增 加 與 表 現 情 形 ， 如 表 4-4。 為 了 解 及 澄 清 Hep3B細 胞 株 中 HBs Ag表 現 受 分 泌 之 細 胞 激素抑制之情形，因而利用多種細胞激素中和抗體，例 如 :anti-IL-1β、 anti-TNF-α、 anti-IFN-γ和 anti-IFN-α抗 體 ， 再 混 合 Hep3B細 胞 株 培 養 前 加 入 HCE-PHA-MNC-CM培 養 基 內 。 加 了 anti-IL-1β antibody於 HCE-PHA-MNC-CM內 ， 再 混 合 培 養 至 Hep3B細 胞 株 ， 產 生 之 HBs Ag被 抑 制 而 下 降 為 67.3%±12.5%。 再 與 無 添 加 細 胞 激 素 中 和 抗 體 之 HCE-PHA-MNC-CM中 所 測 得 之 抑 制 表 現 情 形 (64.7%±12.8%)， 兩 者 相 比 較 之 下 ， 其 前 者 出 現 些 微 增 加 而 統 計學上觀察具顯著差異。 同 樣 的 情 形 觀 察 到 加 入 anti-IFN-α antibody於 HCE-PHA-MNC-CM內 ， 接 著 混 合 培 養 至 Hep3B細 胞 株 ， 表 現 之 HBs Ag則 上 升 至 78.7%±13.8%。 加 了 anti-IFN-α antibody則 HBs Ag抑 制 表 現 上 升 至 82.5±11.7%;添 加 anti-TNF-α antibody 則 增 加 了 79.3±13.2%。 最 後 結 合 三 種 細 胞 激 素 (anti-IFN-α、 anti-IFN-γ、 anti-TNF-α -antibody)可 以 得 到 最 佳 抑 制 HBs Ag 表 現 ， 其 抑 制 率 可 達 到 87.1±11.4%。. 31.
(42) 表 4-4、 經 PHA刺 激 單 核 球 細 胞 條 件 培 養 基 分 泌 出 之 細 胞 激 素 表現情形 SC-PHA-MNC-CM. HCE-PHA-MNC-CM. IL-1β (pg/mL). 312 ± 134. 876 ± 211. IFN-α (pg/mL). 363 ± 158. 1,057 ± 229. TNF-α (pg/mL). 621 ± 251. 1,293 ± 289. IFN-γ (pg/mL). 387 ± 98. 712 ± 125. *Triplicated data from separate experiments are expressed as mean ± standard error of the mean. SC = sedentary control; HCE = habitual cycling exercise; IL-1β = interleukin 1β; IFN-α= interferon alpha; TNF-α= tumor necrosis factor α; IFN-γ = interferon gamma.. 32.
(43) 第五章. 結論. 本 研 究 分 析 HBs Ag在 體 外 試 驗 模 組 下 免 疫 抑 制 調 節 表 現 情 形，其 過 程 能 顯 著 的 表 現 免 疫 調 節 抑 制 作 用，而 在 老 年 人 受 測 族 群 中，HCE組 較 SC組 有 較 佳 的 免 疫 抑 制 表 現。從 基 礎 受 試 者 背 景 變 項 控 制 中，觀 察 受 試 群 身 體 質 量 指 數 等 相 關 資 料。其 兩 群 受 試 者 (HCE和 SC群 )是 無 顯 著 差 異 的 。 • 然 而 透 過 實 驗 觀 察 到 HCE受 試 群 在 VO2. peak表. 現上較優於. SC組 ， 利 用 最 大 心 跳 率 (%)的 控 制 以 及 在 HCE運 動 計 劃 過 程 中 ， 所 測 得 之 值 為 68.5%， 藉 此 定 義 本 運 動 訓 練 計 畫 強 度 為 中 強度運動。 另一個可以解釋此運動訓練計畫為中強度運動的數值為 • VO2. peak(%)其. 測 得 之 值 為 45.52%， 基 礎 代 謝 當 量 為 4.3， 再 從. 運 動 過 程 中 血 液 乳 酸 (Lactate)減 少 的 變 化 ， 可 以 定 義 HCE計 劃 為一種有氧、中低強度運動。 經 由 分 泌 所 表 現 出 之 細 胞 激 素 ， 主 要 研 究 為 IFN-α、 I F N - γ、 T N F - α， 其 主 要 為 控 制 H C E - P H A - C M 免 疫 抑 制 作 用 ， 因 而 中 強 度 運 動 訓 練 可 能 可 以 增 強 抗 病 毒 的 免 疫 反 應，因 此 本 研 究 中 的 中 強 度 之 自 行 運 動 是 有 可 能 出 現 此 種 表 現 作 用。中 強 度 運 動 訓 練 在 在 文 獻 中 (Lowder, 2005)， 觀 察 到 能 減 少 流 感 病 毒 (Influenza virus)的 活 性 。 HCE-PHA-MNC-CM組 與 SC組 相 較 之 下 表 現 出 較 多 IFN-α、 IFN-γ、 TNF-α， 指 出 受 試 者 經 中 強 度 自 行 車 運 動 後 會 表現出表現出較多的單核球細胞。 HCE-PHA-MNC-CM經 anti-IFN-α、 anti-IFN-γ、 anti-TNF-α –antibody中 和 試 驗 之 後 會 有 部 份 喪 失 抑 制 HBs Ag 的 表 現 。 研 究 過 程 中 ， 在 HCE-MNC-CM受 試 群 血 液 細 胞 經 培. 33.
(44) 養處理，發現在抗體中和試驗後可以觀察到一些溶於培養基 (CM)的 免 疫 因 子 ， 如 IFN-α、 IFN-γ、 TNF-α等 細 胞 激 素 ， 藉 由 生 成 之 細 胞 激 素 可 以 繼 續 表 現 出 HBs Ag的 抑 制 活 性 。 值 得 注 意 的 是 實 驗 過 程 中 人 類 單 核 血 球 細 胞 (MNC)及 肝 癌 細 胞 株 (Hep3B)對 於 細 胞 激 素 作 用 後 會 表 現 出 細 胞 抑 制 而 非 毒 殺 細 胞。在 此 研 究 之 前，仍 有 相 關 文 獻 指 出，具 運 動 習 慣 的 老年跑者和無運動習慣組經中強度運動後，血液中之細胞經 PHA刺 激 後 依 循 體 外 試 驗 模 式 可 以 發 現 具 運 動 習 慣 老 年 跑 者 會 出 現 較 多 的 IFN-γ(Shinkai, 1995)。 細 胞 激 素 IFN-γ的 作 用 ， 對 於 B型 肝 炎 抗 原 陽 性 之 病 人 (B 肝 帶 原 者 )體 內 之 HBs Ag表 現 形 成 抑 制 ， 目 前 已 被 臨 床 使 用 (Bonino, 1986 & Mahrle, 1990)。 在 本 研 究 中 ， 經 anti-IFN-γ-antibody中 和 試 驗 之 後 ， 可 以 明 顯 觀 察 到 HBs Ag表 現 被 抑 制 。 在 HCE-MNC-CM所 測 得 之 細 胞 激 素 IFN-γ濃 度 出 現 上 升 之 情 形，而 成 為 一 種 強 而 有 力 之 證 據，同 時 提 供 重 要 免 疫 抑制結果。 類 似 的 研 究 結 果 ， 同 樣 的 可 以 在 PBMNC培 養 基 中 測 得 分 泌 之 細 胞 激 素 IFN-γ， 其 增 加 的 細 胞 激 素 會 和 細 胞 質 體 中 的 HBV DNA片 段 呈 負 相 關 (Schultz, 1999 & Sheron, 1991)。 TNF-α目 前 是 已 知 影 響 免 疫 系 統 啟 動 初 始 因 子 。 例 如 ， 當 TNF-α分 泌 於 培 養 基 中 ， 則 會 使 得 HBV DNA複 製 表 現 受 影 響 ， 而 不 會 使 用 肝 細 胞 發 生 病 變 (Biermer, 2003)。 當 TNF-α加 入 Hep3B細 胞 株 混 合 培 養 時 ， 可 以 觀 察 到 HBV複 製 減 少 (Romero, 1996)。 而 在 研 究 文 獻 中 ， 注 意 到 TNF-α分 泌 較 多 時 ， HBs Ag 表 現 情 形 則 較 低 ， 在 我 們 研 究 中 加 入 anti-TNF-α抗 體 中 和 後 同 樣可獲得相同的結果。. 34.
(45) IFN-α， 目 前 已 知 是 用 於 臨 床 病 患 治 療 上 ， 其 作 用 是 抑 制 病 毒 複 製 ， 當 使 用 IFN-α用 於 治 療 HBe Ag-Positive(HBe Ag， B 型 肝 炎 病 毒 核 抗 原 )的 病 人 時 ， 可 以 觀 察 到 其 血 清 中 HBe Ag的 量 由 40%減 低 至 25%(Perrillo, 1990 & Van, 2004)。 同 樣 於 體 外 試 驗 中 觀 察 IFN-α的 作 用，當 IFN-α分 泌 量 增 加 時，便 會 啟 動 免 疫 調 控 抗 病 毒 機 轉，例 如 利 用 IFN-α在 MNCs中 以 中 和 試 驗，透 過 特 異 性 結 合 ， 可 以 減 少 單 純 疱 疹 病 毒 (HSV)之 表 現 與 影 響 (Leibson, 1986)。 因 此 推 論 細 胞 激 素 生 成 量 和 HBs Ag的 抑 制 表 現 是 有 相 關 的 。 Hep3B細 胞 為 B型 肝 炎 病 毒 依 附 宿 主 而 形 成 之 細 胞 株 。 然 而 在 HCE-PHA-MNC-CM混 合 培 養 中 ， 無 法 被 殺 死 ， 因 而 假 設 實 驗 控 制 所 造 成 之 免 疫 調 控 作 用 使 HBV DNA無 法 於 細 胞 中 進 行病毒複製，進而被抑制表現，而非進行細胞毒殺作用。 以 上 IFN-α與 TNF-α二 者 皆 由 毒 殺 型 T細 胞 所 分 泌 ， 對 HBV有 特 異 性，能 夠 影 響 HBV基 因 表 現 與 DNA複 製 ，不 再 使 細 胞 發 生 病 變。 研 究 中 ， 混 合 培 養 anti-TNF-α、 anti-IFN-γ、 anti-IFN-α抗 體，在 HCE-PHA-MNC-CM受 試 群 中，大 多 數 表 現 為 減 毒 作 用 ， 降 低 HBs Ag生 成 ， 形 成 抵 抗 病 毒 的 結 果 。 因 此 TNF-α、 IFN-γ、 IFN-α與 本 研 究 中 ， 藉 由 HCE計 劃 所 獲 得 之抗病毒免疫調控機制為重要之結果。. 35.
(46) 第六章、討論 本研究透過體外細胞培養試驗過程中以抗病毒免疫細胞 模 組 作 為 研 究，經 由 H C E 計 劃 之 受 試 群 與 S C 計 劃 受 試 群 相 比 之 下 ， 其 HCE計 劃 受 試 群 呈 現 出 較 佳 的 免 疫 調 節 反 應 ， 以 抑 制 Hep3B細 胞 株 上 HBs Ag的 表 現 。 其 實 驗 過 程 中 ， 可 以 觀 察 到 老 年 人 經 HCE運 動 計 劃 後 ， 體 內 週 邊 單 核 球 血 液 細 胞 ， 分 泌 出 較 多 的 細 胞 激 素 ， 如 IFN-γ、 IFN-α和 TNF-α， 而 形 成 免 疫 調 節 反 應 ， 進 而 抑 制 Hep3B細 株 上 B型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 的 表 現 。. 36.
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