中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/41345

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(1)中國醫藥大學營養學系碩士論文. 大蒜精油與 atorvastatin 藥物動力學之探討 Effects of garlic oil on the pharmacokinetics of atorvastatin in rats. 研究生：江佳容(Jia-Rong Chiang) 指導教授：李宗貴博士(Chong-Kuei Lii, Ph.D.). 中華民國一百年七月 July, 2011.

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(4) 目錄目錄.......................................................................................................................................i 圖目錄................................................................................................................................iii 表目錄..................................................................................................................................v 縮寫表.................................................................................................................................vi 中文摘要..........................................................................................................................viii 英文摘要..............................................................................................................................x 第一章、前言...................................................................................................................1 第二章、文獻探討.............................................................................................................2 一、大蒜(Garlic)之簡介.........................................................................................2 二、生物轉換酵素系統(biotransformation enzyme system) .............................6 (一) 第一期藥物代謝作用(Phase I drug metabolism) ................................7 (二) 第二期解毒作用(Phase II detoxification) .............................................8 (三) 第三期膜轉運作用(Phase III membrane transportation).................11 (四) 大蒜與藥物交互作用.............................................................................13 (五) 食用大蒜之副作用及安全性評估.........................................................15 三、生物體之抗氧化防禦系統(antioxidant defense system) ...........................15 四、 Atorvastatin 之簡介......................................................................................21 (一) Atorvastatin 之代謝路徑.....................................................................22 (二) Atorvastatin 之安全性評估.................................................................23 五、調控藥物代謝酵素之訊息傳遞路徑.............................................................23 六、藥物動力學(pharmacokinetics) ..................................................................27 (一) 清除率(Clearance, Cl) ........................................................................28 (二) 半衰期(half-life, T1/2) ..........................................................................28 (三) 藥物濃度曲線下面積(area under the curve, AUC) .........................28 (四) 血中藥物最高濃度(Cmax) ....................................................................28 (五) 藥物達血中濃度最高之時間(Tmax) ....................................................28 第三章、實驗材料與方法................................................................................................29 一、實驗架構.........................................................................................................29 二、實驗材料.........................................................................................................30 (一) 實驗動物...............................................................................................30 i.

(5) (二) 大蒜精油的製備................................................................................30 (三) 化學試劑............................................................................................31 三、實驗方法..........................................................................................................40 (一) 動物飼養.............................................................................................40 (二) 實驗分析項目.....................................................................................40 第四章、結果........................................................................................53 一、以 HPLC/UV 測定大蒜精油中含硫化合物之含量.......................................53 二、大蒜精油對大鼠體重與組織相對重量之影響...............................................53 三、大蒜精油對大鼠肝功能指標之影響...............................................................53 四、大蒜精油處理五天與四週後對大鼠肝臟藥物代謝酵素活性之影響..........53 五、大蒜精油處理對小腸藥物代謝酵素活性之影響..........................................54 六、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP1A1/2 蛋白質表現之影響..................................54 七、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP2B1、2D1 與 2E1 蛋白質與 mRNA 表現之影響 ..................................................................................................................................54 八、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP2C6 與 2C11 蛋白質與 mRNA 表現之影響.....55 九、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP3A1/2 蛋白質與 mRNA 表現之影響.................55 十、大蒜精油對大鼠肝臟 UGT1A1 蛋白質與 mRNA 表現之影響...................56 十一、大蒜精油對大鼠肝臟 GSTs 蛋白質表現之影響.......................................56 十二、大蒜精油對大鼠肝臟 P-gp 蛋白質與 mRNA 表現之影響......................56 十三、大蒜精油對大鼠小腸之 CYP3A1 與 3A2 蛋白質表現.............................56 十四、大蒜精油對大鼠小腸之 UGT1A1 蛋白質表現.........................................56 十五、大蒜精油對大鼠小腸 GSTs 蛋白質表現之影響.......................................57 十六、大蒜精油對大鼠小腸之 P-gp 蛋白質表現................................................57 十七、大蒜精油對血漿中 atorvastatin (ATV)與 2-hydroxy atorvastatin (2-OH ATV).............................................................................................................57 第五章、討論.......................................................................................78 第六章、結論.......................................................................................85 參考文獻…………………………………………………………………………………86 附錄……………………………………………………………………………………....98. ii.

(6) 圖目錄文獻探討圖一、大蒜精油不同製備方式所存在含硫化合物成份..........................................5 圖二、細胞內或外來物質之生物轉換系統............................................................6 圖三、人類肝臟與小腸中 CYPs 之平均分佈比例.................................................8 圖四、UDPGA 與親和性受質透過 UGT 代謝.......................................................9 圖五、GST 催化的結合反應..................................................................................10 圖六、ABC 和 OATP 對口服與靜脈注射藥物的作用........................................13 圖七、麩胱甘肽(Glutathione)之結構.......... ..........................................................17 圖八、GSH 之抗氧化功能.....................................................................................17 圖九、HO-1 之作用及其代謝產物........................................................................18 圖十、麩氨酸-半胱氨酸接合酶與 GSH 生合成..................................................20 圖十一、Atorvastatin 之代謝路徑........................................................................22 圖十二、外來物質或內生性物質對核接受器與 CYP450s 之間的交互影響.......24 圖十三、轉錄因子與核接受器調節 CYP 之路徑..................................................26 圖十四、活化 phaseI 與 phaseIII 轉錄因子之訊號路徑....................................27. 實驗材料與方法圖一、大蒜精油製備之設備與精油成品..............................................................30. 結果圖一、HPLC/UV 測定大蒜精油中含硫化合物之層析圖..................................59 圖二、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP1A1/2 蛋白質表現之影響...............................64 圖三、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP2B1、2D1 與 2E1 蛋白質(A)與 mRNA (B)表現之影響...............................................................................................................65. 圖四、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP2C6 與 2C11 蛋白質(A)與 mRNA (B)表現之影響..................................................................................................................66 圖五、大蒜精油對大鼠肝臟 CYP3A1/2 蛋白質(A)與 mRNA (B)表現之影響...67 iii.

(7) 圖六、大蒜精油對大鼠肝臟 UGT1A1 蛋白質(A)與 mRNA(B)表現之影響........68 圖七、大蒜精油對大鼠肝臟 GSTs 蛋白質表現之影響.......................................69 圖八、大蒜精油對大鼠肝臟 P-glycoprotein 蛋白質(A)與 mRNA (B)表現之影響................................................................................................................70 圖九、大蒜精油對大鼠小腸 CYP3A1 與 3A2 蛋白質表現之影響....................71 圖十、大蒜精油對大鼠小腸之 UGT1A1 蛋白質表現....................................72 圖十一、大蒜精油對大鼠小腸之 GSTs 蛋白質表現...........................73 圖十二、大蒜精油對大鼠小腸之 P-gp 蛋白質表現............................................74 圖十三、大蒜精油處理五天對大鼠血漿 atorvastatin (ATV)和 2-hydroxy atorvastatin (2-OH ATV)濃度之變化.....................................................76 圖十四、四週的大蒜精油處理對大鼠血漿 atorvastatin (ATV)和 2-hydroxy atorvastatin (2-OH ATV)濃度之變化.....................................................77. iv.

(8) 表目錄文獻探討表一、大蒜之一般成分及含硫化合物含量............................................................4 表二、Cytochrome P450 家族的基本特性.............................................................8 表三、大蒜與藥物之交互作用................................................................................14 表四、Statins 類藥物之比較.................................................................................21 表五、調節 CYPs 的核接受器..............................................................................24 表六、核接受器：內生性 ligands 與 DNA response element............................. 24. 實驗材料與方法表一、CYPs 與 UGT 之受質與其代謝物.............................................................46 表二、蛋白質 1°與 2°抗體.....................................................................................48 表三、逆轉錄聚合酶連鎖反應之寡核苷酸引子序列............................................50. 結果表一、以 HPLC/UV 測定大蒜精油中含硫化合物之含量..................................59 表二、大蒜精油對大鼠體重、肝臟重、肺臟重之影響......................................60 表三、大蒜精油投予五天或四週對大鼠肝功能指標之影響..............................61 表四、大蒜精油處理五天與四週後對大鼠肝臟酵素活性之影響......................62 表五、大蒜精油處理對大鼠小腸酵素活性之影響..............................................63 表六、大蒜精油處理五天與四週對血漿中 atorvastatin (ATV)與 2-hydroxy atorvastatin (2-OH ATV)對藥物動力學參數之影響.............................76. v.

(9) 縮寫表 ACN. Acetonitrile. ALT. Alanine aminotransaminase. AST. Aspartate aminotransaminase. ATV. Atorvastatin. 2-OH ATV. 2-Hydroxy atorvastatin. AUC. Area under the curve. CYP450. Cytochrome P450. DADS. Diallyl disulfide. DAS. Diallyl sulfide. DATS. Diallyl trisulfide. DMSO. Dimethyl sulfoxide. DTNB. 5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoicacid). DTT. Dithiothreitol. EDTA. Ethylenediaminetetracetic acid. ELISA. Enzyme-linked immunosorbent assay. GAPDH. Glucose-6-phosphate dehydrogenase. GCLC. Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit. GCLM. Glutamate-cysteine ligase modifier subunit. GO. Garlic oil. GSH. Glutathione. GSSG. Glutathione disulfide. HO-1. Hemeoxygenase. HPLC/MS. High-performance liquid chromatography-Mass spectrophotometer. vi.

(10) i.g.. Intragastric intubation. P-gp. P-glycoprotein. PMSF. Phenylmethanesulfon. PPB. Potassium phosphate buffer. TEMED. N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine. UDPGA. UDP-glucuronic acid. UGT. UDP-glucuronosyltransferases. GST. Glutathione S-transferases. vii.

(11) 中文摘要近年來，由於生活型態的改變，比如飲食過量、精緻飲食、缺乏運動、壓力過大等，導致許多慢性病的發生，使得養生保健日漸受到重視。數千年來，大蒜便一直被視為是具有健康促進和疾病預防的辛香料和草藥，也是目前市場上常見保健產品之一，在美國草藥類保健產品年銷售額排名中，更位居第二名。研究顯示大蒜擁有多樣生理活性，比如降血膽固醇、降血糖、抗腫瘤、降血壓、保護肝功能、免疫調節、藥物代謝調節等，其中又以降血膽固醇和降三酸甘油脂最為人所知，所以常有大蒜保健產品和降血脂臨床用藥共同使用現象。由於大蒜中富含的多種硫化物已知會上調多種藥物代謝酵素和細胞膜轉運蛋白的轉錄作用，也有報導指出有些大蒜硫化物會直接抑制藥物代謝酵素的活性，這使得大蒜和藥物共同服用時，兩者間是否產生交互作用，影響了藥效，成為一個必須面對的議題。Atorvastatin (ATV)為臨床上常用的降膽固醇藥物，藉由抑制 HMG-CoA reductase 活性達到降低膽固醇的效果；在體內主要由 cytochrome P450 (CYP) 3A4 與 UDP-glucuronosyltransferase (UGT) 負責代謝，最後再透過細胞膜轉運蛋白(P-glycoprotein, P-gp)將代謝產物運出胞外。本研究因此以雄性六週齡 Sprague-Dawley 大鼠為實驗動物模式，先以胃管灌(i.g.)方式給予 50 或 200 mg/kg 大蒜精油(garlic oil，GO) 5 天或 4 週，完成灌食後隔天，經口給予 ATV (10 mg/kg)，隨後採集 6 小時間血液樣本，動物犧牲後，取肝臟和小腸組織樣本，分別作為血漿中 ATV 與 2-OH ATV 濃度變化和肝臟與小腸中藥物代謝酵素與細胞膜轉運蛋白之活性、蛋白質表現、mRNA 表現分析使用。結果顯示：大蒜精油無論處理五天或四週，呈劑量關係增加 ethoxyresorufin O-deethylase (CYP1A1)、pentoxyresorufin O-deethylase (CYP2B1)與 UGT1A1 酵素活性(p<0.05)，在大蒜精油處理四週下，也發現 testosterone 6β-hydroxylase (CYP3A) 與 dextromethorphan O-demethylase (CYP2D6) 類似劑量關係增加酵素活性(p<0.05)。相反的，σ-nitrophenol hydroxylase (CYP2E1) 在五天與四週實驗中以及 diclofenac. viii.

(12) 4-hydroxylase (CYP2C)在五天實驗中皆受到大蒜精油的處理而被抑制(p<0.05)；且 CYP1A1、1A2、2B1、2D1、3A1 與 UGT1A1 的蛋白質表現結果類似於酵素活性；此外，RT-PCR 結果也發現肝臟的 CYP2B1、3A1 與 UGT1A1 在大蒜精油處理下，皆呈劑量關係上調基因的表現(p<0.05)。至於肝臟中的 P-gp 在大蒜精油給予 200 mg/kg 表現下降(p<0.05)。小腸中，無論五天或四週，UGT 酵素活性與蛋白質以及 P-gp 蛋白質皆受到大蒜精油處理而增加表現。利用 LC/MS 分析發現大蒜精油處理下，血漿中 ATV 與 2-OH ATV 藥物濃度呈劑量關係降低，在五天或四週處理下，血漿中 ATV 的最高濃度(Cmax)以及 2-OH ATV，其高劑量大蒜精油組皆顯著低於控制組(p<0.05)。依上述結果推論：大蒜精油處理下，降低 ATV 與 2-OH ATV 血漿中的濃度，比如：AUC(0-6)與 Cmax，主要經由調節藥物代謝酵素與膜轉運蛋白之酵素、蛋白質與 mRNA 的表現，因此推論大蒜精油如與 ATV 共同服用下，將可能與 ATV 的代謝產生交互作用，進而降低 ATV 降血膽固醇之藥效。. 關鍵字：大蒜精油、Atorvastatin、藥物代謝酵素、藥物動力學、大鼠. ix.

(13) Abstract Due to the changes of living styles including over-eating, lacking of exercise, and consuming too much refined foods in modern society, incidence of chronic diseases increase rapidly. Garlic has been used as a culinary spice and medicinal herb for hundreds of years. It has been well demonstrated that garlic owns a diverse biological activities, such as lowering blood cholesterol, lowering blood triglycerides, lowering blood sugar, lowering blood pressure, anti-thrombosis, anti-tumorigenesis, liver protection, immunomodulation, and modulation on drug metabolism. Currently, garlic is a popular health product worldwide and the total sales were ranked the second in the herb market of the United States of America. Due to the effective hypolipidemic effect of garlic, it is possible that certain peoples will co-intake clinical drugs and garlic products, especially the elderlys and those with hyperlipidemia and chronic vascular diseases. Atorvastatin (ATV), a HMG-CoA reductase inhibitor, is the top sale hypocholesterolemic drug. It is mainly catalyzed by cytochrome P450 (CYP) 3A and UDP-glucuronosyltransferase (UGT), which increase the water solubility of ATV. Followed by the action of CYP3A and UGT, ATV metobloites are excreted out of the cells through membrane transporters, such as P-glycoprotein (P-gp). This raises a possibility whether garlic changes the pharmacokinetic parameters of ATV by modulating drug-metabolizing enzyme and transporter activities. In this study, 6 weeks-old male Sprague-Dawley rats were intragastrically (i.g.) administered 50 or 200 mg/kg GO for 5 consecutive days or thrice a week for 4 weeks. Control rats were given 1 mg/kg corn oil (vehicle). At the day 6, ATV (10 mg/kg) was given orally and bloods were withdrawn at different time intervals for 6h. Liver and small intestine were removed following sacrifice. Results indicated that GO, regardless of treating for 5 days or 4 weeks, dose-dependently increased hepatic. x.

(14) ethoxyresorufin O-deethylase (CYP1A1), pentoxyresorufin O-deethylase (CYP2B1), and UGT1A1 activities (p<0.05). A similar dose-dependent increase of testosterone 6β-hydroxylase (CYP3A) and dextromethorphan O-demethylase (CYP 2D6) were also noted in rat livers for 4-week GO administration (p<0.05). In contrast, σ-nitrophenol hydroxylase (CYP2E1) activity in the 5-day and 4-week experiments and diclofenac 4-hydroxylase (CYP2C) activity in the 5-day experiment were decreased by GO (p<0.05). Immunoblots revealed that CYP1A1, 1A2, 2B1, 2D1, 3A1, and UGT1A1 expressions were similar to the changes of enzyme activities. Moreover, RT-PCR showed that hepatic CYP2B1, 3A1, and UGT1A1 mRNA levels were dose-dependently up-regulated by GO (p<0.05). Lower hepatic P-gp levels were resulted in rat dosed with 200 mg/kg GO (p<0.05). In the small intestine, UGT activity and protein level and P-gp protein level were increased by GO in both 5-day and 4-weeks experiments (p<0.05). By LC/MS, area under the curve (AUC0-6 h) of plasma ATV and 2-hydroxylated ATV (2-OH ATV) concentrations were dose-dependently decreased by GO (p<0.05). The maximum plasma concentration (Cmax) of ATV in 4-week treatment and of 2-OH ATV in both 5-day and 4-week treatments were significantly lower in rats administered with high dose of GO (p<0.05). In conclusion, GO decreases the plasma concentrations of ATV and 2-OH ATV, i.e. AUC0-6 h and Cmax, by modulating drug metabolizing enzymes and membrane transporter activities and/or protein and mRNA expressions. Results suggest that garlic co-administration may interact with ATV metabolism and is likely to reduce ATV blood cholesterol lowering efficacy.. Key words: Garlic oil, Atorvastatin, Drug metabolism enzyme, pharmacokinetics, Rat. xi.

(15) 第一章、前言自古以來人類首要追求的關鍵為－健康。隨著保健觀念的興起，眾多消費者也期望透過天然保健食品達到預防或治療效果，因此助長中草藥或食品透過萃取、提煉或半純化等加工過程，提高有效成份，事實上，目前市面上即有眾多經過濃縮的保健產品在販售，也廣為消費者所接受。根據行政院衛生署調查結果顯示，除了惡性腫瘤仍為十大死因之首外，其它慢性疾病死亡率，比如腦血管疾病、心臟病、糖尿病、高血壓以及腎病變等，也都分居前幾名，加總後，它們約佔總死亡率 30%之普(行政院衛生署 2010 年統計資料)。曾有報告指出約有 15～20%長期服用處方藥的慢性病患者也會同時使用中草藥，且大多未告知醫師，因此藥物與保健食品或藥物與中草藥間是否發生交互作用(food-drug or herb-drug interaction)，影響藥物之藥物動力學參數或藥效，值得更深入研究與探討。大蒜數幾千年來一直被認為是具有多樣生理活性之藥用植物，因此普遍被應用於多種疾病的治療，如今進一步透過細胞、動物或人體介入等實驗，更證實了大蒜和其多種硫化物具有降膽固醇、降三酸甘油酯、降血栓、降血糖、降血壓的功效，大蒜保健產品也因此成為保健市場上的熱門產品，然而食用大蒜時是否干擾臨床處方藥的藥效卻仍未釐清，因此，本研究將以大鼠為模式，先予以大蒜精油處理不等時間(五天或四週)，再給予降血脂藥物 atorvastatin，藉由分析(1)大鼠肝臟和小腸藥物代謝酵素暨膜轉運蛋白活性或蛋白質及 mRNA 表現；(2)血漿中 atorvastatin 藥物動力學參數，了解大蒜是否影響或干擾 atorvastatin 的代謝，預期實驗結果將有助於提升消費者食用大蒜保健食品的安全性。. 1.

(16) 第二章、文獻探討一、大蒜(Garlic)之簡介大蒜(Garlic, Allium sativum)，屬蔥科(Alliaceae)，為一年生鱗莖草本植物，屬淺根性作物，無主根，發根部位發生在短縮莖週圍。大蒜因具有的獨特風味及成份，為烹調時不可或缺的辛香料，在中東與遠東地區的栽培史，至少有五千年，而在古老之中國、埃及和印度更將大蒜視為高級食品，2008 年大蒜製品仍為全世界最盛行的食品補充品(Irene Lelekis, 2008)。幾千年來世界各地不但將大蒜當作香料使用，也普遍運用在醫學用途上，李時珍《本草綱目》上記載大蒜性溫味辛，用以治療疑難雜症。近年來，探討大蒜生理特性的文章並不少見，其中較廣泛被研究是其在心血管及其他代謝疾病的預防與治療，例如血管新生作用(atherosclerosis)、高血脂症、血栓、高血壓和糖尿病等(Asdaq and Inamdar, 2009)，亦有文獻指出大蒜具有抑菌(antimicrobial)、抗腫瘤(anticancer)、抗發炎(antiinflammation)、抗氧化 (antioxidation)和刺激免疫反應(immunomodulation) 等功效。在臺灣，大蒜是雲嘉南地區重要的經濟作物，又以雲林縣產量最多，佔總產量 80％以上，大片黑為主要栽植品種，是臺灣品質最佳的蒜頭品種(沈立言, 2004)。大蒜的營養成分：水份 62～68%、醣類 26～30%、蛋白質 1.5～2.1%、脂質 0.1 ～0.2%、膳食纖維 1.5%等，詳細含量見表一；根據台灣行政院農業委員會的報告指出，台灣自產大蒜約有 10-20 個蒜瓣其營養成分為：水份 66.2 公克、蛋白質 7.0 公克、脂質 0.3 公克、醣類 24.9 公克、膳食纖維 1.1 公克等(許苑培, 2009)。除此之外，大蒜亦含多種特殊的有機硫化物(organosulfur compounds, OSCs)，含量約 1.1～ 3.5%，這些含硫化合物不但是大蒜特殊氣味的來源，也被認為與大蒜調節生理機能之功效有關。大蒜具有獨特風味，這與大蒜中的 allicin (蒜素)與其下游多種油溶性含硫化合 2.

(17) 物有關。新鮮大蒜主要的含硫化合物為 alliin(S-allyl-L-cysteine sulfoxide)和少量的 S-methyl cycteine sulfoxide, S-propyl cysteine sulfoxide。Alliin 主要存在完整未被破壞的大蒜中，無色無味，一但經過切碎或壓榨後，釋放出酵素 alliinase 會將 alliin 轉變成具特殊氣味的 allicin。Allicin 並不穩定，會迅速分解、重組，轉化為眾多的下游含硫化合物，比如 DAS (diallyl sulfide)、DADS (diallyl disulfide)、DATS (diallyl trisulfide)、ajoene 等揮發性的產物。在不同的加工處理方式下，其大蒜產品的含硫化合物組成也有極大不同(圖一)，例如利用水蒸氣蒸餾加熱法所得到的大蒜精油，其主要的含硫化合物成份為油溶性的 DAS、DADS、DATS 等，各佔總硫化物 4%、35~40%和 30~35%之多(Sheen et al., 1996)；另外將生大蒜切片、浸泡於 15～20%酒精中經 20 個月後製成後熟大蒜 (age garlic extract, AGE)，由於此方法會流失較多的 allcin，因此其主要的成份不同於大蒜精油所知的油溶性含硫化合物，而多為較具穩定性、生物可利用性以及抗氧化特性之 S-allylcysteine (SAC)、S-allylmercaptocysteine、allixin 等水溶性硫化物(Borek, 2001)。. DAS 和 DADS 已被證實具有調節藥物代謝酵素活性和基因轉錄作用的生理效應，因此可能具備改變生物體對藥物的代謝能力。目前已有研究指出同時服用大蒜補充劑與抑制愛滋病毒生長的 saquinavir 或 ritonavir 時(Piscitelli et al., 2002)，將影響 saquinavir 或 ritonavir 的藥物動力學(pharmacokinetics)。. 3.

(18) 表一、大蒜之一般成分及含硫化合物含量(Lawson, 1996) General composition of garlic. Amount (fresh weight; %). Component Water. 62-68. Carbohydrates (mainly fructans). 26-30. Protein. 1.5-2.1. Amino acids: common. 1-1.5. Amino acid: cysteine sulphoxides. 0.6-1.9. γ-Glutamylcysteines. 0.5-1.6. Lipids. 0.1-0.2. Fibers Total sulfur compounds. 1.5 a. 1.1-3.5. Sulphur. 0.23-0.37. Nitrogen. 0.6-1.3. Minerals. 0.7. Vitamins. 0.015. saponins. 0.04-0.11. Total oil-soluble compounds. 0.15 (whole)-0.7 (cut). Total water-soluble compounds a. 97. Excluding protein and inorganic sulphate (0.5%). 4.

(19) 圖一、大蒜精油不同製備方式所存在含硫化合物成份(Banerjee et al., 2003). 5.

(20) 二、生物轉換酵素系統(biotransformation enzyme system) 當脂溶性內生性物質(例如固醇類荷爾蒙、膽紅素)或外來物質(xenobiotics)例如藥物等，進入生物體內將藉由生物轉換酵素進行代謝，加速其排泄速率。生物轉換系統成員依功能可分為三大類：第一期作用(phase I reaction)主要透過分布於細胞平滑內質網上的 cytochrome P450 (CYP450)進行催化，對親脂性物化合物進行氧化 (oxidation)、還原(reduction)以及水解(hydrolysis)作用，使其轉變為更具極性（親水性或親電子性）的代謝產物；第二期作用(phase II reaction)主要由分布於細胞質中(少數則分部於內質網上)的多種結合酵素負責，例如 glutathione S-transferases (GSTs)、 sulfotransferases (SULTs)、NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO-1)以及 UDP-glucuronosyltransferases (UGTs)（主要位於內質網），透過與胞內水溶性小分子的結合作用(conjugation)，增加產物的水溶性，因而促進其排除；最後再藉由藉由第三期作用(phase III reaction)，成員屬細胞膜上的多種膜運送蛋白(membrane transpoters)，例如 P-glycoprotein 和其它 mutidrug-resistance-associated proteins (MRPs) 等，負責將經 phase I 和 II 酵素作用後生成的產物由胞內送至胞外(Bock, 2003)。在哺乳動物中，肝臟為最大的代謝器官，其他如腎臟、肺臟、小腸等也具有藥物代謝酵素。. 圖二、細胞內或外來物質之生物轉換系統 modified from (Bock, 2003). 6.

(21) (二)第一期藥物代謝作用(Phase I drug metabolism) 許多藥理活性分子在正常生理酸鹼值下，為脂溶性或非離子性。phase I 酵素系統中包含多種代謝酵素，其中以細胞色素 P450 (cytochrome P450, CYP) 最為重要，屬單氧化酶(monooxygenase)，主要分布於細胞內平滑內質網上。進行催化反應時，同時需要 NADPH-CYP reductase 及細胞膜上磷脂質(phospholipids)的共同參與，電子主要透過 NADPH-CYP reductase 將 NADPH 轉移到 CYP 上，並藉由 cytochrome b5 reductase 將 NADH 轉移至 cytochrome b5 以增強代謝活性(Sole and Livingstone, 2005)。CYPs 由許多同功異構酵素(isozymes)所組成，已知人類至少表現有 59 種 isozymes，大鼠體內至少也有 47 種。主要負責代謝內生性(endogenous)與外源性 (exogenous)之化合物，以基因同質性(homology)區分，CYP 酵素基因可分屬不同家族(family)，以 1、2、3、4 表示之，每一家族另包含多個次家族(subfamily)，分別以 A、B、C、D 等表示。依其代謝受質之屬性，人類之 CYP 可分為三大類：(1) CYP 5-51 家族主要代謝內生性物質，通常對受質(substrates)具高度親和性且在代謝過程中較容易取得平衡；(2) CYP 1-3 家族對受質有較低的親和性且代謝過程中不易平衡，此外亦具有許多重要的基因多形性(genetic polymorphisms)；(3) CYP 4 家族主要代謝脂肪酸、外來物質及其相關代謝受質(Ingelman-Sundberg, 2004)。目前已知，臨床常見藥物中有 70~80%種類可被 CYP 1-3 家族所代謝(Bertz and Granneman, 1997; Evans and Relling, 1999)，其胞內分佈位置整理如表二所示。大部分的 CYPs 存在肝臟中，亦存在小腸黏膜、肺、腎、腦、鼻黏膜和皮膚等組織。肝臟中 CYP 家族含量多寡依次為 CYP3A＞CYP2C＞CYP1A2＞CYP2E。Lin (2001) 指出小腸黏膜則是肝外組織中最重要的藥物代謝轉換的部位，與肝臟一樣小腸中含量最多的也是 CYP3A，約佔 50~70% (Paine et al., 1997; Watkins et al., 1987)。肝臟與小腸中 CYPs 主要分布比例如圖三所示(Shimada et al., 1994)。至於大鼠體內 CYPs 分布情形，也與人類相似(Guengerich, 2004)。. 7.

(22) 表二、Cytochrome P450 家族的基本特性(Ingelman-Sundberg, 2004) 酵素. 代表性受質反應. Probe drugs. 主要存在位置. CYP1A2. Ethoxyresorufin O-deethylation. Acetaminphen、 Caffeine. 肝臟. CYP2C9. Diclofenac 4-hydroxylation. Diclofenac、Tobutamide. 肝臟. CYP2D6. Dextromrthorphan O-deethylation. Detromethorphan、Debrisoquine. 肝臟. CYP2E1. Chlorzoxazone 6-hydroxylation. Clorzoxazone、Enflurane. 肝臟. Testosterone 6-hydroxylation,. Erythromycin、Midazolam、. Midazolam 1’-hydroxylation. Testosterone. 肝臟、腸. CYP3A4. 圖三、人類肝臟與小腸中 CYPs 之平均分佈比例. modified from. (Paine et al., 2006; Shimada et al., 1994). (三)第二期解毒作用(Phase II detoxification) 由多種負責催化結合反應(conjugation)的酵素所組成，主要催化的反應有 glucuronidation、sulfation、methylation、acetylation、glutationation 以及 amino acid conjugation 等。Phase II 酵素大部分為轉移酶(transferases)，比如 glutathione (GSH) S-transferases (GSTs)、sulfotransferases (SULTs)、UDP-glucuronosyltransferases (UGTs)、amino acid conjugases 等，另外，N-Acetyltransferases (NATs) 和 NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO)也是 Phase II 酵素成員。Phase II 轉移酶可直接催化外來物質或間接代謝 phase I 的代謝產物與胞內具高水溶性之 GSH、sulfate、 glucuronic acid、taurine 和 glycine 等分子結合，生成更具親水性之產物而有利於藉 8.

(23) 由尿液或膽汁排出體外(Rushmore and Kong, 2002)。 1. UDP-glucuronosyltransferases (UGTs；EC 2.4.1.17) UGTs 主要存在細胞的內質網(endoplasmic reticulum)與核膜上(Mackenzie et al., 1997)，催化受質與 glucuronic acid 結合後，將使得脂溶性化合物的親水性大為增加，因此有利於由膽汁與尿液排出體外，參與許多藥物、植化素和內生性物質例如膽紅素、甲狀腺荷爾蒙及固醇性荷爾蒙的代謝。人體內，將近 40～70%臨床用藥可透過 UGTs 行醣醛酸作用。哺乳動物的 UGTs 超過 117 種，在人類中，依其基因同源性可分為 UGT1、UGT2，可分為兩個 subfamily A、B 以及 UGT3 與 UGT8 四個家族。大部分的 UGTs 存在肝臟中(Congiu et al., 2002)，其它如 UGT1A7、1A8 和 1A10 並不存在肝臟中，主要分布於腸胃道中(Mojarrabi and Mackenzie, 1998; Tukey and Strassburg, 2001)。不同 UGT 酵素的受質親合力也不儘相同，比如膽紅素為 UGT1A1 的專一受質(Tukey and Strassburg, 2001)，因此降低 UGT1A1 的表現時將增加體內膽紅素的濃度，造成膽黃症及腦損傷(Meech and Mackenzie, 1997)。UGT 利用 uridine-5’-diphospho-α-D-glucuronic acid (UDPGA)作為 glucuronic acid 的提供者，將之結合在內生性與外源性受質上(Jancova et al., 2010) (圖四)。. 圖四、UDPGA 與親和性受質透過 UGT 代謝(Jancova et al., 2010). 2. Glutathione S-transferases (GSTs；EC 2.5.1.18). 9.

(24) GSTs 是 phase II 反應中重要的酵素之一，為複合型酵素家族(mutienzyme family)，多數 isozymes 存在細胞質(cytosol)中，僅少部分則存在微粒體(microsome) 中。哺乳動物之 GST 可分為八大類，分別是存在細胞質的 α、μ、ο、π、σ、τ、ζ 和微粒體中的 κ form (Hayes et al., 2005; Pool-Zobel et al., 2005; van Iersel et al., 1999)；廣泛分布於各組織中。 GSTs 藉由催化 GSH 與外來物質或致癌物結合，GSTs 受質包括親核性芳香物質 (nucleophilic aromatic substitutions)、氫過氧化物以及疏水性和親電子性的化合物等，所以胞內如有過多這些化合物發生 GSH 結合反應時，將使得胞內 GSH 含量減少，此時 GSH 如未能及時補充，將增加氧化傷害的機會(圖五) (Jancova et al., 2010)。 GSTs 除行解毒反應外，同時也具有過氧化酵素活性(selenium-independent GSH peroxidase)，可將有機過氧化物(organic hydroperoxides)還原為醇類(alcohols)，因此 GSTs 除參與解毒反應外，同時也是抗氧化酵素之一。. 圖五、GST 催化的結合反應(Jancova et al., 2010). 由於 GST 的特性，它有廣泛的受質選擇性，比如 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)即是其中之一，而 CDNB 也常作為測量 GST 酵素活性的受質。Manson 等人證實十字花科蔬菜的萃取物與葡萄柚萃取物具有誘發 GST 的現象，被當作 GST 的 inducer (Manson et al., 1997)。. 10.

(25) (四)第三期膜轉運作用(Phase III membrane transportation) 轉運蛋白主要的角色是降低內生性物質及外來物質的吸收或增加排除，所以藥物轉運蛋白(drug transporter proteins)的角色於許多醫學領域中受到不少注意，尤其是藥理學(pharmacology)和腫瘤學(oncology)，其調節作用無論在藥物之動力學性質 (吸收、分布以及排除)和細胞抗藥性之發展上皆為重要。膜轉運蛋白主要分為三大類：ATP-binding cassette transporters (ABC)、mutidrug resistance-associated protein (MRP)和 organic anion transporting polypeptide (OATP)，目前已有 400 種獨立的轉運蛋白質被發現，且遍布身體各部位。近幾年雖對這些轉運蛋白在體內的遺傳變異雖有不少研究，但對它們在藥物的轉運作用機轉上，仍有相當多的地方有待釐清 (Franke et al., 2010)。. 1. ATP-binding cassette transporters (ABC) ABC transporters 家族約有 48 種基因，最廣為研究的是 ABCB1 和 ABCG2 兩者，與跨膜蛋白結合，水解 ATP 產生能量，驅動許多分子穿透細胞膜(Franke et al., 2010)。ABC 轉運蛋白被認為具有高度的受質依賴性(substrate-dependent)，在解毒和防禦抵抗外來物質上扮演著重要的角色(Lin and Yamazaki, 2003)，已知 ABC transpoter 基因剔除的 mdr1a/1b (-/-)小鼠，將有血腦障壁功能改變(Schinkel et al., 1997; Schinkel et al., 1994)，小腸之藥物吸收受到影響(Jonker et al., 2002; Sparreboom et al., 1997)，胎兒的藥物暴露(Smit et al., 1999)及藥物對輸精管的損傷(Wijnholds et al., 2000)增加等現象。 ABCB1 是第一個被分離鑑定出來的膜轉運蛋白，又稱為 MDR1 (muti-drug resistant)或 P-gp (p-glycoprotein) (Gottesman and Pastan, 1993)。已知 ABCB1 表現在許多正常的組織中，主要目的是將有毒物質從細胞內排出，避免殘留在胞內，造成傷害。ABCB1 在血腦障壁中高度表現，所以有助於排出腦部的有毒化合物，減少這. 11.

(26) 些化合物在腦內的濃度(van Tellingen, 2001)。除此之外，ABCB1 也存在於許多具分泌功能的細胞(excretory cells)中，例如腎小管上皮細胞、肝細胞、小腸上皮細胞，以小腸上皮細胞為例，ABCB1 即主要表現在上皮細胞的頂面(apical surface)，已有研究指出 ABCB1 表現的多寡與功能正常與否將影響下消化道(迴腸、空腸和結腸) 對藥物的吸收及口服藥物的生物可利用率(bioavalibility)。. 2. Mutidrug resistance-associated protein (MRP) MRP 共有 MRP1 (ABCC1)、MRP2 (ABCC2)、MRP3 (ABCC3)等共 9 個家族， MRP1 和 MRP3 位於肝細胞小管(canalicular)的基底膜上，負責將代謝後的藥物運送至血液中，透過尿液排除；MRP2 則位於肝細胞膜表面，負責將藥物運送至膽汁中 (Xu et al., 2005)。. 3. Organic anion transporting polypeptides (OATP) OATP 家族包含至少 300 種以上蛋白質，分成 47 個家族(Hediger et al., 2004)，此膜蛋白利用被動運輸和離子交換方式協助運送、穿透細胞膜。OATP 調節廣泛的兩性有機化合物(amphipathic organic compounds)，並以 sodium-和 ATP-independent 方式運送多種內生性與外源性化合物，包括結合與未結合的膽紅素、類固醇結合物、陰離子 oligopeptides、二價陽離子、甲狀腺素(T3、T4)、膽鹽、外來物質以及藥物等(Hagenbuch and Meier, 2003; Reichel et al., 1999)。 OATP1B1 主要表現在肝細胞的基底膜上，可將血液中的藥物吃入(uptake)肝細胞內(Abe et al., 1999)，進入細胞後，再由 Phase I 及 Phase II 藥物代謝酵素接手作用 (圖六)。. 12.

(27) 圖六、ABC 和 OATP 對口服與靜脈注射藥物的作用(Franke et al., 2010). (五)大蒜與藥物交互作用近年來，已有不少研究指出大蒜或大蒜硫化物可改變生物體內多種藥物代謝酵素的活性及基因轉錄作用，此外深入了解保健食品消費市場後，可發現慢性病患者或高齡者常是購買這些食品補充劑最大之族群，由於慢性病患者或高齡者同時也是慢性處方藥物高度使用者，因此保健食品和藥物共同服用後，如果引起 herb-drug interaction，將是使得藥效減弱或是使得藥物累積於體內產生毒性之重要關鍵。 Gurley 等人即證實大蒜精油會影響人類的藥物代謝酵素 CYP2E1 活性，他們給予受測者大蒜精油每天 1500 mg，為期 28 天，結果發現大蒜精油可顯著抑制了血液中 6-hydroxychlorzoxazone/chlorzoxazone 的比值，指出大蒜精油可抑制 CYP2E1 的酵素活性(Gurley et al., 2002, 2005)。在另一有九位自願者參與的實驗中，每人每日服用 1200 mg 大蒜萃取物，分三次給予，持續 21 天，結果發現大蒜萃取物將降低血漿中蛋白質酶抑制劑－saquinavir 曲線下面積(area under the curve, AUC)，同時也使得血漿最大濃度(Cmax)減少 51～54%(Piscitelli et al., 2002)。Saquinavir 已知是 CYP3A4 和. 13.

(28) P-GP 的受質，而 CYP3A4 與 P-GP 的活性會被大蒜萃取物所誘發(Plosker and Scott, 2003)。然而 Markowitz 等人卻證實每天投與大蒜萃取物 1800 mg，14 天後並不會改變 dextromethorphan (CYP2D6)和 alprazolam (3A4)之血漿藥物濃度(Markowitz et al., 2003)。近年來針對大蒜和藥物交互作用的研究報告整理如下表(表三)：. 表三、大蒜與藥物之交互作用 Preparation. Dose. Model. Effects. Reference. Garlic extract. 1200 mg/day for 21. 9 health adults. ↓ saquinavir 51% AUC. (Piscitelli et. ↓ Cmax 54%. al., 2002). 14 healthy. Did not signiﬁcantly. (Markowitz. volunteers. affect the activity of. et al., 2003). days Garlic extract. 1800 mg /day (600 μg allicin /600 mg tablet). Garlic oil. CYP2D6 or CYP3A4. 1500 mg /day for 28. 12 elderly. ↓ 6-hydroxy-. (Gurley et. days. adults. chlorzoxazone/chlorzoxa. al., 2005). zone serum ratios ↓ CYP2E1 activity Garlic extract. Garlic extract. Garlic extract. 600mg /day. 10 Patients. No changes on. (Cox et al.,. (3.6 mg allicin /. (adenocarcinom. pharmacokinectics of. 2006). tablet), for 17 days. a of the breast). docetaxel. 2000 mg /day. 12 health males. No changes on. (Mohamme. (3.71 mg allicin /. pharmacokinectics of. d Abdul et. tablte), for 2 weeks. warfarin. al., 2008). ↑ p-glycoprotein. (Hajda et. mg γ-glutamylcysteine. Independent of CYP 3A4. al., 2010). 及 4.8 mg alliin), for. ↓ saquinavir. 21 days. bioavailability. 600 mg taplets (含 12. 10 health males. Garlic. 125, 250, 500 mg/kg. 8 Wistar Albino. ↑ bioavalibility. (Asdaq and. homogenate. for 30 days. rats. ↑ half-life of. Inamdar,. hydrochlorthiazide. 2009). ↓ clearance rate. 14.

(29) (六)食用大蒜之副作用及安全性評估雖然大部分的人服用大蒜似乎是安全的，然而也有報告發現有些人在食用大蒜後，可能會有呼吸困難、口腔或胃灼熱、心灼熱、產氣、噁心、嘔吐和腹瀉等副作用，亦有研究指出在術後服用可能增加出血的機率，大蒜也不適合塗抹在皮膚上，可能造成皮膚灼傷(Ackermann et al., 2001)。許多研究已證實大蒜可能對部分藥物在體內的作用產生影響，因此改變了這些藥物的藥效，可能藥物包括 acetaminophen (Zhao and Shichi, 1998)、chlorzoxazone (Gurley et al., 2002)、抗癌藥物(paclitaxel) (Cox et al., 2006)、降血壓藥(losarstatin)、降血糖藥(glucocorticoids)與抗凝血藥物(aspirin, diclofenac, heparin, warfarin)等 (MedlinePlus®-U.S. National Library of medicine)。亦有實驗證實，如大蒜與其它也具有抗凝血功能的保健食品(如魚油或銀杏、薑與丹蔘等中草藥) 同時服用的話，可能延緩血液凝集，因而增加出血的風險(Evans, 2000) (MedlinePlus®-U.S. National Library of medicine)。. 三、生物體之抗氧化防禦系統(antioxidant defense system) 生物體進行氧化作用等代謝時，比如粒線體中氧化磷酸化作用、免疫作用、CYP 藥物代謝，常伴隨自由基與活性氧物質(reactive oxygen species)的產生，如超氧陰離子(superoxide anion radical，O2-‧)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、氫氧自由基(hydroxyl radicals，‧OH)及過氧化自由基(peroxyl radical)等，除了來自前述內生性反應外，也有部分活性氧來自外在因子，比如離子輻射、紫外線照射、抽菸、空氣汙染、重金屬、氧化物、藥物等。當胞內或體內製造出過多自由基與活性分子時，它們會和體內許多重要分子如核酸、蛋白質或生物膜上之多元性不飽和脂肪酸發生反應，產生氧化壓力(oxidative stress)，引起生物體氧化性傷害；為抵禦氧化傷害，生物體因此演化出一套抗氧化防禦系統，達到自我保護的效果。依抗氧化的作用性 15.

(30) 質，此系統可概分為兩類，一類為由非酵素分子組成的抗氧化系統(non-enzymatic antioxidant defense)，主要成員包括脂溶性的維生素 E、類胡蘿蔔素與水溶性的維生素 C、麩胱甘肽(glutathione, GSH)等；另一類則是由多種抗氧化酵素所組成的酵素系統(enzymatic antioxidant defenses)，酵素成員有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、觸酶(catalase, CAT)、麩胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase, GPx) 與血基質氧化酶(heme-oxygenase, HO)等；第三類則是輔助系統，參與成員有麩胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GRd)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, GAPDH)和運鐵蛋白(transferrin)等，這些成員分別有各自的生化功能，並未直接與活性分子反應，但是它們卻可透過間接方式，協助抗氧化分子或抗氧化酵素的作用，協同抵抗活性氧分子的生成(Berlett and Stadtman, 1997)。. 1. 麩胱甘肽(glutathione, GSH) 麩胱甘肽(glutathione, GSH)為胞內重要三胜肽分子，由麩氨酸(glutamate)、半胱氨酸(cysteine)及甘氨酸(glycine)三個氨基酸所組成(圖七)，分子量為 307.33 Da，是一廣泛分布於生物體內的天然抗氧化物質，通常以還原態(glutathione , GSH)及氧化態(glutathione disulfide, GSSG)二種型式存在，正常狀態下，還原態 GSH 含量遠高於氧化態，一般細胞中，超過 90%的 GSH 是以還原態型式存在。哺乳動物細胞內的 GSH 濃度約 1~10 mM 間，以肝臟為例，GSH 濃度可高達 10 mM (Knapen et al., 1999; Lu, 2009; Lu et al., 1999; Soltaninassab et al., 2000)。證據顯示 GSH 在體內扮演著多種生理角色(Fang et al., 2002; Han et al., 1997a, b) 重要者有：(1)抗氧化作用：清除自由基與過氧化物(Griffith and Mulcahy, 1999; Pompella et al., 2003)；(2)參與外來異物(xenobiotics)的藥物代謝或解毒作用；(3)維持蛋白質分子中硫醇基之氧化與還原狀態間的平衡；(4)作為半胱胺酸的儲存及運送型式；(5)參與維生素 E 再生(Halliwell and Cross, 1994)；(6)參與蛋白質與 DNA 合成、. 16.

(31) 調節細胞生長與代謝；(7)增進免疫功能：刺激干擾素 IL-1 (interleukin)及 IL-2 產生 (Wu et al., 1994)等，其中又以它在抗氧化及藥物代謝上扮演的角色受到最多重視。. 圖七、麩胱甘肽(Glutathione)之結構(Lu, 2009). ◆GSH 之抗氧化功能 GSH 的抗氧化作用主要與其 cysteine 側鏈的硫醇基有關，可提供電子給自由基，終止自由基的連鎖反應；GSH 除了直接與活性氧反應外，亦可透過 GSH peroxidase (GPx)的作用，參與胞內過氧化物的還原，因此 GSH 在還原體內過氧化氫與消除自由基中扮演重要角色。在這些反應中，GSH 將形成氧化態的 GSSG，此時 GSSG 在 NADPH 的存在下，可經由 GSH reductase (GRd)的作用，還原為 GSH，提供細胞後續再利用，同時維持胞內還原態和氧化態 GSH 含量的平衡(圖八)。這也解釋胞內 GSH/GSSG 比值的變化所以被視為抗氧化和氧化壓力間平衡的指標的原因(Knapen et al., 1999; Pompella et al., 2003)。. 圖八、GSH 之抗氧化功能(Lu, 2009). 17.

(32) 2. 血基質氧化酶(Hemeoxygenase, HO; EC 1.14.99.3) 目前已知有三種血基質氧化酶，分別為第一型血基質氧化酶(HO-1)，分子量約 32 kDa，第二型血基質氧化酶(HO-2)，分子量約 34 kDa，以及第三型血基質氧化酶(HO-3)，分子量約 33 kDa。三者可能源自同一基因，所以分子量相近，事實上，HO-1 及 HO-2 二者同源性(homology)約 40%，然而 HO-2 與 HO-3 的同源性則高達 90%。HO-1 屬於誘導表現(inducible)的酵素，多存在於脾臟、肝臟及睪丸組織中(Siow et al., 1999)；HO-2 和 HO-3 則是持續表現(constitutive expression)在腦、神經系統以及心血管組織等各組織細胞中，而且表現量相當高。由於 HO-1 的可誘發性質，因此被視為是細胞在氧化壓力誘發下重要的抗氧化酵素蛋白質之一。HO-1 負責催化血基質(heme)之分解，產生等莫耳數的膽綠素 (biliverdin)、鐵離子(Fe+2)以及一氧化碳(carbon monoxide, CO) (圖九) (Farombi and Surh, 2006)。. 圖九、HO-1 之作用及其代謝產物(Farombi and Surh, 2006). 許多研究指出，HO-1 受到許多因子的誘發，例如低氧(hypoxia)、血基質(heme)、內毒素、發炎、紫外線、局部缺血(ischemia)、熱休克、重金屬(鎘、砷)等(Clark et al., 18.

(33) 2000; Gruber et al., 2010; Minamino et al., 2001))，也有文獻指出，多種天然植化物 (phytochemicals)，如 resveratrol、curcumin、quercetin 等，亦可透過調控 HO-1 表現，因應胞內氧化壓力(Farghali et al., 2009)。上述證據可知，當組織或細胞處於氧化壓力或損傷等壓力情況時，均會誘導 HO-1 的大量表現，達到保護細胞的目的，因此 HO-1 也被稱為誘導性壓力蛋白(inducible stress protein)。 HO-1 具調節多種生理機能的特性，除了藉由本身酵素活性及其反應產物降低細胞氧化壓力的強抗氧化能力外，另外還有(1)抗發炎：可透過降低內皮細胞之黏附因子與趨化因子的表現，直接或間接抑制發炎反應(Chao et al., 2011; Minamino et al., 2001; Vachharajani et al., 2000)；(2)抗細胞凋亡：在 TNF-α 誘發小鼠初代肝細胞損傷模式下，上調 HO-1 表現有助於抑制細胞凋亡(Zuckerbraun et al., 2003)；(3)保護心血管(Idriss et al., 2008)；(4)避免移植的排斥現象：增加 HO-1 活性可防止心血管受到局部缺氧/再灌流(ischemia/reperfusion)的傷害(Yet et al., 2001)。. 3. 麩氨酸-半胱氨酸接合酶(glutamate-cysteine ligase, GCL; EC 6.3.2.2) GCL 又稱 γ- glutamylcysteine synthase (GCS)，為 GSH 生合成之第一反應步驟，也是 GSH 生合成的速率限制酵素(rate-limiting enzyme)。GCL 主要作用為催化 glutamate 上的 γ-羧基(carboxyl group)經由 ATP 的活化，形成醯基磷酸(acyl phosphate)中間產物，再與 cysteine 上 α-胺基形成 γ-glutamylcysteine； γ-Glutamylcysteine 形成後，再藉由 GS 催化與 glycine 結合，即可完成三胜肽 GSH 的生成。由於 GCL 是決定胞內 GSH 含量多寡的主要酵素，因此在調控體內氧化還原平衡中，扮演著重要角色，所以在多種抗氧化酵素基因中，GCL 基因表現的調節機轉也受到不少的注意。在低等生物體中，GCL 為單一基因產物；但在多數真核生物體中，GCL 為異質二聚體(heterodimer)，由兩個獨立的蛋白質所構成，一為麩氨酸-半胱氨酸接合酶. 19.

(34) 催化次單元(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)，分子量約 73 kDa，另一則是負責調節 GCLC 活性的麩氨酸-半胱氨酸接合酶調節次單元 (glutamate-cysteine ligase modifier subunit, GCLM) 分子量約為 31 kDa，兩者共同合作形成具催化效率之 GCL (圖十) (Dalton et al., 2000; Franklin et al., 2009; Seelig et al., 1984). 圖十、麩氨酸-半胱氨酸接合酶與 GSH 生合成(Franklin et al., 2009). GCLC 具有活化 ATP，催化 cysteine 上 α-胺基與 glutamate 上的 γ-羧基形成 γ-glutamylcysteine 之位點。GCLM 本身並不具酵素活性，但可與 GCLC 交互作用，所以在調控 GCL 活性上有著重要的角色。一般情況下，雖 GCLC 的活性受到 GCLM 的調節，但當 GCLC 大量表現時，亦可直接擔負 GCL 活性，單獨催化 γ-glutamylcysteine 的生成，當然和 GCLC/GCLM 形成的異質二聚體相較，單獨 GCLC 的催化活性遠較異質二聚體低(Chen et al., 2005; Seelig et al., 1984)。. 20.

(35) 四、 Atorvastatin 之簡介 Atorvastatin 是目前市面上常見六種 statins 中的一種，其他則有 fluvastatin、 lovastatin、pravastatin、rosuvastatin、simvastatin (蔡慧珊, 2004)。 3-Hydroxy-3-methylglutary:coenzyme-A (HMG-CoA) reductase 是催化 HMG-CoA 轉變成 mevalonate 的速率限制酵素，抑制此一酵素將可減少膽固醇合成，使得血膽固醇濃度降低。由於 Statins 在抑制 HMG-CoA reductase 活性上表現出良好的效果，所以臨床上主要應用在降血膽固醇，可(1)抑制內生性膽固醇之合成、(2)降低低密度脂蛋白(LDL)、(3)降低 apolipoprotein B (Apo B)、(4)降低三酸甘油脂(triglycerides)、 (5)增加高密度脂蛋白(HDL)，因此有助於減少心血管疾病發生的機會。但各種 statins 之間的效果、藥物動力學之特性、藥物交互作用仍有所差異(表四)。其中 atorvastatin 是目前世界上最廣泛使用的降血脂用藥，市售劑量為 10 mg～80 mg (IMS Health. MIDAS, 2010)。Atorvastatin 為親脂性藥物，在體內主要被 CYP 3A4 所代謝，代謝產物主要經由糞便排除(98%)，其餘則由尿液中排除。. 表四、Statins 類藥物之比較(Goard et al., 2010; 蔡慧珊, 2004) 特性. 藥物. atorvastatin. lovastatin. simvastatin. Rosuvastatin. 生物可利用率%. 15. <5. <5. 20. 蛋白結合率%. 80-89. >95. 94-89. 88-90. 血漿半衰期(hr). 14-30. 3-4. 2-5. 19-21. 親脂/親水性. 親脂. 親脂. 親脂. 親水. 代謝. CYP 3A4. CYP 3A4. CYP 3A4. CYP 2C9. 尿液. 2%. 10 %. 13 %. 10 %. 糞便. 98 %. 83 %. 60 %. 90 %. 排除. 21.

(36) (一) Atorvastatin 之代謝路徑經口攝入 atorvastatin 後，透過腸肝循環進行全身性代謝作用(圖十一)，第一個遇到的屏障為負責吸收的腸腔，在小腸上皮細胞中透過 CYP3A4 代謝，產物隨即在腸腔中即被 P-gp 等轉運蛋白送入腸腔中，未代謝的 atorvastatin 則藉血液循環進入肝臟中，此時的 atorvastatin 再藉由 CYP3A4 與 phase II 的 UGTs 的代謝，最後經由尿液或膽汁排出體外。Atorvastatin 在人體內被 CYP3A4 代謝後可生成具活性的 acid 產物 ortho- (2-OH)和 para- (4-OH) hydroxylated atorvastic acid 及不具活性的 lactone 產物。由於 atorvastatin 主要藉 CYP3A4、UGTs 以及 P-gp 所代謝，因此，如同時服用也由 CYP 3A4 所代謝的藥物時，例如 azole 類抗黴菌藥物、巨環類抗生素、鈣離子阻抗劑(如 diltazem、verapamil)、cyclosporin 或葡萄柚汁(抑制 CYP 3A4 活性)時，均可能降低 atorvastatin 的代謝速率，因此增加藥物滯留時間，當然可能增加 atorvastatin 的副作用。. 圖十一、Atorvastatin 之代謝路徑 modified from (Klein et al., 2001). 22.

(37) (二) Atorvastatin 之安全性評估目前已超過 400 個臨床試驗對 atorvastatin 的功效與安全性進行評估，結果指出 atorvastatin 在劑量 80 mg/day 下是安全的，然而仍有少部分的人可能出現不良現象，如腹瀉、關節痛、鼻咽炎、噁心、嘔吐等副作用，也有些人在服用 80 mg/day 時，可能增加血漿中轉胺酶(AST、ALT)活性。除此之外，若再同時服用 CYP3A4 抑制劑(如 cyclosporine, protease inhibitors)、葉酸衍生物(如 gemfibrozil)或菸鹼酸(≧1 g/day)時，則可能發展成橫紋肌溶解(rhabdomyolysis)症，並伴隨急性腎衰竭或肌病變。所以如有上述現象時，應考慮調整服用 atorvastatin 劑量(Pfizer, Inc.)。. 五、調控藥物代謝酵素之訊息傳遞路徑近年來有許多研究指出，大部分的 CYP 基因表現可透過 ligand-activated nuclear receptors (NRs)或轉錄因子(transcription factors)加以調節。目前已知有 49 種 NR subfamily，但仍有許多 NRs 的 ligand 仍不清楚，因此稱為 orphan receptors，或可能不存在的稱為 true orphans。核接受器的 ligand 在自然情況下通常為小的且是親脂性的分子，待其以擴散(diffuse)方式進入細胞。目前較廣泛被研究的三種 orphan 核接受器次家族為 Constitutive androstane receptor (CAR，NR1I3)、Pregnane X receptor (PXR，又稱 NR1I2)與 peroxisome proliferative activating receptors (PPARs，有 α、δ 與 γ 三種形式)，分別調節肝臟中的 CYP2、CYP3 與 CYP4 家族基因的轉錄作用，一般實驗中常見的典型誘發劑(inducer) 分別是 phenobarbital (CAR)、pregnenolone 16α-carbonitrile 和 rifampicin (PXR)與 clofibric acid (PPAR) (Waxman, 1999)。此外，AhR 相較於 PXR 與 CAR，更具基因多型性(genetic polymorphism)。其他參與 CYP 基因調控的核接受器，還有調控 CYP7 的 liver X receptor (LXR)、調控膽酸生合成的 farnesoid X receptor (FXR)。這些接受器結合到 DNA 上前，還須先與另一核蛋白質結合為異質二聚體(hetrodimer)，比如. 23.

(38) AhR 與 ARNT、PXR 和 CAR 分別與 retinoid X receptor (RXR)，才能調控藥物代謝酵素基因的轉錄。刺激上述之核接受活化的內生性 ligands 以及各自的 DNA response element 如表六所示，此外，外來物質或內生性物質對核接受器與 CYP450s 之間的交互影響路徑如圖十二所示。. 表五、調節 CYPs 的核接受器(Waxman, 1999) P450 誘導物. 影響大鼠肝臟的 CYPs. 核接受器. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). 1A1、1A2、1B1. AhRa. Phenobarbital. 2B1、2B2. CAR. Dexamethasone. 3A1、3A2、3A23. PXR. Fibrate drugs. 4A1、4A2、4A3. PPARα. Cholesterol. 7A1. LXRα. Bile acid. 7A1. FXR. a. Basic helix-loop-helix protein belonging to the Per-Arnt-Sim family of transcription factors.. 表六、核接受器：內生性 ligands 與 DNA response element (Waxman, 1999) Nuclear receptor. AGGTCA-based. Endogenous ligands. DNA response element. CAR. Androstanol, androstenol. DR4 (direct repeat4 bp). PXR. Pregnenolone, corticosterone. DR3, ER6 (everted repeat 6 bp). PPARα. Linoleic acid, arachidonic acid. DR1. 圖十二、外來物質或內生性物質對核接受器與 CYP450s 之間的交互影響 (Waxman, 1999). 24.

(39) 1. Aryl hydrocarbon receptor (AhR) AhR 為 basic helix-loop-helix (bHLH) 蛋白質，屬於 Per-Arnt-Sim 家族的轉錄因子(transcription factor)，除了負責誘發人類 CYP1A1、1A2 以及 1B1 的轉錄作用外 (Quattrochi et al., 1994; Tang et al., 1996; Whitlock, 1999)，也會誘發許多其他的基因，例如 phase II 的藥物代謝酵素，比如：NQO-1、GST 與 UGT 等， (Schmidt and Bradfield, 1996)。當 AhR ligand 未與受質(ligand)結合稱之為 unligand AhR，可與 chaperon 蛋白，如 HSP90 (heat shock protein 90)等形成雙體(dimer)，這些蛋白可穩定 AhR 並做出正確的摺疊(folding)，因此留在細胞質中(Gu et al., 2000)，一旦 AhR 與其受質結合後，將與 chaperon 蛋白解離，並轉位進入細胞核中，再與 ARNT (AhR nuclear translocator)形成 heterodimer (Hoffman et al., 1991)，隨後與目標基因調控區 (promoter)上的 XRE /DRE (xenobiotic response element/didoxin response element)上 (圖十三 A)，因此活化 CYP 基因進行轉錄作用(Hankinson, 1994)。. 2. PXR PXR 為 orphan receptors，負責調節 CYP3A4、3A7 與 2C9 等，但其中以 CYP3A4 為最重要的目標基因，主要表現在肝臟、小腸與結腸中(Bertilsson et al., 1998)。PXR 的 ligand 具有多樣性的，其中包括親和性較低的內生性物質與化學物質，例如：固醇類荷爾蒙和固醇類代謝物等以及食物來源的成份(coumestrol (香豆素)和類胡蘿蔔素等) (Pichard-Garcia L, 2000)；此外，PXR 也已知可被一些藥物所活化，例如 rifampicin、phenobarbital、RU486 等(Moore et al., 2000)。當活化的 PXR 和 RXR (retinoid X receptor)形成 heterodimer 後，將接合在 PXRRE (PXR response element) 上，因而上調 CYP 基因進行轉錄作用(Waxman, 1999)，其路徑如圖十三(B)所示。至於 CAR 主要以 CYP2B 為目標基因，當 CAR 與 ligand 結合後，活化的 CAR 會與 RXR 形成 heterodimer，隨之與 CARRE (CAR response element )結合(圖十三 C)。. 25.

(40) 除了 phase I 的 CYPs 調控外，Phase II 解毒酵素基因轉錄作用的調控機制也廣受研究，後來更發現 phase II 結合酵素與 phasr III 膜轉運蛋白在活化轉錄因子間有著共同調節的關係(Yang et al., 2010)。綜合許多研究證實，植物化學物質可透過 phosphoinostide 3-kinase (PI3K)、protein kinase C (PKC)以及 mitogen-activated protein kinases (MAPK)等訊號路徑誘發 phase II 結合酵素與 phase III 轉運蛋白表現(Yang et al., 2010)，這些訊號進一步活化下游轉錄因子後，將上調 phase II 結合酵素與 phase III 轉運蛋白基因表現，參與的轉錄因子中較為孰知的有 NF-E2-related factor 2 (Nrf2)、CCAAT-enhancer binding protein-β (C/EBPβ)、hepatic nuclear factor 1 (HNF1)、 peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs)以及 nuclear receptors (比如 PXR、 FXR)等(Yang et al., 2010)，其路徑圖如圖十四所示。. (A). (B). (C). 圖十三、轉錄因子與核接受器調節 CYP 之路徑 Modified from (Hukkanen, 2000). 26.

(41) 圖十四、參與 phase II 結合酵素與 phase III 轉運蛋白基因轉錄之訊號路徑 (Yang et al., 2010). 六、藥物動力學(pharmacokinetics) 藥物開發的過程中，找到具備良好藥物活性的候選藥物是最重要的，然而具有活性的藥物卻無法同時擁有適當的藥物動力學性質(例如吸收差、半衰期過短或過長等)，即可能無法成為發展為適用藥物的候選者。臨床試驗中藥物動力學試驗屬於藥理與毒理試驗中的一部份，目的在探討人體中對藥物的吸收(absorption)、分布 (distribution)、代謝(metabolism)以及排除(elimination)等性質，以及藥物與其代謝產物在體內的濃度隨時間變化與毒性或藥效間的相關性。藥物動力學模式可分為 compartmental 或 non-compartmental，但無論使用何種模式描述生理現象，都會有許多的限制，因此模式並非分析的必要條件，更重要的是藥物動力學參數的計算，所以藥物動力學分析應著重在精確的參數運算上。常見藥物動力學參數包括清除率(clearance)、分布體積(volume of distribution)、生物可利用率(bioavalibility)、吸收速率常數(Ka)、排除常數(K)、半衰期(half-time)、藥物在. 27.

(42) 體內的平均滯留時間(mean retention time, MRT)、血中最高濃度與時間(Cmax, Tmax)、血中濃度與曲線下面積(area under the curve, AUC)等(林君榮, 2005)。. (一) 清除率(Clearance, Cl) 清除率(Clearance, Cl)，指單位時間內藥物從身體清除的體液體積，被認為是藥物溶解且分布於身體的體液中，而身體為體液分布的空間。清除率的單位為 ml/min 或 L/min，因此清除率可被定義為藥物排除速率除以血漿中藥物之濃度，由下列公式表示： Cl=藥物排除速率/血漿中藥物濃度. (二) 半衰期(half-life, T1/2) 血漿中藥物濃度達到其原始值的一半所需的時間，計算藥物的半衰期可以了解藥物目前的體內濃度。. (三) 藥物濃度曲線下面積(area under the curve, AUC) AUC 可反應藥物到達全身循環的總量，利用血漿中藥物濃度－時間曲線下，從 t=0 到 t=∞的面積，單位是濃度×時間(μg/ml×hr)。. (四) 血中藥物最高濃度(Cmax) 口服藥物後，觀察其血漿中達到最高之藥物濃度，單位是 nmol/ml 或 ng/ml。. (五) 藥物達血中濃度最高之時間(Tmax) 口服藥物後，觀察其血漿中達到最高濃度所需之時間，單位是 min 或 hr。. 28.

(43) 第三章、實驗材料與方法一、實驗架構. 29.

(44) 二、實驗材料 (一) 實驗動物六週齡及十週齡 3 50 公克頸靜脈插管雄性 Sprague-Dawley 大鼠由樂斯科生物科技股份有限公司(Bio LASCO Taiwan Co., Ltd)購入。. (二) 大蒜精油的製備當季新鮮大蒜購自雲林縣北港鎮。製備大蒜精油(GO, garlic oil)時，秤取 1 公斤脫膜新鮮大蒜放入 Warring blender 中，加入 2 公升蒸餾水，打碎後，倒入蒸餾瓶中(圖一 A)，以水蒸氣蒸餾法(Steam distillation method)抽取大蒜可揮發成分(圖一 B、C)，所得萃取物以 Na2SO4 進行脫水作用後，利用 0.45 μm nitrocellulose acetate membranes 過濾所得油狀物即大蒜精油，每公斤大算約可抽取 2～2.5 g 精油。. A. B. C. Garlic oil. 圖一、大蒜精油製備之設備與精油成品. 30.

(45) (三) 化學試劑 1、大蒜精油脫水之用藥 (1) 購自 Wako (Tokyo, Japan) Sodium sulfate, anhydrous (Na2SO4). 2、大蒜精油之含硫化合物之標準品 (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Diallyl sulfide (DAS) , ≥95% (GC) (2) 購自 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan) Diallyl disulfide (DADS) , ≥70% (GC) (3) 購自 LKT Diallyl trisulfide (DATS) , ≥98% (GC) (4) 購自 Merck Chemical Company (Darmstadt, Germany) Dimethylsulfoxide (DMSO). 3、大鼠採血與分析之材料與用藥 (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Heparin Ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) (2) 購自 TERUMO® (Tokyo, Japan) Needle 19G×1 1/2〞R.B. (3) 購自台灣特浦份有限公司 (Taiwan) Top syringe tuberculin with needle 1ml 27 G× 1/2〞R.B. Top syringe tuberculin with needle 20 ml 23 G× 1〞R.B.. 31.

(46) 4、大鼠血液生化值分析之用藥 (1) 購自 Randox (Antrim, United Kingdom) AST kit ALT kit. 5、大鼠肝臟均質液、保存液之用藥 (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) Sodium chloride (NaCl) Potassium chloride (KCl) Potassium phosphate dibasic anhydrous, ACS reagent (K2HPO4) Potassium phosphate monobasic anhydrous, ACS reagent (KH2PO4). 6、. 大鼠小腸清洗與浸泡之用藥. (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) Dithiothreitol (DTT) Protease inhibitor cocktail tablet, EDTA free Phenylmethanesulfon (PMSF) Sodium chloride (NaCl) Sodium phosphate dibasic anhydrate, ACS reagent (Na2HPO4．7H2O) Sodium phosphate monobasic monohydrate, ACS reagent, (NaH2PO4．H2O). 32.

(47) 7、大鼠小腸微粒體均質之用藥 (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) Glycerol Protease inhibitor cocktail tablet, EDTA free Phenylmethanesulfon (PMSF) Sodium phosphate dibasic anhydrate, ACS reagent (Na2HPO4．7H2O) Sodium phosphate monobasic monohydrate, ACS reagent, (NaH2PO4．H2O) Sodium chloride (NaCl). 8、大鼠肝臟與小腸 P-glycoprotein 均質之用藥 (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) Dithiothreitol (DTT) Protease inhibitor cocktail tablet,EDTA free Sodium phosphate dibasic anhydrate, ACS reagent (Na2HPO4．7H2O) Sodium phosphate monobasic monohydrate, ACS reagent, (NaH2PO4．H2O) Sodium chloride (NaCl) Sucrose, ACS reagent. 9、 CYPs 酵素活性、total cytochreme P450 含量、cytochrome b5 及 NADPH-CYP P450 reductase 測定之用藥 (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Alametihicin. 33.

(48) Ethoxyresorufin Cyrochrome c Diclofenac sodium salt Dextromethorphen Dextrophan Glucose-6-phosphate Glucose-6-phosphate dehydrogenase 4’-Hydroxydiclofenac, ≥98% (HPLC) 6’-Hydroxynitrophenol 1’-Hydroxymidazlam Magnesium chloride (MgCl2) Midazlam Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) Potassium phosphate dibasic anhydrous, ACS reagent (K2HPO4) Potassium phosphate monobasic anhydrous, ACS reagent (KH2PO4) ρ-nitrophenol 4-ntrocatechol 4-nitrophenyl β-D-glucuronide (4-NPG) Pentoxyresorufin Resorufin methyl ether (Methoxyresorufin) Resorufin-O-deethylation Sodium dithionite (Na2S2O4) Testosterone. 34.

(49) 6-β-testosterone UDP-glucuronic acid (UDPGA) (2) 購自 ECHO chemical (Taiwan) Acetonitrile (ACN) (3) 購自翔源行氣體公司 (Taiwan) 氮氣. 10、 Atorvastatin 血漿濃度測定之用藥 (1) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Cremophor EL Ammonium acetate (2) 購自 Merck Chemical Company (Darmstadt, Germany) Dimethyl sulfoxide (DMSO) (3) 購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) 2-hydroxyatorvastatin (4) 購自 Waterstone Technology LLC (Hancock St , Carmel, USA) Atorvastatin (5) 購自 ECHO chemical (Taiwan) Acetonitrile (ACN) (6) 購自 Thermo fisher scientific of ACROS organics (Waltham, MA) Formic acid. 35.

(50) 11、蛋白質定量 (1) 購自 Thermo Fisher Scientific Inc.(Rockford, IL, USA) Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay Kit 12、西方墨點法(Western Blotting) (1) 購自 Abcam (MA, USA) Anti-GCS polyclonal antibody Anti-cytochrome P450 2C11 polyclonal antibody (2) 購自購自 BD Biosciences (Clontech, CA, USA) Mouse anti-GST-π (3) 購自 Bio Rad Laboratory (Hercules, CA, USA) 30% Acrylmide/Bis Solution, 29:1 Ammonium persulfate Bromophenol blue (4) 購自 Calbiochem (San Diego, CA) Anti-heme oxygenase-1 rabbir polyclonal antibody Anti-P-glycoproein mouse monoclonal antibody (5) 購自 Chemicon International, Inc. (Beaford, MA, USA) Anti-cytochrome P450 2C6 polyclonal antibody Anti-cytochrome P450 2D1 polyclonal antibody Anti-cytochrome P450 2E1 polyclonal antibody Anti-cytochrome P450 3A1 polyclonal antibody Anti-cytochrome P450 3A2 polyclonal antibody (6) 購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) UGT1A1 polyclonal antibody. 36.

(51) γ-GCLm polyclonal antibody (7) 購自 Merck Chemical Company (Darmstadt, German) 99.8% Ethanol Sodium chloride (NaCl) (8) 購自 Millipore Corporation (Beaford, MA, USA) Anti-GAPDH polyclonal antibody Immobilon™ PVDF (Polyvinylidene fluoride) Transfer Membranes (9) 購自 PerkinElmer Life Science (Boston, MA, USA) Enhanced Chemiluminescence Reagent (ECL kit) (10) 購自 Sigma Chemical company (St. Louis, MO, USA) N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Rabbit anti-actin monoclonal antibody β-Mercaptoethanol Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Glycine Glycerol Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (TWEEN® 20) Ponceau S solution Potassium chloride (KCl) Potassium phosphate dibasic anhydrous, ACS reagent (K2HPO4) Potassium phosphate monobasic anhydrous, ACS reagent (KH2PO4) Sodium dodecyl sulfate (for electrophoresis, ≥98.5% (GC) ) (11) 購自 United States Biological (Swampscott, MA, USA) Tris-HCl (Ultra pure). 37.

(52) 13、 RNA 純化與 real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)分析 (1) 購自 Kapa Biosystems, Inc. (Woburn, MA, USA) KAPA PROBE FAST qPCR kit (2) 購自 MDBio. Inc. (NJ, USA)生工有限公司逆轉錄聚合酶連鎖反應之寡核苷酸引子: β-actin, UGT1A1, P-glycoprotein, HO-1, and cytochrome P450 2B1, 2C11, 2D1, 2E1, 3A1, and 3A2 primers (3) 購自 Merck Chemical Company (Darmstadt, Germany) 99.8% Ethanol Isopropanol (4) 購自 Molecurlar Research Center Inc. (Clincinnati, Ohio) TRI reagent® 1-Bromo-3-Chloropropane 99% (BCP, C3H6BrCl) (5) 購自 Promega Company (Madison, WI, USA) Oligo(dT)15 Primer dNTP mix M-MLV Reverse Transcriptase Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (6) 購自 GENET BIO (Chungnam, Korea) Prime Taq DNA Polymerase (7) 購自 Protech (Taiwan) Ultra pure DEPC water (8) 購自 Roche (Mannheim, Germany) Universal ProbeLibrary Probes #6、#7、#12、#121、#18、#63、#65、#68、#76、. 38.

(53) #92、#113. 14、 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)分析 (1) 購自 GE Healthcare Bio-Sciences AB. (Uppsala, Sweden) Nylon membrane (Hybone-N+) (2) 購自 Merck Chemical Company (Dermstadt, Germany) 10X TBE buffer (3) 購自 Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA) LightShiftTMChemiluminescent EMSA kit (Pierce) (4) 購自 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, USA) Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (Thermo) (5) 購自 Sigma Chemical Company (St, Louis, MO) Aprotinin DL-Dithiothreiyol (DTT) Ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) Leupeutin Magnesium chloride (MgCl2) N-[2-hydroxythyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) Nonidet P-40 (Nonionic detergent) Phenyl methylsulfonyl fluoride (PMSF, C7H7FO2S) Potassium chloride (KCl). 39.

(54) 三、實驗方法（一）動物飼養大鼠飼養於中國醫藥大學動物中心，餵養環境控制為室溫 24℃、12 小時晝夜循環(光照時間為 8：00～20：00)及相對濕度 61%的條件下。大鼠經兩天適應後，依體重分組，實驗期間，自由攝取水與飼料(LabDiet® rodent 5001, Framingham, MA)，實驗分兩部分進行，(1)短期實驗(五天)：早上(9:00-10:00 AM)以胃管灌方式(ig)餵食玉米油(CO 1mg/kg，對照組)或 50 mg/kg 或 200 mg/kg 兩種不同劑量的大蒜精油(Garlic oil, GO)，每天灌食一次；(2)長期實驗(四週)：劑量同短期實驗，但灌食方式採一週三次。兩組大鼠均於最後一次灌食後當日晚上隔夜禁食，期間僅供應水，次日早上再以胃管灌方式坄予 atorvastatin (10 mg/kg)，隨後 6 小時，分於不同時間點經頸靜脈插管(短期)或尾靜脈(長期)採集血液，每次採集血液約 0.2 mL，以肝素為抗凝血劑。. （二）實驗分析項目 1、大蒜精油含硫化合物成分之分析-HPLC 大蒜精油之含硫化合物主要利用 HPLC/UV (High-Performance Liquid Chromatography UV detector, HPLC/UV L-7400, Hitachi)分析，並以紫外線可見光分光光度計(UV-visible spectrophotometer)偵測(波長 240 nm)，其所使用的分離管柱為 ZORBAX Extend-C18 (5 μm, 3.0 × 250 mm)，樣品注入量為 10 μl，流速(flow rate)為 0.8 ml/min，移動相(mobile phase)：移動相 A 是二次水(ddH20)，移動相 B 是 100% acetonitrile (ACN) ，移動梯度如下表所示。所有進入 HPLC 之溶液(移動相 A 與 B)，須經超音波震盪(sonication)脫氣 10 分鐘，即可進行分析，上述實驗皆在室溫下操作。標準品為 diallyl sulfide (DAS)、diallyl disulfide (DADS)、diallyl Trisulfide (DATS) (Chen and Ho, 1998)。. 40.

(55) 移動相沖提梯度設定： Time (min). 0. 20. 30. 40. 45. 50. Mobile phase A (%) Mobile phase B (%). 50 50. 50 50. 0 100. 0 100. 50 50. 50 50. 比對 GO 的 LC 圖譜與標準品的滯留時間與與標準品的檢量線，即為判定 GO 中含硫化合物之依據。再經定性分析確定 GO 中之含硫化合物的含量。. 2、 DAS、DADS 及 DATS 標準品之製備秤取 1 mg DAS、DADS 及 DATS 標準品溶液，先以少量 DMSO 溶解後，再加甲醇至 1 ml，製成濃度為 1 mg/ml 之儲存溶液。. 3、肝臟微粒體(microsome)的製備動物犧牲後立即將肝臟取出，用 0.9% Nacl 灌流乾淨，用衛生紙吸乾多餘水份並秤取重量，之後將肝臟組織剪碎混勻，並利用液態氮冷凍，放入-80℃冰箱中保存備用。秤取約 1 g 冷凍組織碎片，加入四倍肝重的肝臟均質液(0.1 M potassium phosphate buffer (PPB)，含 1.15% KCl)，利用組織均質器(Teflon pestle-glass homogenizer) (Gal-Col® )進行均質(4000 rpm)，直到溶液中不再有塊狀肝臟組織為止，均質完後分裝於離心管中，於 4℃下以 10,000 ×g 離心 15 分鐘，取上清液，重複兩次，再以超高速離心機(Optima™ L-90K Ultracentrifuge, Beckman Coulter) 離心 1 小時(105,000 ×g、4℃)，所得沉澱物即為微粒體，上清液即是細胞質液。以超音波震盪(VIBRA Cell™)方式將微粒體懸浮於 500 μl 0.1M PPB 中(含 1 mM EDTA)，分裝保存於-80℃，兩週內完成藥物代謝酵素活性的測定。. 41.