中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/46095

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(1)中國醫藥大學中醫學系博士班博士論文. 指導教授：陳汶吉教授. 論文題目. 川紅花萃取物對乙二醇誘導大鼠腎臟結石的保護作用 Protective effect of Flos carthami extract against ethylene glycol-induced urolithiasis in rats. 研究生：林武周中華民國一百零一年六月.

(2) 目錄 0B. U 一章、前言U ........................................................ 1 第 U. U. U第一節、研究動機與目的U ......................................... 1 U. U. U第二節、研究的背景U ............................................. 1 U. U. 第 U 二章、文獻回顧U ................................................... 4 U. U. U第一節、尿路結石的流行病學U ..................................... 4 U. U. U第二節、尿路結石的病因病理學U ................................... 4 U. U. U第一項、尿路結石的病理學U ................................... 8 U. U. U第二項、乙二醇、草酸鈣、檸檬酸鉀之作用機制U ................ 10 U. U. 第 U 三項、結石與其他疾病的相關性U ............................ 11 U. U. U第三節、國內相關中西醫研究U .................................... 13 U. U. U第一項、中醫方面U .......................................... 13 U. U. U第二項、西醫方面U .......................................... 14 U. U. U第四節、尿路結石的中醫學探討U .................................. 16 U. U. U第一項、中醫對尿石症的成因及其症狀的相關記載U .............. 16 U. U. 第 U 二項、中醫對尿石症的治療理論U ............................ 16 U. U. U第五節、川紅花的藥理學研究U .................................... 17 U. U. U第一項、化學成分U .......................................... 18 U. U. iv.

(3) U第二項、藥理作用U .......................................... 18 U. U. U第六節、尿路結石的動物模式U .................................... 20 U. U. 第 U 三章、材料與方法U ................................................. 22 U. U. U第一節、實驗流程U .............................................. 22 U. U. U第二節、實驗材料U .............................................. 24 U. U. 第 U 一項、實驗動物U .......................................... 24 U. U. U第二項、川紅花粉末藥物組成U ................................ 26 U. U. U第三項、川紅花粉末的指紋圖譜分析U .......................... 27 U. U. 第 U 四項、川紅花粉末的成份分析U .............................. 28 U. U. U第三節、實驗方法U .............................................. 29 U. U. 第 U 一項、動物分組U .......................................... 29 U. U. U第二項、藥物餵食U .......................................... 30 U. U. 第三項、尿液之收集與檢......................................32 U第四項、血液之採集與檢驗U .................................. 33 U. U. U第五項、動物腎臟之取樣與處理U .............................. 33 U. U. U第六項、腎結晶嚴重度與組織病理評估U ........................ 35 U. U. 第 U 七項、圖片瀏覽評分輔助程式(ImageScoring)U ................ 37 U. U. U第四節、統計方法U .............................................. 42 U. U. 第 U 四章、結果U ....................................................... 43 U. U. U第一節、實驗前後大鼠體重變化和實驗後肝腎重量分析U .............. 43 U. U. v.

(4) U第二節、實驗前基本資料分析U .................................... 44 U. U. U第三節、實驗前後尿液量及尿液生化數據分析U ...................... 45 U. U. U第四節、實驗前後血液生化數據之分析U ............................ 46 U. U. U第五節、腎臟組織損傷之病理分析U ................................ 47 U. U. U第六節、結石誘發比率U .......................................... 49 U. U. U第七節、腎臟結晶嚴重度之分析U .................................. 50 U. U. 第 U 五章、討論U ....................................................... 52 U. U. U第一節、紅花抑制結石機制研究之承啟和延續U ...................... 52 U. U. U第二節、灌食劑的製備、問題與修改U .............................. 53 U. U. U第一項、川紅花灌食劑的製備U ................................ 53 U. U. U第二項、澱粉安慰劑配製U .................................... 53 U. U. U第三項、結石清（檸檬酸鉀）配製U ............................ 54 U. U. U第三節、試驗前後尿液量差異之探討U .............................. 54 U. U. U第四節、乙二醇誘石效果與川紅花預防腎結石劑量之探討U ............ 55 U. U. U第五節、本動物實驗模式之探討U .................................. 56 U. U. U第六節、電腦輔助評分系統是一有效的工具U ........................ 57 U. U. U第七節、川紅花的抗結石機制之探討U .............................. 57 U. U. U第八節、未來展望U .............................................. 59 U. U. 第 U 六章、結論U ....................................................... 61 U. U. 參 U 考文獻U U. U. ......................................................... 62 vi.

(5) U作者簡歷及論文著作U ................................................. 73 U. U. 英 U 文摘要U. ......................................................... 80. 致 U 謝U. ......................................................... 82. U. U. U. U. vii.

(6) 圖目錄. 圖 3.1 SD大鼠（BioLASCO Co 公司提供） ............................................................. 24 U. U. 圖 3.2 中國醫藥大學校內動物飼養中心，室溫維持 22±2℃，濕度為 55±5％ .......25 U. U. 圖 3.3 川紅花（FC）(2)參照標準品(1)之薄層色層分析（由柯達製藥股份有限公司 U. 所提供） ................................................................................................................ 26 U. 圖 3.4 川紅花粉末的指紋圖譜（由柯達製藥股份有限公司所提供） .................... 27 U. U. 圖 3.5 胃管灌食 ............................................................................................................ 31 U. U. 圖 3.6 尿液收集生理代謝籠 ........................................................................................ 32 U. U. 圖 3.7 腎臟組織切片-平分成 8 區 .............................................................................34 U. U. 圖 3.8 腎臟組織切片-100X光學偏光顯微鏡 ............................................................. 34 U. U. 圖 3.9 腎臟組織切片-100X偏光顯微鏡，評分分數 ................................................. 35 U. U. 圖 3.10 圖片瀏覽評分輔助程式(ImageScoring)，登入畫面。 ................................. 37 U. U. 圖 3.11 四級評分參考標準之畫面。 .......................................................................... 38 U. U. 圖 3.12 按上方"評分"進入評分畫面。系統以隨機、雙盲、匿名的方式顯示圖片， U. 判讀者依此圖片在右下角"評分"欄內選取(此張選 0 分)，再按壓下方"給分" 欄給分，系統自動跳下張。 ................................................................................ 38 U. 圖 3.13 在評分畫面，判讀者給予此圖片 1 分。 ....................................................... 39 U. U. viii.

(7) 圖 3.14 在評分畫面，判讀者給予此圖片 2 分。 ...................................................... 39 U. U. 圖 3.15 在評分畫面，判讀者給予此圖片 3 分。 ...................................................... 40 U. U. 圖 3.16 在評分畫面，判讀者完成所有圖片之分數給予後，系統出現"判讀完畢" U. 對話方塊，此時可按"OK"離開"評分"畫面。 .................................................... 40 U. 圖 3.17 選擇上方進入"我的成績單"畫面，將個人之"評分檔"拷貝，送回整合分 U. 析。 ........................................................................................................................ 41 U. 圖 3.18 軟體可以把資料輸出成統計圖表 .................................................................41 U. U. 圖 4.1 各組大鼠腎臟以石蠟包埋切片、H-E染色，在偏光顯微鏡下之照片。箭頭所 U. 指為沉積於腎臟皮質、集尿管和髓質之晶體。 EG：乙二醇。FC：川紅花。 comtrol：對照組。K-citrate：檸檬酸鉀。starch:澱粉。 ................................ 48 U. 圖 4.2 分析結晶沉積分數，數值以"平均數±標準差"來呈現。當p值小於 0.05 時表 U. U. 示當與對照組或安慰劑組比較起來，有顯著差異。 ........................................51. ix.

(8) 表目錄. 表 2.1 尿石症形成過程的機制 ........................................................................................ 7 表 2.2 尿液物理化學狀態對晶體/ 結石生長的影響…………………………………9 表 3.1 實驗流程 .............................................................................................................23 表 3.2 大鼠之一般血清生化檢測值（BioLASCO Co 公司提供）........................... 25 表 3.3 川紅花粉末的成份和重金屬含量分析（由柯達製藥股份有限公司所提供） ................................................................................................................................ 28 表 3.4 動物分組及餵食分配 .......................................................................................... 30 表 3.5 電腦輔助圖像評分系統 (ImageScoring) ........................................................... 36 表 4.1 體重、肝和腎臟重量分析 ................................................................................. 43 表 4.2 實驗前基本資料分析 ......................................................................................... 44 表 4.3 實驗前後尿液量及尿液生化數據分析 ............................................................. 45 表 4.4 實驗前後血液生化數據之分析 .........................................................................46 表 4.5 大鼠腎臟結石誘發比率 ...................................................................................50. x.

(9) 紅花萃取物對乙二醇誘導大鼠腎臟結石的保護作用單. 位. : 中國醫藥大學中醫學系博士班. 指導教授：陳汶吉研. 究. 教授. 生：林武周. 中文摘要. 川紅花 Flos carthami (FC) 也稱為 Carthamus tinctorius，是傳統的中藥植物，幾個世紀以來，其用於改善血液循環相關的各種症狀。本研究旨在研究川紅花(FC)對以乙二醇(EG)餵食大白鼠所形成的腎臟草酸鈣(CaOx)結晶的影響。實驗共選用 50 隻雄性 Sprague–Dawley 大鼠，分成以下 6 組：第一組 5 隻(n = 5)，作為正常對照組（normal control）以胃管灌食澱粉；第二組 5 隻(n = 5)，以 0.75%的乙二醇(ethylene glycol， EG)作為結石的誘導劑自由飲用(當成安慰劑 placebo)，為結石對照組；第三組 10 隻 (n = 10)，灌食檸檬酸鉀(potassium citrate) 並自由飲用乙二醇作為陽性對照組(positive controls)；第四組 10 隻(n = 10) 灌食 300 毫克/天川紅花 Flos carthami (FC) 和自由飲用乙二醇；第五組 10 隻(n = 10)，灌食 600 毫克/天川紅花 FC 和乙二醇自由飲用；第六組 10 隻(n = 10)，灌食 FC 1,200 毫克/天和自由飲用乙二醇。所有的實驗動物，在 1.

(10) 實驗開始和結束時，都分析了 24 小時尿液和血液標本。腎組織的病理組織學檢驗用偏光顯微鏡來檢查，結晶等級以半定量的評分方法評估；這些分數在川紅花灌食組（600 和 1,200 毫克/天）比安慰劑組低。本研究發現川紅花(FC)可以抑制乙二醇(EG) 餵食大鼠所造成草酸鈣(CaOx)結晶的沉積。因此，儘管川紅花(FC)有一定的副作用，如出血傾向，但其可能有效的預防結石。將來需要進一步的臨床試驗來評估其效益及可能之副作用。. 關鍵字：草酸鈣、乙二醇、傳統中藥、川紅花. 2.

(11) 第一章、前言 1B. 第一節、研究動機與目的 10B. 泌尿道結石(包含腎結石)是常見的泌尿系統疾病之一。根據中央健康保險局的統計資料顯示，從 80 年起台灣一年體外震波碎石術（Extracorporeal Shock Wave Lithotripsy, ESWL）的數量約有 1 萬人次以上，耗費大量的醫療資源。截至民國 89 年，體外震波碎石機在台灣目前超過 130 台以上，對照兩千三百萬全人口數來計算，我們台灣每百萬人口就會有一台體外碎石機。健保局統計民國 87 年上尿路結石之各項治療費用達十七億五千萬元，因此一旦罹患腎結石，不但會影響個人及家人的生活品質，更會造成醫療成本和社會資源的大量消耗 [1]。目前臨床治療結石以體外碎石法與手術為主，但在腎結石的預防上，除一般飲食建議外，則未見有重大突破[2]。在此種好發結石之環境下，我們希望能找出可預防或治療腎結石的方法。本研究的目的即在於探討紅花萃取物對於以乙二醇（Ethylene Glycol；EG）誘發大鼠腎結石的預防效果。. 第二節、研究的背景 1B. 尿路結石是泌尿系統中常見的疾病，在西元 4,800 年前的古埃及，就已發現人類最早的尿路結石化石。當結石部分發生在腎臟時即稱之為「腎結石」，其在台灣及全 1.

(12) 世界均有很高的發生率[3-5]。過去國外許多的研究均指出，生活方式、遺傳與氣候相關因素的改變，與其罹病率逐步增加和發病年齡降低有關[6、7]。形成尿路結石的原因頗為複雜，其危險因子一般可分成內在及外在兩大類，內在因子包含性別、年齡及遺傳，外在因子則包括有地理分佈、季節氣候、飲食、水份攝取量、排尿習慣及職業等。不論是內在或外在的因子，主要都和尿液中所含溶解態晶體之濃度變化有關，因此養成良好的飲水及飲食習慣應可防尿路結石發生及再復發[8]。腎結石的形成原因，目前至少有五種以上的闡釋假說，這些假說各有體外(in vitro)或者動物實驗(in vivo)的證據支持，但由於成因複雜，並非單一理論就可以解釋結石發生的所有原因。但總括來的說，都是存在著礦物質於泌尿道內產生不易被尿液溶解的結晶而續發結石的形成。目前預防尿路結石復發的長期治療對策不多，其中包括有服用檸檬酸鉀 (potassium-citrate) [9]等。近來，數種中藥藥物被用於治療腎結石，已發表的中草藥包括單方及複方者，如五苓散、豬苓湯 [10、11]、澤瀉[12]、毛決明萃取物[13]、真珠草(Phyllanthus niruri) [14]和其它漢方藥物(kampo medicines) [15–17]。這些研究大多數顯示對草酸鈣(CaOx)結晶的形成有某些程度的抑制作用。之前我們以果蠅的動物模型來快速篩選可能可用於預防結石的中藥藥物 [18、 19]。從資料庫選擇了八十種可能對腎臟有影響中藥萃取物。其中紅花(Flos carthami； FC）別名草紅、刺紅花、杜紅花、金紅花，為菊科植物紅花 Carthamus tinctorius 的管狀花，一年生草本高約 1 公尺。本實驗是先前研究中發現在果蠅馬氏管中草酸鈣. 2.

(13) (CaOx)結晶的沉積，其有最高的抑制效果。因此，我們選擇紅花萃取物來深入研究其對草酸鈣結晶形成的抑制作用。紅花含有紅花苷 (carthamin) 、紅花黃色素 (Safflor yellow) 、新紅花苷 (neocarthamine)及山奈酚配醣體(kaempferol 3-rhamnoglucoside)等；在中國，自數世紀以來，均曾經用於泌尿系統疾病的治療[20]。根據衛生署的官方網站和文獻記載，紅花其抗凝血作用，可用於活血通經、散瘀止痛，[21、22]。紅花還可用於改善疼痛，擴張冠狀動脈，降低血壓和抗炎的作用。中度和低劑量的紅花可以改善血流[22]。但是高劑量的紅花會增加出血傾向的危險性[23]。李.等人[24] 的報告指出紅花可降低血瘀症模型大鼠的血液粘度(viscosity)、血漿粘度和紅血球的聚集。但是尚未有動物或臨床研究能確認紅花對腎結石疾病的影響。本研究的目的是要探討紅花對乙二醇（EG）餵食大鼠形成草酸鈣的影響。因此，我們針對於紅花在雄性大鼠體內的影響，藉由分析其體重、尿液和血清中各種生化參數的變化，及使用偏光顯微鏡和電腦輔助圖像評分系統來評估大鼠腎臟中草酸鈣沉積的情形。. 3.

(14) 第二章、文獻回顧 2B. 第一節、尿路結石的流行病學 12B. 上尿路結石之盛行率與發生率，在西方已開發國家為 4-20%。二次世界大戰後, 日本與印度之上尿路結石盛行率與發生率逐漸增加；而在芬蘭、南美洲、非洲、澳洲原住民部落等區域，發生率則較低。臺灣地區上尿路結石之盛行率為 9.6% (男性 14.5%，女性 4.3%)。臺灣地區之結石帶在中部地區：南投縣 14.2%；臺中縣 13.1%；彰化縣 13% ; 雲林縣 12.9%。中部最高，花蓮與屏東縣最低。父親曾罹患結石者, 可增加 3.44 倍之危險性；母親曾罹患結石時,增加 4.79 倍之危險性；父母親曾罹患結石, 則增加 10.4 倍之危險性[25]。. 第二節、尿路結石的病因病理學 13B. 尿路結石為泌尿系統疾病中最常見的疾病之一。在美國，一般保守且客觀的估計，在每一萬人中有 16.4 人有尿路結石的困擾，終生盛行率約為 12%。依據李瀛輝等人於民國 82 年的調查發現，南台灣成人之尿路結石盛行率為 8.93%，其中以腎結石及輸尿管結石最多，且該研究發現尿路結石 10 年內之復發率高達 50%以上，也高於國外的 30%~40%[25]。 4.

(15) 尿路結石的病因：尿路結石形成，是多種因素綜合而成，其危險因子分可成內在及外在因子，前者意指性別、年齡及遺傳，後者則包括有地理分佈、氣候、季節、飲食、水份攝取、排尿習慣及職業等。國內外許多研究亦顯示，個人生活習慣與尿路結石罹病危險性有顯著之相關性，其中包含了飲用水水質、每日水份攝取量、飲食型態及家族遺傳等。其病因可歸納為三大類:代謝因素、局部因素及其他影響因素。全身代謝因素可見於高鈣尿、高草酸尿、高尿酸尿、低檸檬酸尿（hypocitraturia）、低鎂尿、胱胺酸尿 (cystinuria)、黃嘌呤尿(Xanthinuria)、2,8-二氫腺嘌呤尿(2,8-dihydroxyadeninuria)及藥物引起的結石。尿路局部因素可見於尿滯留、尿路感染及異物存於尿路中。其他影響因素可見於性別與年齡、營養(食物)因素、地理因素、種族因素、遺傳因素及職業因素。尿石症的病因較為複雜，以下所舉皆可能與之有關。 1. 泌尿系統本身的疾患:如感染、尿滯留。 2. 全身性新陳代謝紊亂:引發的高鈣尿、高草酸尿、高尿酸尿、低枸櫞酸尿、低鎂尿、胱氨酸尿、黃嘌呤尿。 3. 社會生活條件因素:如每天飲用水次數少或經常工作在高溫環境為重要的危險因素，而尿石症患者有較高比率的家庭開支較低及工作壓力大，如此反映出社會經濟狀況或與尿石症有關。 4. 天然環境:如居住於高溫地區氣候的炎熱引起的多汗致尿液高度濃縮，長時 5.

(16) 間日照促使維生素 D 的合成增加導致腸鈣吸收增加，水質和土壤中的無機塩對尿結石的形成有一定影響。 5. 種族因素:黑色人種罹患率較其他人種低這可能為深色皮膚可以降低皮膚對紫外線的吸收進而減少維他命 D 的合成。 6. 遺傳因素:原發性高草酸尿、胱氨酸尿等均為遺傳疾病，高鈣尿亦有家族史，探討家族性問題 (表 2.1) [26]。. 6.

(17) 目前普遍認為其形成是多種因素促成而非單一因素。表 2.1 尿石症形成過程的機制[26] 外界環境：自然環境、社會環境 ↓. ↓. 個體因素：種族、遺傳、疾病、藥物、飲食營養 ↓. ↓. ↓. ↓. ↓. 泌尿系統：腎鈣化、異物、感染、阻塞、腎損傷 ↓. ↓. ↓. 尿液因子抑制因子. ↓. ↓. 過飽和. 促進因子. Inhibitors. supersaturation. promotor. ↓. ↓. ↓. 結晶沉積：成核. 基質. nucleation. matrix. ↓ 結晶生長：. 結晶 crystallization. ↓. ↓. 聚集. 生長. Aggregation. growth. ↓. ↓ 結石. 7.

(18) 第一項、尿路結石的病理學 37B. 當尿液從腎臟的乳頭部分泌出來後，經由腎杯、腎盂、輸尿管流至膀胱，再經由尿道排出體外，這整個尿液流通的管道就稱為「尿路」。如果尿液在上述的任何一個部位，因為腎乳頭部的微小病變或在狹窄處造成尿液滯留，使得尿中結石因子濃度升高凝結，從細小的尿液沉渣變成臨床上常見的結石，於是就會造成「尿路結石」。尿石症對泌尿系統的損害，主要在泌尿系統，阻塞尿路、繼發感染和上皮病變。其程度依結石大小和部位而有所不同，結石、阻塞和感染互為因果，即結石→阻塞→ 感染→結石 ... →形成惡性循環[26]。一、腎臟病變: 60B. 腎乳頭鈣斑學說；核心母質學說 (matrix-nucleation theory)： Randall(1937-1940 年)認為腎盂腎結石形成之前，腎乳頭上定存在某些病變，致使尿內結晶體沉積。此學說找到腎鈣化為尿石症的早期病變，而尿結石形成的重要來源為腎內微結石。 Randall 把腎乳頭鈣斑分成兩種類型： Randall Ι 型：較常見，病變位於腎乳頭壁內，集合管基底膜鈣質沉著，鈣質沉著在小管間擴展，引起小管上皮受損、脫落、小管收縮狹窄，尿中鈣塩沉積，導致腎乳頭鈣斑脫落，成為結石核心，最終形成結石。 Randall Π 型：較少見，此症乃鈣鹽沉積在腎集合管和腎乳頭導管的末端部分，此型特徵為可見鹽包裹於腎乳頭管末端和腎乳頭尖端，並伴有尿中鹽類過飽和。 8.

(19) 二、過飽和結晶: 61B. 超飽和結晶學說(supersaturation)：分泌過多-結晶形成學說(hyperexcretion-crystallization theory)：結石基質學說(stone matrix theory)： 20 世紀 60 年代末到 70 年代中期，有學者將物理化學溶液理論用於研究尿結石的形成，並認為尿中結石鹽的過飽和、成核、聚集和生長等一系列物理化學過程為尿結石的成因。也就是說尿過飽和是尿結石形成的先決條件，亦即尿過飽和是尿結石形成的化學驅動力(表 2.2)。表 2.2 尿液物理化學狀態對晶體／結石生長的影響[26] 尿液物理化學狀態. 晶體／結石作用. 超飽和區. 自然成核晶體／結石生長. 平穩區. 原有晶體可生長、聚集不形成新的晶體. 不飽和區. 原有晶體將溶解. 三、抑制物缺乏: 結晶抑制物學說(inhibitors of crystallization theory) 62B. 正常人尿液中含有高的抑制物之濃度或活力，此物能影響尿結石塩在飽和的尿液中成核(nucleation)、聚集(aggregation)或生長(growth)等一系列結晶動力學過程。尿中抑制物分類方法很多種：1.分子量(大分子抑制物、小分子抑制物)；2.來 9.

(20) 源(內源性抑制物、外源性抑制物)；3.作用對象(磷酸鈣抑制物、草酸鈣抑制物)；4. 作用過程(成核抑制物、聚集抑制物、生長抑制物)。尿結石形成抑制物依大小可分成兩大類：小分子抑制物(如檸檬酸塩、焦磷酸塩、二磷酸塩、鎂)；大分子抑制物(如核糖核酸、酸性黏多糖、蛋白多糖、非聚合 TH 蛋白) [26]。. 第二項、乙二醇、草酸鈣、檸檬酸鉀之作用機制 38B. 一、乙二醇 63B. 乙二醇(HOCH2—CH2OH)，一種無色無臭、有甜味液體，能與水以任意比例混合。其對動物有毒性，人類的最低致死劑量為 786 毫克/公斤。目前已知乙二醇會先被氧化成乙醇酸，再被氧化成草酸。草酸及其副產物會影響中樞神經系統、心臟、腎臟。乙二醇可被 alcohol dehydrogenase 分解成四種產物， Glycoaldehyde、Glycolic acid、 result in acidosis 、Glyoxylic acid、Oxalic acid。其中草酸可形成草酸鈣(CaOx)結晶，沉積於遠端腎小管與集尿管,造成細胞壞死(Leth PM,等人 2005)。 Ethylene glycol(EG)常用劑量 0.5~2% EG (Lee 等人，1991)安全劑量 0.75% EG (Salido 等人， 2006)。. 二、草酸鈣 64B. 草酸（Oxalic acid，乙二酸，HOOC-COOH），是一種強有機酸，廣泛存在於菠菜和植物大黃中。草酸鈣(CaC2O4 或 Ca(COO)2，分子量 128.10)，白色針狀晶體。難 10.

(21) 溶於水和乙酸，可溶於強酸。由鈣鹽與草酸在水溶液中作用製得。草酸於水中形成含有草酸根離子（C2O42−或(COO)22−）。草酸根離子可沉澱鈣離子，生成不溶於水的草酸鈣。尿液中的草酸鈣結晶是人類腎結石的主要成分。. 三、檸檬酸鉀 65B. 檸檬酸鉀(K3C6H5O7)是一種白色，略帶吸濕性結晶性無臭粉末，有生理鹽水的味道。添加於食品中用來調節酸度。臨床上用於治療源自腎結石之尿酸或胱氨酸。腎結石是尿液中的礦物質結晶沈積在腎臟裡，其病因可分為原發性、其他疾病及與飲食習慣有關。已經知道泌尿結石有 32 種成分，最常見的為草酸鈣。當尿中檸檬酸濃度升高時，可與鈣離子結合，並可置換其他鈣鹽中的鈣，形成上穩定且易溶于水的復合物，從尿中排出。如此檸檬酸可阻止尿中鈣結合成溶解度低的草酸鈣和磷酸鈣。當尿中與鈣結合的檸檬酸濃度低或缺乏時，尿易出現草酸鈣和磷酸鈣沉澱而促進結石形成。. 第三項、結石與其他疾病的相關性 39B. 尿酸(痛風)、內分泌的疾病、發炎性腸道疾病 (Inflammatory Bowel disease Immobilization syndromes)、長期臥床、長期脫水、短腸症候群、飲食、腎臟結構異常、藥物、類肉瘤(Sarcoidosis)、維生素 D 中毒、副甲狀腺機能亢進，以及基因遺傳疾病等都跟結石形成有相關性。全身性的疾病如高血壓、糖尿病、肥胖、代謝症候群 (Metabolic syndrome)、家族性/種族因素、心臟血管系統疾病、睡姿、骨骼系統疾病 11.

(22) 等也是與結石有高的相關性，其中高血壓、糖尿病、肥胖與心臟血管系統疾病則是和結石互為相互影響的因子[27-33]。在一項健康專業照顧資料庫的研究發現高血壓的病人會增加80%的機會產生結石 Health Care Professionals Data Set，而結石的病人當中也有30%的機會產生高血壓，其可能機制有 – 腎元鈣離子的漏出，低檸檬酸，尿酸分泌增加，草酸分泌增加，飲食鈉過多，因此在臨床上會建議 — 減少鹽與蛋白質的攝取，以及多喝水等；造成高血壓也可能和阻塞性腎病變有關，由於水壓高導致Bellini氏管的倒流，因而傷及遠端腎曲小管也容易產生高血壓[34]。結石的病人容易患第二型糖尿病，大約增加30% to 40%的機會，而年輕的女性糖尿病患者則會增加60%的機會產生結石，二者互為因果；糖尿病會影響尿液的酸鹼值，增加尿液中尿酸的分泌，降低尿中酸鹼值且氨增加，由於胰島素的阻抗增加和血糖的升高會影響腎臟鈣的再吸收，使得尿中鈣的濃度增加而產生高尿鈣症 (hypercalciuria)，糖尿也會增加尿液草酸與鈉的排泄，有利於草酸鈣結石的形成。肥胖者與高身體質量指數(body mass index, BMI)或代謝症候群增加結石的機會是來自於增加胰島素阻抗、草酸、鈣與尿酸的分泌與降低尿液中的酸鹼值[31、33、35、36]。在血管疾病方面，腎鈣斑(Randall’s plaque)則發現腎乳頭上皮的鈣化是沿著血管產生的，它會降低此區的氧氣含量，增加滲透壓。腎臟血流也會受睡姿影響，一項研究發現猶太人在二次世界大戰期間於集中營的狹窄空間側睡，偏哪側低者，在同側產生結石的機會比對側高出76%[37]。在心肌梗塞的病人會增加16%的機會產生結石。結石病人也會增加冠狀動脈鈣化，使冠狀動脈增厚與減少彈性，增加了冠狀動脈 12.

(23) 疾病的機會[34、38]。泌尿道結石也常常合併其他全身性疾病，根據鐘旭東等人針對健保局資料庫的研究發現，在病人被診斷出結石的第一年，常常合併有憂鬱症的看病記錄，可見結石是會影響病人的心理疾病。由同一研究團隊也發現，年輕結石患者也比正常人有較高的勃起功能障礙[39]。此外，由陳等人的研究發現糖尿病與結石的關聯性，雖然糖尿病病人容易發生尿路感染導致感染結石，但是這個研究發現糖尿病直接增加結石風險，而且與尿路感染無關[40]。反過來看，鐘旭東等人在五年的追蹤研究發現，結石經診斷後，會比對照組增加 1.32 倍 (95% CI 1.26–1.39)的機會罹患糖尿病，顯示二者之間有相互影響的因素在 [41]。. 第三節、國內相關中西醫研究 14B. 第一項、中醫方面 40B. 目前在台灣僅有中國醫藥大學的團隊在研究中醫藥治療尿路結石的方式，以大白鼠做為研究動物模式，以 0.75%乙二醇做為誘石劑，經過四周的自由飲用後，解剖取出即可觀察鼠腎的結晶情形是否有抑制的現象，另外一個方式是利用結晶形成的三個步驟：核心形成(nucleation)、結晶成長(growth)與聚集(aggregation)，在試管內可以觀察測試方劑是否具備抑制作用，目前有五苓散和豬苓湯通過這些研究獲得成果，其中五苓散並完成初步的臨床試驗，證明其無不良副作用且有利尿作用[42-44]。該團 13.

(24) 隊並利用果蠅模式篩選八十種中藥，這些中藥是根據古方經典記載與結石治療相關的藥物，結果發現有四、五種中藥在動物模式中有抑制草酸鈣結晶形成的作用，川紅花即為其中一項。. 第二項、西醫方面 41B. 結石是泌尿科常見疾，因此在國內有很多相關的研究，而在基礎研究方面也有很多的報告出現，其中有基因多型性的研究，腎臟離子通道的研究，三聚氰氨的研究，新的動物模式開發以及蛋白體學等研究。李瀛輝教授在台灣的結石研究中陸續開發了很多的研究方法，他報告了台灣的結石盛行率約為9.6%( Urol Int 2002; 68:172-7.)，在大鼠的動物模式研究中，李氏以以 0.5% 的乙二醇來做為誘石劑，並將雄性鼠切除睪丸以觀察雄性素的影響，結果發現雄性素促進結石的形成，而雌性素顯示有抑制乙二醇導致的鼠腎草酸鈣結晶形成。李氏也是首先將尿液做二維電泳分析的，這跟後來很多蛋白質體學研究習習相關，蔡等人也因此分析了結石中蛋白質的成份[9、45、46]。黃鶴翔與陳淳等人研究了自由基與結石的關係，在大白鼠的乙二醇飲用水造成高草酸尿的四十二天實驗中，一氧化氮 (NO)的代謝產物 (nitrate and nitrite), cGMP, 及脂質過氧化酶檢驗發現，過多的過氧化物產生在這個動物模式中；研究也指出在高草酸大鼠模型中氧化壓力( oxidative stress) 與腎小管的受傷息息相關，而這種受傷會導致結石的產生，腎小管受傷後的指標因子如 alpha和 mu GST,增生細胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen, PCNA), OPN, 和THP蛋白在高草酸後會增加，補充維生素 E 則可以防止 OPN 和THP蛋白的減 14.

(25) 少，因此可以降低高酸草導致的腎小管受傷，進而抑制草酸鈣的結晶形成[47、48]。三聚氰胺與腎結石的關係也在近幾年造成轟動，王等人在2008的研究曾經探討了1129名可能曝露在為害中的台灣孩童，檢視了腎結石的臨床症狀以及風險因子，並分析了尿意中的鈣、肌酸酐(creatinine)，並同時做腎臟超音波檢查。聚氰胺含量達2.5 ppm。結果在高暴露的一組共有44名孩童，雖沒有嚴重的血尿、鈣尿、腹側疼痛或是急性的腎衰竭，但是超音波卻顯示有腎結石，而在高暴露族群中，患有腎結石的孩童年齡明顯年幼於沒有罹患腎結石孩童(2.33±1.12 vs. 4.83±2.64 years ； P=0.009)。而平均暴露於三聚氰胺的時間裡，高暴露組為7.19個月 (範圍從0.67~36個月)，低暴露組為17.4個月 (範圍從3~48個月)。而腹部的X光片卻沒能查出結石，僅有超音波能看出結石。根據推測，因為由三聚氰胺所造成的結石，與鈣類無關，可能是尿酸成分較多之故，X光無法偵測其存在。因此，三聚氰胺的汙染，和孩童的腎結石有相當大的關係[49]。另外在高雄醫學大學也有研究團隊在探討三聚氰胺與腎結石的關係，劉家駒，周以和等人，在檢驗鈣類結石病人的尿液也發現，鈣類結石病人的尿液中三聚氰胺的微量存在也比沒有結石的病人高，因此三聚氰胺雖然在鈣類結石中沒有高含量，但仍有比較高的風險導致鈣類結石的行程。本研究團隊也曾對此做過相關研究，陳等人可以分紅外線分光儀偵測到結石中接近1%的三聚氰胺存在[50]；同時在果蠅的動物模型中，三聚氰胺的結晶成分是多樣的，經由掃描式電子顯微式的檢查，結石的元素發現有鈣、磷酸、尿酸與三聚氰氨本身[51]，因此呼應了三聚氰胺容易導致各種結石的看法。. 15.

(26) 第四節、尿路結石的中醫學探討 15B. 第一項、中醫對尿石症的成因及其症狀的相關記載 42B. 中醫古代醫書在兩千年前就有尿石症的相關記載，如石淋、砂淋、血淋等。中藏經(華陀，漢代)中提到："砂淋者，腎氣虛…邪氣漸強，結聚而成砂。有如水煮盅，火大水少，盅漸成石。"；醫宗必讀之諸淋證治(李中梓，明代)中記載："石淋者，有如砂石，膀胱蓄熱而成，正如湯品久在火中，底結白鹼也。"。這些尿石成因的論述與西醫學之過飽和濃度致結晶沉積的觀點相似。中醫對尿石症的臨床症狀，也早有描述。金匱要略、消渴小便利淋病脈症併治篇(張仲景，漢代)中有記載："淋之為病，小便如粟，小腹弦急，痛引臍中。"；石室秘錄、石淋篇(陳士鋒，清代)中提到："人有小便中溺五色之石，未溺之前痛甚，已溺之後少少寬快…"。中西醫對尿石症臨床症狀的見解是相同的。. 第二項、中醫對尿石症的治療理論 43B. 中醫藥對尿石症的治療有：清熱、分利、下行、氣化、補腎和溶石等方法。八正散能清熱利濕；枳殼、木香、川揀子以行氣利濕；附子、茯苓、白术等濕腎利濕；化瘀尿石湯則活血化瘀清利止痛；能通淋化石者如金線草、雞內金等。有關中藥治療尿石症的藥理研究，大體可歸納為以下幾個方面:. 16.

(27) 一、排石作用單味活血化瘀藥川牛膝、川穹，通淋利尿藥金錢草、海金砂等，均可增加輸尿管的動作電位和蠕動頻率。二、利尿作用增加尿量有利於尿結石排出和預防結石形成。金錢草、川牛膝、瞿麥、白术、益母草等均有較強的利尿作用。三、干擾代謝作用加味八正散，能分別干擾大鼠體內羥基-L-脯氨酸 (HLP)和乙醇(EG)酸轉化為草酸(Oxalate)，其結果是降低了尿草酸鈣(CaOx)飽和度，達到防石的目的。四、. 抗菌消炎作用. 中藥赤芍、丹参、乳香、沒葯、三菱、莪术等能減輕輸尿管黏膜因結石刺激所致之炎症反應，減少組織充血、水腫和炎性增生，有利於尿路結石的防治[26]。. 第五節、川紅花的藥理學研究 16B. 川紅花性味辛而微溫，其為菊科草本植物紅花的花冠，主產於河南、湖北、四川、雲南、浙江等地，又稱草紅花、紅蘭花。有活血化瘀，通經止痛之功效。用於痛經、血滯經閉、產後瘀阻腹痛、跌打損傷、關節痺痛、瘡痈肿毒、以及斑疹透發不暢等。. 17.

(28) 第一項、化學成分 4B. 川紅花含有紅花黃色素、紅花苷、留體化合物、紅花油(包括棕櫚酸、硬酯酸、花生酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等)。. 第二項、藥理作用 45B. 一、對心血管系統作用 6B. 紅花之水萃取液，小劑量(0.01g/kg) 對麻醉犬有顯著增加冠狀動脈流量作用。血壓略有降低，心肌耗氧量及心律稍有增加但不明顯。乙醇萃取液則使麻醉犬血壓降低、心率減慢、對冠脈流量並無增加作用。紅花水煎醇萃取液對大鼠離體心壓灌流十分鐘，使冠脈流量增加 23%，對心肌收縮幅度及心律無明顯影響。紅花醇萃取液有顯著延長耐缺氧致死時間作用。對結紮犬冠脈左前降支所造成的急性心肌梗塞模型，滴注紅花液有縮小梗塞範圍、減輕缺血程度、降低耗氧量、保護邊緣區域心肌等作用。. 二、對血液流變性的影響 67B. 紅花水煎醇萃取液有降低兔全血黏度作用。試管內 20%紅花液可使犬全血凝固時間與血漿(缺血小板) 復鈣時間明顯延長，較強抗凝作用。紅花對凝血過程內在凝血酶原及凝血酶──纖維蛋白反應具有顯著抑制作用。紅花水萃取液在試管內有抑制二磷酸線苷及膠原引起的血小板聚集作用。體內 18.

(29) 給要對大鼠體外血栓形成能降低血栓長度及重量。黃色素也有類似作用，能抑制大鼠體外血栓形成。. 三、對平滑肌作用 68B. 紅花煎劑對多種動物在體與離體子宮具有興奮作用，能使子宮發生緊張性或節律性收縮，大劑量增強子宮自動收縮率，甚至達到痙攣程度，對已孕子宮作用更為明顯。但作用時間不持久。紅花煎劑給豚鼠支氣管平滑灌流，可使其收縮。. 四、對神經系統作用 69B. 紅花對腦缺血缺氧狀態下大鼠的呼吸中樞有一定的興奮作用。對急性缺血缺氧性動物模型能提高存活率，缺血性腦損害的病理體征與形態變化對照組輕，恢復亦快。腦組織化學與酶學觀察顯示三磷酸線苷、琥珀酸脫氧酶的活性較強，核醣核酸的含量接近正常，異常的腦電、肌電迅速恢復等。紅花黃色素與催眠劑量巴比妥類與飛巴比妥類合用能使清醒動物進入深度睡眠，且有較強的陣痛作用 (扭體法與熱板法)。. 五、其他 70B. 紅花黃色素及其分離物黃II、III對高分子右旋糖酐造成家兔微循環障礙有改善作用。紅花煎劑 40mg/kg 對摘除卵巢的雌小鼠，能增加子宮重量，可能具有雄激素樣作用。對摘除睪丸的雄性小鼠能使精囊重量增加，可能也有雄性激素樣作用。紅花 19.

(30) 黃色素對炎症早期的毛細血管通透性增加及炎症增殖過程的肉芽組織增生均有抑制作用。口服紅花油1g/kg/day ，對高血酯症家兔有降低總膽固傳、總脂、甘油三酯等作用。紅花浸膏幽門彎曲菌有抑菌作用，抑菌圈大小與劑量增加有關[52-54]。. 第六節、尿路結石的動物模式 17B. 目前結石的基礎研究中，主要以大白鼠為實驗動物，用乙二醇(Ethylene glycol, EG) 為誘石劑，根據文獻報告，目前研究結石形成的機制有幾個研究方向：細胞受傷與自由基之傷害，蛋白質調節因子，蛋白質體學、遺傳體學等。然而，以大白鼠實驗是有其限制的，譬如草酸鈣只沉積於腎皮質，結晶的形成非由自然或體內產生乃是由於乙二醇中毒所致，而轉殖基因操作則不只因費用昂貴、困難，而且必需經動物倫理委員會通過等等限制。新的動物模式，如以短腸症候群的大白鼠、L-proline 或豬做為誘導結石等也有了初步成果[55-56]。現在也有九篇以基因 knockout 的小白鼠實驗來觀察結石的形成的動物模式，其標的與限制如下：特發性高鈣尿鼠: 尿鈣會增加十倍但並不會形成結石。Ob/ob 老鼠模式:由於缺乏 leptin 而產生肥胖、糖尿病及維生素 D 過多，產生高鈣尿症但不產生結石。Dent’s 症：產生維生素 D 過多，高鈣尿症不產生結石。Klotho 基因 knockout 小白鼠(三種)：高血鈣症與高鈣尿症，僅見鈣沉積於腎臟。NaPi IIa (Na-P cotransporter) 的基因 knockout 小白鼠：高血鈣症、高鈣尿症與維生素 D 過多，僅見鈣沉積於腎臟。 Cav1 的基因 knockout 小白鼠：高鈣尿症產生尿結石但無腎的鈣化。Aldose reductase 20.

(31) 的基因 knockout 小白鼠：高鈣尿症，但無腎的鈣化。NH ERF-1 的基因 knockout 小白鼠：高鈣尿症與維生素 D 過多，只有腎乳頭鈣化。另外有以 MCP-1 null knockout 的小白鼠模式來研究結石，這個模式會造成草酸分泌過多，檸檬酸分泌減少，這研究也發現高草酸尿單獨並不能造成草酸鈣結石[57-59]。Evan 等人從結石手術病人的腎乳頭腎鈣斑中發現，草酸鈣結石病人可以在亨利氏環見到磷酸鈣的沉積，而無腎小管細胞傷害之現象，但是結石成份卻不一樣；反而在短腸症候群與磷酸鈣結石病人的腎臟見到腎小管細胞傷害的現象，使得人類腎臟結石腎臟所見與動物實驗模式並不完全配合，因此有必要建立新的動物模型來釐清這些矛盾現象[60-62]。新的動物實驗模型: 由於生物礦化是普遍存在的，所以理論上任何動物模型均可以採用。因為果蠅在實驗動物模式上的優勢，可以利用果蠅馬氏管做為生物體結石研究。果蠅的馬氏管類似於人類的肝臟和腎臟，馬氏管(腎小管)已發展出液體傳送上皮的基因模型，其訊號因子與人類基因有很高的相似度。因此利用果蠅之結石生物模型將可縮短實驗所需時間，增加臨床藥物篩選之時效性，以儘速將有效藥物應用於生物醫學之治療上並可快速並大量尋找相關之致病基因，以做為有效預防醫學之基礎。目前國內也已完成兩篇論文發表，其他研究成果也陸續發表中。. 21.

(32) 第三章、材料與方法 3B. 第一節、實驗流程 18B. 實驗動物鼠先於本校動物中心豢養 3 天以適應環境與飲食。實驗開始動物分組後先分別秤體重、抽血液、收集尿液。本研究將實驗大鼠分為六組，對照組給予正常飲水，實驗組餵食 0.75%乙二醇作為誘石劑。安慰劑用澱粉，陽性對照用檸檬酸-鉀，試驗中藥川紅花分成 300 mg、600 mg、1200 mg 三組。. 四週後在乙醚麻醉之下犧牲動物，分別秤體重、抽血液、收集尿液、摘取腎臟、秤取左右腎臟重量。右腎於中性福馬林中固定，進行組織切片與 HE 染色，觀察組織病理形態。. 以偏光顯微鏡觀察結晶情形，評估結石嚴重度。彙整體重等基本數據、血液與尿液生化數據、結石分數數據等，進行統計分析 (表 3.1 實驗流程) 。. 22.

(33) 表 3.1 實驗流程. 23.

(34) 第二節、實驗材料 19B. 第一項、實驗動物 46B. 本研究採用 Sprague-Dawley （SD）品系雄性大鼠，六週年齡，每隻約重量 250~300 公克(圖 3.1) (表 3.2)。購自樂斯科(BioLASCO)公司（台灣、台北）。全程飼養於中國醫藥大學校內動物飼養中心（圖 3.2），其室溫維持 22±2℃，濕度為 55±5 ％，每日光照及黑暗各 12 小時(日夜週期)，同時提供其標準大鼠專用飼料。動物實驗過程與步驟均遵循中國醫藥大學動物飼養中心委員會之規定。. 圖 3.1 SD 大鼠（BioLASCO Co 公司提供）. 24.

(35) 圖 3.2 中國醫藥大學校內動物飼養中心，室溫維持 22±2℃，濕度為 55±5％. 表 3.2 大鼠之一般血清生化檢測值（BioLASCO Co 公司提供）血清生化數值. 分析項目. 檢驗結果. 參考值. ALB. 3.7. 2.5-4.8 g/dL. ALKP ALT（GPT）. 120. 62-209 U/L. 56. 28-132 U/L. AST（GOT）. 79. 59-247 U/L. BUN. 22. 18-29 mg/dL. Ca. 6.5. 5.9-9.4 mg/dL. CHOL. 48. 36-96 mg/dL. Cl. 105. 92-120 mmol/L. CREA. 0.46. 0.2-0.8 mg/dL. GLOB. 0.11. 0-0.6 g/dL. GLU. 124. 90-192 mg/dL. K. 5.9. 4.6-8 mmol/L. Na. 135. 124-174 mmol/L. PHOS. 7.3. 6.1- 10.1mg/dL. TBIL. 0.3. 0.1-0.9 mg/dL. TP. 4.1. 3.6-6.6 g/dL. 25.

(36) 第二項、川紅花粉末藥物組成 47B. 使用的川紅花（FC）粉末係由柯達製藥股份有限公司（桃園，臺灣）所提供。柯達製藥公司以薄層色層分析(Thin layer chromatography)方式參照標準品所得結果如（圖 3.3）所示。顯示試驗用藥川紅花(圖 3.3 之 2)之含量與標準品(圖 3.3 之 1)者一樣。. 圖 3.3 川紅花（FC）(2)參照標準品(1)之薄層色層分析（由柯達製藥股份有限公司所提供）. 26.

(37) 第三項、川紅花粉末的指紋圖譜分析 48B. 川紅花粉末的"指紋圖譜分析"係委託財團法人醫藥工業技術發展中心（台灣） (Medical and Pharmaceutical Industry Technology and Development Center , Taiwan)來進行。 "高效液相層析分析"中所使用管柱為 reverse-phase C18 column ( Cosmosil 5C18-MS-II water 4.69 250 mm，5 ml，NACALAI），並使用了線性梯度（linear gradient）的 0.1% H3PO4 和流量為 1 毫升/分的乙腈/氰甲烷（acetonitrile）。川紅花的色譜分析是用 UV 203 nm 來監測。經高效液相層析分析結果顯示，川紅花粉末之指紋圖譜分析結果如（圖 3.4）所示，七個吸收峰分別為：9.469, 34.527, 39.254, 69.521, 93.202, 96.738 和 99.265min。. 圖 3.4 川紅花粉末的指紋圖譜（由柯達製藥股份有限公司所提供） 27.

(38) 第四項、川紅花粉末的成份分析 49B. 川紅花粉末的重金屬成份分析，結果顯示鎘≦0.5 ppm，汞≦0.1 ppm，砷≦2.0 ppm 和鉛≦10.0 ppm，均在容許範圍之內（表 3.3）。. 表 3.3 川紅花粉末的成份和重金屬含量分析（由柯達製藥股份有限公司所提供）. 28.

(39) 第三節、實驗方法 20B. 第一項、動物分組 50B. 總共五十隻大鼠，隨機分為六個小組，分別利用耳朵標示及背部標示編號。紀錄實驗開始第一天每隻大鼠的體重，及實驗四週後終止飼養時大鼠體重。第一組為正常控制組(Group 1, normal control group) 5 隻，給正常飲水；第二組為陰性對照組(安慰劑組）(Group 2, negative control group, placebo group) 5 隻，給予 0.75%乙二醇水以誘發腎結石產生，胃灌食澱粉(安慰劑)；第三組為陽性對照組(Group 3, positive control group) 10 隻，給予 0.75%乙二醇水，胃灌食檸檬酸-鉀（500 毫克/天）；第四、五、六組為給予不同川紅花劑量的實驗組(experimental group) 各 10 隻。在這 4 週實驗期間，大鼠實驗組（2、3、4、5 和 6 組）所餵養的飲用水含有 0.75% 的乙二醇（EG）當為結石誘導因子。實驗組與對照組除飲水條件不同之外，其餘環境與飼料條件皆相同，飼養於相同條件之環境空間，給予同ㄧ批飼料餵食，並於每日上午同ㄧ時間添加飼養飼料及更換飲水。根據先前的研究 [10、11]，草酸鈣（CaOx）結晶會在餵食乙二醇 4 週後才會出現。4 週後乙二醇餵食組中結晶形成的機率是 80%左右（表 3.4）。. 29.

(40) 表 3.4 動物分組及餵食分配分組. 隻數. 食物. 飲水. 胃灌食川紅花. Group 1. 正常組. 5. 正常. d.d. water. 無. Group 2. 陰性對照組 5. 正常. EG water. 澱粉 (安慰劑組）. Group 3. 陽性對照組 10. 正常. EG water. 檸檬酸-鉀. Group 4. 低劑量組. 10. 正常. EG water. 川紅花(300mg)/天. Group 5. 中劑量組. 10. 正常. EG water. Group 6. 高劑量組. 10. 正常. EG water. 川紅花(600mg) /天川紅花(1200mg) /天. 第二項、藥物餵食 51B. 第 1 組大鼠（n=5）是正常控制組，只給予去離子的蒸餾水和正常飼料。第 2 組大鼠 (n=5)每天給予一次胃灌食 60 毫克澱粉當安慰劑（placebo）和 0.75%的乙二醇（EG）（由 99.5 % Ethylene glycol 配製而成）當作結石的誘導劑。第 3 組的大鼠(n=10)則是給予含 0.75%乙二醇添加的飲用水和每日胃灌食檸檬酸-鉀（500 毫克/天）（圖 3.5）。. 30.

(41) 圖 3.5 胃管灌食. 川紅花之劑量的決定是根據我們先前的研究結果，再將其轉換為適合人類使用的劑量。在人方面，川紅花的科學中藥劑量是一天 3~10 公克。參考體表面積，把人類的劑量轉換為與人類的等同的動物劑量[62]，依此，本試驗第四組為低劑量實驗組 (Group 4, low dose experimental group)選用川紅花 300 毫克/天。我們更進一步用 600 和 1,200 毫克/天的組別來檢測高劑量的影響(第五、六組)。. 第四組大鼠(n=10)給予 0.75%乙二醇添加的飲用水和胃灌食川紅花每日 300 毫克。第五組大鼠 (n=10)則給予 0.75%乙二醇添加的飲用水和每日胃灌食川紅花 600 毫克 (Group 5, medium dose experimental group)。第六組大鼠 (n=10)也給予 0.75%乙二醇添加的飲用水和胃灌食川紅花每日 1,200 毫克 (Group 6, high dose experimental group)。各種給予灌食之實驗藥物，都統一調成約 1~2 毫升的量。實驗前後均紀錄大鼠體重變化。 31.

(42) 第三項、尿液之收集與檢驗 52B. 收集 24 小時尿液樣本共二次，第一次在第一週實驗開始前，第二次在試驗結束後（第四週）。於 24 小時尿檢體收集過程中，我們將大鼠分別放置在生理代謝籠子裡（圖 3.6），持續 24 小時，收集並記錄其總量，尿液檢體收檢後需置於 4℃運送容器中，送交檢驗其成分及分析其數據。這段期間均提供大鼠足夠的食物和飲水。尿液檢測項目為尿液鈣(urinary calcium)、尿液游離鈣(urinary free calcium)、尿液磷(urinary phosphorus)及尿液酸鹼值(urinary pH value)。. 圖 3.6 尿液收集生理代謝籠. 32.

(43) 第四項、血液之採集與檢驗 53B. 採集時間在第一週實驗開始前與第四週結束後，實驗開始前從尾巴抽取血液樣本約 2 毫升，實驗結束時的血液樣本以乙醚麻醉方式由心臟採集，採取血液檢體約 3 毫升，置於含有肝素(Heparin)之抗凝血生化試管中。檢體收檢後需置於 4℃運送容器中送交作血清生化分析。所使用儀器設備為日立 -7150 （ Hitachi-7150 ）和羅氏 -Omnic 分析儀（Roche-Omnic analyzer）來測量尿和血清中的鈣(serum calcium)、游離鈣(serum free calcium)、磷(serum phosphorus)和 pH 值(serum pH value)和已知的結石危險因數，如鈉、鉀、鎂和檸檬酸鹽。測量 Prothombin 時間(PT)和 Activated partial thromboplastin time (APTT)。在第二次實驗結束時，除了原來的檢測項目外，再增加四項：冬氨酸轉氨酶（Aspartate transaminase, AST）、丙氨酸轉氨酶（Alanine transaminase, ALT）、尿酸(Uric acid)和尿液微白蛋白(Microalbumin)。. 第五項、動物腎臟之取樣與處理 54B. 4 週後在乙醚麻醉後犧牲所有的實驗大鼠，收集每隻大鼠的兩側腎臟，右側腎用 10%中性福馬林固定、石蠟(paraffin)包埋切片，蘇木素-伊紅染色法(Hematoxylin and Eosin Y solution)染色、光學光顯微鏡來檢視其組織病理變化，有無發炎、紅血球浸潤或組織擴張損傷等情況。 33.

(44) 然後我們使用偏光學光顯微鏡來觀察腎臟組織切片中的結晶沉澱嚴重程度、照相，再把影像併入 ImageScoring 軟體中判讀、計分。（圖 3.7、圖 3.8）將已做組織染色之鼠腎組織切片(segital section)以四條虛擬線平均分配為八個區域，如圖 3.7 所示，利用偏光顯微鏡拍攝 100X 影像，每一區域隨機挑選一個視野拍照，並存成數位圖片(JPEG 格式，4080 x 3072 pixels) 如圖 3.8 所示。全部大鼠腎臟切片共拍攝成 400 張圖片，儲存並燒錄成 DVD 片，提供往後之判讀和計分。. 圖 3.7 腎臟組織切片-平分成 8 區. 圖 3.8 腎臟組織切片-100X 光學偏光顯微鏡. 34.

(45) 第六項、腎結晶嚴重度與組織病理評估 5B. 以光學偏光顯微鏡(polarized light microscope)測量結晶沉積的嚴重程度。在 100 倍鏡下檢視，若發現有雙折射光亮點(bi-refringent spotlight)特徵之結晶，即視為草酸鈣（CaOx）結晶。評估嚴重程度之分級，採用"主觀性半定量計分方式"，分為四個級別，從 0 到 3 的分數：其中 0 分代表無(none)結晶；1 分代表很少(few) 結晶；2 分代表一些(several) 結晶；3 分代有表很多結晶沉積(many crystal deposits) （圖 3.9）。依此來評估結晶沉積程度 [13-15]。. 圖 3.9 腎臟組織切片-100X 偏光顯微鏡，評分分數 0 為 0 分、1 為 1 分、2 為 2 分、3 為 3 分。. 35.

(46) 此評分系統是採用我們的電腦輔助圖像評分系統 ImageScoring [10、11]。首先把數位照相機裝載到 100 倍光學偏光顯微鏡上，然後隨機照相截取八區之一內的數位圖像，存於資料庫中。此電腦輔助系統將儲存於資料庫內的影像，採用隨機、雙盲、匿名顯示圖片的方式呈現給判讀者，六位獨立工作的同仁用此電腦輔助系統個別給予判讀評分。最後收集匯整所有的個案分數，進行統計分析各組差異(表 3.5)。. 結石誘發比率(成石率) = 該組內罹患結石之大鼠數目 ÷ 該組大鼠總數目。表 3.5 電腦輔助圖像評分系統 (ImageScoring) 1. used a polarized light microscope to measure the severity of crystal deposition 2. spotlight the bi-refringent crystals of CaOx with a magnification factor of 100 to evaluate the score. 3. A subjective, semi-quantitative scoring system was used with four grades ranging from 0 to 3+ (where 0=none, 1+=few, 2+= several and 3+=many crystal deposits) to evaluate the degree of crystal deposition as previously described. 100 倍 (0=none,. 1+=few=1-2 顆,. 2+= several= 3~10 顆 and. 3+=many crystal deposits= ≧11 顆) 6 個人判讀,取其平均. 4. computer-assisted image-scoring system :. ImageScoring. 5. The program randomly selected and displayed an image file to rank. 6. Then all of the scores were gathered and integrated for statistical analysis.. 36.

(47) 第七項、圖片瀏覽評分輔助程式(ImageScoring) 56B. 本實驗使用之 ImageScoring 程式，是由本研究室蔡宙晃醫師所研發之圖片瀏覽軟體，程式開發採用 Borland Delphi® version 6.0 (Borland software Co., California)程式語言來設計；資料格式採用 dBASEIII®；圖檔格式採用 jpeg 格式(4080 x 3072 pixels) [10、11]。顯示圖片以隨機、雙盲、匿名方式呈現，由六位獨立工作的判讀者評分。操作之介面和方法，如圖 3.10 ~3.18 所示。判讀者完成所有圖片之評分後，依判讀者之姓名、評分時間，將結果存成個人評分檔案，以免混淆。最後匯集所有評分檔，進行統計分析，如圖 17 -18 所示。. 圖 3.10 圖片瀏覽評分輔助程式(ImageScoring)，登入畫面。 37.

(48) 圖 3.11 四級評分參考標準之畫面。. 圖 3.12 按上方"評分"進入評分畫面。系統以隨機、雙盲、匿名的方式顯示圖片，判讀者依此圖片在右下角"評分"欄內選取(此張選 0 分)，再按壓下方"給分"欄給分，系統自動跳下張。 38.

(49) 圖 3.13 在評分畫面，判讀者給予此圖片 1 分。. 圖 3.14 在評分畫面，判讀者給予此圖片 2 分。 39.

(50) 圖 3.15 在評分畫面，判讀者給予此圖片 3 分。. 圖 3.16 在評分畫面，判讀者完成所有圖片之分數給予後，系統出現"判讀完畢"對話方塊，此時可按"OK"離開"評分"畫面。 40.

(51) 圖 3.17 選擇上方進入"我的成績單"畫面，將個人之"評分檔"拷貝，送回整合分析。. 圖 3.18 軟體可以把資料輸出成統計圖表. 41.

(52) 第四節、統計方法 21B. 大鼠的體重、鼠腎重量、尿液和血清等生化檢驗數據以平均值±標準差（mean±SD）來呈現，檢定是以單側 ANOVA（one-way ANOVA）(analysis of variance) 來分析。腎結晶沉積的嚴重程度，是使用前面所描述之半定量評分法來表示。結晶沉積分數的統計分析，各組差異是以無母數 K-W 檢定(non-parametric Kruskal–Wallis test) 來檢測組間之比較；配對組別之比較(實驗組與安慰劑組)，是以 Wilcoxon rank sum test (Mann–Whitney U)來分析。當 P 值小於 0.05 代表在統計上有顯著性意義的存在。統計分析是使用統計套裝軟體 SPSS@ for Windows，版本 11.5（The Statistical Package for the Social Science） (SPSS@ for Windows, release 11.5) 。. 42.

(53) 第四章、結果 4B. 第一節、實驗前後大鼠體重變化和實驗後肝腎重量分析 2B. 大鼠體重(body weight)，在試驗之前，各組之間並無差異（表 4.1）。當 4 週的實驗結束時，各組體重均有增加(body weight increase)。但在這六組之間的體重，並無觀察到有特別差異（表 4.1）。在 4 週的實驗結束時，這六組之間的肝(liver)、左右腎臟(kidney)之重量，也無差異(表 4.1)。. 表 4.1 體重、肝和腎臟重量分析. body weight (g) (before) body weight (g) (4W) body weight increase (g)(2W) body weight increase (g)(4W) right kidney weight (g) (4W) left kidney weight (g) (4W) liver weight (g) (4W). Group 1 Control. Group 2 EG+starch;Placebo Negative control. Group 3 EG+K-citrate Positive control. Group 4 EG+FC (300mg/day). Group 5 EG+FC (600mg/day). Group 6 EG+FC (1200mg/day). 304.7±12.4 439.6±27.5* 89.5±9.3 135.0±16.7 2.0±0.2 1.9±0.3 16.5±1.3. 313.2±19.0 441.0±34.0* 78.3±13.3 127.9±16.9 1.9±0.2 1.9±0.4 15.7±1.4. 302.6±12.3 405.8±20.3* 60.18±8.8 103.2±16.5 1.8±0.4 1.8±0.2 13.9±0.9. 303.1±17.4 417.2±47.4* 68.7±22.3 114.8±33.0 1.8±0.3 1.9±0.3 15.2±2.8. 305.4±16.5 423.0±40.8* 64.4±16.2 117.5±26.0 1.8±0.3 1.7±0.2 15.1±2.2. 302.9±19.6 409.5±46.3* 75.4±18.5 106.5±37.3 1.7±0.2 1.7±0.1 14.8±2.9. EG：乙二醇。FC：川紅花。K-citrate：檸檬酸鉀。starch:澱粉。 g:公克。mg：毫克。W：週。數據以平均值±標準差(mean±SD)來表示 * P 值<0.05 表示有統計學上顯著義意. 43.

(54) 第二節、實驗前基本資料分析 23B. 基本生化數據在這六個組別裡並無特別差異。體重、尿量、pH 值、微量白蛋白 (micro-albumin)、肌酐(creatinine)、尿酸(uric acid)、Na+、K+、Cl-、Mg2+和 Ca2+等均無顯著差異（表 4.2）。. 表 4.2 實驗前基本資料分析 Group 1 Control. Group 2 EG+starch;Placebo Negative control. Group 3 EG+K-citrate Positive control. Group 4 EG+FC (300mg/day). Group 5 EG+FC (600mg/day). Group 6 EG+FC (1200mg/day). 21.2±7.9 7.0±0.1 1.0±1.6 39.6±13.7 10.6±3.3 98.0±17.2. 25.4±4.9 7.1±0.3 3.1±4.2 43.0±11.2 9.2±2.4 85.7±17.8. 25.5±11.5 7.0±0.1 3.4±3.6 51.1±18.8 8.2±2.7 111.9±31.6. 22.8±6.4 7.0±0.2 1.9±2.4 51.9±17.2 6.9±2.3 112.3±34.0. 20.4±6.0 7.1±0.2 3.5±2.4 53.6±17.2 11.2±2.3 91.9±36.0. 19.2±3.0 7.2±0.3 2.2±2.4 58.5±13.6 13.5±3.5 98.6±37.9. 2+. 20.3±10.4. 30.5±15.4. 34.0±18.7. 29.3±20.4. 25.3±20.4. 32.1±10.9. 2+. 0.51±0.09. 0.34±0.04. 0.53±0.15. 0.54±0.06. 0.40±0.15. 0.53±0.13. 7.5±0.1 0.63±0.11 8.9±1.4 121.9±2.5. 7.4±2.2 0.58±0.11 8.0±1.6 123.1±2.2. 7.5±0.1 0.63±0.4 1 8.1±1.5 111.6±13.1. 7.5±0.1 0.52±0.09 8.1±1.5 119.0±4.9. 7.5±0.1 0.52±0.09 7.9±1.7 113.3±9.1. Urine ( baseline) 24 hrs volume (ml) (before) pH Micro-albumin (mg/L) Creatinine (mg/dl) Uric acid (mg/dl) Na+ (mmol/L) Mg (mEq/L). Ca (mmol/L) Serum ( baseline, before) pH 7.6±0.2 Creatinine (mg/dl) 0.63±0.10 Uric acid (mg/dl) 9.7±0.3 120.4±3.9 Na+ (mmol/L) +. K (mmol/L). 17.6±1.6. 16.9±4.1. 16.9±1.8. 16.7±2.2. 15.2±2.5. 15.5±2.4. Cl - (mmol/L). 102.6±2.6. 103.5±5.2. 100.3±1.2. 93.7±12.0. 97.5±5.5. 94.6±7.2. Mg2+ (mEq/L). 3.7±0.2. 3.1±1.0. 3.2±0.3. 3.2±1.0. 3.1±0.45. 3.2±0.7. Ca2+ (mmol/L). 0.82±0.09. 0.78±0.11. 0.87±0.06. 0.69±0.17. 0.79±0.72. 0.74±0.14. EG：乙二醇；FC：川紅花數據以平均值±標準差(mean±SD)來表示 * P 值<0.05 表示有統計學上顯著義意. 44.

(55) 第三節、實驗前後尿液量及尿液生化數據分析 24B. 在試驗之前，各組之間尿液量並無差異（表 4.3）。在實驗末期時，第二組的尿量明顯增加。相反的，第六組投與紅花（FC）1,200 mg/day 之後，尿量明顯較少(表 4.3)。六組之間的所有其他尿液生化資料則類似(表 4.3)。. 表 4.3 實驗前後尿液量及尿液生化數據分析 Group 1 Control. Group 2 EG+starch;Placebo Negative control. Group 3 EG+K-citrate Positive control. Group 4 EG+FC (300mg/day). Group 5 EG+FC (600mg/day). Group 6 EG+FC (1200mg/day). + Na (mmol/L). 21.2±7.9 7.0±0.1 1.0±1.6 39.6±13.7 10.6±3.3 98.0±17.2. 25.4±4.9 7.1±0.3 3.1±4.2 43.0±11.2 9.2±2.4 85.7±17.8. 25.5±11.5 7.0±0.1 3.4±3.6 51.1±18.8 8.2±2.7 111.9±31.6. 22.8±6.4 7.0±0.2 1.9±2.4 51.9±17.2 6.9±2.3 112.3±34.0. 20.4±6.0 7.1±0.2 3.5±2.4 53.6±17.2 11.2±2.3 91.9±36.0. 19.2±3.0 7.2±0.3 2.2±2.4 58.5±13.6 13.5±3.5 98.6±37.9. Mg2+ (mEq/L). 20.3±10.4. 30.5±15.4. 34.0±18.7. 29.3±20.4. 25.3±20.4. 32.1±10.9. Ca2+ (mmol/L) Urine (4W) 24 hrs volume (ml) (4W) pH Micro-albumin (mg/L) Creatinine (mg/dl) Uric acid (mg/dl). 0.51±0.09. 0.34±0.04. 0.53±0.15. 0.54±0.06. 0.40±0.15. 0.53±0.13. Na+ (mmol/L). 26.0±6.0 7.2±0.3 0.5±0.6 55.3±16.6 7.2±0.6 108.9±18.7. 43.2±15.9* 7.0±0.2 2.1±4.2 41.9±18.6 6.8±3.1 78.6±27.7. 30.5±13.6 7.1±0.4 1.2±3.2 50.3±20.2 7.3±3.1 72.9±16.0. 37.0±11.8 7.0±0.5 1.1±1.9 47.2±19.9 6.4±2.8 90.9±27.4. 27.8±8.3 7.0±0.5 1.3±3.8 64.0±23.3 8.5±2.8 109.7±28.5. 24.8±8.3* 7.1±0.4 1.4±2.6 58.9±26.8 7.7±3.4 93.1±41.3. Mg2+ (mEq/L). 21.6±15.7. 16.1±5.4. 14.1±11.8. 25.3±7.2. 17.6±7.3. 12.1±9.6. Ca2+ (mmol/L) Citric acid (g/l). 0.49±0.24 1.88±0.53. 0.36±0.15 0.83±0.37. 0.43±0.12 2.48±1.05. 0.39±0.26 1.63±1.19. 0.63±0.15 1.41±0.48. 0.53±0.25 1.03±0.69. Urine ( baseline) 24 hrs volume (ml) (before) pH Micro-albumin (mg/L) Creatinine (mg/dl) Uric acid (mg/dl). EG：乙二醇；FC：川紅花數據以平均值±標準差(mean±SD)來表示 * P 值<0.05 表示有統計學上顯著義意. 45.

(56) 第四節、實驗前後血液生化數據之分析 25B. 第三組(positive control group)血清肌酐(creatinine) 可見降低。在乙二醇(EG)餵食組其血清 ALT 和 AST 則明顯上升(與 Group 1,normal control 組比)。紅花的投藥降低冬氨酸轉氨酶(Aspartate transaminase, AST)和丙氨酸轉氨酶(Alanine transaminase, ALT)，間接指出其可能具有保肝作用的潛力(與 Group 2, placebo 組比)。六組之間的所有其他血清生化資料則類似(表 4.4)。Prothombin 時間(PT)和 Activated partial thromboplastin time (APTT)在川紅花使用組有稍為增加之趨勢，但無統計學上之意義。. 表 4.4 實驗前後血液生化數據之分析 Group 1 Control Serum ( baseline, before) pH 7.6±0.2 Creatinine (mg/dl) 0.63±0.10 Uric acid (mg/dl) 9.7±0.3 120.4±3.9 Na+ (mmol/L). Group 2 EG+starch;Placebo Negative control. Group 3 EG+K-citrate Positive control. Group 4 EG+FC (300mg/day). Group 5 EG+FC (600mg/day). Group 6 EG+FC (1200mg/day). 7.5±0.1 0.63±0.11 8.9±1.4 121.9±2.5. 7.4±2.2 0.58±0.11 8.0±1.6 123.1±2.2. 7.5±0.1 0.63±0.4 1 8.1±1.5 111.6±13.1. 7.5±0.1 0.52±0.09 8.1±1.5 119.0±4.9. 7.5±0.1 0.52±0.09 7.9±1.7 113.3±9.1. + K (mmol/L). 17.6±1.6. 16.9±4.1. 16.9±1.8. 16.7±2.2. 15.2±2.5. 15.5±2.4. Cl - (mmol/L). 102.6±2.6. 103.5±5.2. 100.3±1.2. 93.7±12.0. 97.5±5.5. 94.6±7.2. 2+ Mg (mEq/L). 3.7±0.2. 3.1±1.0. 3.2±0.3. 3.2±1.0. 3.1±0.45. 3.2±0.7. 0.82±0.09 Ca2+ (mmol/L) Serum (4 weeks later) pH 7.3±0.0 Creatinine (mg/dl) 0.45±0.07. 0.78±0.11. 0.87±0.06. 0.69±0.17. 0.79±0.72. 0.74±0.14. 7.3±0.1. 7.3±0.1 0.56±0.06. 7.3±0.1 0.51±0.04. 7.3±0.0 0.52±0.04. Uric acid (mg/dl). 7.3±0.0 0.51±0.11. Na (mmol/L). 137.8±1.7. 4.0±1.2# 135.6±5.3. + K (mmol/L). 5.1±0.7. Cl -(mmol/L). 4.5±1.4. 3.5±0.7. 3.0±0.8. 135.2±2.1. 125.4±38.2. 137.4±2.1. 137.1±1.2. 8.1±3.8. 7.4±1.3. 6.6±0.4. 6.2±1.3. 6.5±1.7. 100.0±1.0. 100.8±1.0. 100.1±1.3. 99.8±1.6. 100.1±0.5. 99.6±0.8. 2+ Mg (mEq/L). 2.2±0.3. 2.5±0.5. 2.7±0.5. 2.7±0.6. 2.0±0.4. 2.4±0.4. Ca2+ (mmol/L) Albumin (mg/dl) AST (U/L). 1.3±0.1 4±0.1 80.8±4.3. 1.2±0.2 3.9±0.16. 1.2±0.1 3.93±0.36 185.2±43.1. 1.3±0.1 4.06±0.19. 1.3±0.1 4.04±0.14. 1.3±0.1 3.94±0.15 101.7±20.1. 51.4±5.8 10.24±0.3 19.38±2.2 187.4±67.3. 107.7±25.1† 64.5±5.1 10.2±0.3 20.8±3.1 783.4±850.7. 95.1±10.1†. ALT (U/L) PT (sec) APTT (sec) LDH. +. 2.1±0.5. †. 0.23±0.06 5.38±0.6. 153.6±39.7# #. 74.6±8.6 10.3±0.1 18.6±0.9 368.0±393.2. 69.8±7.9 27.88±25.7 75.47±81.0 1036.9±745.2. †. 58.6±7.6 17.7±19.1 45.5±60.1 275.7±252.3. †. †. 52.8±13.2 17.4±19.2 43.4±60.3 330.6±297.5. EG：乙二醇；FC：川紅花。數據以平均值±標準差(mean±SD)來表示 #. †. ：P值<0.05表示有統計學上顯著義意。 46. ：P值<0.05表示有統計學上顯著義意。.

(57) 第五節、腎臟組織損傷之病理分析 26B. 組織學研究顯示在正常控制組大鼠的腎臟是無鈣化點的（圖 4.1-control）。在乙二醇 (EG) 餵食大鼠組內發現許多結晶沉積在腎皮質和髓質內。在極光顯微鏡下觀看，這些晶體的呈現雙折射的外觀(圖 4.1)。這些結晶體多在腎皮質和髓質中找到。可見腎小管內結晶、晶塊阻塞集尿管管腔；在結晶體周圍可見白血球聚集的發炎反應、巨噬細胞吞噬晶體的免疫反應、也有紅血球浸潤的出血反應(圖 4.1 箭頭所指處)。. 47.

(58) 圖 4.1 各組大鼠腎臟以石蠟包埋切片、H-E 染色，在偏光顯微鏡下之照片。箭頭所指為沉積於腎臟皮質、集尿管和髓質之晶體。 EG：乙二醇。FC：川紅花。comtrol：對照組。K-citrate：檸檬酸鉀。starch:澱粉。. 48.

(59) 第六節、結石誘發比率 27B. 各組大鼠結石誘發比率(成石率)的計算方法是：該組內罹患結石之大鼠數目除以該組大鼠總數目。本研究利用 0.75%乙二醇(EG)飲水誘發大鼠產生腎結石，其結石比率如下表 4.5。安慰劑組(group 2)的結石誘發率高達 80.0%，陽性對照組(group 3)餵食檸檬酸鉀 (K-citrate)可使結石發生率降到 20.0%，餵食川紅花(FC)600 mg/day(group 5)的結石發生率降到 60.0%，餵食川紅花 1200 mg/day(group 6)的結石率更降到 50.0%，但餵食川紅花 300 mg/day(group 4)的結石發生率則與安慰劑組(group 2)一樣為 80.0%。此結果顯示餵食川紅花可以有效的減少乙二醇誘發大鼠產生腎結石的比率，且其效果與餵食川紅花的劑量有正相關，1200 mg/day(group 6)者比 600 mg/day(group 5) 效果好，但是以人類一般的治療劑量換算成大鼠的 300 mg/day(group 4)卻與安慰劑組 (group 2)一樣，完全沒有治療效果。. 49.

(60) 表 4.5 大鼠腎臟結石誘發比率組別. 試驗用藥. 各組大鼠. 有結石之. 總數. 大鼠總數. 結石誘發率 (%). 1. Control. 5. 0. 0.0. 2. EG + starch. 5. 4. 80.0. 3. EG + K-citrate (500 mg/day). 10. 2. 20.0. 4. EG + FC (300 mg/day). 10. 8. 80.0. 5. EG + FC (600 mg/day). 10. 6. 60.0. 6. EG + FC (1200 mg/day). 10. 5. 50.0. 第七節、腎臟結晶嚴重度之分析 28B. 在分析結晶沉積分數後顯示，當與安慰劑組比較，檸檬酸鉀(K-citrate)和川紅花餵食組(FC-fed groups)(600 和 1,200 mg/day)相較分數低很多(圖 4.2)。整體來看，餵食川紅花（FC）能顯著的抑制草酸鈣(CaOx)結晶沉積於試驗大鼠的腎臟組織中。而低劑量者(300 mg/day)則無此作用。. 50.

(61) (1) 0.00 ± 0.00 (2) 68.00±7.00 (3) 34.00±4.00 (4) 75.00±8.00 (5) 24.00±3.00 (6) 40.00±4.00. 圖 4.2 分析結晶沉積分數，數值以"平均數±標準差"來呈現。當 p 值小於 0.05 時表示當與對照組或安慰劑組比較起來，有顯著差異。. 51.

(62) 第五章、討論 5B. 第一節、紅花抑制結石機制研究之承啟和延續 29B. 我們團隊先前的研究計劃"利用果蠅結石動物模式進行有效中草藥物篩選及研究其治療分子機轉"(尚未發表)，以腎結石誘石劑(0.5%乙二醇)和不同的中藥(80 種) 分別添加於果蠅的食物中，經 3 星期飼養後，進行試驗評估中藥功效及探討其抗結石活性分析。以偏光顯微鏡觀察馬氏管內的結石量，評估給予乙二醇或中藥後對腎結石發生率的影響，藉此篩選出有效之藥物。進而將這些有效之藥物，進行誘發果蠅結石方式，確認並探討誘石果蠅經中藥治療後其生存曲線與結石率，藉此評估其治療功效。我們共篩選了 80 種中藥，從中找出 16 種結石率為零之中藥。公果蠅結石率為 62.5%，給予中藥後公果蠅結石率降為零者分別文中藥編號：CMU-11、CMU-19、 CMU-21、CMU-29、CMU-35、CMU-42、CMU-43、CMU-44(因毒性致死,無存活果蠅分析)、CMU-47、CMU-48、CMU-49、CMU-50、CMU-52、CMU-67、CMU-70、 CMU-76、CMU-77 。初步篩選出共 16 種可降低果蠅結石之中藥。未來將先選用其中四種（CMU-11，CMU-21(紅花)，CMU-29，CMU-70）做更深入研究。目前我們已先針對紅花做進一步誘發結石後治療效果之探討，發現利用 0.5%乙二醇誘石後野生種果蠅結石率高達九成以上，有極好之誘石效果，經由紅花治療後其結石率呈濃度依賴性（dose-dependent）之治療效果，故我們推論紅花將是有效治療結石之中藥，未來並將針對其與結石機轉之相關性做深入探討，包括利用細胞吞噬與 52.

(63) 黏附原理分析紅花抑制結石機制，及利用大鼠實驗分析蛋白質體學上兩者之先關性與其影響之蛋白質，以期找尋重要之分子機制(尚未發表)。本研究即為"大鼠實驗"之延續。. 第二節、灌食劑的製備、問題與修改 30B. 第一項、川紅花灌食劑的製備 57B. 以人類每天的治療劑量:3-10 gm/day，最高劑量 10 公克來換算， X 為紅花劑量.10 g/2000 gm(人每日食物量) = x/40 gm 大鼠每日食物量）[62]， X = 0.2 gm；200 mg 為 1 倍量/天。低劑量組：每日吃科達中藥川紅花粉末 300 mg，溶於 1 ml ddH2O 中以利管灌。中劑量組：每日吃科達中藥川紅花粉末 600 mg，溶於 1 ml ddH2O 中以利管灌。高劑量組：每日吃科達中藥川紅花粉末 1200 mg，溶於 2 ml ddH2O 中以利管灌。因 1200mg 很難完全溶於 1 ml ddH2O 中，故改為 2 ml。未來若改用 pure compound，應可解決此問題。. 第二項、澱粉安慰劑配製 58B. 柯達中藥川紅花粉末每公克含有川紅花 3.5 gm，澱粉 0.33 gm，澱粉與川紅花比例約為 1：10，以中劑量組換算澱粉量，每日澱粉給予 60 mg(1/10 比例)，取 60 mg 澱 53.

(64) 粉溶於 1 ml ddH2O 管灌餵食之。. 第三項、結石清（檸檬酸鉀）配製 59B. 人類的劑量是每日 20 gm，換算大鼠每日 0.5 gm，取 0.5 gm 政德結石清粉末 0.5 gm 溶於 1 ml ddH2O 管灌餵食之。. 第三節、試驗前後尿液量差異之探討 31B. 第二組(Placebo)之成石率為 80%，理論上腎損傷應最嚴重，4 週後 24 小時之尿量卻最多 , 第六組(1200 mg/day FC)之成石率最低為 50%，理論上腎損傷應最不嚴重，4 週後 24 小時之尿量卻最少；原因可能是第六組灌食 2 ml 而其他組只灌食 1 ml，故第六組可能因胃較脹，消化食物需較久時間而到飲水較少，乃致於尿量最少；如要證明此現象可計算飲水之消耗量(飲用量+蒸發量)，因環境因素一樣，蒸發量可視為一致，故消耗量可視為飲用量；或者改用 pure compound，可減少溶解食物所需之液體容積，可使灌食體積一致，以改善此因素。另外，本試驗飲水不受限制，由大鼠自行飲用，喝多者自然尿多，可以增加樣本量(sample size)來解決這種因素造成的誤差。. 54.