水稻抗白葉枯病基因同義密碼子使用偏性之影響因素探討
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(2) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 對應的基本規則，是生物體內資訊傳遞的基本 環節。編碼 20 種胺基酸的密碼子共 61 種，因 此有 2 個或 2 個以上轉譯成同一胺基酸之情 形，這些表現相同胺基酸的密碼子稱為同義密 碼子 (synonymous codon)。大多數生物體或基 因通常傾向使用部份特定的同義密碼子，此種 生物中普遍存在的同義密碼子非均衡使用現 象，稱為同義密碼子使用偏性 (synonymous codon usage bias)。例如密碼子 GUU、GUC、 GUA、GUG 皆決定纈胺酸 (valine, Val)，若突 變使密碼 GUU 改變成 GUC，則仍然可轉譯為 Val，不影響蛋白質的活性，此意味著 tRNA 的 反密碼子 (anticodon) 的第一個鹼基 (從 5’端 算起) 與 mRNA 的密碼子之第三個鹼基並非 一對一的關係，此即所謂的搖擺位點 (wobble position)。 同義密碼子使用偏性會因物種或基因不同 而有所差異 (Gu et al. 2002; Fan et al. 2003)，此 與諸多因素有關，如：鹼基組成突變偏性 (base compositional mutation bias) (Karlin & Mrazek 1996; Knight et al. 2001; Huo & Yang 2003)、自 然選擇 (nature selection) (Sharp & Li 1986; Duret & Mouchiroud 1999; Peixoto et al. 2003; Romero et al. 2003)、基因長度 (Moriyama & Powell 1998)、tRNA 豐富度 (Percudani et al. 1997; Duret 2000)、mRNA 二級結構 (Gu et al. 2004)、密碼子與反密碼子之交互作用 (Shi et al. 2001)、蛋白質結構 (Gupta et al. 2000)、蛋白質 親 水 程 度 及 胺 基 酸 保 守 性 (Romero et al. 2000)、轉譯起點效應 (Stenström et al. 2001) 等。然而，不同物種基因體發生密碼子使用偏 性 的 原 因 也 不 盡 相 同 (Berezhnoy & Duplij 2005; Liu & Xue 2005)。大腸桿菌 (Escherichia coli) 及 釀 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) 的 密 碼 子 用 法 取 決 於 突 變 偏 性 (mutational biases) 及 對 最 優 密 碼 子 選 擇 (selection for optimal codons) 的平衡，而與此相反，一些極. 87. 端富含 AT 或 GC 的原核生物及哺乳動物中基 因的密碼子用法主要由突變偏性造成 (Bulmer 1988; Sharp et al. 1993)。但是，Duret & Mouchiroud (1999) 卻 發 現 在 線 蟲 (Caenorhabditis elegans)、果蠅 (Drosophila melanogaster) 及阿 拉伯芥 (Arabidopsis thaliana) 中該特性並非 由突變引起，而是取決於對密碼子搖擺位點的 選擇。Liu et al. (2003) 則發現水稻的 GC 含量 決定了密碼子的使用，而主要與轉錄水平上的 突變有關。 同義密碼子使用偏性究竟是由突變偏性或 轉譯選擇 (translational selection) 產生，還是兩 者共同作用產生，迄今結論不甚一致 (Salim & Cavalcanti 2008)。Sharp & Li (1987) 認為密碼 子使用偏性在高效表達基因中是由轉譯水準上 的選擇壓力主宰，在低表達基因或群體比較小 的物種中則主要經由突變或漂移產生。但是 Chiapello et al. (1998) 發現轉譯時密碼子的選 擇是造成阿拉伯芥密碼子使用偏性的重要角 色，Karlin & Mrazek (1996) 卻認為人類基因體 之密碼子使用偏性變異以突變偏性較轉譯選擇 更為重要。在大腸桿菌、釀酒酵母、線蟲、果 蠅、阿拉伯芥及水稻等生物基因體中，皆發現 基因表達程度與密碼子使用偏性間存在顯著相 關關係 (Ikemura 1985; Sharp & Li 1987; Duret & Mouchiroud 1999)。Liu et al. (2004a) 也發現 基因表達程度是造成稉稻粒線體中密碼子使用 偏性的主要因素，高度表達之粒線體基因的密 碼子通常含有豐富的 A 或 T，且偏好以 A 或 U 結尾；但稉稻粒線體的基因長度與基因表達程 度、密碼子使用偏性之間並無明顯關係。Liu et al. (2004b) 利 用 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 之 GenBank 資料庫 中 1860 條大於 300 bp 的水稻 CDS 探討同義密 碼子使用偏性之影響因素，認為水稻密碼子使 用偏性之變異性是由於轉錄時核苷酸突變偏性 所造成，水稻基因體中高度表達基因較偏好某.
(3) 88. 台灣農業研究. 種 GC 含量豐富的同義密碼子。Liu et al. (2003) 以水稻品種 93-11 作為材料進行基因體同義密 碼子使用偏性分析，則發現基因表達程度雖會 影響密碼子使用偏性，但兩者間相關係數較 小。顯然，影響水稻基因體之同義密碼子使用 偏性的因素，可能因目標基因而有所不同。 水稻白葉枯病 (rice bacterial leaf blight) 是 由 黃 單 孢 桿 菌 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) 引起的一種細菌性維管束病害， 為世界性主要稻作病害之一。為瞭解水稻白葉 枯病抗病基因 (Xa) 之抗性分子機制，前作 (Wei et al. 2009) 自 NCBI 之 GenBank 資料庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html, Guisez et al. 1993) 下載已完全定序的 Xa 基因 (Xa1, xa5, xa13, Xa13, Xa21, Xa26 及 Xa27) 及 其家族之 17 個編碼區序列 (coding domain sequence, CDS) 進行密碼子使用偏性分析，發 現同樣對 Xoo 產生抗性的不同 Xa 基因間呈現 出密碼子使用偏性的多樣性，Xa1、Xa21 及 Xa26 的 CDS 僅少數胺基酸具有高頻密碼子 (high-frequency codon) 且大多偏好以 A 或 U 結 尾的密碼子，而 xa5、xa13、Xa13 及 Xa27 之 CDS 的所有胺基酸都偏好以 C 或 G 結尾的密 碼子，由此揭示出選擇在抗病基因的演化中有 著重要的作用。因此，值得進一步探討 Xa 基 因密碼子使用偏性之影響因素，可有利 Xa 基 因分子機制演化上之研究，並促進蛋白質結構 預測與基因改良。. 材料與方法 Xa 基因序列之蒐集 本研究自 NCBI 之 GenBank 資料庫下載已 定序之 Xa 基因的 CDS，這些已知 Xa 基因的相 關資訊整理如表 1，Xa1 分別於 1999 及 2004 年登錄有兩條序列 (本文簡稱 Xa1-1999 及 Xa1-2004)，各位於第 4 及第 10 條染色體；xa5. 第 59 卷. 第2期. 為一隱性基因，位於第 5 條染色體；Xa13 及 xa13 分別為顯、隱性基因，皆位於第 8 條染色體； Xa21 基因家族位於第 11 條染色體，包含 7 個 成 員 分 別 為 Xa21-A1 、 Xa21-A2 、 Xa21-B 、 Xa21-C、Xa21-D、Xa21-E 及 Xa21-F；Xa26 基 因家族位於第 11 條染色體，包含 4 個成員分別 為 Xa26-MRKa、Xa26-MRKb、Xa26-MRKc 及 Xa26-MRKd (本文簡稱 Xa26a、Xa26b、Xa26c 及 Xa26d)；Xa27 位於第 6 條染色體。. 同義密碼子使用偏性指標值之計算 將上述各 Xa 基因之 CDS，利用 CodonW 密碼子分析軟體 (1.4 版，http://bioweb.pasteurur.fr/ seqana/interfaces/codonw.html, Peden 1999)，先 求出各基因序列上各種密碼子的個數，然後進 行以下各種同義密碼子使用偏性指標之計算。 編碼 20 種胺基酸的密碼子共有 61 種 (附錄 1)，其中由於甲硫胺酸 (methionine, Met)、色 胺酸 (tryptophan, Trp) 各只對應一個密碼子， 因此在以下計算過程中皆未將其納入，而只針 對各基因之 59 種同義密碼子進行同義密碼子 使用偏性指標值之估算。 同 義 密 碼 子 相 對 使 用 度 (relative synonymous codon usage, RSCU) 及其對應分 析 (correspondence analysis, COA)：RSCU 通 常用來研究整個基因的密碼子使用變異。編譯 成同一種胺基酸的同義密碼子從理論上期望是 有相同的使用頻率 (具有隨機性)，RSCU 是實 際觀測值與理論期望值間之比率，其大小反映 出胺基酸內同義密碼子的偏性變異。為探討不 同 Xa 基因間密碼子使用性的相似及相異程 度，在不考慮 Met、Trp 下，計算出各基因之 59 種同義密碼子之 RSCU 值，其計算式 (Sharp et al. 1993) 為. RSCU ij =. X ij 1 ni. [1]. ni. ∑X j=1. ij.
(4) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 89. 表 1. 已知序列之水稻 Xa 基因之解碼區序列 (CDS) 長度及各種同義密碼子使用偏性指標值 Table 1. Length of coding domain sequence (CDS) and indices of synonymous codon usage bias of bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice with known sequences z. Label Xa1-1999. Gene symbol. Gene Accession no. Submitted length in NCBI year (bp). Xa1. AB002266. Xa1-2004. Xa1. xa5. xa5. xa13. CDS Chromosome Length location (bp). CAI y ENC y GC3 y GC12 y. 1999. 5910. 4. 5409. NM_194685. 2004. 4206. 10. 4206. 0.209. 56.91. 0.543. 0.462. AY643716. 2004. 318. 5. 318. 0.273. 39.93. 0.673. 0.429. xa13. DQ421394. 2006. 924. 8. 924. 0.266. 31.06. 0.956. 0.508. Xa13. Xa13. DQ421395. 2006. 924. 8. 924. 0.261. 31.08. 0.953. 0.510. Xa21-A1. Xa21. U72725. 1997. 8416. 11. 2991. 0.196. 55.94. 0.446. 0.465. Xa21-A2. Xa21. U72727. 1998. 5940. 11. 2991. 0.192. 55.44. 0.443. 0.463. Xa21-B. Xa21. U37133. 1995. 3921. 11. 3078. 0.168. 55.56. 0.464. 0.458. Xa21-C. Xa21. U72723. 1998. 19639. 11. 2978. 0.195. 57.12. 0.445. 0.472. Xa21-D. Xa21. U72726. 1997. 13341. 11. 1839. 0.166. 58.44. 0.513. 0.445. Xa21-E. Xa21. U72724. 1997. 9424. 11. 2442. 0.202. 57.11. 0.459. 0.454. Xa21-F. Xa21. U72728. 2005. 7204. 11. 3071. 0.205. 55.70. 0.504. 0.454. Xa26a. Xa26. DQ355952. 2006. 3401. 11. 3297. 0.180. 57.34. 0.439. 0.469. Xa26b. Xa26. DQ355952. 2006. 3631. 11. 3312. 0.199. 57.99. 0.480. 0.464. Xa26c. Xa26. DQ355952. 2006. 3456. 11. 3342. 0.176. 57.02. 0.475. 0.459. Xa26d. Xa26. DQ355952. 2006. 11396. 11. 3327. 0.200. 57.24. 0.482. 0.470. Xa27. Xa27. AY986491. 2005. 2393. 6. 342. 0.213. 33.09. 0.798. 0.663. z y. 0.183. 54.25. 0.440. 0.459. Source: Oryzabase and NCBI databases, searched on Feb. 29, 2008. CAI, codon adaption index; ENC, effective number of codons; GC3, frequency of G or C nucleotides present at the third position of synonymous codons; GC12, mean frequencies of G or C nucleotides present at the first and second positions of synonymous codons.. 式中 Xij 是第 i 個胺基酸中第 j 個密碼子出現的 次數，ni 為第 i 個胺基酸同義密碼子的數目。 RSCU 用以觀測同義密碼子出現頻率是否相 等，當 RSCU 值大於 1 時表示相對應的密碼子 出現的次數比期望次數 (即該胺基酸所有同義 密碼子出現平均頻率，意味著其出現頻率都相 等) 為高，反之則表示出現次數相對較少 (Sharp et al. 1993)。本研究同義密碼子使用性是 由不同 Xa 基因 (樣本) 與 59 種同義密碼子出 現頻率 (變數) 所構成的資料矩陣來決定，此 係一種多維 (multiple dimensions) 的資料形 式 ， 最 適 合 利 用 多 變 數 分 析 (multivariate. analysis) 之統計技術來解析其所蘊含之訊息。 對應分析 (correspondence analysis) 為 Benzécri 於 1973 年所提出，是一種廣泛運用到生態學 (尤其是植物生態學) 的多變數統計分析技 術，現已大量應用到其他各方面的研究領域 (Beh 2004)，包括基因組分析上之各種應用 (Gupta & Ghosh 2001; Tekaia et al. 2002; Tan et al. 2004)。對應分析對於數據的要求比較簡 單，不需要有嚴格的線性關係，也無須限定所 處理的資料是連續或離散變數，只需要是一個 列聯表 (contingency table) 的資料形式，即可 將多維之變數或樣本於一個低維空間上以一個.
(5) 90. 台灣農業研究. 序列分布圖 (ordination diagram) 呈現，藉此不 但可用來檢測變數間或樣本間的關係，也能從 各變數或樣本落在序列分布圖上之距離遠近來 判斷分群結果 (Benzécri 1973)。密碼子使用性 之對應分析，能區分高表達基因和低表達基因 (Gouy & Gautier 1982; Holm 1986; Peden 1999)， 並可有效檢測出不同基因間之密碼子使用性的 變異形式 (Gupta & Ghosh 2001; Wei et al. 2009) 。 因 此 ， 本 研 究 根 據 RSCU 值 利 用 STATISTICA 統計軟體 (7.0 版，Statsoft Inc. 2002) 進行對應分析，由各 Xa 基因落在所得序 列分布圖之因子軸 (COA axis) 上的相對位 置，來探討 Xa 基因之同義密碼子使用偏性。 密碼子適應指標 (codon adaption index, CAI)：CAI 是透過計算某基因中每個密碼子的 相對貢獻及所有密碼子的頻率，來做為測量該 基因之同義密碼子使用偏性大小的一個指標， 用以評估哪一種選擇在形成密碼子使用模式時 是有效的，故可有效運用於預測基因的表達程 度、估計病毒基因對宿主的適應性及比較不同 生 物 之 間 密 碼 子 之 使 用 模 式 (Sharp & Li 1987)。Nakamura & Tabata (1997) 以 7 個基因 組的表達模式，證實了 CAI 能有效預測基因表 達程度。自此，CAI 已成為最常用的基因表達 程度之估計值 (Salim & Cavalcanti 2008)。CAI 的計算步驟如下 (Sharp & Li 1987)：首先，利 用 RSCU 值計算出密碼子相對適應值 (relative adaptiveness of a codon, W)，W 為同一胺基酸中 各密碼子使用頻率與最優密碼子 (即出現頻率 最高之密碼子) 使用頻率的比值，即. Wij =. RSCU ij X ij = RSCU i max X i max. [2]. 式中 RSCUi max 為第 i 個胺基酸中最大的 RSCU 值；Xi max 為第 i 個胺基酸中出現頻率最高的密 碼子個數。. CAI = CAIobs CAImax. [3]. 第 59 卷. 其中. 第2期. L. CAIobs = L ∏ RSCU k. [4]. k =1. L. CAI max = L ∏ RSCU k max. [5]. k =1. 式中 RSCUk 為基因中第 k 個密碼子的 RSCU 值；RSCUk max 為基因中第 k 個密碼子所編碼之 胺基酸中最大 RSCU 值；L 為基因中密碼子的 數目。因此，CAI 的精確計算式可寫成 L. CAI = L ∏ Wk. [6]. k =1. 由該公式可知，CAI 是密碼子相對適應值 (W) 的幾何平均值 (geometric mean)，顯示出其與 基因表達程度之間具有正向相關性。CAI 值介 於 0–1 之間，高度表達之基因，通常 CAI 值也 越高。但 Sharp & Li (1987) 強調 CAI 只能大致 估計出基因內密碼子使用性的適合度 (suitability)，而不考慮密碼子在基因上的分布。 有 效 密 碼 子 數 (effective number of codons, ENC)：ENC 為觀察在基因序列中密碼 子被真正使用的密碼子使用偏性之測量方法， 其數值範圍在 20–61 之間 (Wright 1990)。當每 個胺基酸都使用到一種密碼子時，ENC 為 20 ； 若各胺基酸皆無偏好任何同義密碼子時，則 ENC 當近於 61。ENC 的計算步驟如下 (Wright 1990)： 先計算各胺基酸的密碼子均質性 (homozygosity, F)，計算式為 k. Fˆ =. 2. n ∑ pi - 1 i =1. [7]. n -1. 式中 k 為同義密碼子數，例如白胺酸 (leucine, Leu) 有 6 個密碼子 (附錄 1)，則 k = 6；n 為某 一胺基酸之同義密碼子的總和，例如 Leu 中 n = n1 + n2 + ... + n6；pi 為某一胺基酸之第 i 個同 n. i 義密碼子頻率，例如 Leu 中的 p i = n 。.
(6) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 再求 ENC，其在 Wright (1990) 使用的符 號為 Nˆ C ，計算公式為. ˆ C =2+ 9 + 1 + 5 + 3 N Fˆ2 Fˆ3 Fˆ4 Fˆ6. [8]. 式中 Fˆ i 為每一種同義密碼子家族，如 Fˆ6 表示所 有包含 6 個同義密碼子之同義密碼子家族 的 均質性，如 Leu、精胺酸 (arginine, Arg)、絲胺 酸 (serine, Ser) 之 3 種胺基酸 (附錄 1)。由於 在計算時，可能有些基因會缺少某些密碼子， 針對此類情況，可循以下幾種方法處理：(1) 若 某一同義密碼子家族的 Fˆ 計算結果為 0，則對 ˆ C 的計算應加以調整，即在計算某些同 於之前 N 義密碼子家族的平均均質性時，應按照實際出 現的同義密碼子家族之數目來計算；(2) 包含 3 個同義密碼子之同義密碼子家族的異白胺酸 (isoleucine, Ile) (附錄 1) 若缺失或很少被使 用，則 Fˆ3 應計算為 Fˆ2 與 Fˆ4 之平均值；(3) 由於 某些基因之密碼子之使用可能具有極度偏性， 而造成 Nˆ C 值可能大於 61，此時該基因之 NˆC 值 則以 61 計算。 同義密碼子第三位置出現 G 或 C 核苷酸之 頻率 (GC3)：GC3 含量可能是影響同義密碼子 使用偏性的因素之一。一般而言在計算各基因 之同義密碼子的 GC3 時，並不納入只對應一個 密碼子的 Met 和 Trp。 同義密碼子第一、二位置出現 G 或 C 核苷 酸 之 平 均 頻 率 (GC12) ： GC12 為 在 不 考 慮 Met、Trp 下同義密碼子第一位置出現 G 或 C 之頻率 (GC1) 及其第二位置出現 G 或 C 之頻 率 (GC2) 的平均值，其計算式為. GC12 =. (GC1 + GC2) 2. [9]. 密碼子使用偏性影響因素之分析 CDS 長度對基因表達程度之影響：將各基因 的 CDS 長度與 CAI 進行簡單相關，並繪製散佈 圖，以探討 CDS 長度是否影響基因表達程度。. 91. CDS 長 度 對 同 義 密 碼 子 使 用 偏 性 之 影 響：將各基因的 CDS 長度與在 RSCU 之對應分 析所得序列分布圖中解釋變異具有最大貢獻率 的第一軸 (COA axis 1) 上位置、以及與 ENC 分 別進行簡單相關，並繪製散佈圖，以探討 CDS 長度是否為影響同義密碼子使用偏性之因素。 基因表達程度對同義密碼子使用偏性之影 響 ：將各基因的 CAI 與在 RSCU 之 COA axis 1 上位置及 ENC 分別進行簡單相關，並繪製散佈 圖，以探討基因表達程度是否為影響同義密碼 子使用偏性之因素。 GC3 含 量 對 同 義 密 碼 子 使 用 偏 性 之 影 響 ：為探討基因中 GC3 含量是否會影響同義 密碼子使用偏性，因此本研究以 GC3 為 X 軸 而 ENC 為 Y 軸，繪製一個 Nc-plot 圖 (Wright 1990)，可用來檢視同義密碼子使用偏性是否因 GC3 組 成 的 壓 力 限 制 (compositional constraints) 所造成。若密碼子為隨機使用， ENC 與 GC3 的期望關係可根據 Wright (1990) 提出之方法求得，其使用的符號及公式如下：. Nc = 2 + s + [. 29 ] s + (1 - s) 2 2. [10]. 式中符號 Nc 即 ENC，s 為 GC3 值 (註：Wright 之原著印刷有誤，Nc 公式的分母被誤寫成 s2 + (1 - s2 ) ，本文在此予以修正)。 透過 Nc-plot 可看出，若基因受到 GC3 組 成之壓力限制影響，則其 Nc 會落在期望值平 滑曲線正上面或曲線之下方，表示基因可能受 到 GC 突變偏性之影響或者受到密碼子第三位 置對 G 或 C 之選擇，而造成密碼子使用偏性 (Wright 1990)。 同時，為評估 ENC 期望值與估計值間之差 異，計算 ENC 的估計值與期望值之比率 (ENC ratio)：. ENC ratio =. (ENC exp - ENC obs ) ENC exp. [11].
(7) 92. 台灣農業研究. ENCobs 為基因經由算式 [8] 所計算出之 ENC 值；ENCexp 為某基因所含之 GC3 含量時，利用 ENC 與 GC3 之期望關係的公式 [10] 所算出之 期望值。然後，以基因為 X 軸，ENC ratio 為 Y 軸，繪製曲線分布圖，其結果可用以佐證 Nc-plot 之結果 (Kawabe & Miyashita 2003)。 GC12 含量對 GC3 突變偏性之影響：為瞭 解突變偏性與密碼子使用偏性之間的關係，以 GC3 為 X 軸，GC12 為 Y 軸，繪製中性圖 (neutrality plot)，用以觀察 GC12 含量是否為 GC3 含 量 突 變 偏 性 之 影 響 因 素 (Sueoka 1988)。若 GC3 和 GC12 之間存在顯著相關關 係，則表示基因會受突變偏性影響，若他們之 間無顯著關係，則表示該等基因有較低的突變 偏性或較高的保守性。. 結. 果. 已知序列之 Xa 基因之 CDS 的長度及各種 同義密碼子使用偏性指標值 (除 RSCU 以外)， 整理如表 1。由表 1 可知，就密碼子適應指標 CAI 越高，表示基因之表達程度越高來看，所 有 Xa 基因的表達程度並不高；而較短 CDS (318–924 bp) 之 xa5、xa13、Xa13 及 Xa27 基因 的 CAI 值介於 0.213–0.273 之間，至於 CDS 較 長 (1839–5409 bp) 的 Xa1、Xa21 及 Xa26 基因 家族之 CAI 值則在 0.168–0.209 之間，似乎 Xa 基因之 CDS 長度較短者可有較高的基因表達 程度。xa5、xa13、Xa13 及 Xa27 基因之 CDS 的 ENC 值在 31.06–39.93 之間，該有效密碼子 數較接近於 20，表示胺基酸的同義密碼子使用 偏性較高；然而，Xa1、Xa21 及 Xa26 基因家 族之 CDS 的 ENC 值在 54.25–58.44 之間，較接 近於 61，表示其序列胺基酸較不偏好任何密碼 子。xa13 及 Xa13 基因之 CDS 的 GC3 值甚近 於 1，表示其同義密碼子第三位置的 G 或 C 含 量很高，其次為 Xa27 基因；Xa1、Xa21 及 Xa26 基因家族之 CDS 的同義密碼子第三位置的 G. 第 59 卷. 第2期. 或 C 含量則相對較低，GC3 值在 0.5 左右。所 有 Xa 基因之 CDS 的同義密碼子第一、二位置 之 G 或 C 含量則並無偏高現象，其 GC12 值在 0.5 左右，未接近於 1。 將各 Xa 基因之 CDS 的 RSCU 值進行對應 分析結果 (圖 1)，兩個主要因子軸能解釋變異 的貢獻分別為 56.94%和 19.61%，總貢獻量合 計佔 76.55%，此意謂著利用對應分析所得之二 維序列分布圖的兩個因子軸，當足以充分說明 Xa 基因間密碼子使用偏性的差異趨勢，且以第 一軸 (COA axis 1) 能夠解釋過半數的密碼子 使用偏性 。因此，由各基因落在 RSCU 之 COA axis 1 上的位置，可顯示各基因密碼子使用性 的變異形式：基因在 RSCU 之 COA axis 1 上的 落點越偏離 0，表示其同義密碼子使用偏性越 高；而各基因落點點之間有群團現象，表示這 些基因的同義密碼子使用性相近。由圖 1 發 現，xa5、xa13、Xa13 及 Xa27 都甚遠離於其他 Xa 基因，且 xa5 及 Xa27 亦各偏離於 xa13 及 Xa13，此表示 xa13 及 Xa13 之 CDS 的胺基酸 之同義密碼子使用偏性與 xa5 及 Xa27 所得者有 差異，而此四個 Xa 基因之同義密碼子使用偏 性又甚異於 Xa1、Xa21 及 Xa26 基因家族。 將各 Xa 基因的 CDS 長度與 CAI 進行相關 分析，結果發現 CDS 長度會影響基因表達程 度 ， 其 間 存 在 極 顯 著 的 負 相 關 關 係 (P < 0.001)，即 CDS 長度越短則基因表達程度越高 (圖 2)。透過 Xa 基因的 CDS 長度與在 RSCU 之 COA axis 上位置間存在之極顯著負相關關 係，以及 CDS 長度與 ENC 間之極顯著正相關 關係，可知 CDS 長度越短則同義密碼子使用偏 性也越高 (圖 3、4)。再將 CAI 分別與 RSCU 之 COA axis 1 上位置及 ENC 進行簡單相關， 發現 CAI 與在 RSCU 之 COA axis 1 上位置之間 呈極顯著正相關 (圖 5)，而 CAI 與 ENC 間則 呈極顯著負相關 (圖 6)，顯示 Xa 基因之表達程 度確實會影響其同義密碼子使用偏性。為探討.
(8) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 93. 圖 1. 水稻 Xa 基因根據同義密碼子相對使用度 (RSCU) 的對應分析之序列分布圖。 Fig. 1. Ordination diagram of correspondence analysis based on the relative synonymous codon usage (RSCU) for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice.. 圖 2. 水稻 Xa 基因的編碼區序列 (CDS) 長度與密碼子適應指標 (CAI) 間之相關關係。 Fig. 2. Correlation between coding domain sequence (CDS) length and codon adaption index (CAI) for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice. *** Significant at 0.1% level..
(9) 94. 台灣農業研究. 第 59 卷. 第2期. 圖 3. 水稻 Xa 基因的編碼區序列 (CDS) 長度與在同義密碼子相對使用度 (RSCU) 之對應分析第一因子軸 (COA axis 1) 上位置間之相關關係。 Fig. 3. Correlation between coding domain sequence (CDS) length and the position along the first axis of correspondence analysis (COA axis 1) of relative synonymous codon usage (RSCU) for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice. *** Significant at 0.1% level.. 圖 4. 水稻 Xa 基因的編碼區序列 (CDS) 長度與有效密碼子數 (ENC) 間之相關關係。 Fig. 4. Correlation between coding domain sequence (CDS) length and effective number of codon (ENC) for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice. *** Significant at 0.1% level..
(10) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 95. 圖 5. 水稻 Xa 基因之密碼子適應指標 (CAI) 與在同義密碼子相對使用度 (RSCU) 之對應分析第一因子軸 (COA axis 1) 上位置間之相關關係。 Fig. 5. Correlation between codon adaption index (CAI) and the position along the first axis of correspondence analysis (COA axis 1) of relative synonymous codon usage (RSCU) for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice. *** Significant at 0.1% level.. 圖 6. 水稻 Xa 基因的密碼子適應指標 (CAI) 與效密碼子數 (ENC) 間之相關關係。 Fig. 6. Correlation between codon adaption index (CAI) and effective number of codon (ENC) for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice. *** Significant at 0.1% level..
(11) 96. 台灣農業研究. Xa 基因 CDS 的 GC3 含量是否影響其同義密碼 子使用性，由圖 7 之 Nc-plot 可看出，所有 Xa 基因皆落於期望曲線之下方，表示所有 Xa 基 因皆因 GC3 組成而造成其同義密碼子使用偏 性，尤以 CDS 長度較短 (< 1000 bp) 的 xa5 及 Xa27 基因受到 GC3 組成之影響更鉅 (更明顯 偏離期望曲線)；此結論亦可由圖 8 之基因對 ENC ratio (基因間 ENC 期望值與估計值間之差 異) 的曲線分布圖獲得佐證，各基因之 ENC ratio 皆為正值，而 xa5 及 Xa27 之 ENC ratio 遠 大於其他 Xa 基因，表示 xa5 及 Xa27 確實距離 期望曲線較遠，其同義密碼子使用偏性受到 GC3 組成限制之影響更甚於其他 Xa 基因。繼 由圖 9 之中性圖可知，GC12 與 GC3 之間呈顯 著正相關 (P < 0.05)，顯示 GC 含量在 Xa 基因 之同義密碼子使用偏性的產生過程中扮演著決 定性的作用，且 Xa 基因密碼子之 GC3 組成也. 第 59 卷. 第2期. 受到其 GC12 之影響，導致可能發生較高的突 變偏性而造成同義密碼子使用上之偏性。. 討. 論. 本研究發現不同 Xa 基因存在密碼子使用 偏性變異，Xa1、Xa21 及 Xa26 基因家族之序 列胺基酸較不偏好任何密碼子，而 xa5、xa13、 Xa13 及 Xa27 基因卻有較高的同義密碼子使用 偏性 (表 1、圖 1)。進而根據本研究同義密碼 子使用偏性之影響因素探討，顯示 Xa 基因長 度較短者可有較高的基因表達程度、以及較高 的同義密碼子使用偏性，如 xa5、xa13、Xa13 及 Xa27 基因 (圖 2–圖 6)。因此，CDS 長度及 基因表達程度是影響 Xa 基因同義密碼子使用 偏性的部份因素。而在其他水稻基因，如稉稻 粒線體基因之表達程度是造成密碼子使用偏性 的因素之一，但其 CDS 長度則並不影響基因表. 圖 7. 水稻 Xa 基因之 Nc-Plot：圖中實線為在密碼子逢機使用下之密碼子第三位置出現 G 或 C 核苷酸之頻率 (GC3) 與有效密碼子數 (ENC) 之期望值。 Fig. 7. Nc-plot for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice. The solid curve represents the expected curve between frequency of G or C nucleotides present at the third position of synonymous codons (GC3) and effective number of codon (ENC) under random codon usage..
(12) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 97. 0.30 Xa27. xa5. 0.25. ENC ratio. 0.20. 0.15 Xa1 (1999). 0.10. Xa21-A2. 0.05. Xa21-A1 Xa1 (2004). 0.00. xa13. Xa21-F Xa21-B. Xa26d. Xa21-E. Xa21-C Xa21-D. Xa13. Xa26c. Xa26a. Xa26b. Xa1(1999) Xa1(2004) Xa21-A1 Xa21-A2 Xa21-B Xa21-C Xa21-D Xa21-E Xa21-F Xa26a Xa26b Xa26c Xa26dxa5xa13Xa13Xa27. Gene. 圖 8. 水稻 Xa 基因的有效密碼子數估計值與期望值之比率 (ENC ratio) 的曲線分布圖。 Fig. 8. Distribution curve of the ratio between observed and expected effective number of codon (ENC ratio) for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice.. 1.0. r = 0.558* 0.8. Xa27. GC12. 0.6 Xa13 xa13 0.4. xa5. 0.2. 0.0 0.0. 0.2. 0.4. 0.6. 0.8. 1.0. 1.2. GC3. 圖 9. 水稻 Xa 基因之中性圖。 Fig. 9. Neutrality plot for bacterial leaf blight resistant genes (Xa) of rice.. * Significant at 5% level..
(13) 98. 台灣農業研究. 達程度及密碼子使用偏性 (Liu et al. 2004a)； Liu et al. (2003) 在水稻品種 93-11 之基因體上 發現 CDS 長度較短之基因的密碼子使用偏性 較高，而基因表達程度多少影響密碼子使用偏 性，但兩者間相關係數較小；Liu et al. (2004b) 認為水稻密碼子使用偏性之變異性是由於轉錄 時核苷酸突變偏性所造成，水稻基因體中高度 表達基因較偏好某種 GC 含量豐富的同義密碼 子，且 CDS 長度越短，水稻轉錄活性表達程度 越高。一般而言，CDS 長度為影響水稻密碼子 使用偏性的因素之一，當 CDS 長度越短，其密 碼子使用偏性越高；但當目標基因不同，影響 程度也會不同 (Liu et al. 2004b; Liu et al. 2005)。在多細胞真核生物中，基因長度與密碼 子使用偏性之關係的內在機制和原因還不是很 清楚 (Salim & Cavalcanti 2008)；有可能是因為 遺傳上連鎖的選擇位點的進化動力學所造成 (Comeron et al. 1999; McVean & Charlesworth 2000)，即所有的都是相等，但較長基因內的位 點將與更大數目的分離非中性突變位點緊密相 連，如此形成有更低的密碼子使用偏移 (Comeron et al. 1999)。Liu et al. (2005) 則指出 高表達基因比低表達基因對密碼子偏好性有顯 著的變異，是因為高表達基因有較強的天擇限 制，會選擇密碼子以進行有效的轉譯，而影響 高表達基因最主要之因素為 tRNA 的豐富度， 即高表達基因會要求密碼子的使用頻率與 tRNA 數量及轉錄能力相符。 影響 Xa 基因之同義密碼子使用偏性，還 包括 GC3 之組成限制 (圖 7、8)。Wei et al. (2009) 發 現 具 有 多 白 胺 酸 重 複 (leucine-rich repeat, LRR) 區域結構且 CDS 長度大於 1000 bp 的 Xa1、Xa21 及 Xa26 基因的大多數胺基酸並無 密碼子使用偏性，僅少數胺基酸偏好以 A 或 U 結尾的同義密碼子；而不具 LRR 區域蛋白質結 構且 CDS 長度較短的 xa5、xa13、Xa13 及 Xa27. 第 59 卷. 第2期. 基因，則幾乎所有胺基酸都偏好以 C 或 G 結尾 的同義密碼子。由此顯見，同樣對白葉枯病菌 產生抗性的不同 Xa 基因間所呈現的密碼子使 用偏性的多樣性，揭示出選擇在抗病基因的演 化中有著重要的作用。按照中性進化理論的觀 點，核苷酸序列中密碼子第 3 位鹼基的變化受 到突變和自然選擇的影響是中性或近中性的 (Sharp et al. 1993)，由此似乎意味著可能由於鹼 基突變偏好 G + C 或 A + U 而造成這些 Xa 基因 之同義密碼子使用偏性。Liu et al. (2003) 也指 出水稻基因序列 GC 含量強烈影響了密碼子的 使用，其密碼子使用偏性之產生主要與轉錄水 平上的突變有關。此外，本研究也發現 GC12 之突變也會影響 GC3 的突變偏性，進而造成 Xa 基因之同義密碼子使用偏性 (圖 9)。同樣這 一特點也存在於其他生物，但其影響程度不 同。Kawabe & Miyashita (2003) 利用 4 種單子 葉植物 (小麥、大麥、水稻及玉米) 以及 3 種 雙子葉植物 (阿拉伯芥、菸草、豌豆) 的 CDS 進行密碼子使用偏性分析，結果發現單子葉與 雙子葉植物的密碼子使用偏性皆受到 GC3 組 成限制之因素影響，又單子葉植物之 GC3 組成 則受到 GC12 之影響，但雙子葉植物則否。Liu & Xue (2005) 利用水稻、玉米、小麥及阿拉伯 芥等四種植物的細胞核基因與葉綠體基因進行 密碼子使用偏性之比較，發現密碼子使用偏性 在葉綠體及細胞核中皆受到 GC3 組成限制影 響，而細胞核基因體 GC3 突變偏性又受到 GC12 所影響，葉綠體基因體中 GC3 則否，表 示細胞核基因體之 GC 含量會影響突變偏性， 而葉綠體基因體則有較低的突變偏性或較高的 保守性。. 誌. 謝. 本研究承蒙國家科學委員會 (計畫編號： NSC95-2317-B-055-004) 補助經費，特致謝忱。.
(14) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 引用文獻 (Literature cited) Beh, E. J. 2004. A Bibliography of the Theory and Application of Correspondence Analysis. Vol. II-By Publication. School of Quantitative Methods and Mathematical Sciences, Univ. Western Sydney. Australia. 101 pp. Benzécri, J. P. 1973. Lanalyse des Donnees. II. Lanalyse des Correspondances. Dunod. Paris, France. 619 pp. Berezhnoy, A.Y. and S. A. Duplij. 2005. Dependence of nucleotide physical properties on their placement in codons and determinative degree. J. Zhejiang Univ. Sci. 6:948–960. Bulmer, M. 1988. Are codon usage patterns in unicellular organisms determined by selection-mutation balance? J. Mol. Bio. 1:15–26. Chiapello, H., F. Lisacek, M. Caboche, and A. Henaut. 1998. Codon usage and gene function are related in sequences of Arabidopsis thaliana. Gene 209:GC1–GC38. Comeron, J. M., M. Kreiman, and M. Agude. 1999. Natural selection on synonymous sites is correlated with gene length and recombination in Drosophila. Genetics 151:239–249. Duret, L. 2000. tRNA gene number and codon usage in the C. elegans genome are co-adapted for optimal translation of highly espressed genes. Trends Genet. 16:287–289.. 99. Guisez, Y., J. Robbins, E. Remaut, and W. Fiers. 1993. Folding of the MS2 coat protein in Escherichia coli is modulated by translational pauses resulting from mRNA secondary structure and codon usage: a hypothesis. J. Theor. Biol. 162:243–252. Gupta, S. K., S. K. Majumdar, T. Bhattacharya, and T. C. Ghosh. 2000. Studies on the relationships between the synonymous codon usage and protein secondary structural units. Biochem. Biophys. Res. Commun. 269:692–696. Gupta, S. K. and T. C. Ghosh. 2001. Gene expressivity is the main factor in dictating the codon usage variation among the genes in Pseudomonas aeruginosa. Gene 273:63–70. Holm, L. 1986. Codon usage and gene expression. Nucleic Acids Res. 14:3075–3087. Hou, Z. C. and N. Yang. 2003. Factors affecting codon usage in Yersinia pestis. Acta Biochem. Biophys. Sin. 35:580–586. Ikemura, T. 1985. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2:13–34. Karlin, S. and J. Mrazek. 1996. What drives codon choices in human genes? J. Mol. Biol. 262:459–472. Kawabe, A. and N. T. Miyashita. 2003. Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species. Genes Genet. Syst. 78:343–352.. Duret, L. and D. Mouchiroud. 1999. Expression pattern and, surprisingly, gene length shape codon usage in Caenorhabditis, Drosophila, and Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4482–4487.. Knight, R. D., J. F. Stephen, and L. F. Landweber. 2001. A simple model based on mutation and selection explains trends in codon and amino-acid usage and GC composition within and across genomes. Genome Biol. 2:1–13.. Fan, S. H., A. G. Guo, L. W. Shan, and X. P. Hu. 2003. Analysis of genetic code preference in Arabidopsis thaliana. Prog. Biochem. Biophys. 30:221–225. (in Chinese with English abstract). Liu, Q. P., J. Tan, and Q. Z. Xue. 2003. Synonymous codon usage bias in the rice cultivar 93-11 (Oryza sativa L. ssp. Indica) Acta Genet. Sin. 30:335–340. (in Chinese with English abstract). Gouy, M. and C. Gautier. 1982. Codon usage in bacteria correlation with gene expressivity. Nucleic Acids Res. 10:7055–7074.. Liu, Q. P., Y. Feng, and Q. Z. Xue. 2004a. Analysis of factors shaping codon usage in the mitochondrion genome of Oryza sativa. Mitochondrion 4:313– 320.. Gu, W. J., J. M. Ma, T. Zhou, X. Sun, and Z. H. Lu. 2002. Codon usage in genes coding for proteins with different tertiary structures. Acta Biophys. Sin. 18:81–86. (in Chinese with English abstract) Gu, W. J., J. M. Ma, T. Zhou, X. Sun, and Z. H. Lu. 2004. The relationship between synonymous codon usage and protein structure in Escherichia coli and Homo sapiens. BioSystems 73:89–97.. Liu, Q. P., Y. Feng, X. Zhao, H. Dong, and Q. Z. Xue. 2004b. Synonymous codon usage bias in Oryza sativa. Plant Sci. 167:101–105. Liu, Q. P. and Q. Z. Xue. 2005. Comparative studies on codon usage pattern of chloroplasts and their host nuclear genes in four plant species. J. Genet. 84: 55–62..
(15) 100. 台灣農業研究. Liu, Q., S. Dou, Z. Ji, and Q. Xue. 2005. Synonymous codon usage and gene function are strongly related in Oryza sativa. Biosystems 80:123–131. McVean, G. A. T. and B. Charlesworth. 2000. The effects of Hill-Robertson interference between weakly selected mutations on patterns of molecularly evolution and variation. Genetics 155:929–944. Moriyama, E. N. and J. R. Powell. 1998. Gnen length and codon usage bias in Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 26:3188–3193. Nakamura, Y and S. Tabata. 1997. Codon-anticodon assignment and detection of codon usage trends in seven microbial genomes. Microb. Comp. Genomics 2:299–312. Peden, J. F. 1999. Analysis of Codon Usage. PhD thesis. Dept. Genetics, Univ. Nottingham. 226 pp. Peixoto, L., A. Zavala, H. Romero, and H. Musto. 2003. The strength of translational selection for codon usage varies in the three replicons of Sinorhizobium melioti. Gene 320:109–116. Percudani, R., A. Pavesi, and S. Ottonello. 1997. Transfer RNA gene redundancy and translational selection in Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol. 268: 322–330. Romero, H., A. Zavala, and H. Musto. 2000. Codon usage in Chlamydia trachomatis is the result of strand-specific mutational biases and a complex pattern of selective forces. Nucleic Acids Res. 28:2084–2090. Romero, H., A. Zavala, H. Musto, and G. Bernardi. 2003. The influence of translational selection on codon usage in fishes from the family Cyprinidae. Gene 317:141–147. Salim, H. M. W. and A. R. O. Cavalcanti. 2008. Factors influencing codon usage bias in genomes. J. Braz. Chem. Soc. 19:257–262. Sharp, P. M. and W. H. Li. 1986. An evolutionary perspective on synonymous codon usage in unicellular organisms. J. Mol. Evol. 24:28–38.. 第 59 卷. 第2期. Sharp, P. M. and W. H. Li. 1987. The codon adaptation index-a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic Acids Res. 15:1281–1295. Sharp, P. M., M. Stenico, J. F. Peden, and A. T. Lloyd. 1993. Codon usage: mutational bias, translational selection, or both? Biochem. J. 21:835–841. Shi, X. F., J. F. Huang, C. R. Liang, S. Q. Liu, J. Xie, and C. Q. Liu. 2001. Is there a close relationship between synonymous codon bias and codon-anticodon binding strength in human genes? Chinese Sci. Bull. 12:1015–1019. Statsoft Inc. 2002. STATISTICA: The Small Book Chinese Version. USA. 144 pp. Stenström, C. M., H. Jin, L. L. Major, W. P. Tate, and L. A. Isaksson. 2001. Codon bias at the 3΄-side of the initiation codon is correlated with translation initiation efficiency in Escherichia coli. Gene 263:273–284. Sueoka, N. 1988. Directional mutation pressure and neutral molecular evolution. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:2653–2657. Tan, Q., K. Brusgaard, T. A. Kruse, E. Oakeley, B. Hemmings, H. Beck-Nielsen, L. Hansen, and M. Gaster. 2004. Correspondence analysis of microarray time-course data in case-control design. J. Biomed. Inform. 37:358–365. Tekaia, F., E. Yeramoan, and B. Dujon. 2002. Amino acid composition of genomes, lifestyles of organisms, and evolutionary trends: a global picture with correspondence analysis. Gene 297:51–60. Wei, M. L., Y. H. Chung, C. T. Lu, and H. Y. Lu. 2009. Synonymous condon usage bias in rice genes with resistance to bacterial blight (Xanthomonas oryza). J. Taiwan Agric. Res. 58:155–168. (in Chinese with English abstract) Wright, F. 1990. The 'effective number of codons' used in a gene. Gene. 87:23–29..
(16) Xa 基因密碼子使用之影響因素. 101. 附錄 1. 各種胺基酸之同義密碼子 Appendix 1. Synonymous codons of each amino acid Amino acid. Amino acid Codon. Name. Code. Proline. Pro. Amino acid Codon. Name. Code. Phenylalanine. Phe. UUU UUC. CCC. Leucine. Leu. UUA. CCA. UUG. CCG. CUU. Threonine. Thr. CUC. Isoleucine. Ile. CCU. ACU. Name. Code. Codon. Aspartic acid. Asp. GAU. Glutamic cid. Glu. GAA. GAC GAG Cysteine. Cys. ACC. UGU UGC. CUA. ACA. Tryptophan. Trp. UGG. CUG. ACG. Arginine. Arg. CGU. AUU. Alanine. Ala. AUC. GCU. CGC. GCC. CGA. AUA. GCA. CGG. Methionine. Met. AUG. GCG. AGA. Valine. Val. GUU. Tryptophan. Tyr. GUC GUA. UAC. Ser. UCU. AGC. GGU. CAU CAC. GGA. Glutamine. Gln. CAA. GGG. Asparagine. Asn. AAU. Lysine. Lys. AAA. CAG. UCG AGU. Gly. His. UCC UCA. AGG Glycine. Histidine. GUG Serine. UAU. AAC AAG. GGC.
(17) 102. 台灣農業研究. 第 59 卷. 第2期. Factors Influencing the Synonymous Codon Usage Bias in the Genes for Resistance to Bacterial Leaf Blight (Xanthomonas oryza pv. oryza) of Rice (Oryza sativa)1 Meng-Li Wei2, Yi-Han Chung2, Chun-Tang Lu2, and Hsiu-Ying Lu3,4 Abstract Wei, M. L., Y. H. Chung, C. Y. Lu, and H. Y. Lu. 2010. Factors influencing the synonymous codon usage bias in the genes for resistance to bacterial leaf blight (Xanthomonas oryza pv. oryza) of rice (Oryza sativa). J. Taiwan Agric. Res. 59:86–102.. Codon usage bias varied among genes (Xa) conferring resistance of rice (Oryza sativa) to bacterial leaf blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae. This study was conducted to elucidate the evolution of synonymous codon usage by analysis of factors influencing the synonymous codon usage pattern of Xa genes. A total of 17 coding domain sequences (CDS) of the completely sequenced genes, Xa1, xa5, xa13, Xa13, Xa21, Xa26, and Xa27, were obtained through the access of the GenBank database of National Center for Biotechnology Information (NCBI) and they were used to unravel the main factors influencing codon usage bias. The length of CDS and indices of synonymous condon usage bias such as relative synonymous codon usage (RSCU), codon adaption index (CAI), effective number of codons (ENC), frequency of G or C nucleotides present at the third position of synonymous codons (GC3), and mean frequencies of G or C nucleotides present at the first and second positions of synonymous codons (GC12) were estimated to examine relationships among them. The length of CDS and level of gene expression were highly correlated to codon usage bias in Xa genes; the Xa genes with shorter CDS (xa5, xa13, Xa13, and Xa27) had higher gene expression and higher codon usage bias. The GC3 compositional constraints also affected the codon usage in Xa genes. Moreover, the GC12 had a direct effect on GC3 mutation bias, leading to further high codon usage bias in Xa genes. Key words: Synonymous codon usage bias, Gene expression level, GC3 content, Mutation bias, Molecular evolution, Bacterial leaf blight, Xanthomonas oryzae.. 1. Contribution No.2400 from Taiwan Agricultural Research Institute (TARI), Council of Agriculture. Accepted: June 21, 2010. 2. Respectively, Assistant Researcher, Project Assistant, and Assistant Researcher, Crop Science Division, TARI, Wufeng, Taichung, Taiwan, ROC. 3. Secretary General, TARI, Wufeng, Taichung, Taiwan, ROC. 4. Corresponding author, e-mail: [email protected]; Fax: (04)23302801..
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