行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
硝酸鹽對生物除磷系統及其菌相結構之影響(2/2)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2211-E-002-065- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學環境工程學研究所 計畫主持人： 曾四恭 計畫參與人員： 莊雅雲 報告類型： 完整報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 10 月 27 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
硝酸鹽對生物除磷系統及其菌相結構之影響（2/2）
The influence of nitrate on enhanced biological phosphate
removal system and the microbial structure
計畫類別：個別型計畫
計畫編號：NSC 91－
2211－E－002－041
執行期間：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
計畫主持人：曾四恭 台灣大學環境工程學研究所
執行單位：國立台灣大學環境工程學研究所
中 華 民 國 九 十 二 年 十 月 二 十 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
硝酸鹽對生物除磷系統及其菌相結構之影響（2/2）
The influence of nitrate on enhanced biological phosphate removal
system and the microbial structure
計畫編號：NSC 91
-2211-E-002-065
執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主持人：曾四恭 台灣大學環境工程學研究所
計畫參與人員：莊雅雲 台灣大學環境工程學研究所
一、摘要 本研究進行硝酸鹽對生物除磷系統的影 響，本年度重點在於進行厭氧-無氧 SBR 脫硝 除磷菌的馴養，了解脫硝除磷菌對碳、氮、 磷之去除特性、PHAs 及醣原之變化特性，並 利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）與 16S rDNA 純系選殖（cloning）技術分析菌相變化，嘗 試解析除磷污泥菌相結構。 研究中之除磷反應槽為連續式批次反應 槽，以醋酸鹽為唯一碳源，在長期馴養下除 磷效果可達 90%以上。研究結果顯示，硝酸鹽 的添加會對除磷反應槽有立即影響，使厭氧 段污泥釋磷量降低，但卻有明顯脫硝現象， 顯示即使進流基質中從未添加硝酸鹽，除磷 效果良好的污泥中已有一定數量的脫硝菌存 在。以硝酸鹽持續馴養後，污泥釋磷攝磷現 象消失，應是外部碳源（醋酸鹽）持續不足 使菌體內部碳源（PHB、glycogen）儲存量不 足所致，提高基質碳源後污泥可恢復釋磷/攝 磷現象。 在菌相方面，硝酸鹽的添加會造成部份 菌群消失，使菌相較簡化，配合水質分析與 菌相分析結果顯示，同樣具有除磷效果的不 同反應槽，菌群僅有少部份相同且優勢菌種 皆不同； 16S-rDNA 分析結果顯示除磷污泥中 有 親 源 近 於 Nitrosococcus spp. 、 Azospirillum spp.、Rhodospirillum spp.、 Dechlorosoma spp.等菌群存在。 關鍵詞：硝酸鹽、磷酸鹽、厭氧-好氧 SBR、厭氧-無氧 SBR、脫硝除磷菌。 二、緣由與目的 造成生物除磷程序效能低落因素很多， 例如：大量降雨進入處理廠、進流碳源種類、 溫度、pH 值、硝酸鹽對厭氧段或好氧段之影 響。而硝酸鹽對 EBPR 厭氧槽或 SBR 厭氧段及 無 氧 段 之 影 響 ， 以 及 脫 硝 除 磷 菌 （Denitrfying phosphorus removing）於無 氧相（Kuba,1997）之除磷特性乃是目前研究 之重心；根據文獻回顧，目前探討進流廢水 含硝酸鹽對厭氧槽之影響時多採以批次實驗 之方式（Malnou et al., 1984；Hascoet and Florentz, 1985；Iwema and Meunier, 1985； Gerber et al.,1987；Comeau et al., 1986； Wentzel et al., 1989；Kern-Jespersen and Henze, 1993），而推測經含硝酸鹽之人工合 成廢水長期馴養下，EBPR 系統中之活性污泥 其釋磷行為及其菌相結構應與批次實驗結果 有所出入，其成果應較能解析實際 EBPR 污水 處理廠所遭遇的問題，如 A/O 處理系統，及 A2O 無氧槽中釋磷與攝磷的矛盾之處。 三、研究方法 （一） 實驗架構︰本研究為探討硝酸鹽對 生 物 除 磷 系 統 及 其 菌 相 結 構 之 影 響，首先需建立一除磷效果良好之反 應槽，收集其水質分析、污泥分析及 DGGE 圖譜等資料，同時嘗試純菌分 離、16S rDNA 純系選殖等方式以進一 步分析除磷菌相，之後進流硝酸鹽至 反應槽並收集各項分析資料進行比 較，實驗架構如圖一所示。
（二） 反應槽基質組成：本實驗中連續批次 式 反 應 槽 使 用 之 基 質 組 成 以 Smolders et al. 所 使 用 者 為 參 考 （Smolders et al., 1994），添加之 硝酸鹽是以硝酸鈉（NaNO3）配製。 （三） 反應槽構造：如圖二所示，反應槽主 體以透明壓克力製成，內徑 15cm、高 30cm，有效體積為 5.3L，操作體積 5L；設有電動攪拌器、氮氣及空氣進 氣裝置、進流及出流裝置、ORP 及 pH 連續監測及紀錄系統。每日 4 循環 （6hr/cycle），每循環細分為基質進 流 段 15 mins （ 進 流 速 率 167 ml/min）、厭氧段 2 hrs、好氧/無氧 段 3 hrs、沉澱段 0.5 hrs、上澄液 出流段 15 mins。 （四） 水質及污泥分析：以連續監測及自動 紀錄系統，進行水質 DO、ORP、pH 等 水質參數之監測紀錄，並分析 MLSS、
NH4-N、NO2-N/NO3-N、PO4-P、COD、HAc
（除 NO2-N/NO3-N 以 IC 分析，其餘參 照 standard method）。實驗之水質分 析 均 於 採 樣 後 立 即 以 針 筒 過 濾 頭 (0.22μm) 過濾後進行，以杜絕微生 物之影響。另亦分析污泥內 PHB、醣 原(glycogen)含量。 （五） 污 泥 菌 相 分 析 ： 以 Phenol- Chloroform 萃取法萃取污泥 DNA，配 合 PCR(引子序列見表一)、變性梯度 凝交電泳(DGGE)、16S rDNA cloning 及 DNA 定序分析污泥菌相 （六） 觀 察 初 始 硝 酸 鹽 影 響 及 系 統 穩 定 後，各系統（包括厭氧-好氧 SBR 及 好氧-無氧 SBR）中脫氮釋磷/攝磷之 特性。 （七） 實驗數據整理、分析及研討。 圖一：實驗架構圖 圖二、反應槽架構 表一：菌相分析使用之 PCR 引子序列 Use for Name Sequence (5’-3’)
gc341f CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG
DGGE- PCR 534r ATT ACC GCG GCT GCT GG 8f AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 16S rDNA PCR
1510r GGT TAC CTT GTT ACG ACT T M13f GTA AAA CGA CGG CCA G 16S rDNA
cloning
M13r CAG GAA ACA GCT ATG AC
馴養除磷效果 良好之污泥 厭氧-無氧 反應槽 純菌分離 16S rDNA 純系選殖 除磷試驗 菌種鑑定 進流硝酸鹽 0-30 小時 第二除磷反應槽 （保存除磷污泥） 進流硝酸鹽 50 天 進流硝酸鹽 並提升碳源 水質分析 污泥分析 DGGE 圖譜 DGGE DGGE 廢棄 污泥 圖 錯誤! 所指定的樣式的 PH ORP Pumping system 基質儲存槽 出流及排泥裝置 曝氣系統 (air or N2)
四、實驗結果 （一）無氧-好氧系統 無氧-好氧系統為一開始即進流硝酸 鹽，結果可發現污泥釋磷攝磷反應立即受影 響(圖三)，同時有明顯無氧脫硝及好氧硝化反 應(圖四)，但有亞硝酸鹽累積現象(圖五)，長 期馴養下醣原之生成消耗狀況與一般除磷反 應槽呈相反狀態(圖六)；若提升進流碳源量可 發現污泥釋磷攝磷反應逐漸回復(圖七)，污泥 醣原含量仍偏低但消長狀況逐漸趨向一般除 磷反應(圖八)即厭氧段醣原消耗，好氧段合成 醣原。 （二）厭氧-無氧系統 厭氧-無氧系統以添加 40mgN/L 的硝酸鹽 代替曝氣。圖九為碳源利用情形，原除磷反 應槽(厭氧-好氧系統)之 TOC 去除率達 97％， 厭氧-無氧系統為 70％，且主要為脫硝反應所 消耗。圖十顯示水中磷含量變化，其中厭氧-好氧系統磷去除率約 80％，厭氧-無氧系統中 無釋磷攝磷現象。圖十一為兩系統中醣原含 量變化圖，可發現厭氧-好氧系統在厭氧段利 用醣原，在好氧段合成醣原，而厭氧-無氧系 統中醣原含量極少幾近於零。 （三）菌相分析 圖十二為污泥菌相分析結果，由左至右 為未添加硝酸鹽之除磷污泥、添加硝酸鹽短 期、長期馴養及厭氧-無氧 SBR（以 A2 表示） 之污泥 DGGE 圖譜。一般除磷污泥中大致可分 為 A 至 I 共 9 菌群，其中較優勢者為 G 群； 添加硝酸鹽後第一循環（0-6 小時）菌相未改 變，添加硝酸鹽 24 小時後 I 菌群稍微增加， 在 E-F 間、J、K 等位置有新菌群出現，菌相 變得較為繁複；在添加硝酸鹽 10 天與 20 天 後菌相趨向單純化，優勢種為 A、C 與 E 菌群； 添加硝酸鹽 50 天後，菌相更為簡化，原除磷 污泥中之菌群僅剩 C 及 E 存在且為優勢菌， 在 M 位置有新菌群出現。而厭氧-無氧 SBR 中 之菌群為 K、M、N、C，其中 N 菌群較為優勢， 與原除磷污泥相同的僅有 C 菌群。經由 16S rDNA 序列比對發現菌群 C 親源接近於 Dechlorosoma，Dechlorosoma spp.為 2001 年定名之新菌屬（Achenbach et al. 2001）， 此類菌除了 O2外還可使用 ClO3-、ClO4-與 NO3 -做為電子接受者，使用硝酸鹽可轉變為氮 氣，Dechlorosoma spp. 與 Rhodocycles spp. 親源十分相近，目前已有數篇文獻提及 Rhodocycles spp.或 Rhodocycles-related 菌群在生物除磷系統中佔有極高比例（Bond et al., 1995；Hesselmann et al., 1999；
Crocetti et al., 2000）。菌群 E 則近似於
Nitrosococcus spp.，是一種氨氧化菌，可
將 NH3轉變為 NO3- (Black J. G., 1996) 。菌
群 F 親源與 Rhodospirillum spp.相近，此屬 菌為可在化學異營狀態下生長良好的紫色非 硫細菌（purple nonsulful bacteria）(Black J. G., 1996) 。 五、結果與討論 本研究主要目的在探討硝酸鹽對生物除 磷系統之影響，並利用 DGGE 與 16S rDNA 純 系選殖（cloning）技術分析菌相變化，並解 析除磷污泥菌相結構。實驗結果獲致結論如 下。 1. 硝酸鹽的添加會對除磷反應槽釋磷現 象有立即影響，但有明顯脫硝效果，顯 示即使進流基質中從未添加硝酸鹽，除 磷效果良好的污泥中已有一定數量的 脫硝菌存在，但較缺乏使用亞硝酸鹽為 電子接受者的能力。 2. 進流硝酸鹽持續馴養後，污泥釋磷攝磷 現象消失，應是外部碳源（醋酸鹽）持 續不足使菌體內部碳源（PHB、 glycogen）儲存量不足所致，提高基質 碳源後可回復。 3. 反應槽在添加硝酸鹽並提高碳源至 TKN/COD 值 0.1 左右時可保有完全除磷 能力。 4. 在菌相方面，硝酸鹽的添加會造成部份 菌群消失，使菌相較簡化，其中與 Dechlorosoma spp.（脫硝菌）、 Nitrosococcus spp.（硝化菌）親源相 近的菌群存在除磷污泥中，添加硝酸鹽 後成為優勢菌群。 5. 反應槽除磷效果受碳源量含量是否充 足影響大，即使污泥中有除磷菌存在但 在碳源不足時亦無法顯現除磷效果。 6. 近來許多文獻提及 Rhodocycles –related 菌群在除磷反應 槽中佔有很高比例，本研究的 16S rDNA 分析結果亦顯示除磷污泥中有多數 Rhodocycles -related 菌群存在。
圖三 無氧-好氧系統，進流硝酸鹽 30 小時內水 中磷酸鹽濃度變化 圖四 無氧-好氧系統，進流硝酸鹽 30 小時內水中 硝酸鹽濃度變化 圖五 無氧-好氧系統，進流硝酸鹽 30 小時內水中 亞硝酸鹽濃度變化 圖六 無氧-好氧系統，進流硝酸鹽 20 天污泥中 醣原含量變化 圖七 無氧-好氧系統，提升進流碳源量水中 磷酸鹽濃度變化 圖八 無氧-好氧系統，提升進流碳源量污泥 醣原含量變化 圖九 厭氧-無氧系統水中磷酸鹽濃度變化 圖十 厭氧-無氧系統水中有機碳濃度變化 P i 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 0 6 0 1 2 0 1 8 0 2 4 0 3 0 0 T im e ( m in ) mg -P/L N o N O 3 - + N O 3 - 0 - 6 h r + N O 3 - 6 -1 2 h r + N O 3 - 1 2 -1 8 h r + N O 3 - 1 8 - 2 4 h r + N O 3 - 2 4 -3 0 h r N O3 -0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 0 6 0 1 2 0 1 8 0 2 4 0 3 0 0 T im e (m in ) m g -N /L N o N O 3 - + N O 3 - 0 -6 h r + N O 3 - 6 -1 2 h r + N O 3 - 1 2 -1 8 h r + N O 3 - 1 8 -2 4 h r + N O 3 - 2 4 -3 0 h r N O2 -0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 0 6 0 1 2 0 1 80 2 4 0 3 0 0 T im e (m in ) mg -N /L N o N O 3 - + N O 3- 0 -6 h r + N O 3 - 6-12 h r + N O 3- 1 2 -1 8 hr + N O 3 - 18 -2 4 h r + N O 3- 2 4 -3 0 hr g ly c o g e n 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 0 6 0 1 2 0 1 8 0 2 4 0 3 0 0 T im e (m in ) mg /g M L S S N o N O 3 - + N O 3 - 1 0 d a y + N O 3 - 2 0 d ay P i 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 0 6 0 1 2 0 1 8 0 2 4 0 3 0 0 T im e (m in ) mg -P /L N o N O 3 - T O C = 1 5 0 m g /L + N O 3 - T O C = 1 5 0 m g /L + N O 3 - T O C = 2 2 5 m g /L + N O 3 - T O C = 3 0 0 m g /L g lyco g en 0 50 1 00 1 50 2 00 2 50 0 6 0 12 0 1 8 0 2 4 0 30 0 T im e (m in ) mg /g MLS S N o N O 3 - T O C = 1 50 m g /L + N O 3- T O C = 22 5 m g /L + N O 3 - T O C = 3 00 m g /L P i 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 1 8 0 2 1 0 2 4 0 2 7 0 3 0 0 Tim e (m i n ) mg -P /L N o N O 3 - + N O 3 - 1 2 5 m g -N 5 0 d a y + N O 3 - 2 5 0 m g -N 2 0 d a y + N O 3 - 2 5 0 m g -N 5 0 d a y TOC 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 60 120 180 240 300 Tim e(m in)
mg-C
/L
N o N O 3- +N O 3- 125m g-N 50day +N O 3- 250m g-N 20day
六、參考文獻
1. Liu WT, Mino T, Matsuo T, Nakamura K Biological phosphorus removal processes-effect of pH on anaerobic substrate
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8. Arun V, Mino T, Matsuo T Biological mechanisms of acetate uptake mediated by carbohydrate consumption in excess phosphorus removal systems. Water Res 22: 565-570(1988). 圖十一 厭氧-無氧系統污泥中醣原含量變化 圖十二 一般除磷污泥、添加硝酸鹽之無氧-好氧系統 及厭氧-無氧系統(以 A2 表示)污泥 DGGE 圖譜 glycogen 0 50 100 150 200 250 300 0 60 120 180 240 300 Time(min) mg /g M L S S
No NO3- +NO3- 125mg-N 50day
原除磷槽 加硝酸鹽 加硝酸鹽 加硝酸鹽 加硝酸鹽 加硝酸鹽 無硝酸鹽 0-6 小時 18-24 小時 10 天 20 天 50 天 A2 A B C D E F G H I K E C L M N O J
