多孔幾丁聚醣基質製備及以溶菌酶對其改質之探討

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

多孔幾丁聚醣基質製備及以溶菌

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對其改質之探討

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2214-E-002-035- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學化學工程學系暨研究所 計畫主持人： 謝學真 計畫參與人員： 苑乃義 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 92 年 11 月 29 日

多孔幾丁聚醣基質製備及以溶菌酶對其改質之探討

Fabrication of porous chitosan matrix and adjustment of matrix property by lysozyme

苑乃義、王大銘、謝學真* 國立台灣大學化工系 國科會計畫編號: NSC 91-2214-E-002-035

摘要:

幾丁聚醣為一良好的生醫材料，但是幾丁聚醣在生物體內降解較為緩慢。本研究將幾丁聚 醣製成多孔狀基質，以增加其降解反應的表面積，同時採用溶菌酶(lysozyme)增加幾丁聚醣降解 程度及速率，並探討溶菌酶以不同的添加方式降解基質，測定基質隨時間之重量改變、含水率 的變化與機械強度的變化。另以SEM 觀察基質的結構。結果顯示，隨降解時間增加，基質的重 量減少、機械強度變低、結構逐漸鬆散，但含水率無顯著的變化。由此可知溶菌酶具有降解幾 丁聚醣的效果，使其性質改變。在不同的溶菌酶添加方式中，幾丁聚醣的降解速率亦不同。因 此，可藉由溶菌酶添加量及添加方式的改變來控制幾丁聚醣的降解速率，以因應不同應用上的 需求。 關鍵字：幾丁聚醣(chitosan)、溶菌酶(lysozyme)、降解(degradation)

前言

幾丁聚醣(chitosan)，可由幾丁質(chitin)去乙醯化而得[1]。由於幾丁聚醣具有良好的生物特 性如生物相容性(biocompability)[2]、抗菌性(anti-bacterial action)[3]、可結晶性(crystallization)[4] 與生物可分解性(biodegradation)[5]。因此，廣為應用於生醫工程領域如藥物控制釋放(drug delivery)[6]、傷口敷料(wound healing)[7]等。 過去的研究中，幾丁聚醣在酸中會進行水解反應[8]，然而其降解速率緩慢，因此必須使用 酵素增加其降解速率。而生物體內的溶菌酶 (lysozyme) 是其中一種可分解幾丁聚醣的酵素。通 常使用的是雞蛋白溶菌酶 (Hen-egg white lysozyme)，分子量約在 14-15 kD 左右，其組成為單體 蛋白質( monomeric protein)。溶菌酶的分子內有四個雙硫鍵(disulfide bond)，等電點(pI 值)約為 10.5[9]。溶菌酶的催化反應主要在水解微生物細胞壁多醣類中的 β-(1→4)-glycosidic bond。酵素 活性位置與基質鍵結殘基是乙醯化葡萄胺(N-acetylglucosamine)，而被切斷的位置發生在含有乙 醯基之β-(1→4)-glycosidic linkage[10]。 另外，根據文獻的報導，以0.2mg/ ml 的溶菌酶在 pH 5.6 之微酸性溶液下，經過 50 分鐘反 應之後，約有 35%的幾丁聚醣被溶菌酶分解[11]。亦有學者將幾丁聚醣/丙烯酸的共聚物以溶菌 酶分解之，數天後可達30%~60%重量損失率[12]。

研究方法

幾丁聚醣基材的製備 先以0.2 M 醋酸水溶液溶解幾丁聚醣(去乙醯度為 85%以上)，其重量百分濃度為 4 %(w/w)。 將溶解之幾丁聚醣溶液以超音波振盪洗淨機(BRANSON 3210)及離心機(2000 rpm，60 min， KUBOTA 2100)去除氣泡。將去除氣泡之幾丁聚醣溶液 60 ml 倒入 15×15×0.9(cm3)的不銹鋼容器 中，置於低溫下待其結凍後，由容器中取出結凍之水-幾丁聚醣固體浸入低溫之鹼性溶液中使幾 丁聚醣沉澱及凝膠，之後將所得之幾丁聚醣基質浸入4 ℃PBS 溶液中保存。

溶菌酶-瓊脂糖微粒混幾丁聚醣基材的製備

首先將低凝膠溫度(low gel point)的瓊脂糖(agarose)配置成 40 mg/ml 溶液 5 ml。加入 Tween-20 1 g。將溶液恆溫於 35 ℃，緩緩加入溶菌酶 0.1 g 均勻攪拌。於定溫下攪拌 30 分鐘。將此溶液倒 入預熱至35 ℃的油(35 ml)中。停止恆溫加熱，冰浴維持攪拌，待瓊脂糖凝膠後離心、過濾將微 粒取出。將此微粒混入配置好的幾丁聚醣溶液中，如同上述之步驟製成多孔性基質。 直接混入溶菌酶-幾丁聚醣基材之製備 以0.2 M 醋酸水溶液溶解幾丁聚醣，其重量百分濃度為 4 %(w/w)，混入 0.1 g 溶菌酶，總重 量為60 g，之後離心去除氣泡，以前述之步驟，製成多孔性基質。 幾丁聚醣的降解 將4 cm×1 cm×2 mm 的基質浸泡於 70%酒精溶液中 30 分鐘，再浸泡於含抗生素溶液中 2 小 時，達成滅菌效果。泡入添加溶菌酶的0.05M PBS (0.05wt%、Tween80，pH7.4) 水溶液中，若 混有溶菌酶的基材則是直接泡入0.05M PBS，將上述之基材置於 37℃培養箱中，於固定時間點 (1h 至數天或更久) 取樣烘乾秤重。 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 幾丁聚醣基質先裁成 0.5cm×0.5cm ×2mm 大小，浸泡於純水清洗三次，之後於 4℃下逐次以 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精脫水，每次 15 分鐘。之後再進行臨界點乾燥、 鍍金，以掃描式電子顯微鏡觀察基材的孔洞分布、表面及截面性質。 孔隙度測量 先測量基材的各項數值如下所示，再利用下列公式計算孔隙度： % 100 % 100 (%) × × ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ − × = × − = A D W A D V V V porosity P M M P M ρ (1) 其中：VM為基材的總體積；VP為幾丁聚醣實際所佔的體積 ; D 為基材厚度；A 為基質面積； WM為基材的質量; ρp為緻密幾丁聚醣的密度。純幾丁聚醣的密度為1.342g/cm3 [21]。 機械強度測試

將溶菌酶降解後的基材，利用拉伸機 (tensile strength instrument) 於完全膨潤狀態下測定基

材的機械強度，所採用的拉伸速度10 mm/min。 基質含水率測定 將不同降解條件下的幾丁聚醣基材取出，輕拭基材表面後，以電子天秤稱量溼重，再將基 材烘乾稱得乾重，再利用下列公式計算膨潤度。 含水率(%)=(濕重—乾重)/濕重 (2)

結果與討論

由 Fig. 1 顯示在不同系統中幾丁聚醣基質的降解情況，在有溶菌酶相較於不含溶菌酶的系 統，溶菌酶確有降解幾丁聚醣基質的效果，且降解率可達 20%左右，之後似乎無法再提高降解 率。其原因可能是溶菌酶是對含乙醯基的β-(1→4)-glycosidic bond 去作用，而本研究所使用的幾 丁聚醣的乙醯化程度不高有關。由Fig. 2 與 Fig. 3 的結果可得，幾丁聚醣含水率和孔隙度隨降 解時間增加而略為增加。另外，綜合比較Fig. 1~3 可發現混入瓊脂糖微粒(PL)的基材降解較慢， 含水率較低，孔隙度亦下降，這些可能是因微粒的存在，進而改變基材的特性所致。在 Fig. 4 機械性質的測試中，在加有溶菌酶的降解系統(AL、ML、PL)，相較於不含溶菌酶的系統(control)， 其機械強度有著明顯的不同，外加溶菌酶的系統(AL)中，最大拉伸力下的應力值隨降解的時間 增加而下降的程度最多，而混入瓊脂糖微粒(PL)的基材則是在一開始的強度就較差，而直接混入 溶菌酶的基材(ML)則是有相同的情形。但未加溶菌酶的系統則是幾乎沒有變化，並且擁有最高 的應力值。 關於基質的結構變化，由 Fig. 5 電子掃描顯微鏡的觀察，經過溶菌酶降解後的幾丁聚醣基

材，表面((a) ～(d))與底面((e)～(h))的結構被破壞，多出一些孔洞，而由截面的圖((i)～(l))，可 以發現孔洞的壁上多出許多小洞，結構變的比較鬆散，推測應是被降解的緣故。由重量損失結 果可得，在不同的溶菌酶加入方式，會有不同的降解效果，直接混入的作用於初期最快，而微 粒包覆法則是由於多了瓊脂糖的質傳阻力，因此初期作用較小。但長時間都可達20%的降解率， 因此，可藉由溶菌酶添加方式的改變來調整幾丁聚醣基材的降解速率，以因應各種應用上的需 求。

參考文獻

1. Goosen M. Applications of chitin and chitosan, Technomic Publishing., Lancaster (1997).

2. Yannas IV, B J, ”Design of an artificial skin. .ⅠBasic design principle,” J. Biomed. Mater. Res., 14, 65 (1980).

3. Hu S G, Jou C H, Yang M C, “Surface grafting of polyester fiber with chitosan and the antibacterial activity of pathogenic bacteria,” J. Appl. Polym. Sci., 86, 2977 (2002).

4. Robert Joel Samuels, “Solid state characterization of the structure of chitosan films,” J. Polym. Sci., 19, 1081 (1981).

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6. Bernkop Schnurch A, Kast C E, “Chemically modified chitosans as enzyme inhibitors,” Adv. Drug.

Deliv. Rev., 52, 127 (2001).

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9. Osserman E F, Canfield R E, and Beychok S, Lysozyme, Academic Press, USA (1974).

10. Pangburn S H, Trescony P V, Heller J, “Lysozyme degradation of partially deacetylated chitin, its films and hydrogels,” Biomaterials, 3, 105 (1982).

11. Quong D, Yeo J N, Neufeld R J, “Stability of chitosan and poly-L-lysine membranes coating DNA-alginate beads when exposed to hydrolytic enzymes,” J. Microencapsul., 16, 73 (1999). 12. Izume M, Nagae S, Kawagishi H, Mitsutomi M, Ohtakata A, “Action pattern of bacillus Sp

No-7-M Chitosanase on Partially N-Acetylated chitosan,” Biosci. Biotech. Bioch., 56, 448 (1992).

Time (Day) 0 1 2 4 10 20 30 Perce n t We ig ht Remai n ing (%) 60 70 80 90 100 AL ML PL control

Fig. 1 Time course of degradation of chitosan matrices

by lysozyme. (mean±SD, n 4). AL: lysozyme added in ≧ PBS; ML: lysozyme dispersed in matrices; PL: lysozyme embedded in agarose particles; control: no lysozyme used.

Time (Day) 0 1 2 4 10 20 30 W a ter c o n ten t (% ) 0 20 40 60 80 100 AL ML PL control

Fig. 2 Time course of water content of chitosan matrices.

(mean±SD, n 4). AL: lysozyme added in PBS; ML: ≧

lysozyme dispersed in matrices; PL: lysozyme embedded in agarose particles; control: no lysozyme used.

Bottom Surface

(c)

(b)

(d)

(g)

(f)

(h)

(k)

(j) (l)

Cross- section

(i)

(e)

(a)

Time (Day) 0 1 2 4 10 20 30 Porosity 0.80 0.84 0.88 0.92 0.96 AL ML PL control

Fig. 3 Time course of porosity of chitosan matrices.

(mean±SD, n 4). AL: lysozyme added in PBS; ML: ≧

lysozyme dispersed in matrices; PL: lysozyme embedded in agarose particles; control: no lysozyme used.

Time (Day) 0 1 2 4 10 20 30 Stres s of m a x. load (MPa) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 AL ML PL control

Fig. 4 Mechanical strength of chitosan matrices. (mean

±SD, n 4). AL: lysoz≧ yme added in PBS; ML: lysozyme dispersed in matrices; PL: lysozyme embedded in agarose particles; control: no lysozyme used.

Degradation time (day)

1 2 10 30