行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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※ 利用雷射鑷夾技術量測細胞分裂力之研究
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計畫類別：□個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號：NSC89－2215－E－009－110－
執行期間：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
計畫主持人：徐 琅
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位： 國立交通大學電子物理系
中
華
民
國
90 年
10 月 31 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
國科會專題研究計畫成果報告撰寫格式說明
Pr epar ation of NSC Pr oject Repor ts
計畫編號：NSC 89-2215-E-009-110
執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
主持人：徐琅
E-mail：
c2654@ms19.hinet.net
執行機構及單位名稱：交通大學電子物理系
計畫參與人員：張博睿
E-mail：bojui.ep88g@nctu.edu.tw
執行機構及單位名稱：交通大學光電工程研究所
計畫參與人員：陳嘉齡
E-mail：jailing.ep89g@nctu.edu.tw
執行機構及單位名稱：交通大學電子物理系
計畫參與人員：張玉姍
E-mail：ysc.ep89g@nctu.edu.tw
執行機構及單位名稱：交通大學電子物理系
說明：在本計劃「利用雷射鑷夾技術量測細胞分裂力之研究」中，由於我們欠缺生
物細胞培養設備，而且對細胞分裂的操控不熟練，因此無法進行細胞分裂力之量測。然
而我們在研究雷射鑷夾的過程中發現，若我們改變雷射光聚焦的焦點大小，則雷射鑷夾
可以從過去只能捕捉及操控單一微粒子，變成可以捕捉一群微粒子。在經由與生物系的
專家討論之後，我們認為這樣一個可捕捉一群微粒子的雷射鑷夾系統，可運用在生物醫
學的樣品篩選上，對於生物醫學上的樣品處理將有很大的貢獻。因此本計劃我們研究目
標改成「生物醫學樣品篩選的新利器：準焦與散焦雷射鑷夾」。
摘要 在過去，雷射鑷夾一直被廣泛應用在捕捉及搬 運單一個微粒子或微生物體。現在，我們已完成一 套散焦雷射鑷夾，可用於提高樣品溶液的局部濃 度，以及篩選微粒子的大小。如果成功，這對生物 醫學上的樣品處理將有很大貢獻。本文即在介紹散 焦雷射鑷夾的特色與應用，並展示其實際功能。 關鍵詞：雷射鑷夾、濃縮及篩選、準焦與散焦。 Abstr actIn the past, optical tweezers have been widely used in the capture, move, and manipulation of a single micro particle at a time. Here, we have accomplished an off-focus optical tweezers system, which is capable of sample concentrate and sample sifting. If this work, it will contribute a great advantage in sample prepare in biology and medicine science. This thesis will introduce the character and application of off-focus optical tweezers, and demonstrate its function in practice
Keywor ds: Optical tweezers、Concentration and Sift、Off-focus and In-focus.
介紹 由於雷射鑷夾能捕捉到的微粒子大小約在 nm ∼µm 的數量級，恰好與生物學中微小物的尺度相 符，因此在雷射鑷夾誕生以後，立即被大量應用在 生物學的研究上。藉著其可被量化的特性，量測出 許多生物學中微小的力：例如肌動蛋白運動的作用 力1,2,3、細胞與細胞間的作用力大小、精子的運動
情形4、DNA 分子的彈性係數5、RNA polymerase
的轉錄行為6,7等等；這些基礎的研究在世界各地已 被陸陸續續地發表出來。
在研究雷射鑷夾的過程中，我們發現
雷射鑷夾不只可以操控一個微小粒子，有
時甚至會同時捕捉到數個微小的粒子。這
樣的現象引發了我們的興趣，也因此我們
開始研究如何能捕捉到更多的微小粒子。
若能充分利用雷射鑷夾同時捕捉一大群微
小粒子的功能，也許可以設計一個裝置，
應用在生物醫學樣品的濃縮及篩選上。
雷射鑷夾之捕捉機制 雷射鑷夾的基本概念是將一道雷射光束經顯 微物鏡聚焦後，在雷射聚焦處形成一穩定的位能 井。於是，在此焦點周圍的微粒子就會被吸引到焦 點，而達到捕捉與操控的目的。 如圖一所示，我們利用簡單的幾何光學與動量 變化產生力的概念就可以闡釋雷射鑷夾的捕捉機 制。當光線由一介質中進入到另一不同介質中時， 光會發生偏折的現象，也就是所謂的折射。如果我 們將光線想像成由光子所組成，當光線發生偏折 時，光子的動量即產生改變，而動量改變即反應有 作用力的存在。所以當雷射光線經過透明小珠子 （Bead）後發生偏折，此光線偏折力係由透明小珠 子提供，也就是說透明小珠子對雷射光子施一作用 力使之偏折。又由牛頓第三運動定律所描述之作用 力與反作用力的關係知道，雷射光子亦對透明小珠 子施一反作用力，而這些反作用力的合力便是雷射 鑷夾的捕捉力。 因此，一道平行的雷射光束，經過顯微物鏡聚 焦後，若有微小的透明物體在其焦點附近時，由於 左右偏折對稱的關係，其合力指向焦點，就會產生 一個類似彈簧力的恢復力，將這個微小物體往焦點 拉，並在焦點的位置達到力平衡。這樣的一個現 象，就像是用一個鑷夾去夾住物體，故琛為雷射鑷 夾 。 以 上 所 述 就 是 雷 射 鑷 夾 的 幾何光學模型 8
（Pseudo Ray Optics Model，或稱為 Ray Optics Approximation）。 雷射鑷夾之準焦操作與散焦操作9 準焦與散焦雷射鑷夾是依其操作方式所命 名。由於雷射鑷夾捕捉微小粒子的位置主要是在平 行雷射光束經過物鏡後聚焦的焦點附近，因此過去 對於雷射鑷夾最簡單的設計便是將雷射光束聚焦 在所要捕捉的微小粒子的樣品平面上。然而，如果 讓雷射光的焦點與樣品平面有些微的偏差，使得樣 品平面的光點面積變大成為一個大光圈，將可以捕 捉到更多的微小粒子。如圖二所示，在此我們定義 準焦與散焦雷射鑷夾如下： 定義 ： 1.準焦(In-Focus)雷射鑷夾：雷射光焦點與樣品 平面共平面。 2.散焦(Off-Focus)雷射鑷夾：雷射光焦點與樣品 平面不共平面。 由於雷射鑷夾的作用力與光強度成正比，因此 我們推論散焦雷射鑷夾的抓力應比準焦雷射鑷夾 弱。但有趣的是，由於散焦的關係，雷射光束在樣 品平面上分布的範圍比較大，能吸引的微粒子也越 多，即散焦雷射鑷夾的捕捉範圍較大。因此從捕捉 效率而言，散焦雷射鑷夾會比準焦雷射鑷夾用在增 加微粒子濃度還來得適合。 實驗裝置9 雷射鑷夾基本上是由一雷射光源、反射鏡與透 圖二. 利用聚焦鏡調變準焦或散焦操作模式 (a) 準焦雷射鑷夾：在樣品平面捕捉範圍較小 (b) 散焦雷射鑷夾：在樣品平面捕捉範圍較大 樣品平面 雷射光入射 樣品平面 (b) 聚焦鏡 (Focusi ng lens) 雷射 光入 射 物 鏡 x f (a) 物 鏡 > x f 物 鏡 物鏡 (Focu sing lens) 物鏡 (Focu sing lens) 聚焦鏡 (Focusi ng lens) 雷射光入射 光子動量變化作用 力 光子動量變化作用力 圖一. 雷射鑷夾捕捉微粒的工作機制 雷射 光束 顯微物鏡 微粒子 (透明小珠子) 雷射光焦點 反作用力 反作用力 合力
鏡所組成，如圖三雷射鑷夾裝置圖所示。其準焦與 散焦操作情形如下分述兩點。 1. 準焦雷射鑷夾： 本文之雷射鑷夾裝置，其準焦操作情形 如圖四。利用Lens1、Lens2、與聚焦鏡的配 合，使雷射光束聚焦在樣品平面上，並且可 以藉由M1的調整在樣品平面上移動雷射光焦 點。 2.散焦雷射鑷夾： 在散焦雷射鑷夾的操作中，將聚焦鏡拿 掉，使雷射光束會先在物鏡焦點聚焦，在到達 樣品平面時散為一光圈，成為一散焦雷射鑷夾 系統，如圖五所示。 準焦與散焦雷射鑷夾橫向力之比較 我們直接引用電磁波模型 10的結果作為理論 分析基礎。雷射鑷夾橫向的捕捉力為： ) ( ) ~ 2 ( 1 ) ( / ~ 2 2 1 2 ˆ ) ~ 2 ( 1 ) ~ ~ ( 2 exp ) ~ 2 ( 1 1 ) ( 2 ) ~ 2 ( 1 ) ( / ~ 2 2 1 2 ˆ ) ( 2 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 , r I z z w y n n c a n y z y x z z w P z z w y n n c a n y y grad + + − − = + + − + + + − − = π π π r F 其中
r
為樣品平面上距原點的距離， 1n
為微粒子 的折射率， 2n
為微粒子所在介質折射率， 2 1/
n
n
n
=
，a為微粒子直徑，c為光速，w
(
z
)
為 雷射光點半徑(Spot Size)， 2 2 0 0 1 ( / ) ) (z w z w w = + λ π ，w
0為雷射光腰半徑 (Beam Waist)，x
~
、~
y
和~
z
則為正規化座標 （Normalized spatial coordinates）：)) ( / ), ( / ), ( / ( ) ~ , ~ , ~ ( 2 z kw z z w y z w x z y x = ，k為光波的 波數，
P
為雷射功率，I
(
r
)
雷射光強度在樣品平 面上的分布， 若把式中的n
2、n，a、 c、w
(
z
)
、k、P、z
~
等數 值代入， Fgrad,y主要與y及I(r)有關，也就是可以 把(1)式看成：)
(
.
)
(
,yConst
y
I
r
grad=
−
×
×
r
r
F
圖六為一個100X物鏡下，直徑為1 ìm的微粒 子(polystyrene Bead)，在雷射功率為100 mW下的準 雙色 分光鏡 圖三. 雷射鑷夾裝置圖 目鏡 顯微鏡光源 影像輸出(CCD Camera) 雷射光源 可移動樣品平臺 y z 聚焦鏡 (Focusin g Lens) Lens2 Lens1 L1 L L2 M1 物鏡 圖四. 準焦雷射鑷夾 裝置圖 雷 射 光 束 物鏡 6mmL
f z y 聚焦鏡 160mm f Lens1 Lens2 L2 L M1 L1 f1 f2 樣品平面 ) ( 2 / 2 2 2 ) ( 2 ) (e
r w z z w P r I = − π (2) (1) 圖五. 散焦雷射鑷夾裝置圖 Lf 聚焦鏡 Lens3 Lens4 L2 L M1 L1 物鏡 6mm 樣品平面 散焦雷射光線 準焦雷射光線 z y 雷 射 光 束焦雷射鑷夾的橫向力 Fy分布，本圖呈現一以原點 為對稱中心的圖形。在原點附近某範圍內，當 I(r) 的指數衰減還不劇烈，可視為常數時，(2)式就類似 於一彈簧恢復力的作用力方程式，因此，在圖五原 點附近某範圍內也就如一彈簧恢復力的線性作用 情形。當超過某範圍 後，I(r)的指數衰減劇烈，已 不能視為一常數時，圖六就如指數衰減的情形。 另外，在圖中，當y為正值時，Fy為負值；代 表的是當微粒子在正y方向時，橫向力Fy是把它拉 回光束中心。此時為一負 y 方向的力，橫向力 Fy 為負值。反之，當微粒子在負 y 方向時，橫向力 Fy也要把它拉回光束中心，此時即為一正 y 方向的 力，橫向力Fy為正值。而當微粒子在光束中心時， 即y= 0，橫向力Fy消失，微粒子不受力，所以光束 中心是力平衡的捕捉中心。 圖七為100X物鏡下，準焦與散焦雷射鑷夾的 圖七為 100X物鏡下，準焦與散焦雷射鑷夾的 橫向力分布。我們可以發現在相同物鏡下，散焦的 橫向力的大小比準焦的橫向力小的多，而散焦的橫 向力的分布卻比準焦大許多。圖七畫有主副兩圖， 主圖為準焦的橫向力分佈，副圖為散焦的橫向力分 佈。 準焦與散焦雷射鑷夾的功能比較 我們設計一個可同時比較準焦與散焦雷射鑷 夾的捕捉範圍與捕捉力大小的實驗9。 如圖八所示，改裝原有顯微鏡的樣品平台成為 一個可精密控制的移動平台，接著等速移動平台， 製作出水溶液與懸浮微粒子等速移動的效果。當雷 射鑷夾啟動時，被捕捉的微粒子不再隨水溶液流 動，兩者之間產生相對速度，微粒子因而受到一個 與流速方向相同的黏滯力（Dragging Force）。此 黏滯力的大小與相對速度成正比，方向與捕捉力相 反，會降低雷射鑷夾的捕捉成效，並縮小捕捉範圍。 如圖六所示，雷射鑷夾的橫向捕捉力在原點附 近某範圍內為類似彈簧恢復力的作用方式，在此範 圍之外則會隨距離而衰減。因此當平台拖曳速度 v= 0時，某些微粒子受雷射鑷夾捕捉力作用而聚集 成一圓面積，如圖八(2)所示。接著再以v> 0的速度 等速移動平台，如圖八(3)所示，使得微粒子於平台 移動方向受一黏滯力作用，此黏滯力會隨平台拖曳 速度增加而變大。因為雷射鑷夾的捕捉力並不會隨 平台拖曳速度而改變，所以在被捕捉範圍內，捕捉 力小於水流黏滯力處的微粒子很容易脫離捕捉範 圍，使得雷射鑷夾可捕捉的範圍變小。 由於準焦雷射鑷夾在樣品平面上的光點面積 小，捕捉範圍小，捕捉力量大；而散焦雷射鑷夾在 樣品平面上的光圈面積大，捕捉範圍大，捕捉力量 小。因此，推測在樣品流速較低，水溶液黏滯力作 用較小時，雷射鑷夾捕捉範圍仍由光焦點截面積大 小所決定，所以散焦雷射鑷夾的捕捉範圍會比準焦 雷射鑷夾的捕捉範圍大。但在樣品流速較高，水溶 液黏滯力作用較大，此黏滯力大小足以影響其捕捉 範圍時，主宰雷射鑷夾捕捉範圍的關鍵不再是光焦 點截面積大小，而是雷射鑷夾的橫向捕捉力。捕捉 力越大，才能捉住微粒子不使其脫離捕捉範圍，故 此時準焦雷射鑷夾可捕捉的範圍較散焦雷射鑷夾 可捕捉的範圍大。 圖六. 100X物鏡之下準焦的橫向力 圖七. 100X物鏡下，準焦與散焦雷射鑷夾 的橫向力分布 散焦 準焦
圖九是一系列在雷射功率為100mW、物鏡放大 率為40X，雷射鑷夾為散焦操作下的圖片。發現當 樣品流速增加時，捕捉的範圍慢慢地減少。圖十是 一系列在雷射功率為100mW、物鏡放大率為40X， 雷射鑷夾為準焦操作下的圖片。比較圖九及圖十發 現(注意圖九（1）、九（5）及圖十（1）、十（5） 的箭號)，在散焦操作下，雷射鑷夾在樣品速度小 時可以捕捉到較多微粒子，但速度增大後，就無法 捕捉到那麼多。相反的，在準焦操作下，雖然一開 始在樣品速度小時捕捉的微粒子較少，但當樣品速 度增大後，仍能捕捉到幾個微粒子。 (1)v= 0 nm/sec (2)v= 600 nm/sec (3)v= 1500 nm/sec (4)v= 3000 nm/sec (5)v= 4500nm/sec (6)v= 9000nm/sec (1)v= 0 nm/sec (2)v= 600 nm/sec (3)v= 4500 nm/sec (4)v= 9000 nm/sec (5)v= 12000 nm/sec (6)v= 15000 nm/sec 雷射鑷夾可捕捉 到的範圍 (2) 微粒子因雷射鑷夾捕捉而聚集 (平台拖曳速度v = 0 ) (b) R1 雷射 (1) 微粒子均勻散佈 ( R2<R1 ) (3) 平台以等速度v拖曳，捕捉範圍變小 圖八. 實驗方法：量測在不同速度v下， 捕捉範圍的大小(R) 雷射捕捉力方向 以速度v拖曳平台 R2 雷射 黏滯力方向 圖九. 散焦雷射鑷夾在不同的樣品流速下 的捕捉情形，物鏡倍率為40X，雷射功率 為100mW。 圖十. 散焦雷射鑷夾在不同的樣品流速下 的捕捉情形，物鏡倍率為40X，雷射功率 為100mW。
40X 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 Velocity(um/sec) Trapping Range(um) In(2um) Off(5um) 圖十一. 物鏡倍率為40X時，準焦與散焦雷射鑷 夾的捕捉範圍與樣品流動速度的關係。 右上角的圖例 In 代表的是準焦雷射鑷 夾，Off 代表的是散焦雷射鑷夾。括弧 內的數字代表的是雷射光點的直徑。 接著再利用 Labview 軟體分析捕捉範圍的大 小。在雷射功率為 100mW之下，圖十表示物鏡倍 率為40X時，準焦與散焦雷射鑷夾的捕捉範圍與樣 品流動速度的關係。 散焦雷射鑷夾在生物樣品局部濃度控制的應用8 因為散焦雷射鑷夾在樣品平面捕捉力較小，但 捕捉範圍較大，且在樣品平面並沒有強烈的聚焦， 較不會對樣品造成傷害。所以，我們認為可以利用 散焦雷射鑷夾做一個裝置，用來濃縮生物檢測上樣 品的濃度。設計概念如圖十二。 濃縮樣品的原理是讓欲檢測的溶液樣本流過 一具有微小的通道的裝置。在此通道中加入散焦雷 射鑷夾，使得欲觀察的東西如微生物或細菌等等能 被雷射鑷夾抓住，而在通道中累積，達到濃度增加 的效果。 由於雷射鑷夾的捕捉還是有一定的範圍，因此 必須設計微小通道的寬度，以及將來要通過此一微 小通道的流速，以提高捕捉的效率。 結論 雷射鑷夾自 1970 年發明以來，在生物科技上 的應用已是越來越多。在國外，雷射鑷夾早已被廣 泛應用在生物科技研究上，然而在國內卻仍未見許 多研究發表。近來生物醫學與理工學科的跨領域整 合漸漸地大放異彩。在未來的研究中，我們希望繼 續開創雷射鑷夾在生物科技領域的應用，例如即時 (Real Time)量測力的系統、本文所提之濃縮樣品濃 度裝置、以及微粒子的篩選等等。冀望藉由這樣跨 領域的接觸與合作模式，能刺激國內光電或半導體 與生物科技的整合，創造出更多的新點子與新發 明，提升國內生物科技的技術發展，對全人類的生 活福祉有一貢獻。 參考資料
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micromanipulation of human sperm in three 圖十二. 利用散焦雷射鑷夾濃縮檢測樣品的設計概念圖
水溶液流出
微小通道 水溶液流入
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