阿拉比卡咖啡試管內播種及癒傷組織之誘導

全文

(1)國立高雄大學生生命科學系碩士班碩士論文. 阿拉比卡咖啡試管內播種及癒傷組織之誘導. In vitro germination and callus induction of Coffee arabica L.. 研究生：林孟澤撰指導教授：陳彥澄博士. 中華民國 103 年 7 月.

(2) 謝誌非常感謝指導教授陳彥澄博士，於修業期間的細心教導與關心，讓我得以順利進入植物組培的領域當中，且獲益匪淺，在此至上最誠摯的謝意。感謝口試委員張學偉博士與黃斌博士，對於本論文提供寶貴的意見與指正，讓我得以順利完成論文。謝謝修業期間系上楊佳寧及其他老師的指導。謝謝芳儒、政杰、芷婷、舒凱及憶潔在實驗室的陪伴與幫助。謝謝系辦美純姊與劉先生在各種事務上的協助。謝謝所有高大的學長姊、同學及學弟妹們，伴我順利完成學業。感謝女朋友的默默支持，在工作之餘，寧可打瞌睡也要在夜裡陪我做實驗。. 國立高雄大學生命科學系碩士班學生林孟澤謹誌 2014 年 07 月 I.

(3) 縮寫表 NAA. α-Naphthaleneacetic acid. 24-D. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid. BA. N6-benzyladenine. TDZ. Thidiazuron. II.

(4) 目錄頁次謝誌 ....................................................................................................................I 縮寫表 .............................................................................................................. II 目錄 ................................................................................................................. III 表目錄 .............................................................................................................. V 圖目錄 .............................................................................................................VI 中文摘要 ........................................................................................................... 1 英文摘要 ........................................................................................................... 3 第一章前言 ..................................................................................................... 5 1.1. 咖啡之植物學特性................................................................................. 5. 1.2. 咖啡之商業及藥用價值......................................................................... 5. 1.3. 阿拉比卡咖啡之簡介............................................................................. 6. 1.4. 植物組織培養技術................................................................................. 7. 1.5. 咖啡組織培養之前人研究 .................................................................... 8. 1.6. 研究目的................................................................................................. 9. 第二章材料與方法 ....................................................................................... 10 2.1. 實驗材料............................................................................................... 10. III.

(5) 2.2. 基礎培養基植....................................................................................... 10. 2.3. 物生長調節劑....................................................................................... 10. 2.4. 阿拉比卡咖啡種子萌芽試驗 .............................................................. 10. 2.5. 阿拉比卡咖啡癒傷組織之誘導 .......................................................... 10. 2.6. 阿拉比卡咖啡癒傷組織之增殖試驗 .................................................. 11. 2.7. 統計方式............................................................................................... 11. 第三章結果 ................................................................................................... 12 3.1. 阿拉比卡咖啡種子萌芽試驗 .............................................................. 12. 3.2. 阿拉比卡咖啡癒傷組織之誘導 .......................................................... 12. 3.2.1. NAA 搭配 BA 之癒傷組織誘導 ................................................................ 12. 3.2.2. 2,4-D 搭配 TDZ 之癒傷組織誘導 ............................................................ 13. 3.2.3. 不定根之形成 .................................................................................................. 14. 3.3. 阿拉比卡咖啡癒傷組織增殖試驗 ...................................................... 14. 第四章討論 ................................................................................................... 35 第五章參考文獻 ........................................................................................... 39. IV.

(6) 表目錄頁次表 3.1 阿拉比卡咖啡種子萌芽率 ............................................................... 18 表 3.2 NAA 搭配 BA 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導率 ................. 23 表 3.3 2,4-D 搭配 TDZ 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導率 .............. 28 表 3.4 NAA 及 BA 處理之阿拉比卡咖啡葉培植體不定根誘導率 ......... 31 表 3.5 NAA 及 BA 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織增值率與形態 ......... 32 表 3.6 2,4-D 及 TDZ 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織增值率與形態 ...... 33. V.

(7) 圖目錄頁次圖 3.1 阿拉比卡咖啡種子萌芽情形 ........................................................... 17 圖 3.2 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導 ............. 19 圖 3.3 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導 ............. 20 圖 3.4 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導 ............. 21 圖 3.5 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導 ............. 22 圖 3.6 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導 .......... 24 圖 3.7 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導 .......... 25 圖 3.8 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導 .......... 26 圖 3.9 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導 .......... 27 圖 3.10 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植不定根之誘導 ................... 29 圖 3.11 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植不定根之誘導 ................... 30 圖 3.12 阿拉比卡咖啡癒傷組織形態與增生能力..................................... 34. VI.

(8) 阿拉比卡咖啡試管內播種及癒傷組織之誘導指導教授：陳彥澄博士國立高雄大學生命科學系學生：林孟澤國立高雄大學生命科學系碩士班摘要本論文建立阿拉比卡咖啡癒傷組織之誘導系統，首先測試種子無菌萌芽之培養條件，並藉以獲取足量之實生苗供後續試驗。切取阿拉比卡咖啡實生苗的根及葉為培植體，置於含不同種類及濃度植物生長調節劑的 Murashige and Skoog（MS）培養基，以全暗培養進行癒傷組織之誘導，將誘導所得之癒傷組織進行繼代增殖，及試管內形態發生試驗。種子萌芽試驗結果顯示，以濃度 0.5%之次氯酸鈉消毒 10 分鐘，可獲得最高萌芽比率（63.16%）。切取萌芽十二週實生苗之根及葉做為培植體，以不同植物生長調節劑（plant growth regulators，PGRs），包括植物生長素 α-naphthaleneacetic acid（NAA）或 2,4-dichlorophenoxyacetic acid （ 2,4-D ）與細胞分裂素 thidiazuron （ TDZ ）或 N6-benzyladenine（BA），搭配進行癒傷組織誘導試驗。癒傷組織誘導試驗結果顯示，根及葉培植體在不含 PGR 的控制組中，無法誘導出癒傷組織。然而，其餘各試驗組皆可成功誘導出癒傷組織，共獲得二十八個品系癒傷組織，這些癒傷組織可穩定生長，並以相同條件的培養基持續進行繼代，經持續觀察得知，各品系癒傷組織之外觀、顏色、形態及結構有所差異。癒傷組織增殖率試驗及形態分析結果顯示，可將癒傷組織分為四種：第一種為結構緊密、觸感堅硬之黃色癒傷組織，生長速度最快；第二種為. 1.

(9) 蓬鬆顆粒狀且觸感略硬之淡黃色且透白的癒傷組織，生長速度次之；第三種為結構鬆散、觸感軟綿之白色半透明狀癒傷組織，生長速度稍慢；第四種為形態軟爛之紅褐色癒傷組織，生長速度緩慢。本論文成功建立了阿拉比卡咖啡的癒傷組織誘導及增殖系統，建議未來可以選擇本論文所篩選出之生長快速、質地緊密及外觀顏色呈淡黃色或白色之癒傷組織，進一步建立完整的植株再生體系。. 關鍵字：阿拉比卡咖啡、植物生長素、細胞分裂素、癒傷組織、形態發生. 2.

(10) In vitro germination and callus induction of Coffee arabica L. Advisor : Dr. Chen, Jen-Tsung Department of Life Sciences National University of Kaohsiung Student : Lin, Meng-Ze Department of Life Sciences National University of Kaohsiung. ABSTRACT. The thesis attempts to establish a protocol for callus induction of Coffee arabica L. Firstly, the seeds were sown in in vitro conditions and seedlings obtained were used as donor plants for the subsequent tests. The explants were taken from these donor plants and placed on a modified Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with combinations of plant growth regulators (PGRs) in the dark. The calli were proliferated more on the same medium, and their capacities of in vitro morphogenesis were subsequently evaluated. In the seeds germination experiment, 10 min sterilization time with 0.5% sodium hypochlorite gave the highest germination rate (63.16%). The root and leaf explants were taken from 12-week-old seedings and placed on a modified MS medium supplemented with combinations of auxins, ( α-naphthaleneacetic acid : NAA or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid : 2,4-D) and cytokinins (thidiazuron : TDZ or N6-benzyladenine : BA). In the control treatment, no response was found at all the explants.. 3.

(11) In contrast, 28 callus lines were obtained from other treatments. These calli could be subcultured on same medium and proliferated more with viable growth. Based on the proliferation rate and their morphology, the callus were classified into 4 types : 1) Yellowish compact callus with a highest proliferation rate; 2) Pale yellowish granular callus with high proliferation rate; 3) Translucent to whitish and friable callus with low proliferation rate; 4) Red to brown callus with lowest proliferation rate. Type 1 callus lines were suggested for inducing in vitro morphogenesis and subsequent plant regeneration.. Keywords : Coffee arabica L., auxin, cytokinin, callus, morphogenesis. 4.

(12) 第一章. 前言. 1.1 咖啡之植物學特性咖啡（Coffea spp.）為茜草科（Rubiaceae）、咖啡屬（Coffea）的常綠灌木。現今世界上的咖啡市場主要為三個原種系統，包括阿拉比卡咖啡（Coffea arabica L.）、羅布斯塔咖啡（Coffea canephora Pierre ex Froehner）及賴比瑞亞咖啡（Coffea liberica Bull ex Hiern ）（Carneiro, 1997；張等, 2011）。咖啡的生長區域主要集中在美洲、非洲、亞洲的熱帶或亞熱帶的大陸及島嶼，也因此沿著赤道為中心的咖啡生長帶，又稱咖啡帶（Coffee belt）（張等, 2006）。咖啡生長主要受溫度的限制，適宜的生長溫度為 15 至 25℃，對日照要求不高，可忍受的土壤 pH 範圍在 4.0 到 8.0 之間（Willson, 1985）。三原種系統的咖啡樹高、葉片及成熟期果實差異大，其中阿拉比卡咖啡的樹高約 3 至 7 公尺，葉片深綠色並具有光澤，其葉尖尖銳，果實外果皮硬、內果皮結實，成熟後較易剝落。羅布斯塔咖啡樹高約 5 至 10 公尺，葉片柔軟，葉面有明顯波浪狀，果肉易與種子分離。賴瑞比亞咖啡樹高約 10 至 15 公尺，葉片大，內、外果皮及種皮厚，成熟後不易脫落（Duke, 1983；張等, 2011）。. 1.2 咖啡之商業及藥用價值咖啡之商業價值部分為其種子，即咖啡豆（Berries）。採用烘培過的咖啡豆所製作而成的飲料，為廣泛流行的飲品。咖啡豆是國際貿易市場上重要的經濟作物之一，咖啡生長遍佈全世界約 80 個國家，依照咖啡品種、產地的不同，會有各自不同的特性，阿拉比卡咖啡佔全世界總產 5.

(13) 量最多，約為 75%，其次為羅布斯塔咖啡，約為 25%，賴比瑞亞咖啡則只有少數生產國家自行消費（Carneiro, 1999；De Los Santos-Briones and Hernández-Sotomayor, 2006；Vinod et al., 2006）。咖啡含有咖啡因（Caffeine）、葫蘆巴鹼（Trigonelline）、阿拉伯半乳糖（Arabinogalactans）、綠原酸（Chlorogenic acid）及咖啡酸（Caffeic acid）等成分（Charles-Bernard et al., 2005；Stadler et al., 2002；Viani, 1988）。咖啡因為常見的止痛藥成分，具有減輕噁心、緩解偏頭痛的效用（Richard et al., 1998），可短暫刺激中樞神經，研究發現長期飲用咖啡的人在中年時期，可有效降低罹患老年癡呆症（Dementia）及阿茲海默症（Alzheimer’s disease）的風險（Eskelinen and Kivipelto, 2010）。葫蘆巴鹼有助於體內葡萄糖平衡、神經保護作用、抗偏頭痛、鎮靜、改善記憶力、抗菌、抗病毒及抗腫瘤活性（van Dijk et al., 2009；Zhou, 2012 ）。阿拉伯半乳糖能刺激免疫系統、抑制腫瘤細胞增殖能力、阻礙腫瘤細胞轉移至肝臟、刺激吞噬作用以提高免疫力（D’Adamo, 1996；Hauer and Anderer, 1993；Beuth et al., 1988；Hagmar et al.,1991）。綠原酸具有降血壓的作用、減緩葡萄糖釋放到血液中及降低葡萄糖的吸收率（Zhao et al., 2011；Johnston et al., 2003）。咖啡酸為肉桂酸的衍生物，可抑制纖維瘤細胞增生（Rajendra, 2011）此外，咖啡富含多酚類抗氧化物質，具有神經保護作用，可抗活性氧逆境，並提高神經元細胞存活率，烘培過的咖啡豆中，抗氧化的活性及神經元細胞存活率更是提高了數倍（Chu et al,. 2009）。. 6.

(14) 1.3 阿拉比卡咖啡之簡介阿拉比卡咖啡（Coffea arabica L.）的香味充足，味道均勻，品質優良，在各系統咖啡中風味最佳，價格最好。分布於非洲、拉丁美洲及東南亞等地區，全世界以阿拉比卡咖啡的栽培面積及市場佔有率為最高（張等, 2006）。台灣最早於 1884 年引進阿拉比卡咖啡，1919 年農業試驗所嘉義分所對當時所有品種進行試驗種植，結果顯示阿拉比卡咖啡最適合台灣的風土氣候栽培（台灣總督府殖產局, 1929）。阿拉比卡咖啡原產於東非的衣索比亞（Ethiopia），現今仍有豐富的野生種源。其樹高可達 3 至 7 公尺，野生植株更可達 9 至 12 公尺。樹皮呈灰黃褐色，具淺縱向裂痕。葉片呈單葉對生，葉片為長橢圓形，葉尖尖銳，葉長約 10 至 20 公分。花朵生於側枝葉腋，花朵直徑約 3 公分。果實為橢圓形核果，未成熟呈深綠色，成熟時表面呈暗紅色，由外皮、果肉、內果皮、種子所形成，具有一層淺黃色種殼（Duke, 1983；張等, 2011）。. 1.4 植物組織培養技術植物組織培養是利用具有細胞全能性（Totipotency）的植物細胞，經由適當誘導，可再分化並生長成為完整植株（冉, 2004；胡和陳, 2006）。其詳細的過程為，將植物體的種子、器官、組織、胚胎、單一細胞或原生質體等部分，培養於無菌環境下，並提供合適的環境條件，包括光、溫度、養分及生長調節劑等，使之重新長成完整植物（胡和陳, 2006；孔等, 2009）。農業上利用植物組織培養技術進行繁殖，能大幅縮短栽培時 7.

(15) 間，並達成大量生產之目的。因此，此技術常被應用於育種、種苗繁殖及種原保存等方面（冉, 2004）。針對具有高經濟價之作物或者高市場需求之藥用植物，以組織培養來進行人工栽培，即為一常用方法（蔡, 2003）。利用組織培養技術大量繁殖的植物，已有許多成功案例，其中包括具有高經濟價值的蘭科植物及藥用植物等，例如蝴蝶蘭（Ishii et al., 1998）、文心蘭（Chen and Chang, 2000）、素心蘭（Chang and Chang, 1998）、石斛蘭（Jonojit et al., 2007）、芭菲爾鞋蘭（Hong et al., 2008）、人參（Chang and Hsing, 1980）、山葵（劉等, 2002）、大黃（Kaneko et al., 1986）、百合（Shoyama et al., 1987）、丹參（張等, 2003）、山藥（Forsyth and Staden, 1981）、當歸（Tsay and Huang, 1988）、喜樹（高和周, 2003）、新疆紫草（計等, 1983）、柴胡（Hiraoka et al., 1983）、黃耆（Fujioka et al., 1983）及紅豆杉（胡等, 2000）等。. 1.5 咖啡組織培養之前人研究咖啡的兩大品種，包括阿拉比卡及羅布斯塔咖啡。其中阿拉比卡咖啡的風味醇厚，製成品質較良好的飲料，但其植株對蟲害相當敏感。然而，羅布斯塔咖啡的品質及風味較差，卻較耐蟲害。傳統的咖啡育種計畫，通常需耗時 28 年左右，既費時又昂貴。植物組織培養技術可以輔助傳統育種，提供另一個可行的方向（ De Los Santos-Briones and Hernández-Sotomayor, 2006；Vinod et al., 2006）。 1970 年 Staritsky 利用直立芽為培植體，成功誘導出快速生長的癒傷組織（Staritsky, 1970）。Sharp 於 1973 年建立阿拉比卡咖啡的種子、芽、 8.

(16) 葉及花藥癒傷組織誘導系統，認為無光照和 28℃的條件下，能提高癒傷組織的增殖效率（Sharp et al., 1973）。Townsley 於 1974 年使用白色易碎的癒傷組織進行懸浮培養（Suspension culture）（Townsley, 1974）。Söndahl 和 Sharp 單獨使用植物生長素或搭配細胞分裂素，誘導阿拉比卡咖啡葉片癒傷組織，形成體胚（Söndahl and Sharp, 1977）。1995 年 Yasuda 等學者以成熟樹木的葉片為培植體，建立阿拉比卡咖啡及羅布斯塔咖啡的體胚發生系統（Yasuda et al., 1995）。理論上，直接體胚發生系統（Direct somatic embryogenesis）的建立，可有效地縮短咖啡培植體獲得再生植株所需時間（Giridhar et al., 2004）。. 1.6 研究目的本研究之目的在於建立阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導系統，以不同濃度之植物生長素與細胞分裂素，進行阿拉比卡咖啡的試管內癒傷組織誘導。台灣的咖啡產業日漸發展，發展本土咖啡品種有其價值，而本試驗所得之結果，未來可運用在微體繁殖、體胚誘導及細胞懸浮培養等研究，以輔助咖啡之繁殖及育種。. 9.

(17) 第二章. 材料與方法. 2.1 實驗材料阿拉比卡咖啡（Coffea arabica L.）的成熟種子。. 2.2 基礎培養基基礎培養基成分為全量 MS（Murashige and Skoog, 1962），並添加 30 g/L 蔗糖（Sucrose）及 3 g/L 水晶洋菜（Gelrite）。培養基 pH 為 5.7 ± 0.01。. 2.3 植物生長調節劑本試驗所使用之植物生長調節劑，包括屬於植物生長素的 α-naphthaleneacetic acid（NAA）及 2,4-dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D），屬於細胞分裂素的 N6-benzyladenine（BA）及 thidiazuron（TDZ）。. 2.4 阿拉比卡咖啡種子萌芽試驗將阿拉比卡咖啡種子去除果殼及銀皮後，以不同濃度（0.25%、0.5% 及 1%）之次氯酸鈉（Sodium hypochlorite，NaOCl）進行 10 與 20 分鐘的消毒，以無菌水潤洗五次，置入含有 40 ml 固態基礎培養基的試管中進行萌芽試驗。培養於全暗環境，溫度為 25 ± 2℃，於十二週後記錄萌芽情形。. 2.5 阿拉比卡咖啡癒傷組織之誘導. 10.

(18) 切取十二週的實生苗之根及葉做為培植體，進行癒傷組織誘導試驗。以基礎培養基搭配不同濃度（0、0.1、0.5、1 及 2 mg/L）的 NAA 與不同濃度（0、1 及 2 mg/L）的 BA；或者不同濃度（0、0.1、0.5、1 及 2 mg/L）的 2,4-D 搭配不同濃度（0、1 及 2 mg/L）的 TDZ，共 30 組試驗。每一試驗組中植入約一公分長之根或一片葉，培養至每試管含有 10 ml 之固態培養基，並進行三重複試驗。於無光照的環境下，以溫度 25 ± 2℃進行培養。四週後，觀察記錄生長情形，每隔四週進行繼代，並持續記錄生長情形。. 2.6 阿拉比卡咖啡癒傷組織之增殖試驗將各試驗所取得之癒傷組織，取約 0.1 克，培養於原培養基中，進行四週之增殖試驗，每組五重複。四週後計算其增殖率並觀察癒傷組織生長情形。增殖率 =（四週後增殖鮮重 ÷ 原始鮮重）x 100％. 2.7 統計方式試驗結果利用 COSTAT 統計分析軟體進行鄧肯氏多變域分析（Duncan's Multiple Range Test，DMRT），比較各處理組之間平均值的差異。取 P 值小於 0.05 之顯著水準下進行比較，以字母區分各組間之差異性，如兩組間出現相同字母，代表兩者間無顯著差異。. 11.

(19) 第三章. 結果. 3.1 阿拉比卡咖啡種子萌芽試驗阿拉比卡咖啡種子之萌芽情形，大多於六至八週後開始發芽，十二週後生長成為含兩葉之小苗（圖 3.1）。萌芽試驗結果顯示，各試驗組皆有部分萌芽。20 分鐘之消毒條件下，萌芽率分別為：33.33%（濃度 0.25%）、 40.00%（濃度 0.5%）及 25.00%（濃度 1%）；10 分鐘之消毒條件下，萌芽率分別為：11.11%（濃度 0.25%）、63.16%（濃度 0.5%）及 21.05%（濃度 1%）。各測試組中，以濃度 0.5%之次氯酸鈉消毒 10 分鐘可獲得最佳萌芽效果（萌芽率 63.16%）（表 3.1）。. 3.2 阿拉比卡咖啡癒傷組織之誘導 3.2.1 NAA 搭配 BA 之癒傷組織誘導 NAA 搭配 BA 之癒傷組織誘導試驗，經過四週試驗後，初步觀察結果顯示，在根培植體處理組中，控制組與單一使用 2 mg/L BA 的試驗組，無任何誘導反應的發生。其餘試驗組，皆可在培植體周圍發現透明晶體狀的癒傷組織產生（圖 3.2）。經過兩次繼代後，各試驗組中，控制組確認無法誘導出癒傷組織。其餘各試驗組，共十四組試驗，皆可獲得癒傷組織之生成（圖 3.3）。葉培植體處理組中，經過四週誘導試驗後，初步觀察結果顯示，控制組與單一使用 2 mg/L BA 的試驗組，無任何誘導反應的發生。其餘試驗組，在葉緣處、葉片切口處或其傷口處，皆可發現透明晶體狀的癒傷. 12.

(20) 組織產生（圖 3.4）。經過兩次繼代後，各試驗組中，控制組確認為無法誘導出癒傷組織。其餘各試驗組，共十四組試驗，皆可獲得癒傷組織之生成（圖 3.5）。癒傷組織誘導試驗結果顯示，根培植體在控制組中無法誘導出任何癒傷組織之形成。不同濃度 NAA 與 BA 之搭配或者單一使用 BA，皆能成功誘導出癒傷組織，其中則以單獨使用 1 及 2 mg/L BA 的處理誘導率較低（表 3.2）。單一使用 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 或搭配 1 及 2 mg/L BA，共九個品系，其癒傷組織生長情形較佳，其餘組別癒傷組織生長情形較為緩慢（圖 3.3）。葉培植體的試驗組中，癒傷組織誘導情形與根培植體癒傷組織誘導情形類似，控制組確定無法成功誘導癒傷組織形成。不同濃度 NAA 與 BA 之搭配或者單一使用 BA，皆能成功誘導出癒傷組織（表 3.2）。單一使用 0.1、0.5 及 1 mg/L NAA 或搭配 1 及 2 mg/L BA，共九個品系，癒傷組織持續生長情形較佳。其餘試驗組，生長情形則較為緩慢（圖 3.5）。. 3.2.2 2,4-D 搭配 TDZ 之癒傷組織誘導 2,4-D 搭配 TDZ 的試驗，在根培植體試驗組中，控制組與單一使用 TDZ 的試驗組，無任何誘導反應的發生。其餘試驗組，皆可發現透明晶體狀癒傷組織的產生在培植體周圍（圖 3.6）。經過兩次繼代後，2,4-D 搭配 TDZ 的各試驗組中，控制組確認無法誘導出癒傷組織。其餘各試驗組，共十四組試驗，皆可獲得癒傷組織（圖 3.7）。葉培植體的試驗組中，控制組無任何誘導反應的發生。其餘試驗組，可在葉緣、葉片切口或其傷口處，形成透明顆粒狀癒傷組織（圖 3.8）。 13.

(21) 經過兩次繼代後，各試驗組中，控制組確認為無法誘導出癒傷組織。其餘各試驗組，共十四組試驗，皆可獲得癒傷組織之生成（圖 3.9）。癒傷組織誘導試驗結果顯示，根培植體試驗中，在控制組無法誘導出任何癒傷組織之形成。不同濃度 2,4-D 與 TDZ 之搭配或者單一使用 TDZ，皆能成功誘導出癒傷組織並持續生長，其中以單獨使用 1 及 2 mg/L TDZ 處理之誘導率較低（表 3.3）。以單一使用 0.5、1 及 2 mg/L 之 2,4-D 的試驗組，共三個品系，癒傷組織持續生長情形較佳（圖 3.7）。在葉培植體試驗組中，癒傷組織誘導情形，與根培植體癒傷組織誘導情形類似。除了控制組外，不同濃度 2,4-D 與 TDZ 之搭配或者單一使用 TDZ，皆能成功誘導出癒傷組織（表 3.3）。以單一使用 0.5、1 及 2 mg/L 之 2,4-D 的試驗組，共三個品系，癒傷組織持續生長情形較佳，其餘試驗組，生長情形則較為緩慢（圖 3.9）。. 3.2.3 不定根之形成在 NAA 搭配 BA 的試驗組中，以葉培植體誘導癒傷組織，八週後，在單獨使用 1 及 2 mg/L NAA，或者搭配 1 及 2 mg/L BA 的處理組中，共六個試驗組，發現有不定根的形成，且在根尖有癒傷組織生成（圖 3.10）。十二週後，該癒傷組織發現不定芽的形成（圖 3.11）。其餘試驗組，則未有發現不定根之形成（表 3.4）。. 3.3 阿拉比卡咖啡癒傷組織增殖試驗阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導試驗中，使用植物的成熟器官（根及葉）為培植體，因此誘導出之各癒傷組織，其生長速度皆有所差異，而外觀 14.

(22) 形態上也不盡相同。故進行癒傷組織增殖試驗，藉以區分各癒傷組織生長速度及外觀差異。癒傷組織增殖試驗結果顯示，以 NAA 搭配 BA 的試驗組所誘導之癒傷組織做比較，在根培植體中，以 0.5 mg/L NAA 搭配 2 mg/L BA 所誘導之癒傷組織增殖率為最高（10.63 倍），次高者為 0.5 mg/L NAA 搭配 1 mg/L BA 所誘導之癒傷組織（9.23 倍），兩者之癒傷組織顏色皆呈淡黃色，結構緊實且觸感偏硬；再者以 0.1 mg/L NAA 搭配 1 mg/L BA 的試驗組（8.16 倍）及 1 mg/L NAA 搭配 1 mg/L BA 的試驗組（8.12 倍）所誘導之癒傷組織，其外觀顏色淡黃且透白，結構較為蓬鬆而觸感略硬（表 3.5）。葉培植體所誘導之癒傷組織，因癒傷組織生長速度較為緩慢，數量不足故無法進行增殖率試驗。以 2,4-D 搭配 TDZ 的試驗組所誘導之癒傷組織中，由葉培植體單一使用 0.5 mg/L 2,4-D 所誘導之癒傷組織增殖率為最高（5.32 倍），由根培植體單一使用 0.5 mg/L 2,4-D 所誘導之癒傷組織次之（4.82 倍），兩者之癒傷組織，外觀呈現白色半透明狀，結構鬆散且觸感軟綿（表 3.6）。在根培植體及葉培植體試驗組中，除單一使用 0.5、1 及 2 mg/L 2,4-D 外，其餘試驗組，因癒傷組織生長速度較為緩慢，數量不足故無法進行增殖率試驗。增殖試驗結果顯示出癒傷組織外觀形態與其增殖能力間，有其一定相關聯性，以其外觀及生長速率之不同，大致可將癒傷組織分為四類：首先以結構緊實、觸感堅硬之淡黃色癒傷組織，其生長速率為最快[ 0.5 mg/L NAA + 2 mg/L BA（10.63 倍）、0.5 mg/L NAA + 1 mg/L BA （9.23. 15.

(23) 倍）、0.5 mg/L NAA（8.68 倍）]；蓬鬆顆粒狀且觸感略硬之淡黃色且透白的癒傷組織，其生長速度次之[ 0.1 mg/L NAA（6.12 倍）、1 mg/L NAA （6.35 倍）、0.1 mg/L NAA + 1 mg/L BA（8.16 倍）、1 mg/L NAA + 1 mg/L BA（8.12 倍）、0.1 mg/L NAA + 2 mg/L BA（6.44 倍）]；結構鬆散、觸感軟綿之白色半透明狀癒傷組織，生長速度稍慢[ 0.5 mg/L 2,4-D（葉 5.32 倍、根 4.82 倍）、1 mg/L 2,4-D（葉 4.26 倍、根 3.85 倍）、2 mg/L 2,4-D （葉 3.94 倍、根 4.04 倍）]；形態軟爛之紅褐色癒傷組織，其生長速度最為緩慢，甚至無增生之現象（葉培植體以 1 mg/L NAA + 1 mg/L BA 處理）（圖 3.12）。. 16.

(24) 圖 3.1 阿拉比卡咖啡種子萌芽情形。播種後十二週所發育之實生苗（bar = 10.0 mm）。. 17.

(25) 表 3.1 阿拉比卡咖啡種子萌芽率 Sodium hypochlorite (％). Time (min). Germination percentage (％). 0.25. 10. 11.11b. 0.25. 20. 33.33ab. 0.5. 10. 63.16a. 0.5. 20. 40.00ab. 1. 10. 21.05b. 1. 20. 25.00b. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test），進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a～b 字母出現相同者，表示無顯著差異。. 18.

(26) 0.1. 1. 2. 1 2. BA (mg/L). 0. 0. NAA (mg/L) 0.5. 圖 3.2 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導。四週後之各試驗組誘導情形（bar = 0.5 mm）。. 19.

(27) 0.1. 1. 2. 1 2. BA (mg/L). 0. 0. NAA (mg/L) 0.5. 圖 3.3 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導。繼代兩次後之各試驗組癒傷組織生長情形（bar = 0.5 mm）。. 20.

(28) 0.1. 1. 2. 1 2. BA (mg/L). 0. 0. NAA (mg/L) 0.5. 圖 3.4 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導。四週後之各試驗組誘導情形（bar = 0.5 mm）。. 21.

(29) 0.1. 1. 2. 1 2. BA (mg/L). 0. 0. NAA (mg/L) 0.5. 圖 3.5 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導。繼代兩次後之各試驗組癒傷組織生長情形（bar = 0.5 mm）。. 22.

(30) 表 3.2 NAA 搭配 BA 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導率 Test. Induction ratio of. Induction ratio of. callus from root (％). callus from leaf (％). NAA (mg/L). BA (mg/L). 0. 0. 0. 0. 0.1. 0. 100a. 100a. 0.5. 0. 100a. 100a. 1. 0. 100a. 100a. 2. 0. 80a. 100a. 0. 1. 60ab. 80b. 0.1. 1. 100a. 100a. 0.5. 1. 100a. 100a. 1. 1. 100a. 100a. 2. 1. 80a. 100a. 0. 2. 40b. 100a. 0.1. 2. 100a. 100a. 0.5. 2. 100a. 100a. 1. 2. 100a. 100a. 2. 2. 100a. 100a. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test），進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a～b 字母出現相同者，表示無顯著差異。. 23.

(31) 0.1. 1. 2. 1 2. TDZ (mg/L). 0. 0. 2,4-D (mg/L) 0.5. 圖 3.6 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導。四週後之各試驗組誘導情形（bar = 0.5 mm）。. 24.

(32) 0.1. 1. 2. 1 2. TDZ (mg/L). 0. 0. 2,4-D (mg/L) 0.5. 圖 3.7 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡根培植體癒傷組織之誘導。繼代兩次後之各試驗組癒傷組織生長情形（bar = 0.5 mm）。. 25.

(33) 0.1. 1. 2. 1 2. TDZ (mg/L). 0. 0. 2,4-D (mg/L) 0.5. 圖 3.8 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導。四週後之各試驗組誘導情形（bar = 0.5 mm）。. 26.

(34) 0.1. 1. 2. 1 2. TDZ (mg/L). 0. 0. 2,4-D (mg/L) 0.5. 圖 3.9 2,4-D 及 TDZ 對阿拉比卡咖啡葉培植體癒傷組織之誘導。繼代兩次後之各試驗組癒傷組織生長情形（bar = 0.5 mm）。. 27.

(35) 表 3.3 2,4-D 搭配 TDZ 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導率 Test. Induction ratio of. Induction ratio of. callus from root (％). callus from leaf (％). 2,4-D (mg/L). TDZ (mg/L). 0. 0. 0. 0. 0.1. 0. 100a. 100a. 0.5. 0. 100a. 100a. 1. 0. 100a. 100a. 2. 0. 100a. 100a. 0. 1. 60b. 60ab. 0.1. 1. 100a. 100a. 0.5. 1. 100a. 100a. 1. 1. 100a. 100a. 2. 1. 100a. 100a. 0. 2. 60b. 40b. 0.1. 2. 100a. 100a. 0.5. 2. 100a. 100a. 1. 2. 100a. 100a. 2. 2. 100a. 80ab. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test），進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a～b 字母出現相同者，表示無顯著差異。. 28.

(36) BA (mg/L) 1. 2. 2. NAA (mg/L). 0. 圖 3.10 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植不定根之誘導。試驗八週後，誘導不定根生長情形（bar = 10.0 mm）。. 29.

(37) 圖 3.11 NAA 及 BA 對阿拉比卡咖啡葉培植不定根之誘導。A.試驗十二週後，不定根尖生成癒傷組織。B 及 C.根尖生成之癒傷組織，分化出不定芽（箭頭為芽體生成處）（bar = 0.3 mm）。. 30.

(38) 表 3.4 NAA 及 BA 處理之阿拉比卡咖啡葉培植體不定根誘導率 Test. Formation ratio of. NAA (mg/L). BA (mg/L). adventitious root (％). 1 2 1 2 1 2. 0 0 1 1 2 2. 20c 80ab 25bc 100a 20c 20c. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test），進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a～c 字母出現相同者，表示無顯著差異。. 31.

(39) 表 3.5 NAA 及 BA 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織增殖率與形態 Test (mg/L) NAA BA 0 0. Proliferation rate (-fold) Root. Callus morphology Root clear-yellowish slight hard, granular yellowish hard, compact clear-yellowish slight hard, granular clear-white soft, friable. 0.1. 0. 6.12de. 0.5. 0. 8.68b. 1. 0. 6.35cde. 2. 0. 4.72e. 0. 1. 0.1. 1. 8.16bc. 0.5. 1. 9.23ab. 1. 1. 8.12bc. 2. 1. 5.76de. 0. 2. 0.1. 2. 6.44cde. 0.5. 2. 10.63a. 1 2. 2 2. clear-yellowish slight hard, compact yellowish hard, compact clear-yellowish slight hard, compact clear-white soft, friable clear-yellowish slight hard, granular yellowish hard, compact. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test），進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a～e 字母出現相同者，表示無顯著差異。 32.

(40) 表 3.6 2,4-D 及 TDZ 處理之阿拉比卡咖啡癒傷組織增殖率與形態 Test (mg/L) 2,4-D TDZ 0 0 0.1 0. Proliferation rate (-fold) Root Leaf. 0.5. 0. 5.38a. 4.82ab. 1. 0. 4.26bc. 3.85c. 2. 0. 3.84c. 4.04c. Callus morphology Root Leaf. clear-white soft, friable clear-white soft, friable clear-white soft, friable. clear-white soft, friable clear-white soft, friable clear-white soft, friable. 試驗結果採用鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test），進行平均值差異分析（P＜0.05）。各數據間 a～c 字母出現相同者，表示無顯著差異。. 33.

(41) 圖 3.12 阿拉比卡咖啡癒傷組織形態與增生能力。A.淡黃色且結構緊實的癒傷組織增生能力最快速。B.淡黃色或淡黃色中透白且結構較為蓬鬆的癒傷組織增生能力快速。C.白色透明狀且結構柔軟的癒傷組織增生能力中等。D.紅褐色且結構軟爛的癒傷組織增生能力緩慢，甚至停止生長（bar = 0.5 mm）。. 34.

(42) 第四章討論咖啡是國際市場上最重要的經濟作物，其貿易額僅次於石油。市場上主要有兩大原種：阿拉比卡咖啡，品質良好卻對蟲害相當敏感；羅布斯塔咖啡，品質及風味較差但可更耐蟲害。傳統育種方式相當緩慢，而培育出的新品種，昂貴且不足以供給需求（De Los Santos-Briones and Hernández-Sotomayor, 2006；Vinod et al., 2006）。因此利用植物組織培養技術建立咖啡微體繁殖系統，便成為一個重要的研究方向。前人研究顯示，癒傷組織之體胚發生需耗費大量時間（Vinod et al., 2006），故本試驗擬建立阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導系統，並利用不同濃度之植物生長調節劑，對於所誘導出癒傷組織進行形態發生之試驗，以獲得完整之阿拉比卡咖啡試管內誘導系統。先前研究顯示，各種常用消毒劑相互比較，其中以次氯酸鈉消毒能力較佳，且對培植體本身並無不良影響（Badoni and Chauhan, 2010），而次氯酸鈉相較於氯化汞，更能有效刺激種子萌發及植株生長（Morla et al., 2011）。本試驗利用不同濃度之次氯酸鈉搭配不同消毒時間，進行阿拉比卡咖啡種子表面消毒。結果顯示，在高濃度次氯酸鈉（1%）的消毒條件下，不利於阿拉比卡咖啡種子萌芽；低濃度次氯酸鈉（0.25%）的消毒條件下，種子消毒情形不佳，汙染率較高；在次氯酸鈉濃度為 0.5%時，種子萌芽情形較佳，其中以濃度 0.5%之次氯酸鈉消毒 10 分鐘可獲得最佳萌芽效果（萌芽率為 63.16%）。癒傷組織誘導試驗中，不論是使用根培植體或葉培植體進行誘導，除了控制組外，皆能成功誘導出癒傷組織。Van Boxtel和Berthouhly單獨 35.

(43) 使用4.5 μM 2,4-D於葉培植體成功誘導出癒傷組織，其誘導出之癒傷組織的增殖能力及形態發生能力也有更加提升（Van Boxtel and Berthouhly, 1996）。本試驗於2,4-D搭配TDZ試驗組中，葉培植體單獨使用0.5、1及2 mg/L 2,4-D的試驗組，獲得穩定且快速生長的癒傷組織，根培植體試驗結果亦然。對照先前研究結果，顯示出在單獨使用0.5 - 2 mg/L 2,4-D，可成功誘導出穩增殖能力快速的癒傷組織。在同屬於茜草科的蛇根草（Ophiorrhiza japonica），Kai等使用0.2 - 1 mg/L NAA + 0.2 - 2 mg/L BA，在蛇根草葉片上成功誘導出癒傷組織，其中以1 mg/L NAA搭配1 mg/L BA 誘導癒傷組織效果最佳（Kai et al., 2008）。在NAA搭配BA的試驗組中，根或葉培植體單獨使用0.1、0.5及1 mg/L NAA或搭配1及2 mg/L BA，皆可獲得持續快速生長的癒傷組織。對照先前研究顯示出，0.1 - 1 mg/L NAA + 0 - 2 mg/L BA範圍內，癒傷組織誘導效果最佳，所誘導之癒傷組織，質地緊密且生長力較強。癒傷組織誘導率顯示，相較於單獨使用細胞分裂素，由生長素搭配細胞分裂素，或者單獨使用生長素進行試驗，更容易誘導阿拉比卡咖啡之根及葉培植體生長癒傷組織，並持續穩定生長。推測單獨使用生長素或搭配細胞分裂素，有利於進行阿拉比卡咖啡癒傷組織誘導。閻等使用中國櫻桃（Prunus pseudocerasus）的不定根作為培植體，以0.5 - 2 mg/L NAA + 0.05 mg/L BA + 0.05 mg/L IBA培養基，成功誘導癒傷組織，該癒傷組織在0.5 - 2 mg/L NAA + 0.5 mg/L BA培養基成功分化出不定芽（閻等, 2003）。癒傷組織誘導試驗中，以葉培植體誘導癒傷組織，單獨使用1及2 mg/L NAA，或者搭配1及2 mg/L BA，共六個試驗組，. 36.

(44) 發現不定根的形成，根尖有癒傷組織生成及不定芽分化。對照先前研究結果顯示，推測是因為不定根尖細胞分裂快速，在1- 2 mg/L NAA的範圍內，可有效誘導不定根產生癒傷組織，該癒傷組織更可有效分化出不定芽。對於癒傷組織的生成及持續生長，影響的因素很多，植物本身所生成的植物性荷爾蒙為一重要的原因。此外，培養基中所添加的醣類、蛋白腖、洋菜及植物生長調節劑，皆會影響癒傷組織生成與持續生長的能力。對於本試驗所使用的水晶洋菜，先前許多研究指出，使用水晶洋菜對於植物的癒傷組織生長、體胚生成、植株再生等各方面，效果較一般洋菜佳（Henderson, 1987；Huang and Chi, 1988；Veramendi et al., 1997）。癒傷組織誘導試驗，因使用的根及葉培植體為植物之多細胞的成熟器官，其誘導出之癒傷組織，在形態及生長速度上皆不盡相同。根據癒傷組織增殖率試驗結果顯示，依照生長速度之快慢與型態之差異，將癒傷組織大致分為四類：結構緊密、觸感堅硬之黃色癒傷組織，生長速度最快；蓬鬆顆粒狀且觸感略硬之淡黃色且透白的癒傷組織，生長速度次之；結構鬆散、觸感軟綿之白色半透明狀癒傷組織，生長速度稍慢；形態軟爛之紅褐色癒傷組織，生長速度緩慢。Armstrong 和 Green 將玉米中所誘導之具有再生能力的癒傷組織分為兩類，第一類癒傷組織，結構緊密且所形成的體胚形態複雜；第二類癒傷組織，結構鬆散且易碎（Armstrong and Green, 1985）。Visarada 等將稻米所誘導出癒傷組織進行分類，第一型為白色且結構緊密之癒傷組織，其再生能力最佳；第二型為黃色且具有組織性之癒傷組織，其再生能力良好（ Visarada et. 37.

(45) al.,2002）。對照先前研究與增殖試率驗結果，建議未來選擇生長快速、結構緊密及外觀顏色呈淡黃色或白色之癒傷組織進行形態發生及植株再生試驗。. 38.

(46) 第五章參考文獻孔建民、何一正、郭嘉信、陳省三、楊其曄、羅朝村、關政平、楊其曄。（2012）《新編生物技術概論》。華格那企業。臺中市。冉懋雄。（2004）《中藥組織培養實用技術》。科學技術文獻出版社。北京市。胡文若、陳俊仁。（2006）花卉微體繁殖技術。台南區農業專訊。第58 期。pp.01-05. 計巧靈、王衛國、李仁敬。（1993）新疆紫草外植體組織培養和植株再生。新疆大學學報。10, 91。高桂珍、周吉源。（2003）喜樹細胞懸浮培養中生理生化指標的測定。武漢植物學研究。21, 259。胡凱、何穎、祝順琴。（2003）紅豆杉細胞懸浮培養產生紫杉醇研究進展。天然產物研究與開發。14, 471。張淑芬、程永雄、徐信次、朱慶國。（2006）台灣咖啡之介紹。農業試驗所技術服務。第67期。pp.13-16。張淑芬、楊宏仁、劉禎棋、林明瑩。（2011）咖啡栽種管理。農業試驗所特刊。157號。pp.01-37。張耀非、雷家容、代其林。（2003）丹參的組織培養及快速繁殖。植物生理學通訊。39, 139。臺灣總督府殖產局。（1929）《珈琲》。台灣總督府殖產局。臺北市。劉琴、吳震、翁忙玲。（2002）山葵的組織培養和快速繁殖。植物生理學通訊。38, 581。 39.

(47) 蔡新聲。（1999）藥用植物之組織培養技術。藥用植物之開發與利用研討會論文集。pp.113-124。農業試驗所。臺中市。閻國華、張開春、周宇、張曉明、牛愛國、李文生。（2003）中國櫻桃‘對櫻桃’不定根離體再生植株的研究。園藝學報。30, 583-585。 Armstrong, C.L. and Green, C.E. (1985) Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and the involvement of L-proline. Planta. 164, 207-214. Badoni, A. and Chauhan, J.S. (2010) In vitro sterilization protocol for micropropagation of Solanum tuberosum cv. ‘Kufri Himalini’. Academia Arena. 2, 24-27. Beuth, J., Ko, H.L., Schirrmacher, V., Uhlenbruck, G. and Pulverer, G. (1988) Inhibition of liver tumor cell colonization in two animal tumor models by lectin blocking with D-galactose or arabinogalactan. Clinical and Experimental Metastasis. 6, 115-120. Carneiro, M.F. (1997) Coffee biotechnology and its applications in genetic transformation. Euphytica. 96, 167-172 Carneiro, M.F. (1999) Advances in coffee biotechnology. AgBiotechNet. 1, 1-7. Chang, W.C. and Hsing, Y.L. (1980) In vitro flowering of embryoids derived from mature root callus of ginseng (Panax ginseng). Nature. 284, 341-342.. 40.

(48) Chang, C. and Chang, W.C. (1998) Plant regeneration from callus culture of Cymbidium ensifolium var. misericors. Plant Cell Reports. 17, 251-255. Charles-Bernard, M., Kraehenbuehl, K., Rytz, A. and D. Roberts, D. (2005) Interactions between volatile and nonvolatile coffee components. 1. screening of nonvolatile components. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 4417-4425. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2000) Plant regeneration via embryo and shoot bud formation from flower-stalk explants of Oncidium Sweet Sugar. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 62, 95-100. Chu, Y.F., Brown, P.H., Lyle, B.J., Chen, Y.M., Black, R.M., Williams, C.E., Lin, Y.C., Hsu, C.W. and Cheng, I.H. (2009) Roasted coffees high in lipophilic antioxidants and chlorogenic acid lactones are more neuroprotective than green coffees. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 9801-9808. D'Adamo, P. (1990) Larch arabinogalactan. Research report. Journal of Naturopathic Medicine. 6, 33-37. De Los Santos-Brione, C. and Teresa Hernández-Sotomayor, S.M. (2006) Coffee biotechnology. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18, 217-227. Duke, J.A. (1983) Hankbook of Energy Crops. Unpublished.. 41.

(49) Eskelinen, M.H. and Kivipelto, M. (2010) Caffeine as a protective factor in dementia and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 20, 167-74. Forsyth, C. and Staden, J.V. (1981) An improved method of in vitro propagation of Dioscorea bulbifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1, 275-281. Fujioka, N., Nakao, K., Fujiota. Y., Miyagawa, H., Kohda, H., Yamasaki, K. and Takami, S. (1983) The production of plants regenerated from the shoot tips of Astragalus membranaceus. The Japanese Journal of Pharmacognosy. 37, 405-411. Giridhar, P., Indu, E.P. and Vinod, K. (2004) Direct somatic embryogenesis from Coffea arabica L. and Coffea canephora P. Ex. Fr. under the influence of ethylene action inhibitor-silver nitrate. Acta Physiologiae Plantarum. 26, 299-305. Hagmar, B., Ryd, W and Skomedal, H. (1991) Arabinogalactan blockade of experimental metastases to liver by murine hepatoma. Invasion and Metastasis. 11, 348-355. Hauer, J. and Anderer, F.A. (1993) Mechanism of stimulation of human natural killer cytotoxicity by arabinogalactan from Larix occidentalis. Cancer Immunology, Immunotherapy. 36, 237-244. Henderson, J.H.M. (1987) The use of gelrite as a substitute for agar in medium for plant tissue culture. Alabama Agriculture. 2, 5-6.. 42.

(50) Hiraoka, N., Kodama, T. and Tomita, Y. (1983) In vitro propagation of Bupleurum falcatum. The Japanese Journal of Pharmacognosy. 7, 62-67. Hong, P.I., Chen, J.T. and Chang, W.C. (2008) Plant regeneration via protocorm-like. body. formation. and. shoot. multiplication. from. seed-derived callus of a maudiae type slipper orchid. Acta Physiologiae Plantarum. 30, 755-759. Huang, L.C. and Chi, D.L. (1988) Pivotal roles of picloram and gelrite in banana callus culture. Environmental and Experimental Botany. 28, 249-258. Ishii, Y., Takamura, T., Goi, M. and Tanaka, M. (1998) Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis. Plant Cell Report. 17, 446-450. Jonojit, R., Soumi, N., Madhumita, M. and Nirmalya, B. (2007) Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 90, 31-39. Johnston, K.L., Clifford, M.N and Morgan, L.M. (2003) Coffee acutely modifies gastrointestinal hormone secretion and glucose tolerance in humans: glycemic effects of chlorogenic acid and caffeine 1-3. The American Journal of Clinical Nutrition. 78, 728-733. Kai, G.Y., Dai, L.M., Mei, X.Y., Zheng, J.G.,Wang W., Qian, Z.Y. and Zho, G.Y. (2008) In vitro plant regeneration from leaf explants of. 43.

(51) Ophiorrhiza japonica. Biologia Plantarum.52, 557-560. Kaneko K., Yoshida N. and Tanaka M. (1986) Studies on the breeding and culivation of Rhubarb, Rheum palmatum L. I. The production of the multiple plantlets from “Hokkaidaio” by meristem tip culture. The Japanese Journal of Pharmacognosy. 40, 401-405. Lipton, R.B., Stewart, W.F., Ryan, R.E. Jr., Saper, J., Silberstein, S and Sheftell, F. (1998) Efficacy and safety of acetaminophen, aspirin, and caffeine in alleviating migraine headache pain: three double-blind, randomized, placebo-controlled trials. Archives of Neurology. 55, 210-217. Morla, S., Ramachandra Rao, C.S.V. and Chakrapan, R (2011) Factors affecting seed germination and seedling growth of tomato plants cultured in vitro conditions. Journal of Chemical, Biological and Physical Sciences. 1, 328-334. Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-97. Rajendra Prasad, N., Karthikeyan, A., Karthikeyan, S. and Reddy, B.V. (2011) Inhibitory effect of caffeic acid on cancer cell proliferation by oxidative mechanism in human HT-1080 fibrosarcoma cell line. Molecular and Cellular Biochemistry. 349, 11-19. Sharp, W.R., Caldas, L.S., Crocomo, O.J., Monaco, L.C. and Carvalho, A.. 44.

(52) (1973) Production of Coffea arabica callus of three ploidylevels and subsequent morphogenesis. Phyton. 31, 67-74. Shoyama, Y., Tareno, R. and Nishioka, I. (1987) Clonal multiplication of Atractylodes lancea by tip tissue culture. The Japanese Journal of Pharmacognosy. 41, 313-317. Söndhal, M.R. and Sharp, W.R. (1977) High frequency induction of somatic embryos in cultured leaf explants of Coffea arabica L. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 81, 395-408. Stadler, R.H., Varga, N., Hau, J., Vera, F.A. and Welti, D.H. (2002) Alkylpyridiniums. 1. Formation in model systems via thermal degradation of trigonelline. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50, 1192-1199. Staritsky, G. (1970) Embryoid formation in callus tissues of coffee. Acta botanica neerlandica. 19, 509-514. Tasy, H.S. and Huang, H.L. (1998) Somatic embryo formation and germination from immature embryo-derived suspension-cultured cells of Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Plant Cell Reports. 17, 670-674. van Dijk, A.E., Olthof, M.R., Meeuse, J.C. Seebus, E., Heine, R.J. and van DaM, R.M. (2009) Acute effects of decaffeinated coffee and the major coffee components chlorogenic acid and trigonelline on glucose tolerance. Diabetes Care. 32, 1023-1025. Van Boxtel, J. and Berthouhly, M. (1996) High frequency somatic. 45.

(53) embryogenesis from Coffee leaves; factors influencing embryogenesis and subsequent proliferation and regeneration in liquid medium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 44, 7-17. Veramendi, J.,Villafranca, M.J., Sota, V. and Mingo-Castel, A.M. (1997) Gelrite. as. an. alternative. to. agar. for. micropropagation. and. microtuberization of Solanum tuberosum L. cv. Baraka. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant. 33, 195-199. Viani, R (1988) Physiologically active substances in coffee. In Coffee. Volume 3. Physiology. (Clarke, R.J. and Macrae, R., eds), pp.1-31, Elsevier Applied Science Publishers, London. Vinod, K., Madhava M. and Ravishankar, G.A. (2006) Developments in coffee biotechnology—in vitro plant propagation and crop improvement. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 87, 49-65. Visarada, K.B.R.S., Sailaja, M. and Sarma, N.P. (2002) Effect of callus induction media on morphology of embryogenic calli in rice genotypes. Biologia Plantarum. 45, 495-502. Willson, K.C. (1985) Climate and soil. In Coffee : Botany, Biochemistry and Production of Beans and Beverage (Clifford, M.N and Willson K.C., eds), pp.97-107, The AVI Publishing Company, Westport, Connecticut. Yasuda, T., Tahara, M., Hatanaka, T., Nishibata, T. and Yamaguchi, T. (1995) Clonal propagation through somatic embryogenesis of Coffea species. In: 16st International Scientific Colloquium on Coffee. Kyoto. pp.392-402.. 46.

(54) Zhao, Y., Wang, J., Ballevre, O., Luo, H. and Zhang, W. (2011) Antihypertensive effects and mechanisms of chlorogenic acids. Hypertension Research. 35, 370-374. Zhou, J., Chan, L. and Zhou, S. (2012) Trigonelline: a plant alkaloid with therapeutic potential for diabetes and central nervous system disease. Current Medicinal Chemistry. 19, 3523-3531.. 47.

(55)