榼藤之化學成分研究; Studies on the Chemical Constituents of Entada phaseoloides (LINNE) MERRILL
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(2) 圖目錄 Fig. 2-1 Fig. 2-2 Fig. 2-3 Fig. 3-1 Fig. 4-1 Fig. 4-2 Fig. 4-3. Fig. 5-1 Fig. 5-2 Fig. 5-3 Fig. 5-4. 歷代本草所繪榼藤圖 .......................................................10 榼藤之本草系統圖........................................................... 11 榼藤(Entada phaseoloides (L.) MERR.)植物… … … … ...… 13 榼藤(Entada phaseoloides (L.) MERR.)莖之抽提流程圖...32 榼藤之 DPPH 自由基清除能力之試驗… … … … … … … … 46 Analgesic effect of methanol extract of Entada phaseoloides (Ep-M) on formalin induced pain response in mice … … … ..48 Anti-inflammation actions of methanol extract of Entada phaseoloides (Ep-M) on λ- carrageenin induced paw swelling in mice… … … … … … … … … … … … … … … … ....49 Spinasterol 在 EI-MS 之可能裂解方式… … … … … … … … 51 5, 4’-Dihydroxy-3, 7, 3’-trimethoxyflavone 在 EI-MS 之可 能裂解方式… … … … … … … … … ...… … … … … ...… … … ..54 Triacontanoic acid 在 EI-MS 之可能裂解方式… … … … … 58 quercetin 在 EI-MS 之可能裂解方式… … … … … … … … … 63. 2.
(3) 表目錄 Table 2-1 Napralert 資料庫-民俗用法(ethnomedical usage)… … … … ..20 Table 2-2 Napralert 資料庫-生物活性(biological activities)… … … … ...22 Table 2-3 Napralert 資料庫-化學成分(presense of compound)… ..… … 26 Table 4-1 榼藤之 MTS 細胞毒性試驗… … … … … … … … … … … … ...45 Table 4-2. 榼藤莖部甲醇出抽(Ep-M)之急性毒性(LD50)及 95%可信 賴區間… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .47 Table 5-1 化合物 H-1 碳譜數據與文獻碳譜數據比對表… … … … .… .52 Table 5-2 化合物 CL-2 碳譜數據與文獻碳譜數據比對表… … … … ...55 Table 5-3 化合物 CL-4 碳譜數據與文獻碳譜數據比對表… … … ..… .60 Table 5-3 化合物 CL-4 碳譜數據與文獻碳譜數據比對表(續)...… … ..61 Table 5-4 化合物 EA-2 碳譜數據與文獻碳譜數據比對表… … … ...… 64 Table 5-5. EA-S 與 inositol 的 4 個立體異構物之碳譜比較… … … ....66. Table 5-6 小鼠 LD50 (mg/kg)之毒性分級… … … … … … … … … … … ..69. 3.
(4) 謝. 辭. 本論文得以順利完成，承蒙恩師張教授永勳博士、何教授禮剛博士 以及黃副教授順爵博士三位老師之諄諄教誨以及對論文的批閱斧正，於 此僅致上由衷謝忱。 此外，還要感謝邱年永老師協助植物之採集、鑑定與關愛，彭主任 文煌博士、何博士玉鈴老師，在藥理實驗方面的指導及協助，謝校長明 村博士、陳主任忠川博士、黃教授瑞東博士、謝教授文全博士、林副教 授宗平博士、陳副教授甘霖博士、張教授賢哲博士、童副教授承福博士、 蔡博士貴花老師及劉博士淑鈴老師之指導與關懷。 特別感謝、詹旭川博士、正賢學長、尚志學長、元照學長、華鑫學 長在實驗上的指導及平日生活上的提攜，及江芙美老師、馬蘇珊博士、 幼安學姊、國清學長、雅純學姊及志文學長等給予的寶貴意見，和冠宏、 峰賓、宏祺、炳賢、文雄、泰昇、琇米、素琴及雯茹等諸位同學平時的 相互勉勵，以及榮麒學弟、宗翰學弟、金松學弟、函嫈學妹等在藥理實 驗的大力協助，使的本實驗得以順利進行，僅此一並致上誠摯之謝意。 最後，感謝我最親愛的家人及朋友們，謝謝你們的支持與鼓勵，我 才能順利的完成學業。. 4.
(5) 榼藤（Entada phaseoloides (LINNE) MERRILL）之化學成分研究 陳兆群 中國醫藥學院 中國藥學研究所. 摘要 台灣產藥用植物榼藤（Entada phaseoloides. (L.) MERR.）為豆科. （Leguminosae）植物，又名鴨腱藤、大血藤、過崗龍等別名。廣泛分 部於台灣中部山區原始闊葉林、再生林或雨林地內。具有袪風除濕，活 血通絡，通經止痛，消腫解毒之效。治四肢麻木，風濕腰痛，風濕性關 節炎，跌打損傷，癰瘡腫毒，為固有之台灣民間藥，其毒性經本研究測 得其莖部甲醇抽取物之 LD50 為 170 mg/kg，在藥理活性方面，發現氯仿 層、乙酸乙酯層、正丁醇層等對 HONE-1（人類鼻咽癌細胞）有抑制活 性，而乙酸乙酯層和正丁醇層等對 NUGC（人類鼻胃癌細胞）也有抑制 活性。而榼藤甲醇粗抽物，在 DPPH 自由基清除能力之試驗發現正丁醇 層、P 層、甲醇粗抽等具有明顯之活性。因民間常用來治療風濕腰痛及 風濕性關節炎等，故本研究亦進行其鎮痛、抗炎之藥理活性評估，已確 認其莖部甲醇粗抽物在 5mg/kg 時，確實有明顯的抗炎及鎮痛作用。 5.
(6) 自榼藤莖部之甲醇出抽物分離出的成分有 spinasterol (H-1)、 5, 4’-dihydroxy-3, 7, 3’-trimethoxyflavone (CL-2)、triacontanoic acid (CL-3)、 spinasterol-β-D- glucoside (CL-4)、quercetin (EA-2)以及 EA-S (仍在解析 中)等成分，而上述化合物均為第一次由本植物中分離得的成分。. 綜合以上結果可知，榼藤莖部有明顯的細胞毒殺、抗氧化、抗炎與 鎮痛等作用。而由本實驗所分離出成分之藥理活性，則有待更進一步之 探討與確認。. 6.
(7) Studies on the Chemical Constituents of Entada phaseoloides (LINNE) MERRILL Jaw-Chyun Chen Institute of Chinese Pharmaceutical Sciences China Medical College. Abstract Entada phaseoloides (L.) MERR. is a native plant of Taiwan belonging to the Leguminosae family. It is a common folk medicine being used for tetraplegia, rehumatalgia, traumatic injury and ulcerative carbuncle. Our preliminary test showed that the CHCl3, EtOAc and n-BuOH fractions of E. phaseoloides exhibited significant cytotoxic activity against NUGC & HONE-1 cell lines. We also evaluated the DPPH free radical scavenging, anti-inflammatory and analgesic effects of the methanol extract of the stem of Entada phaseoloides. The LD50 of methanol extract was 170 mg/kg. The methanol extract showed significant anti-inflammation actions by inhibiting rat paw swelling. It also showed analgesisic effect by decreasing the frequencies of leg-licking in formalin induced pain in mice. In DPPH free radical scavenge screening test, the methanol extract, n-BuOH fraction and precipitate fraction showed significant antioxidant activity. From its methanolic extracts, six compounds were isolated : spinastero l(H-1), 5, 4’-dihydroxy-3, 7, 3’-trimethoxyflavone (CL-2), triacontanoic acid (CL-3), spinasterol-β-D-glucoside (CL-4), quercetin (EA-2) and compound EA-S. These compounds were first isolated from this plant and their structures were determined by spectroscopic methods. Our result indicated that extract Entada phaseoloides exhibted significant cytotoxic activity, antioxidant activity, analgesisic effect and anti-inflammatory effect. However, the active constituents responsible for the activities are still under investigation. 7.
(8) 8.
(9) 第一章. 緒. 言. 榼藤(Entada phaseoloides (L.) MERR.) 為鴨腱藤屬(Entada)一分布廣 泛之豆科(Leguminosae)植物，分布於東半球熱帶地區，而臺灣產之鴨腱 藤屬植物依 Flora of Taiwan 所載有 3 種，榼藤(Entada phaseoloides)為其 中一種 (1)。民間取其粗莖治風濕腰痛，風濕性關節炎，跌打損傷等(2)。 依據 2002 年 10 月向美國伊利諾大學 Narpralert 資料庫搜尋結果， 榼藤目前有 entadamide A, entadamide C(3), entadamide A ß-D-glucoside, methyl ester gentisic acid , 2 - hydroxy - 5-butoxy phenylacetic acid, 5-butoxy:2-ß-D-glucoside phenylacetic acid (4)等成分之分離報導。民間主 要用於治療痙攣、胃痛(5)。藥理活性方面則僅有毒魚作用(6)、殺軟體動 物活性(7)、葡萄糖運輸刺激作用(8)、殺甲殼類動物活性(9)之報導，並無明 確活性成分之相關研究報告，而且在本實驗之藥理活性的預試驗中可以 發現，榼藤確實具有鎮痛、消炎等活性，並試將其甲醇萃取物以不同溶 媒分劃後，分成正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等五層進行榼藤 之成分分離，並期望找出具有高度活性之成分，以確立其藥理上的療效 以及安全有效性，以提高其利用價值及開發台灣產藥用植物資源。. 9.
(10) 第二章. 總. 論. 第一節 榼藤之本草學考察. 一、釋名：. 榼：康熙字典云：音“克”；義：說文：酒器也。徐曰：榼之為言盍也；… 淮 南 子 ：雷水足以溢壺榼，… 貯水器。拾遺：榼藤如通草（藤名）(10) 榼藤子： 綱目曰：“其子象榼形，故名之”。其為藤本，故名榼藤子，簡稱榼子， 轉音稱合子。象豆者，言其豆大也 (11)。. 二、異名：. 榼藤子 南 方 草 木 狀 ：一名象豆 (12)。. 本 草 拾 遺 ：合子，榼子 (13)。. 開 寶 本 草 ：榼藤子 (14)。. 日 華 子 本 草 ：榼子 (15)。. 現代文獻及民間俗名 (15)： 南 方 主 要 有 毒 植 物 ：眼鏡豆。 海南：眼睛豆、牛眼睛。. 廣西：老鴉腎。 10.
(11) 榼藤 本草、現代文獻及民間俗名 (12 , 16 , 17,18)： 南 方 草 木 狀 ：榼藤。. 廣 西 中 草 藥 ：榼子藤、左右扭。. 廣 西 藥 物 植 物 名 錄 ：過山楓、大血藤、過山龍。 全國中草藥匯編：過江龍、扁龍、過崗扁龍、脊龍、扭龍、扭骨風。 廣東：牛腸麻。. 廣西：過山楓。. 內蒙古：木腰子。. 三、藥性. (13~15). ：. 榼藤子 味甘、澀，性平，無(有)毒。入胃、肝、大腸三經。 1. 本 草 拾 遺 ：味甘，平，無毒。 2. 開 寶 本 草 ：味澀、甘，平，無毒。 3. 常 用 中 草 藥 手 冊 ：微苦澀，性涼。 4. 廣 西 本 草 選 編 ：有毒。 5. 福 建 藥 物 志 ：微甘、辛，性平，無毒。 榼藤 味微苦、澀，性平，有毒。入腎經。 1. 常 用 中 草 藥 手 冊 ：微苦澀，微涼。 11.
(12) 2. 廣 西 本 草 選 編 ：性平，有毒。 3. 福 建 藥 物 志 ：微苦、辛，平。. 四、炮製. (15, 19). ：. 榼藤子 1.榼藤子 (1) 本 草 拾 遺 ：取子中仁，碎為粉，為熬。 (2) 聖惠方：以七八重濕紙裹煨，良久脹起，取去殼用肉，細切，碾羅 為散。 (3) 普 濟 方 ：擘破、炙。 2.榼藤子炭 (1) 聖 惠 方 ：燒、研。 (2) 本 草 衍 義 ：燒成黑灰，微存性。 榼藤 切片、曬乾或鮮用。. 五、附方. (15). ：. 1.聖惠方：治大腸風毒，瀉血不止；榼藤子三枚，以七八重濕紙裹煨， 良久脹起，取去殼用肉，細切，碾羅為散。每於食前，以黃耆湯調下一 錢。治喉痹腫痛；榼藤子燒研。酒服一錢。. 12.
(13) 2.經 濟 總 錄 榼 藤 散 ：治痔漏久不愈；榼藤子不以多少。 上一味，為散。先以蜜調少許，塗痔縷瘡上，次用溫酒調一錢，食前服。 3.普濟方蜀椒榼藤丸：治痔漏不限年月深淺，腫痛穿孔，膿血不止；蜀 椒(去目并合口，炒出汗，木杵輕搗，取紅)四兩，榼藤子(大者)一個(擘 破，炙)。上為末，棗肉丸，梧桐子大。每服十五丸至二十丸，空心溫酒 下。. 六、歷代本草原文. (11 ~ 27). :. 南方草木狀：榼藤依樹蔓生，如通草藤也。其子黑紫色，一名象豆，三 年方熟。其殼貯藥，歷年不壞。生南海。解諸藥毒。. 本草拾遺：木部中品-象豆 味甘、平，無毒。主五野雞病，蠱毒，飛尸， 喉痺。取子中仁碎為粉，微熬，水服一二匕亦和大豆澡，面出黑干。生 嶺南山林，作藤著樹，如通草藤。三年一熟。角如弓，袋子若雞卵。皮 紫色。剖中仁用之，一名榼 子 ，一名合 子 。主野雞病為上。. 開寶本草：木部下品-榼藤子味澀、甘，平，無毒。主蠱毒，五痔，喉痹 及小兒脫肛，血痢，並燒灰服，瀉血宜取一枚以刀剜內瓤，熬研為散， 空腹熱酒調二錢，不過三服必效。又宜入澡豆，善除黑干黑曾，其殼用 貯丹藥，經載不壞。按廣州記云：生廣南山林間，樹如通草藤也。三年 方始熟，紫黑色。一名象 豆 。今 附 13.
(14) 嘉祐補註神農本草卷之十四：木部下品-榼藤子味澀甘，平，無毒。主蠱 毒五痔喉痹及小兒脫肛血痢，並燒灰服，瀉血宜取一枚以刀剜內瓤熬研 為散，空腹熱酒調二錢不過三服必效。宜入澡豆，善除黑干黑曾，其殼用 貯丹藥,經載不壞。按廣州記云：生廣南山林間，樹如通草藤也。三年方 始熟，紫黑色。一名象豆。今附臣禹錫等謹按日華子云治飛尸入藥炙用。. 圖經本草：南藤即丁公藤也生南山山谷今出泉州榮州生依南木故名南 藤… 又有榼藤子生廣南山林間，木如通草藤。三年方始熟，紫黑色。一 名象 豆 。今醫家並稀用，故但附於其類。. 宋.經史證類備急本草：木部下品-南藤味辛溫無毒… 圖經曰：南藤即丁 公藤也生南山山谷今出泉州、榮州生依南木故名南藤… 又有榼藤子生廣 南山林間，木如通草藤。三年方始熟，紫黑色。一名象豆。今醫家並稀 用，故但附於其類。. 宋.經史證類大觀本草：木部下品-榼藤子味澀甘，平，無毒。主蠱毒五 痔喉痹及小兒脫肛血痢，並燒灰服，瀉血宜取一枚以刀剜內瓤熬研為 散，空腹熱酒調二錢不過三服必效。又宜入澡豆，善除黑干黑曾，其殼用 貯丹藥，經載不壞。按廣州記云：生廣南山林間，樹如通草藤也。三年 方始熟，紫黑色。一名象豆。今附臣禹錫等謹按日華子云治飛尸入藥炙 用。圖 經 文具南藤條下。 14.
(15) 本草衍義：榼藤子紫黑色微光大一二寸圓褊治五痔有功燒成黑灰微存性 米飲調服；人多剔去肉作藥瓢，垂於腰間。. 重修政和經史證類備用本草：木部下品-南藤味辛溫無毒… 圖經曰：南藤 即丁公藤也生南山山谷今出泉州榮州生依南木故名南藤… 又有榼藤子 生廣南山林間，木如通草藤。三年方始熟，紫黑色。一名象豆。今醫家 並稀用，故但附於其類。. 本草品彙精要卷之二十一：木部下品之下- 木之走：榼藤子無毒，蔓生； 榼藤子主蠱毒五痔喉痹及小兒脫肛血痢，並燒灰服，瀉血宜取一枚以刀 剜內瓤熬研為散，空腹熱酒調二錢不過三服必效宜入藻豆善除黑干黑 曾名 醫別錄 名 ○ 苗 ○. 地 ○ 時 ○. 收 ○ 用 ○ 味 ○ 性 ○ 氣 ○ 臭 ○ 主 ○ 製 ○ 治 ○. 象豆. 圖 經 曰樹如通草藤也三年子始熟紫黑色其殼用貯丹. 藥經載不壞今醫家亦稀用之衍 義 曰榼 藤 子 紫黑色微 光一二寸圓褊人多則去肉作藥瓢垂於腰間. 圖 經 曰生廣南山林間. 生 春生葉. 採 熟時取子. 暴乾. 子. 甘澀. 平緩. 氣厚於味陽中陰. 腥. 五痔血痢. 燒灰或炙用. 療日 華 子 云治飛尸. 15.
(16) 本草綱目 卷十八 草部蔓草類：榼藤子 宋 開寶。 〔校正〕自木部移入 此。 〔釋名〕象豆開寶。榼子日華。合子拾遺。(時珍曰)其子象榼形。故 名之。. ﹛集解﹜ (藏器曰) 按廣州記云：榼藤子生廣南山林間。作藤著樹。如 通草藤。其實三年方熟。角如弓袋。子若雞卵。其外紫黑。其殼用 貯丹藥。經年不壞。取其中仁入藥。炙用。(時珍曰) 子紫黑色微光。 大一二寸。圓而褊。人多剔去肉作藥瓢。垂於腰間也。 仁〔氣味〕濇甘。平無毒。 〔主治〕五痔蠱毒。飛尸喉痺。以仁為粉。 微熬。水服一二匕。亦和大豆澡面。去黑干黑曾。(藏器)。治小兒脫肛, 血痢，並燒灰服，瀉血宜取一枚以刀剜內瓤，熬研為散，空腹熱酒調二 錢，不過三服必效。開 寶 。解諸藥毒。(時 珍 )。 草 木 狀. 〔 附 方 〕 舊三新一： 喉 痹 腫 痛 。榼 藤 子 燒研。酒服一錢。聖 惠 方 五 痔 下 血 。榼 藤 子 燒存性。米飲服二錢。有功。寇 氏 衍 義 腸風下血。華陀中藏經。用榼藤子二個。不蛀皁莢子四十九個。燒存性 為末。每服二錢。溫酒下。少頃再飲酒一盞。趁口服。極效。聖惠方用 榼藤子三枚，厚重者。濕紙七重包煨，取去殼取肉為末。每服一錢。食 前，黃耆湯下。日一服。. 16.
(17) 〔附錄〕合子草。拾遺(藏器曰)子及葉有小毒。主蠱毒及蛇咬。搗傅瘡 上。蔓生岸傍。葉尖花白。子中有兩片如合子。. 植物名實圖考：榼藤子即象豆，詳南方草木狀。本草拾遺、開寶本草始 著錄。南 越 筆 記 云：子炒食，味佳。 雩婁農曰：余至? ，未得見斯藤。按記，子可食；膚可為榼以貯藥。何 造物憫斯人之勞，而為之代斲也？蓏之實有匏焉，小以酌，大以濟；木 之實有椰焉，小以飲，大以掬。古者祭祀器用匏，非僅尚其質，亦以見 天地之為人計者，纖悉具備用之，以示報也。彼爢天地之物，而不知天 地之心，必以暴殄致天罰。榼藤惜不植於嶺北。近世蜀中，模柚皮為器， 以無用為用，且輕而潔。南嶽? 大竹為甑，至省工力，若而人也，以嘗 巧也，不為病矣。. 植物名實圖考長篇：榼藤,其莢有白子數枚，殼扁，狀如榼子。水浸數日， 炒食之，味佳。. ＊註釋： 1.五野雞病：即五痔病，指牝痔、牡痔、血痔、? 痔、腸痔。 2.飛尸：出肘後方：飛尸者，游走皮膚，洞穿臟腑，每發刺痛，變作無 常也。. 3.. 黑干黑曾 ：指面部黑暗斑。 17.
(18) Fig. 2-1 歷代本草所繪榼藤圖. 18.
(19) Fig. 2-2 榼藤之本草系統圖. 19.
(20) 第二節 榼藤之植物學考察. 一. 榼藤之植物學分類(28, 29) 豆科 Leguminosae 含羞草亞科 Mimosoideae 鴨腱藤屬 Entada. 四、台灣產鴨腱藤屬(Entada)植物形態(1, 28, 29) 木質藤本或蔓性灌木。二回羽狀複葉，最先端小葉變形成卷鬚。穗 狀花序。花萼鐘形，萼齒 5。花瓣 5，離生或基部癒合。雄蕊 10，離生。 莢果下垂，扁平，厚，常超過 1 m 長，分節。 台灣有 3 種。. 種之檢索表 (1, 29) 1.小葉 2~4… … … … … … … … … ..… … … … … … … … … … … ..… 2.E. phaseoloides(榼藤) 1.小葉 6~8。 2.種子栗色，厚，中央平坦或有微小凸起。 3.種子盤狀，平坦，非常光滑，邊緣很少有凹槽… .3.a E. pursaetha var. pursaetha (鴨腱藤) 3.種子腎形盤狀，有微小皮屑狀鱗片，通常邊緣皆有凹槽… .3.b E. pursaetha var. formosana (台灣鴨腱藤) 2.種子黑棕色，較薄，中央有凸起… … … … … … … … … 1.E. parvifolia(恆春鴨腱藤). 20.
(21) 五、榼藤子(Entada phaseoloides)植物形態(2) 常綠木質大藤本。莖扭旋，枝無毛。二回羽狀複葉，長 10~25 cm， 頂生一對羽片變為卷鬚。葉 1~2 對羽片，每一羽片 3~4 對小葉，革質； 小葉歪斜橢圓形，長 3~8 cm，寬 3~4 cm，先端鈍，微凹，無毛。花綠 白色，穗狀花序單生或排列成圓錐狀，長 12~25 cm，花序軸密生黃色絨 毛。莢果木質，長達 1 m，寬 8~12 cm，成熟時逐節脫落。每節內有一 顆種子。種子近圓形，直徑 4~6 cm，暗褐色，彎曲，扁平，成熟後種皮 木質，有光澤，具網紋。花期 3~4 月，八月下旬果實成熟。在臺灣分佈 於北部低海拔闊葉林中。. Fig. 2-3 榼藤(Entada phaseoloides (L.) MERR.)植物. 21.
(22) 第三節 榼藤之 Napralert 文獻考察 依據 2002 年 10 月在美國伊利諾大學 Napralert 資料庫所查資料，全 世界與鴨腱藤屬植物相關所發表之文獻可分為民俗用法(ethnomedical usage)、生物活性(biological activities)、化學成分(presense of compound) 三大類：. 一、民俗用法(Ethnomedical usage)(詳見 Table 2-1) Entada abyssinica A. RICH. 根有治癲癇(epilepsy)(30)、睡眠病(sleeping sickness)等作用 (31)。 Entada africana GUILLMIN & PERROTTET 皮部：可用於當墮胎藥(abortifacient)(32,. 33). 、驅蠕蟲藥(vermifuge)(34)等，. 並有治支氣管炎(bronchitis)、咳嗽(coughs)、淋病(blennorrhagia)(35)等作 用。 葉：亦可當墮胎藥(abortifacient) (33)，具有毒魚(fish poison)(36)、治療腹瀉 (diarrhea)等作用 (35)。 根 ： 有 治 療 創 傷 (wounds)(37) 、 肝 病 (liver disease)(38) 、 眼 部 發 炎 (eye inflammations)(35)等作用。 Entada gigas (LINNE) FAWCETT & RENDLE 果實：有治療疼痛(aches)、燒傷(burns)(39)等作用。 全草：有治療風濕痛(rheumatism)(40)等作用。 Entada glandulosa PIERRE ex GAGNEP. 種子有抗癌等作用 (41)。 22.
(23) Entada monostachya DC. 地上部分有治療口腔發炎(inflamed mouth)、創傷(wounds)和挫傷(bruises) 等作用 (42)。 Entada phaseoloides (L.) MERR. (榼 藤 ) 全草有治療驚厥(cure convulsions)和胃痛(stomach ache)等作用 (6)。 Entada scandens BENTH. (攀 緣 性 榼 藤 ) 皮部：治療婦人產後便秘 (33)、糖尿病(diabetes) (43)等作用。 莖及葉：有治療鵝口瘡(thrush)(44)、經痛(menorrhalgia)(45)等作用。 果實：具有避孕(contraceptive)(46)等作用。 種 子 ：具有避孕 (contraceptive)、 幫 助 分 娩 (parturition)(32) 和 治 療 痔 瘡 (piles)、胃痛(stomachache)(47)、抗蛇毒 (antivenin)(48)、治風濕痛(rheumatic pains)、胸痛(chest pain)(49)、抗癌(anticancer)(41)、車禍後全身疼痛(50)、毒 魚(fish poison)(51)等作用。 子葉：有緩解眼睛流淚以及驅蟲(anthelminthic)(52)等作用。 全草：可當肥皂，並具有毒魚及治療胃痛等作用 (53)。 Entada spiralis RIDL. 種子具有治療胸痛等作用. (49). 。. Entada stuhlmannii (TAUBERT) HARMS 根據有壯陽(aphrodisiac)(54)及催乳(galactagogue)(55)等作用。 Entada sudanica SCHWIENF. 葉具有毒魚等作用 (36)。 23.
(24) 二、生物活性(Biological activities)(詳見 Table 2-2) Entada abyssinica A. RICH. 1.抗黴菌活性(Antifungal activity)：對犬小芽胞菌(Microsporum canis)有抑. 制活性(weak activity)(葉)(56)。 2.抗錐蟲活性(Antitrypanosomal)：對 Trypanosoma brucei 有明顯抑制活性 (根、莖)(31)。 3.抑制細胞增生(Cell proliferation inhibition)：對 Cells-WI-38 有抑制活性 (weak activity) (根)(57)。 4.抗菌活性(Antibacterial activity) (58, 59)：對腸球菌屬(Enterococcus species)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)等菌有明顯抑制活性，而 對 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)、 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli)、 沙門桿菌屬 (Salmonella species)、克萊勃士桿菌屬(Klebsiella species)等菌也有抑制活性(weak activity)(莖皮)。. Entada africana GUILLMIN & PERROTTET 1. 抗菌活性(Antibacterial activity)：對霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(60)、 白喉桿菌(corynebacterium diphtheriae)、變形桿菌(Proteus vulgaris)、 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 、 沙 門 桿 菌 屬 (Salmonella species)(61) 、 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 、 大 腸 桿 菌 (Escherichia. 24.
(25) coli) 、 痢 疾 桿 菌 (Shigella dysenteriae)、 鏈 球 菌 屬 (Streptococcus species) 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)、 糞 鏈 球 菌 (Streptococcus faecalis)等菌有明顯抑制活性(莖、葉、種子)(62-64)。 2. 抗氧化活性 (Antioxidant activity)： 有明顯抗氧化活性 (antioxidant capacity=20.4) (葉)(65)。 3. 抗肝毒性(Antihepatotoxic activity)：對四氯化碳所誘導的肝毒性有明 顯 抑 制 的 活 性 ， 如 對 其 誘 發 之 鹼 性 磷 酸 ? (ALP ; Alkaline phosphatase)、glutamate – oxaloacetate – transaminase 以及 glutamate– pyruvate–transaminase 的 升 高 和 高 三 酸 甘 油 脂 血 症 (hypertriglyceridemia)也有明顯之抑制活性(根)(38)。 4. 抗病毒活性：對 B 型肝炎表面抗原有抑制活性(Hepatitis B surface antigen inactivation) (根) (38)。 5. 毒性：有明顯毒魚活性，且具有毒殺軟體動物活性 (Molluscicidal activity)對 Biomphalaria pfeifferi 及 Bulinus truncates 有毒殺活性，但 對天竺鼠(guinea pig)無明顯毒性(葉) (66, 67)。 Entada phaseoloides (L.) MERR. 1. 降 血 糖 活 性 ： 有 刺 激 葡 萄 糖 運 輸 的 活 性 (Glucose transport stimulation)(8)。 2. 毒殺軟體動物活性(Molluscicidal activity)：對 Oncomelania hupensis Quadrasi 有毒殺活性 (莖、種子)(5, 7, 68)。 25.
(26) 3. 抗甲殼類活性(Anticrustacean activity) (9)：對 Artemia salina 有明顯抑 制活性 (莖、種子)。 Entada polystachya (L.) DC. 抗菌活性(Antibacterial activity) (69 ~71)：對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)等菌有明顯抑制活性 (葉)。 Entada scandens BENTH. 1. 抗 菌 活 性 (Antibacterial activity). (72~73). ：對金黃色葡萄球菌. (Staphylococcus aureus)、卵黃色八疊菌(Sarcina lutea)等菌有明顯抑制 活性 (莖、果實)。 2. 抗腫瘤活性(Antitumor activity)：對 Sarcoma-WM256 有抑制活 (種子) (72, 74). 。. 3. 其他：有鬆弛子宮作用(Uterine relaxation effect). (32, 49). 及抑制血壓升. 高素轉換? (Angiotensin-converting enzyme inhibition)等 活 性 (種 子)(75)。 4. 毒性：LD50：ip，小鼠，0.5 g/kg(72)；具毒魚及毒殺軟體動物(Tubifex species)等活性 (果實)(76)。 Entada spiralis RIDL. 有 促 進 人 類 血 球 凝 集 活 性 (hemagglutinin activity) 及 降 低 低 血 壓 (hypotensive)等活性 (種子) (49, 77)。 Entada sudanica SCHWIENF. 具有毒魚活性，但對天竺鼠(guinea pig)無明顯毒性 (葉)(36)。. 26.
(27) 三、化學成分(Presense of Compound)(詳見 Table 2-3) Diterpene Type (57, 78): Iso-kolavenol, Trans-communic acid Triterpene Type (74, 79, 80, 81, 82, 83) , : Entada scandens prosapogenin A, Lupeol, Entada saponin II, Entada saponin III, Entada saponin IV, Entanin, Entagenic acid, Entada-saponin (79) Steroid Type : β-Sitosterol Lipid Type (84~86) : Arachidic acid , Behenic acid , Dilinolenin , Diolein , Dioleolinolein , Lauric acid , Linoleic acid , Linolenic acid, Myristic acid , Oleic acid Oleodilinolein , Oleolinolein , Palmitic acid , Stearic acid , Trilinolein , Triolein Sulfur compound Type. (3, 4, 87, 88). : Entadamide A, Entadamide B ,. 、. Entadamide C , Entadamide A - β -D - glucoside. Benzenoid Type. (4, 89). : Methyl ester - homo - gentisic acid, 2- Hydroxy5-butoxy - phenylacetic acid, 5 - Butoxy phenylacetic acid - 2 - β - D - glucoside , Phaseoloidin. Table 2-1 民俗用法(Ethnomedical usage) 學名 Entada abyssinica. 用部. 地區. dried root. Tanzania. 運用 Used for epilepsy.. 文獻 (30). Used if sickness has been prolonged. dried root Entada africana. bark. Uganda. Used to treat sleeping sickness.. Central Africa Used as an abortifacient. (31) (32). bark. Guinea. Used as an abortifacient. (33). bark. Niger. Used as a vermifuge. (34). bark. West Africa. Used as an abortifacient. (32). dried bark. Senegal. Used for bronchitis.. (35). Used for coughs. Used for blennorrhagia and sores. leaf. Guinea. Used to provoke abortion,prepared into paste with soap. 27. (33).
(28) leaf. Sudan. LEAF. West Africa. dried leaf. Senegal. Used as a fish poison. (36). Used as an abortifacient. (32). Used for sores. (35). Used for diarrhea. root. Entada gigas. Guinea-Bissau Used to treat wounds.. dried root. Mali. dried root. Senegal. fruit. Nicaragua. (37). Used for liver disease.. (38). Used for eye inflammations.. (35). Used for aches. (39). Used for burns. part not. Cameroon. Used for rheumatism.. (40). specified Entada glandulosa. dried seed. Thailand. Used for cancer. (41). Entada monostachya. dried bark. Mexico. Used in baths for children with inflamed mouth, wounds. (42). + leaf Entada phaseoloides. dried entire. or bruises. Tonga. plant Entada scandens. bark. Used to cure convulsions. (6). Used to treat stomach ache Guinea. Decoction used by women after childbirth, as an enema. (33). or bath dried bark. Philippines. cotyledons. Nepal. entire plant fruit leaf + stem. Used for diabetes.. (43). Used as an anthelminthic.. (52). Panama. Used as a fish poison and soap.. (53). Australia. Eaten raw or roasted as a contraceptive by woman. (46). Cook Islands Used to treat oral thrush in children.. (44). leaf + stem. Vanuatu. Used for menorrhagia.. (45). seed. Australia. Used as an aid for difficult parturition. (32). Used by the aborigine as a contraceptive seed. India. Used for stomachache.. (47). Used for piles.. dried seed. India. Used as an antivenin.. (48). Used to relieve body pain after accidents.. (50). Used as a food during famine. Used as a fish poison. (51). dried seed. Malaysia. Used for chest pain.. (49). dried seed. Thailand. Used for cancer. (41). Entada spiralis. dried seed. Malaysia. Used for chest pains.. (49). Entada stuhlmannii. root. Africa. Roots boiled,decoction drunk twice a day as an. (54). aphrodisiac. 28.
(29) Entada sudanica. root. East Africa. leaf. Sudan. Used as a galactagogue(internal and external). (55). Used as a fish poison. (36). 29.
(30) Table 2-2 生物活性(Biological activities) 學名. 用部(地區). Entada abyssinica dried leaf (Rwanda). 活性 Antifungal activity Antiviral activity. 文獻 Microsporum canis (W). (56). 1. Virus-measles (E) 2.Virus-coxsackie (I) 3.Virus-herpes (unspec) (I) 4.iVirus-poliovirus(unspec) (I) 5.Virus-semlicki-forest (I). dried root (Uganda). dried rootbark. Antitrypanosomal activity. Trypanosoma brucei (A). Cell proliferation inhibition. Cells-wi-38 (W). Antitrypanosomal activity. (57). Trypanosoma brucei rhodesiense (A) (57). (Tanzania) dried stembark. Antibacterial activity. (Kenya). 1.Enterococcus species (A). (58). 2.Pseudomonas aeruginosa (A) 3.Staphylo coccus aureus (W) 4.Escherichia coli (W) 5.Salmonella species (W) 6.Klebsiella species (W). dried stembark. Antimycobacterial activity. Mycobacterium species (I). (58). Antibacterial activity. Helicobacter pylori (I). (58). Antibacterial activity. Vibrio cholera (A). (60). Antifungal activity. Vibrio cholera (A). (Kenya) Entada africana dried bark (Nigeria). dried bark (Nigeria). Antibacterial activity. 1.Corynebacterium diphtheriae (A) (61) 2.Pseudomonas aeruginos (A) 3.Salmonella species (A) 4.Streptococcus species (A) 5.Nneisseria species (I) 6.Staphylococcus aureus (I) 7.Streptobacillus species (I). sun dried bark. Antibacterial activity. (Senegal). 1.Bacillus subtilis (A). (62). 2.Staphylococcus aureus (A) Antifungal activity. Aspergillus niger (I). Leaf (Nigeria). Antioxidant activity. (A). (65). leaf (Sudan). Fish poison. (A). (36). Toxic effect(general). (I). 30.
(31) dried leaf + seed. Antibacterial activity. (Nigeria). 1. Proteus vulgaris (A). (63). 2.Salmonella species (A) 3.Staphylococcus aureus (A) 4. Streptococcus species (A) 5. Escherichia coli (I) 6.Klebsiella species (I) 7. Pseudomonas aeruginosa (I). dried leaf + seed. Anticrustacean. Artemia salina (I). Antiyeast activity. Candida albicans (I). (63). 1.Staphylococcus aureus (A). (37). (Nigeria) dried root. Antibacterial activity. (Guinea-Bissau). 1. Vibrio cholera (A) 3.Escherichia coli (W) 4.Streptococcus faecalis (A) 5.Shigella dysenteriae (A) 6. Pseudomonas aeruginosa (I) 7.Salmonella typhimurium (I). Entada africana. Antiyeast activity. Candida albicans (I). dried root (Mali). Alkaline phosphatase inhibition. Plasma (A). dried root (Mali). Antibacterial activity. 1.Haemophilus influenzae (I). (38) (64). 2.Moraxella catarrhalis (I) 3.Staphylococcus aureus (I) 4.Streptococcus pneumoniae (I) 5.Staphylococcus pyogenes (I) 6.Haemophilus influenzae (I) 7.Moraxella catarrhalis (I) 8.Staphylococcus aureus (I) 9.Staphylococcus pyogenes (I) 10.Streptococcus pneumoniae (I). dried stem (Sudan). Antihepatotoxic activity. (A). Antihypertriglyceridemia effect. Liver homogenates (A). Glutamate-oxaloacetate-transaminase inhibition. Plasma (A). Glutamate-pyruvate-transaminase inhibition. Plasma (A). Hepatitis b surface antigen inactivation. (A). Miscellaneous effects. Liver. homogenates(A). Nucleotidase induction. Liver. homogenates(A). Cytotoxic activity. 31. Ca-9kb (I). (38). (66).
(32) Entada africana. dried stembark. Molluscicidal activity. (Sudan). 1.Iomphalaria pfeifferi (A). (67). 2.Bulinus truncates (A). Entada. bark (Philippines). Glucose transport stimulation. Cells-ehrlich (W). (8). phaseoloides. commercial sample. Fish poison. Oryzias latipes (A). (68). of bark (Philippines). Molluscicidal activity. Oncomelania hupensis quadrasi (E). Molluscicidal activity. Oncomelania hupensis quadrasi (A) (7). Entada. fresh bark (Malaysia). Anticrustacean activity. seed (Philippines). Molluscicidal activity. Oncomelania hupensis quadrasi (W) (68). dried bark (Trinidad). Antibacterial activity. 1.Staphylococcus aureus (A). polystachya. Artemia salina (A). (9). (69). 2.Streptococcus faecalis (A) 3.Salmonella typhimurium (E) 4.Escherichia coli (I) 5. Pseudomonas aeruginosa (I) 6.Staphylococcus epidermidis(I) leaf (Puerto Rico). Insecticide activity. Ierotoma ruficornis, adults (I). (70). leaf (Puerto Rico). Larvicidal activity. 1.Diaphania hyalinata, larvae(I). (70). 2.Diaphania hyalinata, larvae (I) 3.Laphygma frugiperda, larvae (I) 4.Plutella maculipennis, larvae (I) petiole (Puerto Rico). Insecticide activity. Serotoma ruficornis, adults (I). Larvicidal activity. 1.Diaphania hyalinata,larvae (I). (70). 2.Laphygma frugiperda,larvae (I) 3.Plutella maculipennis, larvae (I) seed (Mexico). stem (Puerto Rico). Hemagglutinin activity. Rbc (I). Trypsin inhibition. (A). Insecticide activity. Serotoma ruficornis, adults (I). Larvicidal activity. (71). (70). 1.Diaphania hyalinata,larvae (I) 2.Laphygma frugiperda,larvae (I) 3.Plutella maculipennis, larvae (I). Entada scandens aerial parts (India). Analgesic activity Antibacterial activity. (I) 1.Bacillus subtilis (I) 2. Escherichia coli (I) 3.Salmonella typhosa (I) 4.Staphylococcus aureus(I) 5. Agrobacterium tumefaciens (I). Anticonvulsant activity. 32. (I). (72).
(33) Antifungal activity. 1. Microsporum canis (I) 2. Trichophyton mentagrophytes (I) 3.Aspergillus niger (I). aerial parts (India). Antiinflammatory activity. (I). Antispasmodic activity(unspecified type). Ileum (I). Antitumor activity. Leuk-p388 (I). Antiviral activity. Virus-vaccinia (I). Antiyeast activity. Candida albicans (I). Antiyeast activity. Ryptococcus neoformans (I). Barbiturate potentiation. (I). Diuretic activity. (I). Hypoglycemic activity. (I). Hypothermic activity. (I). Semen coagulation. Sperm (I). Spermicidal effect. Sperm (I). Toxicity assessment(quantitative) dried fruit. dried rootbark. Ld50 0.5 gm/kg (A). Molluscicidal activity. Tubifex species (A). Antibacterial activity. 1.Sarcina lutea(A). (76). (73). 2.Staphylococcus aureus (I) Antifungal activity(plant pathogens). Aspergillus niger (I). Antimycobacterial activity. Mycobacterium phlei (I). Antiyeast activity. Saccharomyces cerevisiae (I). seed. Antitumor activity. Sarcoma-wm256(im) (A). (74). seed (Australia). Uterine relaxation effect. Uterus(unspec.cond) (A). (32). seed (India). Angiotensin -converting enzyme inhibition. (A). (75). dried seed (Malaysia). Hypotensive activity. (I). (49). Uterine stimulant effect. Uterus(preg) (I). dried stembark. Antibacterial activity. (Nigeria). Entada sudanica. mouse. Fish poison. (Nigeria). Entada spiralis. ip. 1.Sarcina lutea (A). (73). 2.Staphylococcus aureus (A) Antifungal activity(plant pathogens). Aspergillus niger (I). Antimycobacterial activity. Mycobacterium phlei (I). Antiyeast activity. Saccharomyces cerevisiae (I). seed (Malaysia). Hemagglutinin activity. (A). (77). dried seed (Malaysia). Hypotensive activity. (A). (49). Uterine stimulant effect. (I). Fish poison. (W). leaf (Sudan). 33. (36).
(34) Toxic effect(general). (I). Table 2-3 化學成分(Presense of Compound) 學名 Entada abyssinica. Entada gigas. 化合物. 主結構. 用部. 地區. 文獻. Trans-communic acid Diterpene Type. stembark. Ethiopia. (78). Iso-kolavenol. Diterpene Type. rootbark. Tanzania. (57). Arachidic acid. Lipid Type. seed oil. West africa. (84). Lipid Type. seed oil. West africa. (84). Sulfur compound Type. flowers. Thailand. (88). Sulfur compound Type. seed. Indonesia. (4). seed oil. India. (85). Behenic acid Linoleic acid Linolenic acid Oleic acid Palmitic acid Stearic acid Entada mannii. Behenic acid Lauric acid Linoleic acid Linolenic acid Oleic acid Palmitic acid Stearic acid. Entada phaseoloides Entadamide A Entadamide C Entadamide A-β-D-glucoside Methyl. Benzenoid Type. ester-homo-gentisic acid 2-Hydroxy-5-butoxy-ph enylacetic acid 5-Butoxy-phenylacetic acid-2-β–D–glucoside Entada scandens. Arachidic acid. Lipid Type. Behenic acid Dilinolenin Diolein. 34.
(35) Dioleolinolein Entada saponin II. Triterpene Type. bark. Japan. (80). Entada saponin IV. Triterpene Type. bark. Japan. (80). bark. Philippines. (81). Entada saponin -II. Triterpene Type. bark. Philippines. (81). Entada saponin -III. Triterpene Type. bark. Philippines. (81). Entada scandens. Triterpene Type. seed. India. (79). Entada-saponin. Triterpene Type. seed. Not stated. (74). Entadamide A. Sulfur compound Type. kernel. Thailand. (87). kernel. Thailand. (3). kernel. Thailand. (88). kernel. Thailand. (87). seed. India. (89). kernel. India. (82). seed. India. (79). seed oil. Bangladesh. (86). seed oil. India. (85). seed oil. India. (85). seed. India. (79). prosapogenin A. Entadamide B. Entagenic acid. Sulfur compound Type. Triterpene Type. Entanin. Triterpene Type. Linoleic acid. Lipid Type. Linolenic acid. Lipid Type. Lupeol. Triterpene Type. Myristic acid. Lipid Type. seed oil. India. (85). Oleic acid. Lipid Type. seed oil. Bangladesh. (86). seed oil. India. (85). Oleodilinolein. Lipid Type. seed oil. India. (85). Oleolinolein. Lipid Type. seed oil. India. (85). Palmitic acid. Lipid Type. seed oil. India. (85). Phaseoloidin. Benzenoid Type. seed. India. (89). β-Sitosterol. Steroid Type. seed. India. (79). Stearic acid. Lipid Type. seed oil. India. (85). Trilinolein. Lipid Type. seed oil. India. (85). Triolein. Lipid Type. seed oil. India. (85). Phytochemical screening 學名 Entada africana. 化合物 Alkaloids absent. 用部. 文獻. bark. (34). leaf bark. 35. (61).
(36) 第三章 第一節. 實驗部分 實驗材料. 一、實驗試藥及儀器 1.溶媒 (1) 正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、苯、乙醚、正丁醇等溶媒(以上購 自 Merck)。 (2) 乙醇為台灣省菸酒公賣局之 95%酒精。 (3) 測核磁共振(NMR)光譜所用之溶媒 CDCl3 ( Deuterated chloroform )、 MeOH-d4 (Deuterated methanol)、DMSO-d6 ( Dimethyl sulfoxide )、 D2O、Acetone-d6、Pyridine-d6 等均為光譜級(以上購自 Merck)。 2.顯色劑 (1) 10 % Sulfuric acid spray reagent。 3.薄層層析(Thin Layer Chromatography) TLC plate：Kieselgel 60 F254 silica gel pre-coated aluminum plate，厚度 0.2 mm (Merck)。 4.管柱色層層析(Column Chromatography) 以 Pyrex 或 Merck 公司生產之不同型號管柱 填充物質：Kieselgel 60 70~230 mesh (Merck)，Kieselgel 60 230~400 mesh (Merck)。 5.試藥 (1) 醋酸、硫酸、硝酸(島久藥品株式會社)、無水硫酸鈉、氯化鐵、vanillin、 醋酸鈉、硼酸、三氯化鋁、氫氧化鈉等，均為試藥級。 (2) 福馬林(formalin)購自日本株式會社。 (3) λ-角菜膠(λ-carrageenin)、Indomethacin 均購自 Sigma。. 實驗儀器 (1) 迴轉式濃縮機：Rotavapor R-114 (Büchi)。 (2) 烘箱：CHANEL Drying Oven OV602。 (3) 電子乾燥箱：用於保存 TLC 片、NMR 溶媒及紅外線譜用之 KBr。 (4) 電子天平：Mettler AJ100 and Metter Toledo PB 602。 (5) 電熱板：CORONING MODEL PC-320。 (6) 超音波震盪器： (i) BANDELIN SONOREX SUPER PK1028BH (ii) AQUUSONIC TM MODEL 150D。 (7) 玻璃展開槽 120mm x 150mm 及 220mm x 70mm。 (8) 紫外線燈 CAMAG Universal UV lamp，波長 254 nm 及 366 nm。 36.
(37) (9) 微量熔點測定器 Electrothermal’s Series IA 9100 and IA9200 Digital Melting point， 測定範圍 50.00-500.0℃之間，其溫度未經校正。 (10) 紅外線分光光譜儀 (Infared Spectrophotometer) 使用 Nicolet Impact 400 FT-IR Spectrophotometer 測定，固體以乾 的 KBr 粉未混合均勻，光譜單位為波數(cm-1)(中國醫藥學院)。 (11) 質譜儀(MS) (i) VG PLATFORM II Mass Spectrometer，離子化電壓為 70 eV (中 國醫藥學院) (ii) JOEL JMS-SX/SX 102A Tandem Mass Spectrometer (中興大學)。 (12) 核磁共振光譜儀 (i) Bruker DPX-200 FT-NMR (中國醫藥學院)。 (ii) Bruker DPX-400 FT-NMR(中國醫藥學院)。 Internal standard 為 Tetramethy Silane (TMS)， 化 學 位 移 (Chemical shift)以δ表示，單位 ppm，以 J 表示偶合常數 (coupling constant) ， 單 位 Hz 峰 線 訊 號 以 ”s”表 示 單 峰 (singlet)，”d”表示雙重峰(doublet)，”t”表示三重峰(triplet)，”q” 表示四重峰(quantet)，”m”表示多重峰(multiplet)，”br”表示寬 峰。 (13) 浮腫測定儀器(UGO BASILE Plethysmometer 7140)。. 二、實驗動物 雄性 Wistar 系大白鼠體重 150~180 g、雄性 ICR 系鼷鼠體重 20~30 g 均飼養於互助大樓動物中心。動物來源：購自行政院國科會國家實驗動 物繁殖及研究中心。. 37.
(38) 第二節. 實驗藥材來源及其提取與分離. 一、植物採集及前處理 植物榼藤(Entada phaseoloides (L.) MERR..)於民國九十年十月南投 縣魚池鄉王德伸先生協助採集。經中國醫藥學院 邱年永老師鑑定，確 認為豆科(Leguminosae)之榼藤(Entada phaseoloides (L.) MERR. )後，先將 種子、莖與葉分開處理後，開始進行成分分離實驗之研究。. 二、提取與分離 陰乾後之榼藤約 6.79 公斤。將莖使用甲醇於室溫下浸泡一週後，經 過濾取濾液減壓濃縮，殘渣再經甲醇浸泡，如此反覆浸泡抽取 4 次；莖 的甲醇粗抽物約 678.99 公克(Ep-M)，抽出率約為 10%。再將莖的甲醇粗 抽物，加入蒸餾水形成懸浮液。再以正己烷分劃分離正己烷層合併減壓 濃縮至乾後得正己烷層(Ep-H)共 42.37 公克，以氯仿層和水層分劃分離 出氯仿層(Ep-C)共 7.48 公克，以乙酸乙酯和水層分劃分離出乙酸乙酯層 (Ep-E)減壓濃縮後為 19.28 公克，以正丁醇和水層分劃分離出正丁醇層 (Ep-B)減壓濃縮後為 530.66 公克，最後剩餘水層(Ep-W)為 79.2 公克。. 38.
(39) 成分分離： 利用管柱色層層析法(Column Chromatogyaphy)，以 Silica gel(70~230 mesh 及 230~400 mesh)充填在玻璃管柱內為固定相，以不同 濃度溶媒沖提，並利用再結晶所得之化合物。. 分離出之成分如下列： 正 己 烷 層 分離出之成分有： Spinasterol 氯 仿 層 分離之成分有： 5, 4’-Dihydroxy-3, 7, 3’-trimethoxyflavone Triacontanoic acid Spinasterol-β-D-glucoside. 乙 酸 乙 酯 層 分離之成分有： Quercetin EA-S(仍在解析中). 39.
(40) Stembark of Entada phaseoloides (L.) MERR. (6.79kg) Extracted with MeOH and evaporated (678.9g) Suspension in H2 O Extracted with n-Hexane. n-Hexane layer Evaporated. H2 O layer Extracted with CHCl3. (Fr.H) 42.3g. CHCl3 layer H-1, 72.7 mg. H2 O layer. Evaporated (Fr.C) 7.48 g. Extracted with EtOAc. EtOAc layer CL-2, 40.2 mg CL-3, 8.5 mg CL-4, 60.7 mg. H2 O layer. Evaporated. (Fr.E) 19.2 g. n-BuOH layer. Evaporated. EA-2, 62.3mg EA-S EA-SA. (Fr.B) 530 g. H2 O layer. Evaporated. (Fr.W) 79 g. Fig. 3-1 榼藤(Entada phaseoloides (L.) MERR.)莖之抽提流程圖. 40.
(41) 第三節、藥理實驗方法 一、細胞毒殺活性試驗 (90 ~ 92) 此部分實驗為委託國家衛生研究院代為進行細胞毒殺活性測試，利 用細胞毒殺活性試驗，將人類癌細胞植入 96 孔培養皿中。經過一夜的 適應，在每孔中加入置於無胎牛血清、最終濃度為 50 µg/ml 之待測物。 三天後，由 MTS 還原試劑決定細胞存活能力。Actinomycin D 10 µM 及 0.1 % DMSO 為正對照組及控制組，其結果與 DMSO 相比，換算成百分 比。. MTS: 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethyl-thiazolyl)-3-(4-sulfophenyl) tetrazolium. 培養人類腫瘤細胞： NUGC(胃癌細胞)、HONE-1(鼻咽癌細胞)在 Dulbecco’s modified Eagle’s 培養基培養。(5 % CO2 濕式培養基，維持在 37℃，外加 10 % 胎牛血清 和非必需胺基酸)。. 41.
(42) 二、 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)自由基清除能力之試驗 實驗係採用 Blois (93)及 Shyu YS(94)之方法，在 10 mL 的試管中加入各 種 不 同 濃 度 及 不 同 各 層 (Water, n-Butanol, Ethylactate, Chloroform, n-Hexane)之萃取物(50 µg/ml ~ 500 µg/ml) 0.3 ml 再加入 0.2mL 之甲醇。 此時將 Sample 分成兩組，一組為空白實驗，一組則加入 2.5 mL 的 DPPH 甲醇溶液至總體積為 3 mL。將兩組溶液置於室溫反應 90 分鐘，之後分 別 將各組使用 516 nm (A516) 吸收波長偵測並記錄 。本實驗使用 Quercertin 及 a-tocopherol 作為本實驗的正對照之標準品。. DPPH scavenging effect 計算公試：. Scavenging effect (%) =. [A0 – (A – Ab)] A0. A0 : A516 of DPPH without sample A : A516 of sample and DPPH Ab: A516 of sample without DPPH. ．. DPPH : free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. 42. × 100 %.
(43) 三、急性毒性試驗 實驗係採用 Litchfield 和 Wilcoxon(95)之方法，使用體重 20~30 g ICR 雄性鼷鼠，榼藤經甲醇抽取之粗抽物（Ep-M） ，以腹腔注射給藥後， 連續觀察 72 小時，紀錄其中毒及死亡之情形，求得半數之致死劑量(LD50) 及其 95%可信度。. 四、福馬林誘發舔足實驗 採用 Dubuisson 及 Dennis (96)之實驗方法，選擇 20~25 g ICR 雄性鼷 鼠，隨機分組，每組 8 隻，稱重後以腹腔注射給藥。實驗組則分別腹腔 注射給予不同劑量之榼藤甲醇粗抽物 ， 控制組則給予相同體積之 vehicle。30 分鐘後於鼷鼠右後足背皮下注射 25 µL 之 1%福馬林，觀其 舔右後足所花時間，每五分鐘記錄一次結果，其中 0~5 分鐘稱前期(early phase)，15~40 分鐘稱後期(late phase)，觀察紀錄 40 分鐘。統計比較控 制組、給藥組及 indomethacin( 4 mg/kg)對照組之差異。. 43.
(44) 五、抗炎實驗 依 Winter(97)等人之方法，選用 150~180 g Wistar 系雄性大白鼠，每 組 7~8 隻，於右後足跟作記號，並測量拾藥前之體積，而後腹腔給予不 同濃度之榼藤甲醇粗抽物，控制組則給予相同體積之 vehicle，半小時後 於右後足蹠後皮下注射致炎劑 0.1 mL 1%λ-carrageenin，誘發足蹠浮腫 後，連續以 plethysmometer 測其排水量，每 30 分測一次，連續五小時， 比較控制組、給藥組及 indomethacin (4 mg/kg)對照組之差異，其中浮腫 率計算如下： 浮腫率(edema rate)=(B-A)/A× 100% A：注射前之排水量 B：給藥後測得之排水量. 44.
(45) 第四章. 結. 果. 第一節 各層成分之理化性質與光譜. 【一】 化合物 H-1: 1. 外觀：白色針晶(氯仿)。 2. mp：166~168 ℃。 3. TLC：Rf＝0.58 (CHCl3 : EtOAc ＝8:1) 4. IR：ν max(KBr) cm-1:(Chart 1) 3397, 2933, 2868, 1719, 1445, 1381, 1219, 1038, 969, 772 5. EI-MS (70 eV) m/z (%)：(Chart 2) 412 (M+, 15) 272 9) 233 (2) 81 (56). 6.. 397 (5) 271 (36) 219 (1) 55 (100). 369 (4) 255 (14) 147 (19). 1. H-NMR (in CDCl3; 200 MHz) ppm：(Chart 3) 5.23 5.03~5.15 3.62 1.01 0.86~0.80 0.78 0.55. (1H, br, H-7) (2H, m, H-22, 23) (1H, m, H-3) (3H, H-21) (9H, m, H-26, 27, 29) (3H, s, H-19) (3H, s, H-18). 45. 302 (2) 248 (1) 107 (38).
(46) 7.. 13. C-NMR (in CDCl3; 50.3 MHz) ppm：(Chart 4). 11.8 20.8 25.2 31.6 39.2 49.2 70.8 139.3. (C-29) (C-21) (C-28) (C-2) (C-12) (C-9) (C-3) (C-8). 12.0 21.1 28.3 34.0 40.0 51.0 117.2. (C-18) (C-26) (C-16) (C-10) (C-5) (C-24) (C-7). 12.8 21.3 29.4 36.9 40.6 54.9 129.1. (C-19) (C-11) (C-6) (C-1) (C-20) (C-14) (C-23). 18.8 22.8 31.2 37.7 43.0 55.7 137.9. 8. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4) δ：(Chart 5) CH3 ： CH2 ： CH：. 12.0, 12.2, 12.9, 18.9, 21.3, 21.0 21.5, 23.0, 25.3, 28.5, 29.6, 31.8, 37.1, 37.9, 39.4 31.4, 40.2, 40.8, 49.4, 51.2, 55.1, 55.8, 71.0, 117.4, 129.4, 138.1. 46. (C-27) (C-15) (C-25) (C-4) (C-13) (C-17) (C-22).
(47) 【二】 化合物 CL-2: 1. 外觀：黃色針晶(氯仿&甲醇) 。 2. mp：171~172 ℃。 3. TLC： Rf＝0.4 (CHCl3) 4. IR：ν max(KBr) cm-1：(Chart 6) 3711, 2972, 2864, 1645, 1497, 1017. 5. EI-MS (70 eV) m/z (%)：(Chart 7) 344 (M+, 10) 283 (3) 174 (1) 122 (52). 6.. 329 (2) 243 (6) 151 (29) 79 (77). 301 (14) 175 (4) 146 (2) 69 (95). 1. H-NMR (in CDCl3; 400 MHz) ppm：(Chart 8) 3.87~3.99 6.35 6.44 6.98 7.69 7.74 12.63. 7.. 343 (9) 258 (5) 170 (2) 108 (36). (9H, s, 3, 7, 3’-OCH3 ) (1H, d, J= 2.2 Hz, H-6) (1H, d, J= 2.2 Hz, H-8) (1H, d, J= 8.3 Hz, H-5’) (1H, dd, J= 2.1, 8.3 Hz, H-6’) (1H, d, J= 2.1 Hz, H-2’) (1H, s, 5-OH). 13. C-NMR (in CDCl3; 100 MHz) ppm：(Chart 9). 55.8 92.1 110.4 123.6 148.8 162.0. (3-OCH3 ) (C-8) (C-2’) (C-6’) (C-4’) (C-9). 56.0 97.9 114.3 139.2 155.6 165.5. (7-OCH3 ) (C-6) (C-5’) (C-3) (C-2) (C-7). 47. 60.1 106.1 121.5 145.2 156.8 178.8. (3’-OCH3 ) (C-10) (C-1’) (C-3’) (C-5) (C-4).
(48) 【三】 化合物 CL-3: 1. 外觀：白色粉末狀。 2. mp：92~93 ℃。 3. TLC： Rf＝0.5 (CHCl3) 4. 溶解度：溶於氯仿、乙酸乙酯，難溶於水。 5. IR：νmax (KBr) cm-1：(Chart 10) 2914, 2847,1701, 1462, 1298, 1219, 772, 728 6. EI-MS (30 eV) m/z (%)：(Chart 11) 452 (M+, 1) 368 (2) 283 (1) 227 (2) 129 (41). 7.. 424 ( 9) 325 (1) 269 (1) 213 (1) 85 (32). 396 (8) 311 (1) 255 (1) 199 (2) 73 (77). 382 (2) 297 (1) 241 (2) 185 (8) 60 (59). 1. H-NMR (in CDCl3; 200 MHz) ppm：(Chart 12) 2.35 (2H, t, J=7.3Hz, H-2) 1.64 (2H, m, H-3) 1.26 (br, (CH2 )4~29) 0.88 (3H, t, J=6.4Hz, H-30). 8.. 13. C-NMR (in CDCl3; 50.3 MHz) ppm：(Chart 13). 13.9 31.7. (C-30) (C-28). 22.5 33.7. (C-29) (C-2). 24.5 179.1. 48. (C-3) (C-1). 29.2. (C-4~27).
(49) 【四】 化合物 CL-4: 1. 外觀：白色粉末狀。 2. mp：292~295 ℃。 3. TLC： Rf＝0.45 (CHCl3 : MeOH ＝7:1) 4. IR：νmax (KBr) cm-1：(Chart 14) 3373, 2915, 2848, 1735, 1647, 1463, 1051 5. FAB-MS (m/z)：(Chart 15) 575 (M++H) 484 412 154. 556 466 397 136. 539 448 307. 520 430 271. 6. 1H-NMR (in pyridine-d6; 200 MHz) ppm：(Chart 16) 5.31~4.98 4.60~3.56 1.22~0.78 0.66. 7.. (4H, m, H- 3’, 23, 22, 7) (6H, m , H-1’, 2’, 4’, 5’, 6’a, 6’b, ) (15H, m, H-19, 21, 26, 27, 29) (3H, s, H-18). 13. C-NMR (in pyridine-d6; 50.3 MHz) ppm：(Chart 17) 11.8 20.8 25.2 31.7 39.7 49.9 62.4 78.0 129.2. (C-29) (C-26) (C-28) (C-25) (C-12) (C-9) (C-6’) (C-3) (C-23). 12.1 21.2 28.4 34.1 39.7 51.0 71.3 78.2 138.2. (C-18) (C-21) (C-16) (C-10) (C-5) (C-24) (C-4’) (C-5’) (C-22). 12.6 22.9 29.0 34.1 40.7 54.8 75.4 102.1 139.0. 49. (C-19) (C-15) (C-2) (C-4) (C-20) (C-14) (C-2’) (C-1’) (C-8). 19.5 22.9 29.6 36.7 43.0 55.6 77.6 117.4. (C-27) (C-11) (C-6) (C-1) (C-13) (C-17) (C-3’) (C-7).
(50) 【五】 化合物 EA-2: 1. 外觀：黃色針晶(甲醇)。 2. mp：316~317 ℃。 3. TLC： Rf＝0.7 (CHCl3:Acetone ＝10 :1) 4. IR：ν max (KBr)cm-1：(Chart 18) 3349, 2972, 1645, 1454, 1088, 1039, 875 5. EI-MS (30 eV) m/z (%)：(Chart 19) 302 (M+, 24) 153 (11) 108 (32). 6.. 245 (3) 137 (25) 81 (39). 228 (5) 124 (9) 69 (100). 1. H-NMR (in MeOH-d4; 200 MHz) ppm：(Chart 20). 7.73 7.76 6.88 6.38 6.18. 7.. 274 (3) 150 (4) 91 (26). (1H, d, J=2.0Hz, H-2’) (1H, dd, J= 8.5, 2.0 Hz, H-6’) (1H, d, J= 8.5 Hz, H-5’) (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8) (1H, d, J= 2.0 Hz, H-6). 13. C-NMR (in MeOH-d4; 50.3 MHz) ppm： (Chart 21). 92.8 114.6 144.6 160.8. (C-8) (C-5’) (C-3’) (C-9). 97.6 120.1 146.3 163.9. (C-6) (C-6’) (C-2) (C-7). 102.9 122.5 147.1 175.7. 50. (C-10) (C-1’) (C-4’) (C-4). 114.3 135.6 156.6. (C-2’) (C-3) (C-5).
(51) 【六】 化合物 EA-S. 1. 外觀：無色針晶(甲醇)。 2. mp： 216~218℃。 3. TLC： Rf＝0.4 (CHCl3: MeOH ＝3 :1)。 4. IR：ν max (KBr)cm-1：(Chart 22) 3331, 2987, 2900, 1636, 1406, 1250, 1065 5. EI-MS (70 eV) m/z (%)：(Chart 23) 144 (0.14) 55 (6). 6.. 73 (100). 1. H-NMR (in D2O; 400 MHz) ppm：(Chart 24). 3.98 3.55 3.46 3.44 3.27 3.20. 7.. 102 (2). (1H, br) (2H, t, J=9.2) (1H, d, J=2.6) (1H, d, J=2.6) (2H, s) (1H, t, J=9.2). 13. C-NMR (in D2O; 100 MHz) ppm：(Chart 25). 74.3. 73.6. 72.4. 72.2. 71.1. 8. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4) δ：(Chart 26) CH3 ： CH2 ： CH：. 74.3, 73.6, 72.4, 72.2, 71.1. 51. 60 (33).
(52) 【七】 化合物 EA-SA 1. 外觀：白色粉末。 2. mp： 218~220℃。. 3. TLC： Rf＝0.5 (CHCl3: MeOH ＝8 :3) 4. 以鹽酸鎂粉試驗呈現橙紅色。 5. EI-MS (70 eV) m/z (%)：(Chart 27) 304 (M+, 27) 137 (17). 6.. 165 (23) 91 (46). 153 (100) 77 (44). 1. H-NMR (in D2O; 200 MHz) ppm：(Chart 28). 11.89 6.94 6.74 5.90 5.85 4.97 4.49. 7.. 275 (26) 123 (88). (1H, br, C5 -OH) (1H, br, H-2’) (2H, m, H-5’, 6’) (1H, s, H-8) (1H, s, H-6) (1H, m, H-2) (1H, m, H-3). 13. C-NMR (in CDCl3; 50 MHz) ppm：(Chart 29). 196.7 162.7 128.2 114.6 95.0. (C-4) (C-9) (C-1’) (C-5’) (C-8). 166.8 145.4 119.7 100.3 83.3. (C-7) (C-4’) (C-6’) (C-10) (C-3). 52. 163.4 144.5 114.9 96.0 71.9. (C-5) (C-3’) (C-2’) (C-6) (C-2).
(53) 第二節、藥理實驗之結果. 一、細胞毒殺活性試驗 將榼藤甲醇萃取物以不同溶媒分別萃取後，分成正己烷層、氯仿 層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層(W 層& P 層)等，進行榼藤對細胞毒 殺活性試驗，發現氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層等對 HONE-1（人類 鼻咽癌細胞）有抑制活性，而乙酸乙酯層和正丁醇層等對 NUGC（人類 鼻胃癌細胞）也有抑制活性。（詳見 Table 4-1）. 53.
(54) 二、1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)自由基清除能力之試驗. 將榼藤甲醇萃取物分別萃取後，分成正己烷層、正丁醇層、水層(W 層& P 層)等，進行榼藤對 DPPH 自由基清除能力試驗，發現正丁醇層、 P 層、甲醇粗抽等對 DPPH 自由基清除能力有明顯之活性，且在濃度 2 大於 200 µg/ml 時，其抗氧化效力與 quercetin 和 tocopherol 相近。 （詳見 Fig. 4-1）. Fig. 4-1 榼藤之 DPPH 自 由 基 清 除 能 力 之 試 驗. 54.
(55) 三、急性毒性試驗. 如 Table 4-2 所示，榼藤莖部甲醇粗抽物經腹腔注射鼷鼠後，在 72 小時內之 LD50 為 170 mg/kg，其 95 % 可信賴區間為 123~237 mg/kg。. 中毒症狀：起初鼷鼠之活動量降低，眼睛變為暗紅色，聚集於角落並有 步伐遲緩之現象，死亡前有短暫類痙攣之跳動；當劑量加大時，活動性 減低加劇，死亡之時間縮短。. 55.
(56) 四、福馬林誘發舔足實驗 如 Fig. 4-2 所示，榼藤莖部甲醇粗抽物(Ep-M)在 5、10 mg/kg 時， 無論前期或後期對小白鼠均有明顯之抑制作用。. Fig. 4-2 Analgesic effect of methanolic extracts of Entada phaseoloides (Ep-M) on formalin induced pain response in mice. Ep-M (5 & 10 mg/kg, i.p.) was injected 30 min before formalin (1%) injected. The values are mean±S.E. from 8 mice per group. *P＜ 0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, significantly different from corresponding control group values, ANOVA.. 56.
(57) 五、抗炎實驗 如 Fig. 4-3 所示，榼藤莖部甲醇粗抽物(Ep-M)在 5mg/kg 時即可明顯 抑制λ-carrageenin 所引起之發炎反應，且到給藥後 5 小時仍有一定的抗 炎活性。. Fig. 4-3 Anti- inflammation actions of methanol extracts of Entada phaseoloides (Ep-M) onλ-carrageenin induced paw swelling in mice. Ep-M (5 & 10 mg/kg, i.p.) was injected 30 min before 1%λ-carrageenin injected. The values are mean±S.E. from 7~8 mice per group.*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, significantly different from corresponding control group values, ANOVA.. 57.
(58) 第五章. 第一節. 討. 論. 榼藤化學成分鑑定與討論. 【一】 H-1: Spinasterol. 化合物 H-1 以氯仿再結晶後得白色針狀結晶，熔點為 166~168℃。 TLC 片 經 溶 媒 (CHCl3 : EtOAc ＝ 8:1)展 開 後 Rf 值 為 0.58 。 對 Liebermann-Bürchard 試 劑 呈 陽 性 反 應 ， 故 推 測 可 能 為 植 物 固 醇 (Phytosterol)類化合物 (98 ~ 100)。 由 EI-MS 圖譜(Chart 2)M+ (m/z)顯示 412 為分子離子峰，推測其分 子式為 C29H48O。推斷其他可能斷裂碎片如 Fig. 5-1 (99 ~105)。 由 IR 圖譜(Chart 1)顯示：在 3397 cm-1 有-OH 的吸收帶，1445、1381 cm-1 有-CH2、-CH3 的 H-C-H 的吸收帶，1038 cm-1 是 C-O 的吸收帶(106~08)。 1. H-NMR 圖譜(Chart 3)顯示在δ 5.23 (1H, br)為雙鍵上 C-7 之質子. 訊號；δ 5.03~5.15 為支鏈雙鍵 C-22，C-23 之質子訊號；δ 3.62 為 C-3 連接-OH 之次甲基的質子訊號(3-H)；δ 0.55~1.01 為 6 個甲基(C-18, 19, 21, 26, 27, 29)上的質子訊號，綜合以上推測化合物可能為 spinasterol (bessisterol) (107~109)。. 58.
(59) Fig. 5-1 spinasterol 在 EI-MS 之可能裂解方式 13. C-NMR 圖譜(Chart 4)顯示δ 137.9、129.1 分別為側鏈雙鍵 C-22，. C-23 的碳原子訊號；δ 139.3、117.2 分別為環內雙鍵 C-8，C-7 之碳原 子訊號；δ 70.8 為帶-OH 基 C-3 的碳原子訊號,(107~109)。 DEPT 圖譜(Chart 5)顯示δ 12.0, 12.2, 12.9, 18.9, 21.3, 21.0 為 CH3 之 碳原子訊號；δ 21.5, 23.0, 25.3, 28.5, 29.6, 31.8, 37.1, 37.9, 39.4 為 CH2 之 碳原子訊號；δ 31.4, 40.2, 40.8, 49.4, 51.2, 55.1, 55.8, 71.0, 117.4, 129.4, 138.1 為 CH 之碳原子訊號。本化合物碳譜數據與文獻(106~109)spinasterol 碳譜數據比對如 Table 5-1 所示：. Table 5-1 化合物 H-1 碳譜數據與文獻 (106~109)碳譜數據比對表 No. of C 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.. δc of H-1 (CDCl3). δc of literature data (CDCl3). 36.9 31.6 70.8 37.7 40.0 29.4 117.2 139.3 49.2 34.0 21.3 39.2 43.0 54.9 22.8 28.3. 37.2 31.7 71.0 38.1 40.3 29.6 117.5 139.6 49.5 34.3 21.6 39.5 43.3 55.2 23.0 28.4 59.
(60) 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.. 55.7 12.0 12.8 40.6 20.8 137.9 129.1 51.0 31.2 21.1 18.8 25.2 11.8. 56.0 12.2 13.0 40.7 21.0 138.1 129.5 51.3 31.5 21.3 19.0 25.3 12.0. 綜合以上光譜資料與文獻 (106~109)比對，推定此合物為 spinasterol (bessisterol)。. 60.
(61) 【二】 CL-2: 5, 4’-Dihydroxy-3, 7, 3’-trimethoxyflavone. 化 合 物 CL-2 再 結 晶 (氯 仿 &甲醇 )後得到黃色針晶，其熔點為 171~172 ℃。TLC 片經溶媒(CHCl3)展開後 Rf＝0.4，紫外光(366 nm)下 深紫紅色，在以氨氣處理後，在紫外光下轉為黃色，所以推測可能為黃 酮醇類(5-OH，3-OR，並帶有 4’-OH 或 3’, 4’-OH)化合物 (99, 100, 110)。 由 IR 圖譜(Chart 6)顯示：在 3330 cm-1 有-OH 的吸收帶，1645 cm-1 為 carbonyl group (C=O)的吸收帶 (106, 113~115)。 由 EI-MS 圖譜(Chart 7)M+ (m/z)顯示 344 為分子離子峰，推測其分 子式為 C18H16O7。推斷其他可能斷裂碎片如 Fig. 5 -2(111, 112)。 1. H-NMR 圖譜(Chart 8)顯示在δ3.87~3.99 (9H)分別為 3、7、3’位上. 3 個甲氧基(-OCH3)的質子訊號；δ6.35 (1H, d, J= 2.2 Hz)、6.44 (1H, d, J= 2.2 Hz)分別為 H-6、8 上的質子訊號，H-6 及 H-8 因彼此間的遠程偶合(J= 2.2 Hz)，故二者表現均為雙峰；δ6.98、7.69、7.74 分別為 B 環上 5’、6’、 2’ 的質子訊號；δ12.63 (1H, s)為 C-5-OH 的質子訊號 (109, 113~ 116)。. Fig. 5-2 5, 4’-Dihydroxy-3, 7, 3’-trimethoxyflavone 在 EI-MS 之可能裂解方式 13. C-NMR 圖譜(Chart 9)顯示δ55.8、56.0、60.1 別為 3、7、3’位上 3. 個甲氧基(-OCH3)的碳原子訊號；δ178.8為 C-4位上 carbonyl group (C=O). 61.
(62) 之訊號；δ165.5、156.8、148.8、145.2、139.2 分別為 C-7、5、4’、3’、 3 的吸收訊號是結構上接-OR 基的碳；δ162.0、155.6 分別為 C-9、2 的 吸收訊號是結構上接 1 位“-O-” 的碳 (113~117)。 本 化 合 物 碳 譜 數 據 與 文 獻. (113~117). 5, 4’-dihydroxy-3, 7,. 3’-trimethoxyflavone 碳譜數據比對如 Table 5-2 所示：. Table 5-2 化合物 CL-2 碳譜數據與文獻 (113~117)碳譜數據比對表 No. of C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’. δc of CL-2 (CDCl3). δc of literature data (CDCl3). 155.6 139.2 178.8 156.8 97.9 165.5 92.1 162.0 106.1. 155.9 138.9 178.7 156.7 97.8 165.4 92.2 162.1 106.0. B 環上的碳 C1’~C6’ 121.5 110.4 145.2 148.8 114.3 123.6. 122.5 110.9 146.3 148.3 114.6 122.7. 甲氧基的碳. 3-OCH3 7-OCH3 3’-OCH3. 55.8 56.0 60.1. 55.8 56.1 60.2. 綜合以上光譜資料與文獻 (106,. 62. 109, 113~117). 比 對 ，推定此合物 為 5,.
(63) 4’-dihydroxy-3, 7, 3’-trimethoxyflavone。. 63.
(64) 【三】CL-3: Triacontanoic acid. 化合物 CL-3為白色粉末狀，熔點為 92~93 ℃。TLC 片經溶媒(CHCl3) 展開後 Rf 值為 0.5。溶於氯仿、乙酸乙酯，難溶於水。 由 IR 圖譜(Chart 10)顯示：在 1701 cm-1 有 C=O 的吸收帶，1462 cm-1 為 CH3 的吸收帶 (106, 118, 119)。 由 EI-MS 圖譜(Chart 11)M+ (m/z)顯示分子離子峰為 452，故推測化 合物 CL-3 可能為 triacontanoic acid 的化合物。推斷其他可能斷裂碎片如 Fig. 5 - 3(118~120)。 1. H-NMR(Chart 12)圖譜顯示在δ0.88(3H, t)為長鏈末端甲基之質子. 吸收訊號；δ1.26 (br)為長鏈 methylene (-CH2-)的質子吸收訊號；δ1.64 (2H, m)、2.35 (2H, t)分別為 H-3、H-2 的質子吸收訊號 (118, 119)。 13. C-NMR 圖譜(Chart 13)顯示δ1.39 為長鏈末端甲基碳的訊號；δ. 22.5~33.7 為長鏈 methylene (-CH2-)的吸收訊號；δ179.1 為 carboxyl carbon (C=O) 吸收訊號 (118, 119)。. Fig. 5-3 Triacontanoic acid 在 EI-MS 之可能裂解方式. 64.
(65) 綜合以上光譜並參考文獻 (118~120)推測為 triacontanoic acid 的化合物。. 65.
(66) 【四】CL-4: Spinasterol-β -D-glucoside. 化合物 CL-4 為白色粉末狀，熔點為 292~2951℃。TLC 片經溶媒 (CHCl3 : MeOH ＝7:1)展開後 Rf 值為 0.45。對 Liebermann-Bürchard 試 劑呈陽性反應，故推測可能為植物固醇(Phytosterol)類化合物 (98~100)。. FAB-MS 圖譜(Chart 15)有 m/z 575 [M+H]+離子峰，所以分子量為 574。故推測化合物可能為 spinasterol-β-D-glucoside。. 由 IR 圖譜(Chart 14)顯示：在 3373 cm-1 有-OH 的吸收帶，2915、2848, cm-1 有-CH 的吸收帶，1051 cm-1 是 C-O-C 的吸收帶 (106, 121)。. 1. H-NMR 圖譜(Chart 16)顯示在δ 5.31~4.98 (m)多重峰主要為環內. 及環外雙鍵上 H-7、H-22、H-23 等之質子訊號；δ 4.60~3.56 (m)多重 峰為糖基上質子的訊號 (99,121)。. 13. C-NMR 圖譜(Chart 17)顯示在 d 117.4、139.0 及 138.2、129.2 的訊. 號是雙鍵 C-7、C-8 及 C-22、C-23 之吸收；d 102.1、78.2、77.6、75.4、 71.3、62.4 分別為葡萄糖上 C-1’、C-5’、C-3’、C-2’、C-4’、C-6’的吸收 訊號 (99,121)。 本化合物碳譜數據與文獻 (99,121) spinasterol-β-D-glucoside 碳譜數據 比對如 Table 5-3 所示： 66.
(67) Table 5-3 化合物 CL-4 碳譜數據與文獻 (99,121)碳譜數據比對表 No. of C. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29. δc of CL-4 (pyridine-d6 ). 36.7 29.0 78.0 34.1 39.7 29.6 117.4 139.0 49.9 34.1 22.9 39.7 43.0 54.8 22.9 28.4 55.6 12.1 12.6 40.7 21.2 138.2 129.2 51.0 31.7 20.8 19.5 25.2 11.8. δc of literature data (pyridine-d6 ). 37.1 29.0 78.6 34.7 40.2 29.4 117.9 139.6 49.6 34.5 23.4 39.6 43.5 55.3 23.4 29.0 56.0 12.6 13.3 41.2 21.7 138.7 129.6 51.5 32.2 21.4 19.2 25.3 12.3. 67.
(68) Table 5-3 化合物 CL-4 碳譜數據與文獻 (99,121)碳譜數據比對表(續) 糖的碳 C1’~C6’. 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’. 102.1 75.4 77.6 71.3 78.2 62.4. 102.2 75.4 77.1 71.8 78.6 62.9. 綜合以上光譜並參考文獻 (99, 121)推測為 spinasterol-β-D-glucoside。. 68.
(69) 【五】 EA-2:Quercetin. 化合物 EA-2 再結晶(甲醇)後得到黃色針晶，其熔點為 316~317 ℃。 TLC 片經溶媒(CHCl3 : Acetone ＝10 :1)展開後 Rf＝0.7，紫外光下呈暗 黃色，在以氨氣處理後，在紫外光下轉為亮黃色，所以推測可能為帶有 3-OH、 3’, 4’-OH 的黃酮醇類化合物 (110)。 EI-MS 圖譜(Chart 19)M+ (m/z)顯示 302 為分子離子峰。推斷其他可 能斷裂碎片如 Fig. 5 - 4(99, 100, 103, 110, 112)。 由 IR 圖譜(Chart 18)顯示：在 3349 cm-1 有-OH 的吸收帶，1647 cm-1 為 carbonyl group (C=O)的吸收帶 (122, 123)。 1. H-NMR 圖譜(Chart 20)顯示在δ6.18 (d, J= 2.0 Hz)、6.38 (d, J= 2.0. Hz)分別為 A 環上 H-6、H-8 的質子訊號，且彼此間相互遠程偶合形成雙 峰；δ6.88 (d, J= 8.5 Hz)、7.76 (dd, J= 8.5, 2.0 Hz)、7.73 (d, J= 2.0 Hz)分 別為 B 環上 H-5’、H-6’、H-2’的質子訊號，且彼此間相互偶合，其中 H-6’分別與 H-5’有產生鄰位偶合(J= 8.5 Hz)，而與 H-2’產生遠程偶合(J= 2.0 Hz)(116, 122~ 124)。. Fig. 5 –4 quercetin 在 EI-MS 之可能裂解方式. 13. C-NMR 圖譜(Chart 21)顯示在δ175.7 為 C-4 位上 carbonyl group. 69.
(70) (C=O)之訊號；δ163.9、156.6、147.1、144.6、135.6 分別為 C-7、5、4’、 3’、3 的吸收訊號是結構上接-OH 基的碳；δ160.8、146.3 分別為 C-9、 2 的吸收訊號是結構上接 1 位“-O-” 的碳 (117, 122~ 124)。. 本化合物碳譜數據與文獻 (117, 122~124) quercetin 碳譜數據比對如 Table 5-4 所示：. Table 5-4 化合物 EA-2 碳譜數據與文獻 (117, 122~ 124)碳譜數據比對表 No. of C δc of EA-2 (MeOH-d4) δc of literature data (DMSO-d 6) 2. 146.3 147.2 3. 135.6 135.9 4. 175.7 175.8 5. 156.6 156.0 6. 97.6 98.7 7. 163.9 163.9 8. 92.8 93.8 9. 160.8 161.4 10. 102.9 103.6 B 環上的碳 C1’~C6’ 1’ 122.5 121.8 2’ 114.3 115.2 3’ 144.6 145.0 4’ 147.1 147.7 5’ 114.6 115.4 6’ 120.1 119.9. 綜合以上光譜並參考文獻 (117, 122~ 124)推測為 quercetin。. 70.
(71) 【六】 EA-S：. 化合物 EA-S 再結晶(甲醇)後得無色針晶，熔點為 216~218℃。片經 溶媒展開(CHCl3 : MeOH ＝3 :1)後 Rf 值為 0.4，在以 10% H2SO4 spray 加熱後呈現焦褐色。 由 EI-MS 圖譜(Chart 23)顯示 144 或 102 (m/z)可能為分子離子峰， 70 (m/z)為其基峰，而一般天然物成分中與此化合物質譜裂較相似的主 要為糖類、多元醇類等等，但沒有化合物之分子離子為 102 或 144 (m/z)， 所以與文獻 (103)比較 inositol、D-ribose 、D-fructose 、D-glucose 等該類 化合物斷裂碎片 m/z 值相似的化合物，其中與 inositol 之質譜比較相近。 Inositol 之斷裂如下：Inositol 的基峰為 73 (m/z)，為分子離子 M+ (180) 失去 1 個分子的水，而得到的離子 (162 m/z)再進行對半裂解生成的 〔C3H5O2〕 +離子。離子 144 (m/z)是分子離子失去 2 個水之產物；而 〔M-H2O〕+離子再進行 RDA 裂解，則得互補離子 102 (m/z, 〔C4H6O3〕 +. )和 60 (m/z, 〔C2H4O2〕 +)。 由 IR 圖譜(Chart 22)顯示：在 3331 cm-1 有-OH的吸收帶，在 1065. cm-1 有＞C-OH 之吸收帶 (106)。 1. H-NMR 圖譜(Chart 24)顯示在δ3.98有 1個寬峰的質子訊號，δ3.55. 有 2 個質子訊號(t, J=9.6)；δ3.46 及 3.44 各有 1 個雙峰的質子訊號(1 d, J=2.6)；δ3.27 有 2 個質子的訊號；δ3.20 有 1 個質子的訊號。 71.
(72) 由 13C-NMR 圖譜(Chart 25)與 DEPT 圖譜顯示此化合物應有 5 個碳， 的化學位移訊號分別在δ74.3、73.6、72.4、72.2、71.1，且碳均為 CH， 跟 inositol 的碳一樣。與文獻(109)中 inositol 的 4 個立體異構物之碳譜比 較(詳 Table 5-5)，可以發現雖然化學位移相似，但因為 inositol 的結構有 一定的對稱性，所以至多只有 4 個不同的碳原子吸收訊號，因此應該不 是同一化合物。. Table 5-5 EA-S 與 inositol 的 4 個立體異構物之碳譜比較(109) EA-S△. 74.3 73.6 72.4 72.2 71.1. C. 1. 2. 3. 4. 5. 6.. 1＊. 2＊. 3＊. 4＊. 73.7 73.7 73.7 73.7 73.7 73.7. 72.4 72.2 72.4 71.1 74.3 71.1. 71.6 70.5 72.8 72.8 70.5 71.6. 71.7 74.5 70.1 74.5 71.7 66.8. △-in D2 O，100.6 Hz；＊in D2 O，50.3Hz. DEPT 圖譜(Chart 26)顯示δ 74.3、73.6、72.4、72.2、71.1 的綜合以 上光譜與參考文獻 (106, 109)可知，化合物 EA-S 可能有與 inositol 相似的結 構，但詳細之結構仍在解析中。. 72.
(73) 第二節 榼藤之藥理活性討論 一、細胞毒殺活性試驗 本實驗進行了榼藤甲醇萃取物與其各層對 HONE-1（人類鼻咽癌細 胞）與 NUGC（人類鼻胃癌細胞）之體外抗癌作用評估，結果發現氯仿 層、乙酸乙酯層、正丁醇層等對 HONE-1 有抑制活性，而乙酸乙酯層和 正丁醇層等對 NUGC 也有抑制活性，可見榼藤之抗癌活性成分可能為中 高極性之物質，而本實驗在乙酸乙酯層分離到的檞皮素（EA-2）在許多 的文獻 (125)中顯示對各類癌細胞的抑制都有不錯之活性，且乙酸乙酯層 對 HONE-1、NUGC 均有抑制活性，所以推測檞皮素可能是榼藤抗癌之 活性成分之一。. 二、1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)自由基清除能力之試驗 隨著時代的進步人們對自由基的研究了解亦逐漸深入，也體認到 自由基與許許多多的病理與生理現象密切相關，如衰老、癌症等等， 故不斷尋求阻斷自由基反應的抗氧化劑。也因此自由基清除能力的篩 選也顯的十分重要。一般自由基清除能力的篩選方法(126)主要分為體外 抗氧化與體內抗氧化實驗，而體外抗氧化的特點在於快速、靈敏，以 便進一步再進行體內研究。體外抗氧化之試驗的篩選方法很多，但其 中 DPPH 自由基清除能力實驗方法為最簡便的方法之一，其不需要用 73.
(74) 到太貴重的儀器，且 DPPH· 為一相當安定的自由基，靈敏也高，故在 抗氧化上的研究，經常使用 DPPH·(C18H12N6O5·)來評估抗氧化劑的供 氫能力。原理：DPPH· 其甲醇溶液為紫色(purple color)在 516 nm(文獻 (127). 515~517 nm)下有強吸光，當 DPPH 自由基與抗氧化劑反應時，將. 會降低吸光值。因而藉此判斷抗氧化劑清除 DPPH 自由基的能力，其 吸光值愈低，表示試樣清除 DPPH 自由基的能力愈強。 DPPH + AH → DPPH2 + A (purple color). (yellow color). DPPH 自由基的甲醇溶液會隨著 pH 值的不同及時間長短而有所變 化，DPPH 自由基甲醇溶液在 pH 5.0~6.5 比較穩定而有適當的吸收，在 鹼性時則不穩定。此外，DPPH 自由基的甲醇溶液會隨時間的增長而逐 漸劣化，故實驗時需新鮮配置(93, 94)。而榼藤對 DPPH 自由基清除能力試 驗，發現正丁醇層、P 層、甲醇粗抽等對 DPPH 自由基清除能力有明顯 之活性，可見榼藤之抗氧化活性成分可能為中高極性之物質，本實驗有 分離到的檞皮素，而檞皮素本身就具有很好的抗氧化之活性，同時也是 常用的陽性對照試劑之一，所以檞皮素應該是榼藤抗氧化之活性成分之 一。. 74.
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