台灣族群帕金森氏症FBXO7 基因變異的分子遺傳及功能研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 台灣族群帕金森氏症FBXO7 基因變異的分子遺傳及功能研究 Molecular Genetic and Functional Studies of FBXO7 Gene Variations in Taiwanese Parkinson’s Disease. 研究生：黃奕澂 Yi-Cheng Huang 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen 中華民國一零四年一月.

(2) 致謝. 回想自己在師大的求學生涯中，每天都過著豐富且充實的生活，感謝師大提供豐富的教學資源，讓自己可以充實自我和提高格局。. 本研究的完成，最先要感謝是自己的恩師-李桂楨老師，非常感謝老師的細心與耐心指導，在求學階段，您都願意給我嘗試和學習的機會，而在您豐富的學術專業指導下，自己在研究過程中受益良多，更讓自己有繼續堅持下去與嘗試的勇氣，對於老師的堅持與毅力，自己真的望塵莫及。並感謝林口長庚紀念醫院神經內科的陳瓊美醫師及吳逸如醫師給予指導與建議，以及撥空為我口試，給與研究上寶貴的見解，讓論文得以更加完善。也感謝林口長庚紀念醫院所提供血液樣本的提供者及論文中的部分影像與其分析由使用臺師大分子影像核心實驗室設施取得，核心實驗室部分經費為國科會補助，特此致謝。在研究生涯中，自己仰賴許多人的指導與幫助。感謝實驗室的學長姊麗卿學姊、怡辰學姊、志信學長、春嫺學姊、淑婷學姊、佩茹學姊、慈蓬學姊、詩涵學姊、文騰學長、允麟學長、修嘉學長、明慧學姊、婉玲學姊、可蓁學姊、于婷學姊、德嫻學姊、芷英學姊在實驗上.

(3) 對自己的耐心協助與建議；和研究室的同學，品睿、逸琦、鉦翔，既是益友也是損友的你們，總是陪伴在自己的身旁，讓自己永遠都不會覺得孤單，更讓自己能堅持在這條路上；還有炫江、均如、映伶、奕勝、旻羲、雅婷、雅貞、執中、紫綾、舒琇、信豪、胤榮、怡綺等，感謝你們平時給我的幫助和歡樂，當自己在研究上遇到挫折時，感謝你們在實驗上的建議與給我加油打氣，因為有你們更豐富了我的碩士生活。也非常感謝生科系的所有老師們，因為有您們在學術上的建議與協助，讓自己能順利完成實驗和論文。最後，謹將此篇論文獻給我最親愛的家人們：爸爸、姊姊們、姊夫們、三個可愛的姪子姪女、以及在天上未能看到我這篇論文的媽媽、因為有你們成為我最強而有力的精神支柱，並給予我無限的包容與體諒，我才能無後顧之憂的完成碩士學業，謝謝您們，我愛你們！！.

(4) 目錄. 目錄............................................................................................................. I 中文摘要 ................................................................................................. ..V Abstract................................................................................................... VI 圖表目錄 .............................................................................................. VIII 壹、緒論 .................................................................................................... 1 一、帕金森氏症 .................................................................................1 (一)臨床病徵 ................................................................................1 (二)神經病理學 ............................................................................2 (三)致病原因 ................................................................................3 (四)致病途徑 ................................................................................4 二、帕金森氏症的遺傳分析 .............................................................5 三、FBXO7 基因 ...............................................................................7 (一) FBXO7 的構造、表現與功能 .............................................7 (二) FBXO7 基因變異與帕金森氏症 .........................................8 貳、研究目的 ............................................................................................ 9 參、研究材料與方法 ..............................................................................10 一、FBXO7 基因遺傳分析 ……………………………………...10 I.

(5) (一)研究樣品 ....................................................................................10 (二) FBXO7 cDNA 增幅及定序 ......................................................10 (三) FBXO7 基因 Y52C 及 I115M 多型性分析 .............................11 1.聚合酶連鎖反應(PCR).....................................................11 2.限制酶片段長度多型性分析(RFLP) ..............................12 3.統計分析 ...........................................................................12 二、FBXO7 基因 Y52C 多型性的功能分析……………………..12 (一)細胞培養………………………………………………….12 (二)重組質體的建構 ..................................................................13 1. pEGFP-N1-FBXO7 ..........................................................13 2 . pcDNA3.1/V5-His-FBXO7 ............................................14. 3 .pcDNA5/FRT/TO-FBXO7…….……………………..14. (三)轉染(transfection) ................................................................15 (四)次細胞分層………………………………………………..16 (五)西方轉滯法………………………………………………..17 (六)螢光顯微觀察………..………………….………………...17 (七)Flp-In SH-SY5Y細胞株培養………..………. …………17 (八) 建立Flp-In SH-SY5Y- FBXO7-EGFP穩定細胞株……..18 (九)神經性狀分析………..………………….………………...19 II.

(6) 肆、結果 ..................................................................................................20 一、PD 患者 FBXO7 基因突變…………………………………..20 二、Y52C、I115M 多型性與台灣族群 PD 感受性……………...21 三、Y52C 多型性之功能分析…………………………………….22 (一) EGFP 標記的 FBXO7 cDNA 選殖………………………22 (二) V5-His 標記的 FBXO7 cDNA 選殖……………………….22 (三) FBXO7-EGFP、FBXO7-V5-His 融合蛋白的西方轉漬分析………………………………………………….………22 (四) FBXO7-EGFP 融合蛋白的時間週期分析……………....23 (五) FBXO7-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察……………23 四、誘導式 SH-SY5Y 細胞株建立……………………………….23 (一).pcDNA5/FRT/TO 質體建構..................................................24 (二). 建立 Flp-In SH-SY5Y- FBXO7-EGFP 穩定細胞株…...24 (三).神經細胞性狀分析…………………………………….....25. 伍、討論 ..................................................................................................26 一、FBXO7 基因變異與台灣族群 PD 感受性 ..............................26 (二) FBXO7 基因 Y52C 多型性的功能分析…………………….28 (三)誘導式 SH-SY5Y 神經性狀分析…………………………….29 III.

(7) 陸、參考文獻...........................................................................................30 柒、附錄圖表 ..........................................................................................36. IV.

(8) 中文摘要帕金森氏症主要為中腦黑質緻密區的多巴胺神經細胞缺失所引起的神經退化性疾病。FBXO7 基因位於染色體 22 號 q12-q13 上，與家族性早發性帕金森氏症和錐狀體病症有相關。FBXO7 蛋白由 522 個胺基酸組成，N 端帶有 ubiquitin-like fold、C 端帶有 F-box domain，為 ubiquitin E3 ligase complex 內的重要因子。本研究探討 FBXO7 基因變異與台灣族群帕金森氏症的相關性。首先針對家族性及早發性 84 位帕金森氏症病人進行 FBXO7 cDNA 定序分析，結果共發現二個兩個多型性點 Y52C (c.155A>G)、I115M (c.345A>G)。進一步對所蒐集的帕金森氏症病人(516 位)與性別、年齡相當的正常人(516 位)進行 Y52C、I115M 的病例-對照組分析，結果顯示 Y52C 多型性 G 等位基因頻率在病人族群中明顯較正常人族群低，且和低帕金森氏症感受性相關(0.4% vs. 1.2%, P = 0.046)。進一步結合中國大陸數據(Luo et al., 2010)，651 位病人與 716 位正常人的病例-對照組分析結果亦顯示低帕金森氏症感受性(0.5% vs. 1.4%, P = 0.012)及低罹病機率(odds ratio: 0.33, 95% confidence interval: 0.12-0.77, P = 0.017)。目前已建構 EGFP 標記及 V5-His 和 pcDNA5/FRT/TO 的 FBXO7 cDNA 質體，表現於 SH-SY5Y 及 HEK-293T 細胞，進行次細胞分層、西方轉漬、螢光顯微鏡分析、蛋白穩定性、蛋白質體功能分析和神經纖維分析。本實驗希望可提供疾病診斷及遺傳諮詢的文獻。關鍵字: 帕金森氏症、神經退化性疾病、FBXO7 基因、多型性點 Y52C V.

(9) Abstract Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by with loss of dopamine neurons in the SNc. The chromosome 22q12-q13 FBXO7 mutations have been identified in several families with early-onset parkinsonism and pyramidal tract signs. FBXO7 gene codes for a protein of 522 amino acids, with an ubiquitin-like fold in its N-terminal and an F-box in its C-terminal half. FBXO7 is a key component of an ubiquitin E3 ligase complex. This study investigates the FBXO7 variability in Taiwanese PD. By direct cDNA sequencing of 84 patients with familiar or early-onset PD, two amino acid changed variants Y52C (c.155A>G) and I115M (c.345A>G) were identified. To examine whether Y52C and I115M affect the risk of PD, PCR-RFLP test was developed to assess their frequency in a larger cohort of PD (n = 516) and age- and gender-matched controls (n = 516). We found The Y52C G allele frequency was notably lower in PD patients than the controls (0.4% vs. 1.2%, P = 0.046). After combining data from China (Luo et al., 2010), the Y52C G allele frequency is significantly different between PD (n = 651) and controls (n = 716) (0.5% vs. 1.4%, P = 0.012) and a significant decrease in risk of developing PD can be demonstrated (odds ratio: 0.33, 95% confidence interval: 0.12-0.77, P = 0.017). Cloning and expressing of cDNAs with Y52C in dopaminergic neuroblastoma SH-SY5Y cells and HEH-293T cell are currently ongoing to examine if Y52C affect FBXO7 localization, protein stability, proteasome activity and neurite outgrowth. The study may provide a reference for clinical diagnosis and genetic counseling. VI.

(10) key words: Parkinson's disease (PD)、neurodegenerative disorder、FBXO7 gene、Y52C polymorphism、Dopamine. VII.

(11) 圖表目錄圖一、FBXO7 基因轉錄物及蛋白質。 ...........................................37 圖二、泛素-蛋白解體酶系統。 .......................................................38 圖三、FBXO7 cDNA 增幅及定序。 ...............................................39 圖四、Y52C、I115M 多型性檢測及演化保守性分析。 ...............40 圖五、FBXO7-EGFP 重組質體的構築及限制酵素圖譜確認。....41 圖六、FBXO7-V5-His 重組質體的構築及限制酵素圖譜確認。..42 圖七、FBXO7-V5-His、FBXO7-EGFP 融合蛋白的西方轉漬分析…………………………………………………………………….43 圖八、FBXO7-EGFP 融合蛋白時間週期分析。…………………44 圖九、FBXO7-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察………….......45 圖十、pcDNA5/FRT/TO 重組質體的構築及限制酵素圖譜確認 ..46 圖十一、誘導式 SH-SY5Y 細胞株建立流程圖 ..............................48 圖十二、Flp-In SH-SY5Y-FBXO7-EGFP 細胞株神經纖維生長分析 .........................................................................................................49 表一、帕金森氏症的遺傳因子。.....................................................51 表二、增幅 FBXO7 cDNA 定序與 Y52C、I115M 多型性 PCR 引子 52 表三、增幅 FBXO7 cDNA 重組質體的 PCR 引子對、條件。……53 表四、FBXO7 基因 Y52C、I115M 多型性基因型、等位基因頻率 VIII.

(12) 及與疾病相關性。 ........................................................................54 表五、FBXO7 基因 Y52C 多型性基因型、等位基因頻率及與疾病相關性：綜合分析。 ................................................................55. IX.

(13) 壹、緒論一、帕金森氏症. 帕金森氏症(Parkinson's disease，以下文章簡稱 PD)為一種僅次於阿茲海默氏症(Alzerheimer's disease)的第二常見的漸進性神經退化性疾病。西元 1817 年 James Parkinson 醫師首次描述此疾病，其臨床症狀為震顫性麻痺(shaking palsy)，當時尚未明瞭其病理變化。此疾病大約對 1% 65 歲以上的人口造成影響，平均發病年齡為 60 歲。. (一)臨床病徵. PD 患者通常在中晚年發病，患者發病後其病情狀會隨著時間每況愈下。患者的主要臨床病徵包括靜止性震顫(resting tremor)、四肢僵直(rigidity)、行動遲緩(bradykinesia)、步伐不穩(postural instability) 等(Conley and Kirchner, 1999)。病患靜止性震顫頻率為每秒四到七次，通常會在休息時發生，常是初期症狀的表徵。肢體僵直的症狀常是由肢體近端開始發展，在做動作時當中花費的力氣較平常人大，軀幹旋轉能力會變差。像是有行動遲緩症狀的病患，其自主動作的執行變慢且維持動作出現困難，動作的速度範圍與振幅都會降低。而步伐不穩是指病患在嘗試站立或轉身時，無法維持平衡而容易跌倒 1.

(14) (Marjama-Lyons and Koller, 2001)。帕金森氏症的症狀會隨著病程的演進而逐漸加重，臨床上常以 Hoehn 與 Yahr 發展出的分類系統來評估患者的嚴重程度，可分為五期，隨著病情的發展最終會導致患者的行動能力完全喪失，必須仰賴輪椅，甚至有的會無法行動而臥病在床 (Hoehn and Yahr, 1967)。其它與運動障礙有關的次要症狀包括手臂擺動減少、小碎步、說話聲音小、吞嚥困難、眨眼次數少等 (Marjama-Lyons and Koller, 2001)。. (二)神經病理學. 帕金森氏症病患主要的病理特徵是多巴胺神經元(dopaminergic neuron)在中腦黑質之緻密區(substantia nigra pars compacta, SNpc)與其他腦幹神經核有退化死亡的現象，因而造成黑質紋狀體路徑 (nigrostriatal pathway)的多巴胺(dopamine)分泌不足而引起臨床症狀 (Dauer and Przedborski, 2003)。這些多巴胺神經元是基底核(basal ganglia)重要的組成份子，而基底核位於腦部，主要負責人體的微調及協調運動。. 當腦部黑質中多巴胺神經元剛開始死亡時，其他腦區仍能加以彌補，不過這些特化細胞死亡數目一但超過 50~80%時，腦中其他參與 2.

(15) 運動控制區域，包括基底核其他部位、視丘與大腦皮質等，已無法像往常一樣正常運作，因此運動變得無法控制。近年發現 SNpc 負責協調黑質紋狀體的路徑，當 SNpc 中多巴胺神經元死亡時，會造成投射至紋狀體的多巴胺量下降而引起臨床症狀。. 除了 SNpc 處會有多巴胺神經元死亡的病理特徵外，針對部分偶發性帕金森氏症病患去解剖腦部，亦發現有一種嗜伊紅性的細胞質內蛋白質包涵體(proteinacious cytoplasmic inclusions)，在神經元突起處呈鈁錘絲狀的構造分佈，稱為 Lewy neuritis，有時則在神經元的細胞核周圍形成球狀的 Lewy body (Gibb and Lees, 1991)。這些包涵體分佈在帕金森氏症病患 SNc 處殘存的多巴胺神經元中，主要成分為 α-synuclein、ubiquitin 與 neurofilament (Conley and Kirchner, 1999)。 α-Synuclein 發生變異會導致 Lewy body 的產生(Spillantini et al., 1997)，一般認為此變性蛋白於患者體內是因為不被分解造成腦內堆積，進而引起神經細胞死亡，因而出現帕金森氏症。. (三)致病原因. PD 的遺傳現象最早於 1880 年被 Gowers 注意到，Gowers 發現其所治療的病人中，大約有 15%的病人其家族內也有罹患帕金森氏症的 3.

(16) 親屬。目前在帕金森氏症研究的進展，最被接受的帕金森氏症病因理論為遺傳與環境產生交互作用下的「多因子病因理論」：PD 患者由於先天遺傳了某些基因的缺陷或多型性(polymorphism)，使得這些個體對特定環境因子的感受性較大，而較易引起黑質多巴胺神經元的退化，最後導致帕金森氏症(Bertram et al., 2005; Schapira, 2006)。此外，曾有研究顯示，黑質細胞數量會隨著年齡增加而有所減少(Gibb and Lees, 1991)，顯示年齡的增加亦為帕金森氏症的危險因子。然而多數的帕金森氏症病患屬於偶發型(sporadic)，確切病因目前並不明確，少數的家族遺傳性帕金森氏症則與基因突變有關(Farrer, 2006)。依據目前研究文獻顯示，約有 5~10%的帕金森氏症病人具有家族遺傳的現象，遺傳的方式有體染色體顯性及體染色體隱性兩種。除基因突變外，流行病學、神經病理學與先前的研究都傾向於「多因子病因理論」，包括遺傳變異導致的敏感性差異、環境毒素的長期暴露、老化等 (Scherman et al., 1989)。. (四)致病途徑. 目前研究發現可能的致病途徑包括蛋白質品質控管改變、粒線體功能不良與氧化壓力以及 kinase 的活性受到干擾。蛋白質的聚集以及 ubiquitin proteasome system 的功能不良會導致蛋白質品質控管受到干 4.

(17) 擾。許多文獻也指出粒線體的功能不良會造成 PD 黑質緻密區多巴胺神經元的退化，粒線體 complex I 的活性受損被認為與 PD 有極大關聯(Schapira et al., 1989; Mandemakers et al., 2007)。另外有些活性異常的 kinase 也被證實參與 PD 疾病的形成。而氧化壓力也與導致多巴胺神經元退化的一連串反應有關。在壓力狀態下，一些和帕金森氏症相關的基因產物包括 SNCA、Parkin、PINK1、DJ-1、LRRK2 以及 HTRA2，被顯示會某種程度的出現在粒線體，因此粒線體功能受損以及氧化壓力增加，會使細胞更容易受到細胞外毒性及其他壓力的傷害。這些途徑可能藉由引發神經發炎反應，加速細胞凋亡、細胞自我吞噬、細胞內 Glutamate 產生的細胞毒殺等作用，最終導致神經細胞死亡而引起帕金森氏症的發生(Schulz, 2008)。. 二、帕金森氏症的遺傳分析. 近幾年來，許多證據顯示遺傳因素在家族性帕金森氏症的易感受性上扮演重要的角色，在病例及對照組的研究也顯示 PD 病患家人或親屬，罹患 PD 的相對危險指數增加且發病率較高(Lazzarini et al., 1994; Payami et al., 1994; Bonifati et al., 1995; Vieregge and Heberlein, 1995; De Michele et al., 1996)。家族性帕金森氏症病人約佔所有 PD 患者的 5~10%，且這些家族性帕金森氏症患者發病時通常較年輕，屬於 5.

(18) 早發型帕金森氏症(EOPD，發病年齡＜50) (Elbaz et al., 1999)，病程進展較快且臨床上及病理上的特徵都較不典型(Bertram et al., 2005)。此外，在多個 PD 家族研究也發現兄弟姐妹中罹患 PD 的風險與正常人相比有顯著的提升(Lazzarini et al., 1994; Payami et al., 1994)。同卵雙胞胎研究中有較高罹患帕金森氏症的一致性 (concordance rate) (Piccini and Brooks, 1999)。研究的證據指出，遺傳基因在此疾病的致病機轉上佔有重要的角色(Lev and Melamed, 2001)。. 目前為止，已有數個基因座被發現和帕金森氏症相關，且部分的致病基因也已被確認 (表一 ) (Belin and Westerlund, 2008) ，包括 4q21-23 的 α-synuclein (PARK1) (Polymeropoulos et al., 1997) 、 6q25.2-27 的 Parkin (PARK2) (Kitada et al., 1998)、4p14 的 UCHL1 (PARK5) (Leroy et al., 1998)、1p35-p36 的 PINK1 (PARK6) (Hatano et al., 2004)、1p36 的 DJ-1 (PARK7) (Bonifati et al., 2003)及 12p11.2-q13.1 的 LRRK2 (PARK8) (Zimprich et al., 2004)、1p35-p36 的 ATP13A2 (PARK9) (Schultheis et al., 2004)以及 2p12 的 HTRA2 (PARK13) (Strauss et al., 2005)等。其中，PARK1、PARK5 與 PARK8 基因突變與體染色體顯性遺傳的帕金森氏症(autosomal dominant Parkinson's Disease；簡稱 ADPD)相關，PARK2、PARK6 及 PARK7 基因突變則 6.

(19) 與體染色體隱性遺傳的青少年型帕金森氏症候群(autosomal recessive juvenile Parkinsonism；簡稱 ARJP)相關(reviewed by Wood-Kaczmar et al., 2006)。. 三、FBXO7 基因. (一) FBXO7 的構造、表現與功能. FBXO7 又叫做 F-Box only protein 7，位於第 22 號染色體 q12-q13 上(Shojaee et al., 2008)。FBXO7 基因有 10 個表現子，譯碼出一分子量約為 57 kDa、522 個胺基酸的蛋白質。FBXO7 現在被發現共有 4 種 isoforms，目前研究較多的是第一型及第二型 isoforms (圖一 A)。 FBXO7 蛋白質的結構包含 N 端的 ubiquitin-like domain(Ubl)、C 端的 proline-rich region (PRR)及銜接 Ubl 及 PRR 的 FP (FBXO7/PI31) domain (Di Fonzo et al., 2009) ( 圖一 B) 。在 ubiquitin-mediated proteolysis 的路徑裡，FBXO7 在 Skp1-Cul1-F box protein (SCF) E3 ubiquitin ligase complexes 裡扮演著一個重要的角色(Hsu et al., 2004)。 E3 ligase 在 ubiquitin-mediated proteolysis 裡提供受質辨認的專一性，且也是 ubiquitin 調節的 proteolysis 裡的一個調控點(Lehman, 2009) (圖二)。除與 E3 ubiquitin ligase 功能相關外，FBXO7 有被報導過與 7.

(20) hepatoma up-regulated protein (HURP, a mitotic protein) (Hsu et al., 2004)、the inhibitor of apoptosis protein1 (cIAP1) (Chang et al., 2006)、和 proteasome inhibitor protein PI31 (Kirk et al., 2008)等相互作用。. (二) FBXO7 基因變異與帕金森氏症. 從 2008 年以來，FBXO7 基因變異在不同地區已陸續被發表。根據統計，具有隱性遺傳帕金森氏症家族史的病患中，目前最先被發表的是在伊朗家族裡帶有同型合子變異 R378G (Shojaee et al., 2008)，之後是在義大利家族帶有同型合子變異 R498X 及在荷蘭家族帶有 IVS7 +1 G/T 裁接位異型合子變異及 T22M missense 變異(Di Fonzo et al., 2009)。FBXO7 蛋白存在細胞核內，而帶有 T22M 變異點的 FBXO7 蛋白則存在細胞質內(Zhao et al., 2011)，顯示 FBXO7 蛋白在細胞核的活性，與腦部神經元的維持及 PARK15 病理特徵相關，即溶小體及泛素-蛋白解體酶的功能異常是巴金森氏症的致病機轉之一。. 8.

(21) 貳、研究目的. 帕金森氏症大約對百分之一 65 歲以上的人口造成影響，已逐漸成為全球性老年化社會的重大醫療保健課題，目前對帕金森氏症致病機轉的相關研究亦是刻不容緩。由於未曾有台灣 PD 病患的 FBXO7 基因突變研究被報導，本研究探討 FBXO7 基因變異與帕金森氏症相關性。首先針對台灣 PD 患者進行 FBXO7 cDNA 定序分析，來建立台灣 PD 族群的分子遺傳資料庫，並進一步對所發現的變異進行正常人及帕金森氏症族群的病例-對照組分析，以探討 FBXO7 基因變異與帕金森氏症的相關性。最後對所發現的變異進行功能研究，包括建構 EGFP、V5-His 和 pcDNA5/FRT/TO 標記的野生型及變異型 FBXO7 質體，轉染入 HEK-293T、SH-SY5Y 細胞中表現，利用螢光顯微鏡觀察、西方轉漬分析、神經纖維分化，來探討變異是否影響 FBXO7 蛋白在細胞內的位置，而提供臨床上診斷、諮詢及疾病治療的參考。. 9.

(22) 參、研究材料與方法. 一、FBXO7 基因遺傳分析. (一)研究樣品. 本實驗所使用的 PD 患者與正常人血液的基因組 DNA 與 cDNA 樣品均由林口長庚醫院神經內科所提供。所有患者經吳逸如醫師及陳瓊美醫師的診斷後，徵求患者或家屬同意始進行血液採樣。PD 樣品選取的標準為：含有兩個以上 PD 典型症狀包括靜止性震顫、姿態反射障礙、僵直和運動遲緩。具有家族病史及任何可能因腦部外傷、腦炎或服用抗精神性藥物等已知因子所引起帕金森氏症候群的個體則排除在外。同時也蒐集年齡、性別比率相當的正常人之血液 DNA，作為控制組以供對照。PD 患者共 516 位，45.0%為女性，平均年齡 67.1±11.2 歲，平均發病年齡 62.0±11.5 歲。正常人共 516 位，50.2% 為女性，平均年齡 60.9±12.3 歲。. (二) FBXO7 cDNA 增幅及定序. 設計引子對(表二)，針對 PD 患者的 FBXO7 表現子(exon) 1~9 進 10.

(23) 行 cDNA 增幅及定序。取 100 ng 的 cDNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，反應溶液中包括 50 ng 的引子對、1.5 mM MgCl2、200 M dNTPs、0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酶(Promega)及 10%DMSO。PCR 以熱循環儀 (OmniGene, HYBRID)進行，反應條件為 94℃作用 6 分鐘使 DNA 雙股裂解，接著進行裂解溫度 94℃ 30 秒、煉合溫度 58℃ 60 秒及延長溫度 72℃ 150 秒的 40 個循環，最後以 72℃作用 10 分鐘。反應完畢後以 0.8%洋菜膠電泳分離、純化(gel extraction kit，Viogene)後，以雷射螢光 DNA 自動定序儀進行定序分析(源資國際生物科技公司)。共完成 84 個帕金森氏症患者樣品的 cDNA 定序，發現 Y52C 及 I115M 多型性的改變胺基酸變異。. (三) FBXO7 基因 Y52C 及 I115M 多型性分析. 1.聚合酶連鎖反應(PCR) 設計增幅多型性點 Y52C (TAC>TGC)的誤配反向引子(表二)，與正向引子配對，增幅包含 Y52C 多型性點的 240 bp 片段。另設計引子對(表二)，增幅包含 I115M (ATA>ATG)多型性點的 479 bp 片段。以 PD 患者(516 位)及正常人(516 位)的基因組 DNA 為模板，取 100 ng DNA，置於 25 μl 的 PCR 反應中，PCR 反應的條件列於表二。PCR 產物以 1.6%洋菜膠體電泳檢查片段大小。 11.

(24) 2.限制酶片段長度多型性分析(RFLP) 取 2 μl PCR 產物，加入表二所列檢測各多型性點的限制酵素，與反應溶液均勻混合(10 µl 切割反應)，在水浴槽中反應 2 小時到隔夜。之後以. 洋菜膠體電泳檢查片段大小，檢查各樣品的多型. 性基因型。. 3.統計分析計算各樣品族群多型性基因型數目，利用 Chi-square test (χ2)檢測各多型性點是否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，並比較多型性基因型分佈及等位基因頻率，在帕金森氏症族群與正常人族群間，是否有顯著差異。最後使用 JMP 5.1 軟體計算出罹病的相對危險程度(Odds ratio)。. 二、FBXO7 基因 Y52C 多型性的功能分析. (一)細胞培養. 培養HEK-293T細胞於37℃、5% CO2且溼度穩定之細胞培養箱中，培養液包含10% FBS、1.0 mM sodium pyruvate 、1.5 g/l sodium 12.

(25) bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin的DMEM medium (Gibco)，待細胞生長至8、9分滿時，細胞以1:5或1:10進行繼代培養。. (二)重組質體的建構. 1. pEGFP-N1-FBXO7 以 Y52C 異型合子 PD 病人的 cDNA 為模板，增幅 FBXO7 cDNA 序列，其中反向引子的設計用以移除 FBXO7 cDNA 序列上的終止密碼並引入 AgeI 限制酵素切位(ACCGGT)，正向引子的設計則引入 HindIII 限制酵素切位(AAGCTT) (表三)，以利之後將此 FBXO7 cDNA 序列接到 EGFP-N1 質體。上述 PCR 增幅的 FBXO7 cDNA 片段經純化後接合入 pGEM-T Easy 載體，並以電穿孔 (electroporation) (BIO-RAD, GENE PULSERII)方式轉形(transformation)入 E. coli 轉形勝任細胞內。挑選單一菌落，以鹼性溶菌法(Sambrook et al., 1989)小量抽取質體 DNA，進行限制酵素切割圖譜分析與 cDNA 定序。確認無誤後，利用 Plasmid Midi Kit (Geneaid)大量製備選殖成功的野生型及 Y52C 突變型重組質體 DNA，再以 HindIII 及 AgeI 切出 FBXO7 cDNA，純化後置入 pEGFP-N1 載體 HindIII 及 AgeI 的切位間。接合好的 pEGFP-N1-FBXO7 重組 DNA 的轉形、質體 DNA 小量抽取如上 13.

(26) 述。經 HindIII、AgeI 限制酵素切割圖譜分析確認結構正確、誤配引子 PCR 及 PstI 限制酵素切割確認 Y52C 多型性後，進行質體 DNA 的大量製備與保存。. 2. pcDNA3.1/V5-His-FBXO7 利用 Y52C 異型合子的 PD 病人 cDNA，進行 PCR，去增幅 FBXO7 cDNA 序列，其中反向引子(表三)的設計用以移除 FBXO7 cDNA 序列上的終止密碼並引 XhoI 限制酵素切位(CTCGAG)，正向引子的設計則引入 HindIII 限制酵素切位(AAGCTT) (表三)，以利之後將此 FBXO7 cDNA 序列接到 pcDNA3.1/V5-His 質體。上述 PCR 增幅的 FBXO7 cDNA 先選殖入 pGEM-T Easy 載體，再以 HindIII 及 XhoI 切出，置入 pcDNA3.1/V5-His 載體的 HindIII 及 XhoI 切位間。重組質體的轉形、質體 DNA 抽取如上述。經 HindIII、XhoI 限制酵素切割圖譜分析確認結構正確、誤配引子 PCR 及 PstI 限制酵素切割確認 Y52C 多型性後，進行質體 DNA 的大量製備與保存。. 3. pcDNA5/FRT/TO 質體建構以 pEGFP-N1-FBXO7 重組質體，以 HindIII 及 NotI 切除 FBXO7 cDNA 序列及 EGFP 片段。純化後置入以 HindIII 及 NotI 切除的 pcDNA5/FRT/TO 載體內。切合好的 pcDNA5/FRT/TO FBXO7-EGFP 14.

(27) 總組質體轉型入細菌、抽取小量質體 DNA，經 HindIII 及 NotI 限制酵素切割圖譜分析確認結構正確，誤配引子 PCR 及 PstI 限制酵素切割確認 Y52C 多型性後，進行質體 DNA 的大量製備與保存。. (三)轉染(transfection). 接種 2×105 (HEK-293T)細胞至 6-well 培養盤中。第二天，進行載體(EGFP-N1、pcDNA3.1/V5-His)、FBXO7 重組質體(WT、Y52C)的轉染。取 6 μl lipofectamine 2000 (Invitrogen)，加入 250 μl 去血清且不含抗生素之 OptiMEM 培養液(Gibco)，混合均勻。再將 6 μg 質體 DNA，加入 250 μl OptiMEM 培養液，混合均勻。接著將已作用 5 分鐘的 lipofectamine - OptiMEM 混合液加入質體 DNA - OptiMEM 混合液。 20 分鐘後加入上述 500 μl 的 lipofectamine - 質體 DNA - OptiMEM 混合液到培養盤中，置於 37℃、5% CO2 且溼度穩定之細胞培養箱中培養 6 小時。之後再加入 1 ml 的培養液，培養二天。另外，以不含質體 DNA 的轉染當做轉染控制組。. (四)次細胞分層. 轉染二天後離心收集細胞，以 PBS 清洗兩次，收集細胞 pellets。 15.

(28) 加入適量不含清潔劑的 hypotonic buffer，置於冰上作用 30 分鐘後，利用 26G 的針筒來回推拉 30 次，直到 75~80%的細胞被打破(取 2~3 µl 細胞懸浮液，利用顯微鏡觀察)。離心 1,000 × g、10 分鐘後移除 pellets (含未破細胞及細胞核)，將上清液離心 11,000 × g、15~20 分鐘後，分別蒐集上清液(細胞質液)及 pellets (粒線體)。上清液以 14,000 × g 離心 15~20 分鐘，所得上清液即為細胞質液。未破細胞及細胞核 pellets 以 hypotonic buffer 清洗 2~3 次，每次以 10,000 × g 離心 15~20 分鐘，加入 50~70 µl RIPA buffer，超音波震盪 30 下後，以 14,000 × g 離心 15~20 分鐘，所得上清液即為細胞核液。. (五)西方轉漬法(Western blot). 細胞轉染二天後，直接蒐集細胞，進行上述次細胞分層，或加入蛋白新生抑制劑後，於 0、6、12、24、36、48 小時蒐集細胞、萃取蛋白液。蛋白質以 Bio-Rad Protein Assay 定量後，取 20 µg 蛋白質，加入適量 sample buffer (50 mM Tris, pH6.8 - 2% SDS - 10% glycerol 2.5% β-mercaptoethanol - 0.005% bromophenolblue)，在沸水中預熱 5 分鐘後取出，並離心 10,000 rpm 一分鐘，置於冰上，隨即進行 10% SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)以分離蛋白質。電泳完後以 XCell II TM Blot Module (Invitrogen)及 transfer buffer (25 mM Tris - 0.2 M 16.

(29) glycine - 20% methanol) 將蛋白轉漬至硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane, Whatman)上。之後浸泡膜於 blocking buffer (10% skim milk - PBS)，置 4℃中隔夜或是室溫下震盪一小時。Blocking 完成後以 wash buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0 - 0.05% Tween 20)清洗硝化纖維膜三次，每次 15 分鐘。之後加入一級抗體於室溫下作用 2 小時後，以 wash buffer 清洗膜三次，每次 15 分鐘。接著加入 horseradish peroxidase (HRP) conjugated 二級抗體，於室溫作用 2 小時。之後以 wash buffer 清洗膜三次，每次 15 分鐘。最後加入冷光呈色試劑(Millipore)於膜上，以冷光儀及 ImagerReader LAS-3000 軟體偵測蛋白表現。. (六)螢光顯微鏡觀察. 接種 1×105 HEK-293T 細胞至包含 poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理過的 coverslip 的 12 孔培養盤中。第二天進行 EGFP-N1 載體及 FBXO7 重組質體(WT、Y52C)的轉染，其方法如前所述。二天後進行染色，其方法如下：加入 Hoechst 33342 核染劑(1 μg/ml)到培養液，作用 20 分鐘。染色完成後移除培養液，將細胞以 PBS 潤洗兩次後，直接使用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡觀察細胞形態、聚集表現位置與綠螢光融合蛋白的表現情形與表現位置等。. 17.

(30) 三、Y52C多型性的神經性狀分析. (一) pcDNA5/FRT/TO/FBXO7-EGFP重組質體的建構. 取前述之pEGFP-N1-FBXO7重組重組，以HindIII、NotI限制酵素切出野生型及 Y52C 多型性 FBXO7-EGFP 融合基因，置入 pcDNA5/FRT/TO載體。接合好的DNA的轉形、質體DNA小量抽取如上述。經圖譜分析確認結構正確、誤配引子PCR及PstI限制酵素切割確認Y52C多型性後，進行質體DNA的大量製備與保存。. (二)建立Flp-In SH-SY5Y- FBXO7-EGFP穩定細胞株. 接種 5×105 的 Flp-In SH-SY5Y 宿主細胞(Lee et al., 2012)於 6 孔細胞培養盤中，隔天進行轉染。方法為：取 6 μl T-Pro (Invitrogen)，加入 250 μl OptiMEM 培養液(Gibco)均勻混合。接著取 0.5 μg pOG44 質體與 4.5 μg pcDNA5/FRT/TO/FBXO7-EGFP 質體，加入 250 μl OptiMEM 培養液後，混合均勻。接著將已作用 5 分鐘的 T-Pro-OptiMEM 混合液與 pcDNA5/FRT/TO/FBXO7-EGFP-pOG44OptiMEM 混合液混合並反應 20 分鐘。反應後將上述 500 μl 的混合液，加到 6 孔細胞培養盤的細胞中培養 6 小時。之後以不含抗生素、含 18.

(31) 10% FBS 之 DMEM/F12 培養液補足至 2 ml，培養 2 天後，改以含篩選的抗生素 100 μg/ml hygromycin B 及 5 μg/ml blasticidin S 培養液，進行細胞株之篩選。篩選完成後，將細胞培養在 10% FBS、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin、100 μg/ml hygromycin B 和 5 μg/ml blasticidin S 之 DMEM/F12 培養液中。. (三)神經性狀分析. 接種 2×105 顆 SH-SY5Y-FBXO7-EGFP 細胞於 6 孔盤中，每孔含有 DMEM/F12 的培養液 2 ml，另含 100 μg/mL hygromycin B 及 5 μg/ml blasticidin S，並以 10 μM retinoic acid 誘導神經分化。第二天，加入 5 μg/ml doxycycline，誘導細胞表現 7、14、21 天後，將細胞培養盤取出加入 DAPI 處理 30 分鐘，隨後利用 Metamorph microscopy automation，並統計分析誘導分化後的 total outgrowth、branch、process、 mean outgrowth intensity 等神經纖維生長情形。. 19.

(32) 肆、結果. 一、PD 患者 FBXO7 基因突變分析. 針對 84 位帕金森氏症患者的 FBXO7 cDNA 進行 PCR，增幅 1955 bp cDNA 片段(圖三 A)，純化後進行定序分析。結果發現 3 種報導過的多型性點：Y52C (TAC>TGC) (表現子 2，圖三 B)、I115M (ATA>ATG) (表現子 2，圖三 C)、L317 (CTG> TTG) (表現子 6，data not shown)。. 表現子 2 的 Y52C 多型性未新增任何限制酶切位，故設計誤配引子聚合酶連鎖反應，來做變異的確認及族群分析。增幅的 240 bp 產物經 PstI 切割後，Y52C 的異型合子同時出現切割的 222 bp 片段及未切割的 240 bp 片段，不具 Y52C 多型性者則僅見未切割的 240 bp 片段(圖四 A)。表現子 2 的 I115M 多型性新增一 PaeI 限制酶切位 (GCATGC)，多型性同型合子者出現切割的 300、179 bp 片段，異型合子同時出現切割的 300、179 bp 片段及未切割的 479 bp 片段，不具多型性者則僅見未切割的 479 bp 片段(圖四 B)。. 20.

(33) 由 NCBI 搜尋各種哺乳動物 (Human 、 Pan troglodytes 、 Mus musculus、Bos taurus、Rattus norvegicus) FBXO7 基因序列進行 Y52C、 I115M 多型性的序列比對，結果顯示 Y52C 多型性點在各物種間具有高度保留性(圖四 B)。. 二、Y52C、I115M 多型性與台灣族群 PD 感受性. PD 患者(516 位)與正常人族群(516 位)的 Y52C 與 I115M 多型性分析結果詳見於表四。依等位基因頻率及樣品總數(觀察值)，算出期望之基因數(預期值)，經 chi-square 分析後，兩多型性遺傳情形皆處於哈溫平衡。基因型及等位基因頻率分析結果顯示，Y52C 之 AG 異型合子頻率(0.8%)及 G 等位基因頻率(0.4%)在病人族群中明顯較正常人族群低(2.3%及 1.2%, P = 0.044)，且和低帕金森氏症感受性相關 (odds ratio: 0.33, 95% confidence interval: 0.09-0.95, P = 0.055~0.056)。進一步併入包含中國的 Parkisonism 病患 135 例、正常人 200 例(Luo et al., 2010)的綜合分析顯示於表五，Y52C 之 AG 異型合子頻率(0.9%) 及 G 等位基因頻率(0.5%)在病人族群中明顯較正常人族群低(2.8%及 1.4%, P = 0.011~0.012)，且和低帕金森氏症感受性顯著相關(odds ratio: 0.32~0.33, P = 0.016~0.017)。. 21.

(34) 三、Y52C 多型性之功能分析. (一) EGFP 標記的 FBXO7 cDNA 選殖. 野生型(Wild type)及多型性(Y52C)的 cDNA，經 PCR 移除終止密碼並引入 AgeI 限制酵素切位後，置入 pEGFP-N1 質體(圖五 A)。經 HindIII、AgeI 限制酵素切割及誤配引子 PCR、PstI 切割確認選殖成功的野生型(Wild type)及多型性(Y52C)重組質體(圖五 B)。. (二) V5-His 標記的 FBXO7 cDNA 選殖. 野生型(Wild type)及多型性(Y52C)的 cDNA，經 PCR 移除終止密碼並引入 XhoI 限制酵素切位後，置入 pcDNA3.1/V5-His/lacZ 質體(圖六 A)。經 HindIII、XhoI 限制酵素切割及誤配引子 PCR、PstI 切割確認選殖成功的野生型(Wild type)及多型性(Y52C)重組質體(圖六 B)。. (三) FBXO7 cDNA 表現. 利用 lipofectamine 將 V5-His 及 EGFP 標記的野生型(Wild type) 及多型性(Y52C)的 FBXO7 重組質體轉染入 HEK-293T 細胞表現。二天後蒐集細胞、萃取蛋白，利用 FBXO7 抗體進行西方轉漬分析，觀 22.

(35) 察細胞中 FBXO7 蛋白表現情形，結果顯示於圖七 A。以轉染重組質體表現的 Neomycin 蛋白做定量比較，V5-His 及 EGFP 標記的 Y52C 多型性蛋白的表現量比野生型(Wild type)蛋白表現量多。若先進行次細胞分層再萃取蛋白，FBXO7 抗體的西方轉漬分析結果亦顯示，在細胞質與細胞核中，Y52C 多型性點蛋白表現量相較於野生型(Wild type)蛋白表現量都較多(圖七 B)。. (四) FBXO7-EGFP 融合蛋白的時間週期(time course)分析. 利用 lipofectamine 將 EGFP 標記的野生型((Wild type))及多型性 (Y52C)的 FBXO7 重組質體轉染入 HEK-293T 細胞表現。二天後加入 cycloheximide (200 mg/ml)，並於 0、6、12、24、36、48 小時蒐集細胞、萃取蛋白。定量後利用 FBXO7 抗體進行西方轉漬分析，結果顯示於圖八。可看出隨著時間增長，在 Y52C 多型性點上 FBXO7 融合蛋白的相較於野生型(Wild type)的 FBXO7 融合蛋白是較穩定的。野生型(Wild type)的融合蛋白在 6hr 後就開始降解，融合蛋白表現量有降低趨勢。. (五) FBXO7-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察. 23.

(36) 以共軛焦顯微鏡觀察 FBXO7-EGFP 融合基因在 HEK-293T (細胞內表現位置。如圖九，所示可看出野生型(Wild type) FBXO7-EGFP 融合蛋白主要分佈在細胞核及細胞質中，多型性(Y52C) FBXO7-EGFP 融合蛋白也同樣主要分佈在細胞核及細胞質中，多型性(Y52C)與野生型(Wild type)的蛋白在細胞中表現位置相似，無明顯差異。但比較兩者的藍綠螢光強度，可看出多型性(Y52C)相較於野生型(Wild type)的綠螢光強度是有顯著差異。. 四、Y52C 多型性的神經性狀分析. (一) pcDNA5/FRT/TO 質體建構. 野生型(Wild type)及多型性(Y52C)的 FBXO7-EGFP，以 HindIII 及 NotI 切出包含 FBXO7 cDNA 及 EGFP 片段後，置入 pcDNA5/FRT/TO 載體(圖十 A)。經 HindIII、NotI 限制酵素切割及誤配引子 PCR、PstI 切割確認選殖成功的野生型及多型性重組質體(圖十 B、C). (二)建立 Flp-In SH-SY5Y-FBXO7-EGFP 穩定細胞株. 24.

(37) 圖十一顯示誘導式 SH-SY5Y 細胞株的建構。Flp-In SH-SY5Y 神經瘤宿主細胞上有 TetR (Tet repressor)基因、blasticidin S 抗生素篩選基因及 FRT (Flp Recombinase Target)序列、zeocin 抗生素篩選基因(圖十一 A)。表現載體 pcDNA5/FRT/TO 包含 FRT 序列與不具啟動子及轉譯起始碼的 hygromycin B 篩選基因(圖十一 B)。將 pOG44 質體(提供 Flp recombinase)與 pcDNA5/FRT/TO/FBXO7-EGFP 質體共轉入 Flp-In SH-SY5Y 神經瘤宿主細胞，使 FBXO7-EGFP 的基因片段單一置入細胞的染色體上，且 SV40 啟動子及轉譯起始密碼與 hygromycin 篩選基因相連(圖十一 C)。進行 hygromycin B、blasticidin S 抗生素篩選，建立誘導式 SH-SY5Y 的神經細胞。. (三)神經細胞性狀分析. 將上述建構的 Flp-In SH-SY5Y 神經細胞添加 retinoic acid (10 μM) 誘導神經分化後，第二天加入 doxycycline (5 μg/ml)誘導 FBXO7-EGFP 表現。圖十二 A 顯示誘導神經分化 21 天後的螢光顯微影像。高通量活細胞影像系統分析 7、14、21 天的顯微影像顯示，在神經纖維總生長(total outgrowth)、突起(process)、分支(branch)、平均生長強度(mean outgrowth intensity)等方面，多型性(Y52C)的細胞所表現的神經性狀都較於野生型(Wild type)者顯著佳(圖十二 B)。 25.

(38) 伍、討論. 一、FBXO7 基因多型性. FBXO7 基因變異在不同地區都有陸續被發表出來。在具有隱性遺傳帕金森氏症家族史的病患中，伊朗家族是最先被發表出來，帶有同型合子變異 R378G (Shojaee et al., 2008)，再來是義大利家族帶有同型合子變異 R498X 及荷蘭家族帶有 IVS7 +1 G/T 裁接位異型合子變異及 T22M missense 變異(Di Fonzo et al., 2009)。在最近發表的文章裡指出，FBXO7 蛋白普遍存在核內，而帶有 T22M 變異點的 FBXO7 蛋白則存在細胞質內(Zhao et al., 2011)。故本實驗的研究由長庚醫院提供之 PD 患者 cDNA 進行 FBXO7 基因定序的工作。結果發現在表現子 2 的 I115M (ATA>ATG)多型性、表現子 6 的 L317L (CTG> TTG)多型性、及在表現子 2 的 Y52C (TAC>TGC)多型性(圖三)。. (一) Y52C、I115M 多型性與台灣族群 PD 感受性. (1) Y52C A>G 多型性多型性(Y52C)在所檢測的 84 位帕金森氏症患者，僅有 H666 這位病患帶有此 Y52C 的異型合子。而在中國大陸 200 位 PD 及 200 位 26.

(39) 正常人的研究結果顯示，Y52C 患者及正常族群中的基因頻率有達到差異(Luo et al., 2010)。故本實驗對台灣 516 位 PD 患者與 516 個正常人進行 Y52C 的多型性分析。在 case-control study 裡，可看出並未達到差異(表四)，之後結合 Luo 等人(2010)的數據分析結果(表五)，包含 651 位帕金森氏症患者與 716 位正常人，Y52C 經統計分析可看到 Y52C 之 C 等位基因頻率在病人族群中明顯較正常人族群低(0.5 vs. 1.4%, P = 0.0167)，且和低帕金森氏症感受性相關(odds ratio: 0.32, 95% confidence interval: 0.12-0.77, P = 0.0161)。帶有此多型性點的正常人較患者多，表示 Y52C 具保護性。由序列比對，也可看到 Y52C 在各物種間的演化上具有高度保留性(圖四)，亦支持即此多型性具保護性的論點。. (2) I115M A>G 多型性 I115M 多型性在 516 位帕金森氏症患者與 516 位正常人的 case-control study 裡，I115M 等位基因在患者及正常族群中的基因頻率相似(表四)。與 Luo 等人(2010)所報導的 I115M 多型性點無顯著性差異的結果一致。由序列比對，也看到 I115M 在各物種間的保留性不高(圖四)。. (二) FBXO7 基因 Y52C 多型性的功能分析 27.

(40) FBXO7 蛋白在先前的研究中發現大部分是表現在細胞核，不過帶有 T22M 突變的 FBXO7 蛋白會由細胞核移動到細胞質中(Zhao et al., 2011)，因此本實驗也嘗試將 FBXO7-EGFP 及 FBXO7-V5-His 重組質體送入 HEK-293T 細胞中表現並進行次細胞分層，利用西方轉漬法觀察野生型及多型性型 FBXO7-EGFP 融合蛋白在胞核移及細胞質中的表現情形。結果顯示 Y52C 蛋白表現量在胞核移及細胞質中皆顯著較野生型多(圖七)。進一步時間週期的西方轉漬法，發現含 Y52C 多型性點的 FBXO7 蛋白降解的速率較野生型的 FBXO7 蛋白慢(圖八)，故推論 Y52C 多型性的 FBXO7 蛋白較野生型者穩定。. 使用螢光顯微鏡觀察野生型及 Y52C 多型性 FBXO7-EGFP 融合蛋白在 HEK-293T 細胞中的表現情形與位置，結果顯示兩者皆存在於細胞核及細胞質中，但 Y52C 多型性 FBXO7-EGFP 融合蛋白表現量較野生型者多(圖九)。此結果導致於 Y52C 多型性的 FBXO7 蛋白的穩定性。. (三) 誘導式 SH-SY5Y 神經性狀分析利用以建立好的 Flp-In SH-SY5Y 神經瘤宿主細胞去觀察表現野生型和多型性的 FBXO7-EGFP 融合蛋白的神經性狀。可以發現到表 28.

(41) 現多型性的 FBXO7-EGFP 融合蛋白的神經細胞，其神經纖維全生長、突起、分支、平均生長強度等，皆較表現野生型 FBXO7-EGFP 融合蛋白的神經細胞顯著佳(圖十二)。此結果亦支持 Y52C 多型性具保護性的論點。. 29.

(42) 陸、參考文獻. Belin AC, Westerlund M (2008) Parkinson's disease: a genetic perspective. FEBS J 275:1377-1383. Bertram CP, Lemay M, Stelmach GE (2005) The effect of Parkinson's disease on the control of multi-segmental coordination. Brain Cogn 57:16-20. Bonifati V, Fabrizio E, Vanacore N, De Mari M, Meco G (1995) Familial Parkinson's disease: a clinical genetic analysis. Can J Neurol Sci 22:272-279. Bonifati V, Rizzu P, Squitieri F, Krieger E, Vanacore N, van Swieten JC, Brice A, van Duijn CM, Oostra B, Meco G (2003) DJ-1 (PARK7), a novel gene for autosomal recessive, early onset parkinsonism. Neurol Sci 24:159-160. Chang YF, Cheng CM, Chang LK, Jong YJ, Yuo CY (2006) The F-box protein Fbxo7 interacts with human inhibitor of apoptosis protein cIAP1 and promotes cIAP1 ubiquitination. Biochem Biophys Res Commun 342:1022-1026. Conley SC, Kirchner JT (1999) Parkinson's disease-the shaking palsy. Underlying factors, diagnostic considerations, and clinical course. Postgrad Med 106:39-42, 45-36, 49-50. Dauer W, Przedborski S (2003) Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron 39:889-909.. 30.

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(48) 柒、附錄圖表. 圖一、FBXO7 基因轉錄物及蛋白質。(A) FBXO7 第一型及第二型轉錄物。(B) FBXO7 蛋白結構，包含 N 端的 Ubl (ubiquitin-like domain)、 C 端的 PRR (proline-rich region)及銜接 Ubl 及 PRR 的 FP (FBXO7/PI31) domain (Di Fonzo et al., 2009)。. 36.

(49) 圖二、泛素-蛋白解體酶系統。E3 ubiquitin ligases 會催化 ubiquitin (Ub) 鍵結上目標蛋白質(Target Protein)，此複合物進入 26S 蛋白解體酶 (proteasome)降解(Lehman, 2009)。. 37.

(50) 圖三、FBXO7 cDNA 增幅及定序。(A) FBXO7 cDNA 增幅產物的 0.8% 洋菜膠體電泳照片。(B) Y52C 多型性異型合子定序結果。(C) I115M 多型性異型合子、同型合子定序結果。. 38.

(51) 圖四、Y52C、I115M 多型性檢測及演化保守性分析。(A) Y52C 多型性的 PstI RFLP 檢測。(B) I115M 多型性的 PaeI RFLP 檢測。Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的結果，作為片段大小標記。(C) 演化保守性分析。. 39.

(52) 圖五、FBXO7-EGFP 重組質體的構築及限制酵素圖譜確認。 (A) FBXO7 cDNA、pEGFP-N1 載體及 MCS 的核苷酸序列及置入的 HindIII、 AgeI 限制酵素切位。(B)載體(Vec)、野生型(Wild type)及多型性型 (Y52C)重組質體，經 HindIII、AgeI 切割後的 0.8%洋菜膠體電泳照片。 Lane M 為 1 kb ladder 的大小標記。(C)野生型(Wild type)及多型性型 (Y52C)重組質體的誤配引子 PCR 及 PstI 切割的 2.0%洋菜膠體電泳照片。Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的大小標記。 40.

(53) 圖六、FBXO7-V5-His 重組質體的構築及限制酵素圖譜確認。(A) FBXO7 cDNA、pcDNA3.1/V5-His/lacZ 載體及 MCS 置入的 HindIII、 XhoI 限制酵素切位。(B)載體(Vec)、野生型(Wild type)及多型性型 (Y52C)重組質體，經 HindIII、XhoI 切割後的 0.8%洋菜膠體電泳照片。 Lane M 為 1 kb ladder 的大小標記。(C)野生型(Wild type)及多型性型 (Y52C)重組質體的誤配引子 PCR 及 PstI 切割的 2.0%洋菜膠體電泳照片。Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的大小標記。 41.

(54) 圖七、FBXO7-V5-His、FBXO7-EGFP 融合蛋白的西方轉漬分析。(A) 載體(Vec)、V5-His 及 EGFP 標記的野生型(WT)及多型性(Y52C) FBXO7 重組質體轉染入 HEK-293T 細胞中表現二天後，蒐集細胞、萃取蛋白，利用 FBXO7 抗體、Tubulin 抗體、Neomycin 抗體進行西 42.

(55) 方轉漬。(B) V5-His 及 EGFP 標記的野生型(WT)及多型性型(Y52C) FBXO7 重組質體轉染入 HEK-293T 細胞中表現二天後，蒐集細胞、進行次細胞分層及萃取蛋白，利用 FBXO7 抗體、GAPDH 抗體、Histone 抗體進行西方轉漬。. 43.

(56) 圖八、FBXO7-EGFP 融合蛋白時間週期分析。EGFP 標記的野生型(WT) 及多型性(Y52C) FBXO7 重組質體轉染入 HEK-293T 細胞中表現二天後，加入 cycloheximide (200 µg/ml)，並於 0、6、12、24、36、48 小時後蒐集細胞、萃取蛋白，利用 FBXO7 抗體、GAPDH 抗體進行西方轉漬。. 44.

(57) 圖九、FBXO7-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察。野生型(WT)、多型性(Y52C)的 FBXO7-EGFP 重組質體，轉染入 HEK-293T 細胞中表現二天後以共軛焦顯微鏡觀察融合蛋白的表現情形與位置。藍色為細胞核染色、綠色為 FBXO7-EGFP 融合蛋白，下方為綠/藍螢光定量圖。. 45.

(58) 圖十、pcDNA5/FRT/TO-FBXO7-EGFP 重組質體的構築及限制酵素圖譜確認。(A)將 pEGFP-N1-FBXO7 重組質體的 FBXO7-EGFP 片段以 HindIII、NotI 限制酶切出，置入 pcDNA5/FRT/TO 質體上 HindIII、 NotI 切位間。(B)載體(Vec)、野生型(Wild type)及多型性型(Y52C)重組質體，經 HindIII、NotI 切割後的 0.8%洋菜膠體電泳照片。Lane M 為 1 kb ladder 的大小標記。(C)野生型(Wild type)及多型性型(Y52C) 重組質體的誤配引子 PCR 及 PstI 切割的 2.0%洋菜膠體電泳照片。 Lane M 為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfI 切割的大小標記。 46.

(59) 圖十一、誘導式 SH-SY5Y 細胞株建立流程圖。(A) Flp-In SH-SY5Y 神經瘤宿主細胞上有 TetR (Tet repressor)基因、Blasticidin S 抗生素篩選基因，及 FRT (Flp Recombinase Target)序列、Zecoin 抗生素篩選基因。 (B)將 pcDNA5/FRT/TO/FBXO7-EGFP 質體和 pOG44 質體(提供 Flp recombinase)共轉入 Flp-In SH-SY5Y 宿主細胞。(C)藉同源性重組將 FBXO7-EGFP 融合基因置入 Flp-In SH-SY5Y 神經瘤宿主細胞染色體上。. 47.

(60) 圖十二、SH-SY5Y-FBXO7-EGFP 細胞株神經纖維生長分析。(A)野生型(Wild type)及多型性型(Y52C) SH-SY5Y-FBXO7-EGFP 細胞神經分化第 21 天的情形。 (B) 野生型 (Wild type) 及多型性型 (Y52C) SH-SY5Y-FBXO7-EGFP 細胞神經分化 7 天、14 天、21 天後，以活細胞影像系統量化神經纖維總生長(total outgrowth)、突起(process)、分支(branch)、平均生長強度(mean outgrowth intensity)的情形。. 48.

(61) 表一、帕金森氏症的遺傳因子. 註：AD, autosomal dominant; AR, autosomal recessive; J, juvenile; EO, early onset。(Belin and Westerlund, 2008). 49.

(62) 表二、增幅 FBXO7 cDNA 定序與 Y52C、I115M 多型性的 PCR 引子對、條件及檢測試驗 Test (amplified region). Anneal (℃) / MgCl2 (mM). Product / RFLP enzyme (fragment, bp). cDNA sequencing F: CTCTTTCCCCGTTTCGCC R: GGAGAACCAAGAGCAGGGAGA. 58 / 1.5. 1955. Y52C (TAC/TGC) F: AGGCTGAGGCAGGAGGATTG R: CTCCAGTGAGGGGATCCCTG. 58 / 1.5. PstI: CTGCAG (240 / 222, 18). I115M (ATA/ATG) F: TCACTGGAGATGAAGAGACC R: AATCGCTTGAACTGGGAGGC. 58 / 1.5. PaeI: GCATGC (479 / 300, 179). 註：RFLP (restriction fragment length polymorphism)，限制片段長度多型性。. 50.

(63) 表三、增幅 FBXO7 cDNA 重組質體的 PCR 引子對、條件 Test (amplified region). Anneal (℃) / Product / MgCl2 (mM) RFLP enzyme (fragment, bp). pEGFP-N1-FBXO7 F: AAGCTTCTCTTTCCCCGTTTCGCCTCAG R: ACCGGTGGCATGAATGACAGCCGGCC pcDNA3.1/V5-His-FBXO7 F: AAGCTTCTCTTTCCCCGTTTCGCCTCAG R: CTCGAGACATGCATGACAGCCGGCCATC. 51. 62 / 1.5. 62 / 1.5. 1727. 1726.

(64) 表四、FBXO7 基因 Y52C、I115M 多型性基因型、等位基因頻率及與疾病相關性. PD (516) Genotype/allele. Control (516) Odds ratio. No.. (%). No.. AA. 512. (99.2) 504. AG. 4. (0.8). A. 1028 (99.6) 1020. G. 4. (0.4). AA. 258. (50.0) 258. AG. 220. GG. (%). P-value. (95% CI). Y52C A>G (97.7) 1.00 (2.3) 0.33 (0.09-0.95). 0.055. (98.8) 1.00 (1.2) 0.33 (0.09-0.95). 0.056. (42.6) 221. (50.0) 1.00 (42.8) 1.00 (0.77-1.28). 0.9721. 38. (7.4). (7.2). 1.03 (0.63-1.67). 0.9141. A. 736. (71.3) 737. G. 296. (28.7) 295. (71.4) 1.00 (28.6) 1.00 (0.83-1.22). 0.9612. 12 12. I115M A>G. 37. 註：Odds ratio 的計算是以最常見的基因型/等位基因定為 1.00 做為比較的標準。Odds ratio > 1.00 表示有較高的疾病罹患風險，Odds ratio < 1.00 表示有較低的疾病罹患風險。. 52.

(65) 表五、FBXO7 基因 Y52C 多型性基因型、等位基因頻率及與疾病相關性：綜合分析. PD (651) Genotype/allele. Control (716) Odds ratio. No.. (%). No.. AA. 645. (99.1) 696. AG. 6. (0.9). A. 1296 (99.5) 1412. G. 6. (%). P-value. (95% CI). Y52C A>G. (0.5). 20 20. (97.2) 1.00 (2.8) 0.32 (0.12-0.77). 0.0161. (98.6) 1.00 (1.4) 0.33 (0.12-0.77). 0.0167. 註 1：Odds ratio 的計算是以最常見的基因型/等位基因定為 1.00 做為比較的標準。Odds ratio > 1.00 表示有較高的疾病罹患風險，Odds ratio < 1.00 表示有較低的疾病罹患風險。註 2：綜合分析包含中國的 Parkisonism 病患 135 例、正常人 200 例(Luo et al., 2010)。. 53.

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