台灣疫病菌PHYTOPHTHORA PARASITICA 之基因型研究(二)

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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

臺灣疫病菌基因型之研究 (II)

一、中文摘要

疫 病 菌 Phytophthora parasitica Dastur

(=Phytophthora nicotianae Breda de Haan)

是本省非常重要的植物病原菌。其屬於較 嗜高溫菌，在本省之分佈主要集中於中南 部，可危害之寄主種類繁多。研究顯示， 從不同寄主分離到之疫病菌在形態及生理 特徵上都有相當差異，接種試驗也發現菌 系間病原性有差別，寄主範圍也不同，可 能已有分化現象。本計畫之目的擬藉 DNA 指紋分析來探討自不同寄主植物所分離到 之疫病菌菌株基因型的變異情形。為了尋 求適合的核酸探針，我們除了進行疫病菌 基因庫之篩選外，也嘗試探討以反轉錄轉 位子序列作為探針進行 DNA 指紋分析的 可行性。目前的研究結果顯示，疫病菌確 實帶有 Ty1-copia group 反轉錄轉位子序 列；以之為探針進行基因組南方雜合反應 時，供試菌株之雜合圖譜呈現明顯的多型 性。實驗結果也顯示，在一般培養條件下， 這一個轉位子不具有轉位能力。因此，其 在不同疫病菌分離株之存在情形或可反映 出這些菌株彼此之間的類緣關係。為了進 一步探討這一個核酸片段在疫病菌有性與 無性繁殖過程中的遺傳特性，我們另外還 進行了兩項分析，目前實驗仍在進行當 中，短期內應可獲得明確結果。 關鍵詞: 反轉錄轉位子、疫病菌、基因型、DNA 指 紋分析、核酸探針。 Abstract

Phytophthora parasitica Dastur (=

Phytophthora nicotianae Breda de Haan),

being able to attack a wide variety of plants, is a very notorious plant pathogen in the central and southern Taiwan. Crops of great

economical importance such as citrus, tobacco, dieffenbachia, lily, cymbidium, etc.,

all are targets of this pathogen. It has been shown that there are variations in the morphology, pathogenicity, and virulence among P. parasitica isolated from different

host species, indicating that differentiation may have arisen in P. parasitica isolated

from different host species. The purpose of this study was to analyze the genotypes of P. parasitica by DNA fingerprinting. To

search for probes appropriate for DNA fingerprinting analysis, 20 clones were randomly selected from the genomic library of P. parasitica. Subsequently, DIG-labeled

probes were prepared from each clone and used in genomic Southern hybridization. Besides, the possibility that retrotransposon may serve as a genetic marker was also investigated at the same time. Fortuitously, results obtained from the latter approach have been very inspiring. It has been found that there indeed exist Ty1-copia

retrotransposons in P. parasitica, as revealed

by the presence of reverse transcriptase sequences. Analysis by genomic Southern hybridization using retrotransposon sequence as a probe indicated that polymorphisms exist among P. parasitica isolates tested. To

determine its genetic stability, RNA was prepared from this fungus and analyzed by Northern hybridization as well as reverse-transcriptase-polymerase chain reaction. No signal was detectable, indicating that this retroelement is unable to transpose. In addition, the genetic stability of this sequence throughout the asexual and sexual reproduction cycles of P. parasitica is now

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being investigated as well.

Keywords: Phytophthora parasitica Dastur, DNA fingerprinting, genotypes, retrotransposon

二、緣由與目的

疫病菌Phytophthora parasitica Dastur

之寄主種類非常廣，重要果樹、觀賞植物 及花卉，像鳳梨、柑桔、百香果、百合、 火鶴花、蘭花、蔓綠絨與黃金葛，及一些 重要盆花植物等都是其肆虐對象(1, 2, 5-7)。 安 (3) 最近之調查結果更顯示，疫 病菌在本省之寄主種類至少包括 46 屬 54 種作物，是本地非常重要的植物病原真 菌。由於疫病菌的寄主範圍這麼廣，在本 省的為害情形又十分嚴重，在考量本菌之 防治策略時，勢必得先對各不同寄主分離 到之疫病菌株的特性，包括這些菌株的來 源是否相同、對其他寄主植物之致病情形 如何、及其病原性之差異等問題有所認 識，才能擬出有效對策。之前的研究顯 示，自不同寄主分離到之疫病菌菌株對不 同作物所表現之病原性與致病力不盡一 致 (10, 12, 16)。安之研究 (3) 也指出， 自其它寄主分離到之疫病菌菌株均不能 感染萬年青或煙草，或致病力非常弱，而 自煙安草分離到之疫病菌菌株雖可為害 其它寄主植物，卻不能為害萬年青。此 外，自萬年青分離到之菌株對其它接種植 物之致病力一般比較弱，也不能感染煙 草，顯示菌系間病原性有差別，寄主範圍 也不同，可能已有分化現象。事實上，依 據病原性、形態、生理等特性之差別，本 地疫病菌大概可分為四個類型 (4)，分別 是(一)、typical type A， 可危害一般疫病 菌之寄主，但不危害煙草，為多犯性，從 前被稱為 P. parasitica var. parasitica (或 P.

nicotianae var. parasitica)；(二)、煙草型

(或 type B)，可危害煙草，從前稱為 P.

parasitica var. nicotianae (或 P. nicotianae

var. nicotianae)；(三)、黛粉葉型與 (四)、 枇杷型；後兩者在形態、生理、與病原性 各面都與 typical types 有相當差異。這些 疫病菌在遺傳組成上是否均一，抑或已經 發生某種程度之分化，以及這些分化是否 直接關係到疫病菌病原性、形態及生理等 各項性質之差異是很有趣、而且重要的課 題。本計劃擬藉 DNA 指紋分析來探討不 同寄主植物分離到之疫病菌菌株的基因 型及變異情形，期能對本省疫病菌菌種基 因型之結構及可能存在之分化情形有所 瞭解，也可作為未來進行疫病菌病原性及 族群遺傳相關研究之參考。 三、結果與討論 為了獲得 適用的 核酸片段 以便進 行 DNA 指紋分析，我們首先自疫病菌基因庫 任意挑選了 20 個 clones，再逐一製備核酸 探針，並進行基因組南方雜合分析(genomic Southern hybridization analysis)。實驗結果 顯示，其中惟有編號 88 之 clone 比較有趣； 以 EcoR1 或 XhoI 等限制 酵解疫病菌 DNA，並以 88 為核酸探針進行南方雜合分 析時，分離自煙草之疫病菌菌株所呈現的 雜合圖譜很明顯地與其他供試菌株不同。 不過，由於這一個探針只能偵測到 1-2 個 核酸片段，並不適用於 DNA 指紋分析，我 們另外還嘗試探討反轉錄轉位子在疫病菌 之存在情形，及以之為核酸探針進行 DNA 指紋分析的可行性。 反轉錄轉位子為一段可在染色體上進 行移動的序列，但與一般轉位子不同的 是，其在移動過程中必須先將序列轉錄成 RNA，並由反轉錄 將此 RNA 轉換成雙股 DNA 後，再插入新的位置 (9)。而由於反 轉錄轉位子每次進行轉位時都得複製出一

份新的序列，一旦進駐生物體內後，其拷 貝數常會越累積越多，是生物體內重複性 序列的重要組成。目前已有一些研究顯 示，自基因庫篩選重複性序列以便進行 DNA 指紋分析時，研究人員所獲得的事實 上就是 一些 反轉錄 轉位 子序列 (10, 14, 15)。為了探討反轉錄轉位子在疫病菌之存 在情形，我們首先以反轉錄 之保守性序 列進行聚合 連鎖反應，並獲得一個與預 期長度接近之 DNA 片段。進一步進行 TA 選殖及序列分析的結果顯示，其核酸序列 (編號 G2Ty-1) 與果蠅、酵母菌、及煙草等 的 Ty1-copia group 反轉錄轉位子的反轉錄 序列之相似度將近 60%。胺基酸序列分 析 的 結 果 也 顯 示 ， 其 包 含 序 列

SLYXLKQAXRXW；這個序列是 Ty1-copia

group 反轉錄轉位子在反轉錄 區域、具有 指標意義的重要保守性序列 (13)。因此疫 病菌非常可能含有 Ty1-copia group 反轉錄 轉位子。 以 EcoRI 酵 解 基 因組 DNA ， 並 以 G2Ty-1 為探針進行南方雜合分析時，疫病 菌分離株 91195 總共呈現將近 20 個雜合條 帶，分離株 87112 所呈現之雜合條帶則多 達 25 個，而且各菌株所呈現之雜合圖譜有 明顯的多型性，顯示此核酸片段有相當潛 力可應用於 DNA 指紋分析。為了瞭解 G2Ty-1 的遺傳穩定性，我們首先探討在一 般培養條件下，疫病菌反轉錄轉位子會不 會轉位。由於反轉錄轉位子轉位時一定得 表現反轉錄 ，因此我們進行了北方雜合 分析與反轉錄-聚合 連鎖反應，以便偵測 反轉錄轉位子 RNA 之表現情形，不過截至 目 前 為 止 都 偵 測 不 到 反 轉 錄 轉 位 子 之 RNA，顯示在目前的培養條件下，疫病菌 反轉錄轉位子很有可能無法進行轉位，因 此其在各疫病菌分離株之分佈情形相當程 度即呈現了這些菌株彼此之間的類緣關 係。此外，為了探討 G2Ty-1 在疫病菌無性 繁殖過程中的穩定性，我們收集疫病菌孢 子囊、刺激其釋放游走子 (zoospore)、待游 走子發芽後進行繼代培養，目前已收集到 第五代，近期內即擬進行南方雜合反應， 以便分析各代疫病菌株間，反轉錄轉位子 雜合圖譜之異同情形。另一方面，為了瞭 解以 G2Ty-1 為核酸探針進行南方雜合分 析時，圖譜上各個雜合條帶的遺傳性質， 及其在疫病菌有性繁殖過程的穩定性，我 們也嘗試選取分屬於 A1_{與 A}2_{配對型之疫} 病菌菌株進行對峙培養、分離 A1_{與 A}2_配 對產生之卵孢子 (oospore)，再參照 Ann and Ko (1988) 建立卵孢子發芽系統。由於 卵孢子發芽條件不容易掌握，這部份的研 究進度稍有延宕，不過現在已經不成問題 了，即將進一步進行南方雜合分析，以便 判斷雜合圖譜上各個條帶在 F1 的分離情 形。 四、計畫成果自評 我們的研究結果顯示，在疫病菌所發 現之反轉錄轉位子序列具有相當潛力可作 為進行疫病菌 DNA 指紋分析時所需要之 核酸探針。不過，在正式進行 DNA 指紋 分析之前，一定得先對這個序列的基本遺 傳性質有所了解。在進行其遺傳穩定性測 試時，碰到的困難主要來自建立卵孢子發 芽系統，這一部份工作耗費相當多時間， 所幸目前問題都已經解決了。 五、參考文獻 1. 安寶貞。 1989。 台灣柑桔之疫病。 台 灣省農業試驗所專刊 27, 212-221。 2. 安寶貞。1995a。 台灣蘭花之疫病。 植

5 保會刊 4, 152-162。 3. 安寶貞。 1995b。 疫病菌Phytophthora parasitica 之病原性及生物學研究。 行 政院國家科學委員會專題研究計畫成 果 報告。 4. 安 寶 貞 。 1997 。 Personal communication。 5. 安寶貞、羅朝村、謝庭芳。 1992。 台 灣百合之疫病。 植保會刊 34, 65-69。 6. Ann, P.J. 1992a. Phytophthora diseases

of ornamental plants in Araceae in Taiwan. Plant Pathol. Bull. 1, 79-89. 7. Ann, P.J. 1992b. New diseases and

records of some important flower plants caused by Phytophthora parasitica in

Taiwan. Plant Pathol. Bull. 1, 166-173. 8. Ann, P.J. and Ko, W.H. 1988. Induction

of oospore germination of Phytophthora parasitica. Phytopathology 78, 335-338.

9. Boeke, J.D. and Sandmeyer, S.B. 1991.Yeast transposable elements, p. 193-261. In The molecular and cellular

biology of the yeast Saccharomyces:

genome dynamics, protein synthesis, and energetics, vol. 1. Broach, Pringle, and Jones (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA.

10.Bonnet, P., Maia, N., Tello-Marquina, J., and Venard, P. 1978. Pathogenic capacity of Phytophthora parasitica [Dastur]:

Factors on variability and concept of parasitic specialization. Ann. Phytopathol. 10, 15-29.

11.Diolez, A., Marches, F., Fortini, D., and Brygoo, Y. 1995. Boty, a

long-terminal-repeat retroelement in the

phytopathogenic fungus Botrytis cinerea.

Appl. Environ. Microbiol. 61, 103-108. 12.Erwin, D.C. 1964. A strain of

Phytophthora parasitica from okra and

its sexual compatibility with isolates from citrus. Phytopathology 54, 114-115. 13.Flavell, A.J., Dunbar, E., Anderson, R.,

Pearce, S.R., Hartley, R., and Kumar, A. 1992. Ty1-copia group retrotransposons

are ubiquitous and hetrogenous in higher plants. Nucl. Acid Res. 20, 3639-3644. 14.Hamer, J.E., Farrall, L., Orbach, M.J.,

Valent, B., and Chumley, F.G. 1989. Host species-specific conservation of a family of repeated DNA sequences in the genome of a fungal plant pathogen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9981-9985. 15.He, C., Nourse, J.P., Kelemu, S., Irwin, J.

A., Manners, J. M. 1996. Cg T1: a non-LTR retrotransposon with restricted distribution in the fungal phytopathogen

Colletotrichum gloeosporioides. Mol.

Gen. Genet. 252, 320-331.

16.Matheron, M.E. and Matejka, J.C. 1990. Differential virulence of Phytophthora parasitica recovered from citrus and

other plants to rough lemlon and tomato. Plant Dis. 74, 138-140.