二枚貝之血淋巴球分類與形態觀察

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二枚貝之血淋巴球分類與形態觀察

洪紹文

1

張永昌

2

陳明輝

3

鄭清福

3

涂青宇

5

林育興

4

林荀龍

3

劉邦成

3

張鎮璿

3

鄒禮澤

3

王渭賢

3* 1_{中央研究院農業生物科技研究中心} 2_{動植物防疫檢疫局台中分局} 3_{國立中興大學獸醫學院獸醫學系} 4_{元培科技大學護理學系} 5_{行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所} （收稿日期：2012.1.10，接受日期：2012.2.17）摘要

文蛤 (hard clam, Meretrix lusonia Roding) 和台灣蜆 (freshwater clam, Corbicula fluminea Mullar) 皆為本省重要的養殖貝類，養殖過程中常因養殖環境惡化，使得產量極不穩定，造成嚴重的經濟損失。許多因素皆可造成貝類死亡與生長遲緩，其中微生物感染亦包括其中。因此，如何降低死亡與增加產量為當務之急。本實驗目的在於研究兩種二枚貝類 (文蛤與台灣蜆) 血淋巴球之分類與形態觀察。利用percoll 梯度離心並輔以光學與電子顯微鏡觀察，結果顯示文蛤之血淋巴球可分為3 種血球：嗜鹼性顆粒球 (density: 1.055 g/mL)、嗜酸性顆粒球 (density: 1.029 g/mL) 及透明血球 (density: 1.018 g/mL)。於台灣蜆之血淋巴球亦有類似之嗜鹼性顆粒球 (density: 1.067 g/mL)、嗜酸性顆粒球 (density: 1.047 g/mL) 及透明血球 (density: 1.020 g/mL)。這些結果對於貝類血淋巴球之研究，可以此為基礎，並進一步地研究貝類之各類血淋巴球之細胞性免疫的功能與作用，以及進一步地瞭解其非特異性免疫的特性。因此，基於以上對貝類血淋巴球的初步研究，希望對於未來貝類疾病預防及防治上能有所助益。關鍵詞：文蛤、台灣蜆、血淋巴球、分類，形態

緒言

文蛤俗稱粉蟯 (hard clam, Meretrix lusonia Roding) 和台灣蜆俗稱喇仔 (freshwater clam,

Corbicula fluminea Mullar) 皆為本省重要的養殖

貝類，其分類系統均屬於軟體動物門 (Mollusca) 之二枚貝綱 (Bivalvia)。文蛤為廣鹽及廣溫性的貝類，殼呈三角形，腹緣呈鈍圓，顏色大多呈黃褐色。台灣養殖之文蛤於 1934 年前後從日本引進，在台灣西岸各河口附近之半鹹淡水區逐年相繼放養，並於 1970 年起開始於魚塭中養殖文蛤 (Hu,1974)。近年來，淺海養殖之文蛤常因養殖環境惡化使得產量極不穩定，再加上魚塭養殖文蛤常因季節性或偶發性大量斃死，使得文蛤之產量下滑 (Hu,1974)。台灣蜆為淡水貝類產量最多且分佈最廣的一種，其外殼接近正三角形且腹緣呈圓形，具有明顯的生長線，顏色則呈黃色、黃綠色或黑褐色，而內殼為紫色或白色。台灣養殖台灣蜆開始於1959 年，以 5-8 月為產季，11-12 月為淡季，於 1959 年之後因為水質污染嚴重而使得台灣蜆漸呈枯竭趨勢 (Hu,1974)。因此，如何降低文蛤與台灣蜆之死亡及增加其產量為當務之急。許多因素皆可造成貝類死亡 (Hu,1974; Chen, 1995; Ordás et al., 2000; Allam et al., 2001; Allam and Ford, 2006; Monari et al., 2007; Yu et

al., 2009; Matozzo et al., 2010; Munari et al., 2011)，

其中微生物感染可造成貝體嚴重病害與經濟損

失。許多研究報告已指出，自病貝分離出 Vibrio

parahaemolyticus 對貝類會造成嚴重的死亡與生

長遲緩 (Paillard et al., 2008) 。 Birnavirus 與 retrovirus 對養殖文蛤亦會造成嚴重死亡 (Elston, 1979; Oprandy and Chang, 1983)。此外，Gulka 和 Chang (1984) 與 Elston (1986) 曾於河蚌 (blue mussel)、海扇貝 (Placopecten magellanicus) 及二 枚貝類 (Tapes japonica 及 Patinopecten yessoensis)

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中發現嚴重感染立克次體 (Richettsia-like organism)。 Morrison 等 (1992) 與 Renault 等 (1995) 發現牡蠣 (Crassostrea virginica) 感染

Haplosporidium nelsoni 與 Marteiria 會造成嚴重

的死亡。Shin 等 (1996) 發現吸蟲之胞蚴 (sporocyst) 與尾蚴 (cercaria) 可導致文蛤嚴重的炎症反應。因此，如何增進貝類防禦微生物感染的能力以避免嚴重死亡與生長遲緩為當務之急 (Buggé et al., 2007)。 由於文蛤和台灣蜆皆為本省重要的水產養殖二枚貝類，其皆屬於過濾飼食者 (filter feeders)，因此特別容易使有害物質及感染性病原蓄積體內引致疾病發生。目前對於貝類之研究大多偏向貝類之分類、生物相調查、養殖調查及其病害病原的研究方面，至今對於貝類疾病的預防及控制仍待做進一步之研究。目前國內外已有少許之研究貝類之體內防禦，然而對於不同種別貝類之血淋巴球分類研究仍甚少，亦存在著相當大的差異性，因此本研究以台灣常見的文蛤及台灣蜆作為研究材料，希望建立本土性貝類正常的血球細胞分類方面的資料。

材料與方法

實驗動物

文蛤 (hard clam, Meretrix lusonia Roding) (台西水產試驗分所贈與) 蓄養於經 UV 照射與過濾的 20‰半淡鹹水中。台灣蜆 (freshwater clam,

Corbicula fluminea Mullar) 購自於台中某台灣蜆

養殖場，蓄養在 UV 殺菌過濾的地下水中。此 2 種貝類分別馴化於裝有循環過濾及打氣系統的玻璃蓄養缸中 (150 L)，並定時觀察貝類之活動，並使用溫度計及 S-100 鹽度比重計 (S-100, Tokyo, Japan) 監控水溫 (27°C) 及鹽度。血淋巴液收集實驗之操作方法係參考 Odo 等 (1995) 之方法加以改良而實行。貝體先於貝殼的前端中央部位以銼刀做一刻痕，而後使用小剪刀在刻痕處稍微打開兩片殼，以 21 針頭自兩殼縫隙穿入貝體內，再從心臟部位或兩側閉殼肌抽取血淋巴液 (hemolymph fluid)。血淋巴球之製備針筒中加入等量之 4°C MAS 抗凝劑 (Modified alsever solution ，每升中含 20.8 g

glucose、8 g sodium citrate、3.36 g EDTA 及 100 µL tween 80) ，再加入等量 5% 之戊二醇 (glutaraldehyde)，抗凝之血淋巴球於 4°C 下固定 2 小時後，於4°C 下離心 (160 × g) 10 分鐘，之後 收集下層血淋巴球，並以PBS 連續進行清洗 3 次，最後提供於血球分離、比重分析及血球形態學研究之用。血淋巴球的分離與比重分析血淋巴球的分離參考 Tu 等 (2007) 與 Mateo 等 (2009) 之方法加以修改而實施。血液中的血淋巴球以不同密度之 percoll (Sigma Chemical Co., St. Louis, MA, USA) 溶液來分離。首先，以0.15 M NaCl 將 100% percoll 稀釋成為 10%及 60% percoll 溶液，之後各取 5 mL 10%及 60% percoll 溶液並分別以梯度混合器 (Heofer Pharmacia Biotech., Sollentuna, Sweden) 於 12 mL 矽膠玻璃管 (Sherwood, St. Louis, MA, USA) 中製成10 mL 之梯度 percoll (10%-60%)，最後將 2 mL 上述經抗凝並固定之血淋巴球加於上層，並且同時加入各種不同的比重標示珠子 (Sigma)，於4°C 下離心 (800 × g) 30 分鐘。之後以內差法 計算各層之比重，並將離心後分離的各層分別抽出，以MAS 溶液清洗 3 次後收集之，以作為後續相關實驗使用。血淋巴球的染色並利用光學顯微鏡觀察血淋巴球的型態與特性本實驗係參考Moore 和 Eble (1977) 之方法加以修改而實施。首先，取20 µL 經抗凝並固定之血淋巴球加至玻片上，並製成塗抹片，之後以 May-Grunwald Geimsa (Sigma) 及 Wright’s stain (Sigma) 進行染色，並於光學顯微鏡下觀察各類血淋巴球之細胞形態特性與細胞質中所含胞器的染色情形，並作比較。利用掃描式電子顯微鏡 (scanning electron microscope; SEM) 觀察血淋巴球的細胞型 態與特性本實驗係參考 Cheng 等 (1980) 之方法加以修改而實施。二枚貝之血淋巴液離心 (120 × g) 5 分鐘後，收取其血淋巴球層。血淋巴球先以 2% glutaraldehyde 於 4°C 下固定 2 小時，之後離心 (120 × g) 5 分鐘去除上清液後，以 PBS 清洗 3 次， 之後再以 1%的鋨酸於 4°C 下固定 2 小時後，再以PBS 清洗 3 次，而後以 30%-100%梯度酒精脫

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水，最後以100%酒精處理 3 次，並以 LADD 2800 臨界點乾燥儀 (Critical point dryer ； Ladd Research industries Inc., Burlington, VM, USA) 進行臨界點乾燥處理。將樣品彈至載物台上，在 JBS-E5150 真空鍍膜儀 (Supper coater, J. B. EM Services Inc, Quebec, Canada) 進行金屬離子覆膜，在15 KV 下以 Topcon ABT-150 S 型掃描式電子顯微鏡 (Topcon, Tokyo, Japan) 進行觀察並照相記錄。

利用穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscope; TEM) 之觀察血淋巴

球的細胞型態與特性

本實驗係參考 Ruddel (1971) 之方法加以

修改而實施。經前固定與後固定的樣品以 3%的

agar (Difco Lab., Detroot, MI, USA) 於 45°C 下包埋成形，並以梯度酒精脫水，以LR white acrylic resin (Structure probe Co., Wester chester, PA, USA) 進行滲透取代 3 天並予以包埋，將之置於 70°C 烘箱中，26 小時後待硬化後取出標本塊修整，再以Ultracut E 超薄切片機 (ultra-microtome, Reichert-Jung Co., Veina, Austria) 製成超薄切片，

以銅網格將切片撈起，經以0.22 µm 過濾的醋酸

鈾 (uranyl acetate, Merck, Darmstadt, Germany)

先行染色30 分鐘，再以超純水清洗 30 秒，以濾

紙將多餘的水沾去，再以0.22 µm 過濾的檸檬酸

鉛 (lead citrate, Merck, Darmstadt, Germany) 進

行 10 分鐘之複染色，再以超純水洗淨後乾燥並

保存，在150 KV 下以 JEM-1200 CX II 型穿透式電子顯微鏡 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan) 觀察並照相記錄結果。

結果

文蛤血淋巴球的形態學觀察

實驗結果顯示文蛤以 percoll 梯度離心大致

可將血淋巴球分成四層 (Fig. 1A) ，並輔以 May-Grunwald Geimsa 和 Wright’s 染色以觀察各

層血淋巴球。第一層為透明血球比重約為 1.018 g/mL，細胞直徑大小約 3.9 (2.5-5.4) µm，其細胞核呈嗜鹼性，核質比高 (1:0.5 到 1:1)，細胞質呈嗜鹼性且存在少量顆粒 (Fig. 2A & 2D)。利用掃描式電子顯微鏡觀察結果顯示為較小之細胞 (Fig. 3A)。利用穿透式電子顯微鏡觀察結果顯示細胞有高比例的核質比，細胞質中有游離的核糖體和粗內質網，分佈位置大部分圍繞在核的周圍，並可見少量的帶有脊狀構造粒線體的存在 (Fig. 4A)。第二層細胞的比重約1.029 g/mL，為嗜酸性顆粒球及較小嗜鹼性顆粒球混合層，嗜酸性顆粒球細胞大小約8.9 (8.1-10.6) µm，其核呈嗜鹼性位於中央或偏邊，並且其細胞質呈嗜酸性含有少量的顆粒，有時尚可見足狀絲伸出的情形 (Fig. 2B & 2E)。利用掃描式電子顯微鏡觀察的結果顯示，此層細胞為中等大小之細胞，其中大部分細胞的表面均較為平整，其中具有細顆粒表面，細胞直徑約為8-13 µm (Fig. 3B)。利用穿透式電子顯微鏡觀察的結果顯示，細胞核偏邊，可見有明顯聚集的核染質，細胞質中均具有少量粒線體和些許具有外膜包圍的空泡，在其中有小型的外膜包圍嗜鋨酸顆粒 (Fig. 4B)。第三層細胞為嗜鹼性顆粒球，比重約為 1.055 g/mL，細胞形狀呈現橢圓形或圓形，有時圖一、血淋巴液連續percoll 梯度離心之分布情形。(A) 文蛤 (B) 台灣蜆。

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圖二、血淋巴球光學顯微鏡下之形態。(A-F) 文蛤 (G-L) 台灣蜆。

Figure 2. Morphology of haemocytes under light

microscopy. (A-F) hard clam (G-L) freshwater clam. 則出現不規則足狀絲，細胞核有緻密的染色質，細胞質有明顯的嗜鹼性顆粒 (Fig. 2C & 2F)。利用掃描式電子顯微鏡觀察的結果顯示，此層細胞為直徑較大之細胞 (Fig. 3C)。利用穿透式電子顯微鏡觀察的結果顯示，細胞直徑約為14-22 µm，細胞核偏邊，可見有明顯聚集的核染質出現，在細胞質中可見具外膜包圍明亮空泡、內質網、少量粒線體和具大型外膜包圍的嗜鋨酸顆粒 (Fig. 4C)。第四層可見聚集之細胞團塊，比重約為 1.080 g/mL，利用光學顯微鏡觀察的結果顯示，可見聚集之細胞團及部分的顆粒球混合存在於此層 (data not shown)。

台灣蜆血淋巴球的形態學觀察

利用 percoll 梯度離心，台灣蜆之血淋巴球亦可分成四層 (Fig. 1B)。第一層為透明血球，比重約為1.020 g/mL，直徑大小約 4 (2.7-4.9) µm，其細胞核呈嗜鹼性，核質比高且細胞質呈嗜鹼性，無顆粒或只有少許顆粒存在 (Fig. 2G & 2J)。利用掃描式電子顯微鏡觀察結果顯示，此層細胞為直徑較小之細胞，細胞表面可見些許突出 (Fig. 3D)。利用穿透式電子顯微鏡觀察結果顯示，此層細胞有高的核質比，細胞質中有游離的核糖體和粗內質網，分佈位置大部分圍繞在核的周圍，並可見少量帶有脊狀構造的粒線體存在 (Fig. 4D)。第二層細胞的比重約1.047 g/mL，為嗜酸性顆粒球，細胞大小約8.2 (7.3-10.8) µm，其細胞核呈嗜鹼性位於中央或偏邊，細胞質呈嗜酸性含有少量的顆粒 (Fig. 2H & 2K)。利用掃描式電子顯圖三、血淋巴球掃描式電子顯微鏡下之形態。(A-C) 文蛤 (D-F) 台灣蜆。

Figure 3. Morphology of haemocytes under scanning

electron microscopy. (A-C) hard clam (D-F) freshwater clam. 微鏡觀察結果顯示，此層細胞為中等大小之細胞，其中大部分細胞的表面均較為平整，其中具有細顆粒表面 (Fig. 3E)。利用穿透式電子顯微鏡觀察結果顯示，此層細胞的核偏邊，並可見有明顯聚集的核染質，細胞質中均具有少量粒線體和許多具外膜包圍的空泡，在其中有小型的外膜包圍嗜鋨酸顆粒，細胞外圍亦可見有許多的足狀絲 (Fig. 4E)。第三層細胞為嗜鹼性顆粒球，比重約為 1.067 g/mL，可見細胞形狀呈現橢圓形，有時亦可見不規則足狀絲出現，細胞核有緻密的染色質，細胞質有明顯的嗜鹼性顆粒 (Fig. 2I & 2L)。利用掃描式電子顯微鏡觀察結果顯示，此層細胞為直徑較大之細胞 (Fig. 3F)。利用穿透式電子顯微鏡觀察結果顯示，此層細胞的直徑約為 12.7 (8.8-19.5) µm，有明顯的核染質聚集，在細胞質中有外膜包圍明亮空泡、內質網、少量粒線體和

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圖四、血淋巴球穿透式電子顯微鏡下之形態。(A-C) 文蛤 (D-F) 台灣蜆。(G) 嗜鋨酸顆粒 (M) 粒線體 (N) 細胞核 (P) 假足絲 (RER) 粗內質網 (V) 空泡。

Figure 4. Morphology of haemocytes under transmission

electron microscopy. (A-C) hard clam (D-F) freshwater clam (G) Addicted to osmium tetroxide of granule (M) mitochondria (N) nucleus (P) filopodium (RER) rough endoplasmic reticulum (V) vacuole.

具大量的外膜包圍的大型嗜鋨酸顆粒 (Fig. 4F)。第四層細胞則可見聚集之細胞團塊的比重約為 1.085 g/mL，由於比重較其他細胞重，所以離心後位於分離管的底部，光學顯微鏡下亦可見聚集之細胞團 (data not shown)。

討論

處理貝類之血球抗凝一般會使用抗凝劑，雖然抗凝劑可抗凝，但亦常有血淋巴球聚集成團的情形發生，尤以經離心之後凝集的情形更為嚴重。 Cheng 等 (1980) 以 1.5% glutaraldehyde 先進行血淋巴球固定後，再進行血球梯度分離，可得到較佳分離效果，但所得之細胞皆已不具活性。而 Bachère 等 (1988) 以 modified alsever solution (MAS) 作為太平洋牡蠣的血淋巴液的抗凝劑，於抗凝過程中仍會出現血淋巴球凝集現象。雖然如此，Ford 等 (1994) 也使用同樣的方法固定美國牡蠣之血淋巴球以進行血淋巴球研究，結果其克服此一問題並解決在離心過程中因細胞聚集所造成之血淋巴球凝集。因此，為了避免血淋巴球凝集而造成實驗上的困擾，應先行使用 MAS 抗凝劑抗凝血淋巴球後再進行後續研究。由本實驗結果顯示使用 MAS 抗凝劑對於文蛤和台灣蜆之血淋巴球抗凝效果相當好，且離心之後並無血淋巴球凝集現象發生。由於貝類之血淋巴球具有許多的形態仍需進一步的去分析研究，雖然目前未有一定的標準來加以區別，因此對於二枚貝類之血淋巴球只能依一般形態如血球大小、細胞質染色性、核形狀、組織化學反應等來加以區分 (Suzuki and Iida, 1992)。同時可輔以胞內顆粒形狀及化學物質特性來區分顆粒系列血球 (Moore and Lowe, 1977)。雖然有學者嘗試以染料和酵素染色方法來區分血淋巴球形態，並依哺乳動物之血球形態學區分標準卻仍不能完全可應用於貝類的血淋巴球分類 (Suzuki and Iida, 1992)。Foley 和 Cheng (1975) 指出美國牡蠣之血淋巴球依其型態和特性，可分為顆粒球及纖維細胞 (fibrocyte)，此外顆粒球中之顆粒亦可區分為嗜鹼性、嗜酸性及折射顆粒 (refractile granule)。纖維細胞依其細胞核形 (葉狀與圓形) 可分為兩種細胞，其中小型的無顆粒球又稱透明血球，其不含顆粒或有少量的顆粒。 Cheng 和 Cali (1974) 以穿透式顯微鏡觀察 quahaug clam (Mercenaria mercenaria) 之三種血 淋巴球，並將之區別為顆粒球、透明血球及纖維細胞。Cheng 等 (1980) 以不連續的蔗糖梯度離心可區分出五種的血淋巴球次族群，分別為小型透明血球、透明血球、中型顆粒球、大型顆粒球及更大型顆粒球。Ford 和 Ashton-Alcox (1998) 則將美國牡蠣的血淋巴球分成三種，分別為無顆粒球及兩種不同型態的顆粒球，而 Feng 和 Feng (1974) 則指出美國牡蠣的血淋巴球可能另具有第三種型式的透明血球。本實驗結果顯示文蛤依其比重及形態學上細胞大小、染色性、核質比及細胞質中所含顆粒，大約可分為三大類，分別為嗜鹼性顆粒球、嗜酸性顆粒球及透明血球，而在台灣蜆亦可分為此三大類血淋巴球。由 percoll 梯度分離結果顯示，文蛤之血淋巴球比重，以嗜鹼性顆粒球 (1.055 g/mL) 最高，嗜酸性顆粒球 (1.029 g/mL) 次之，而透明血球 (1.018 g/mL) 最低。而台灣蜆亦有相似的結果，嗜鹼性顆粒球 (1.067 g/mL) 最高，嗜酸性顆粒球 (1.047 g/mL) 次之，而透明血球 (1.020 g/mL) 最低。兩者互相比較下，台灣蜆的血淋巴球比重比文蛤高。

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本研究以 percoll 梯度離心可成功地將不同種類的二枚貝的血淋巴球分離，並藉由染色、光學顯微鏡及電子顯微鏡可更進一步的觀察細胞形態，並可將文蛤及台灣蜆之血淋巴球區分為透明血球、嗜酸性顆粒球及嗜鹼性顆粒球。而未來對於二枚貝類之血淋巴球研究，可以此為基礎，並進一步地研究二枚貝類之各類血淋巴球之細胞性免疫的功能，以及進一步地瞭解非特異性免疫的特性。基於以上對二枚貝類血淋巴球的初步研究，希望對於未來貝類疾病預防及防治上能有所助益。

誌謝

本研究承蒙行政院農業委員會動植物疾病防疫檢疫局之經費支持 (98AS-9.2.4-BQ-B1(21) and 99AS-9.2.2-BQ-B1(28))，特為致謝。

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(8)

Classification and Morphology Observation of Hemocytes in Bivalves

Shao-Wen Hung

1

, Yung-Chung Chang

2

, Ming-Hui Chen

3

, Chin-Fu Cheng

3

, Ching-Yu Tu

5

,

Yu-Hsing Lin

4

, Shiun-Long Lin

2

, Pan-Chen Liu

3

, Chen-Hsuan Chang

3

, Li-Tse Tsou

3

,

Way-Shyan Wang

3*

1_{Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica}

Taipei, Taiwan

2_{Taichung Branch Office, Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine}

Taichung, Taiwan

3_{Department of Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine, National Chung Hsing University}

Taichung, Taiwan

4_{Nursing Department of Yuanpei University}

Hsinchu, Taiwan

5_{Agricultural Chemicals and Toxic Substances Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan}

Taichung, Taiwan

(Received: 10 January 2012, accepted: 17 February 2012) ABSTRACT

Both of hard clam (Meretrix lusonia Roding) and freshwater clam (Corbicula fluminea Mullar) are important cultural shellfishes in Taiwan. During cultural period, environmental deterioration often induced the unstable production of shellfish and caused serious economic losses. Therefore, how to reduce the death of clams and increase production is a priority. Many factors like as microbial infection can cause deaths and growth delay of shellfish. Therefore, how to decrease the mortality and increase the production of shellfish is a priority. Aim of this study is to study the classification and morphology of shellfish (hard clam and fresh clam) haemocytes. By percoll gradient centrifugation and supplemented by optical and electron microscopy experiments showed that haemocytes of hard clams can be divided into three cellular kinds: basophilic granulocyte (density: 1.055 g/mL), eosinophilic granulocyte (density: 1.029 g/mL) and transparent cells (density: 1.018 g/mL). Fresh clams also showed the similar results: the basophilic granulocyte (density: 1.067 g/mL), eosinophilic granulocyte (density: 1.047 g/mL) and transparent cells (density: 1.020 g/mL). These results for the future studies in shellfish haemocytes can be used as the basis then perform the further study of cellular immunity and non-specific immunity of these cells. Therefore, we hope that disease prevention and control of the shellfish can be helpful in the future based on the above preliminary investigation of shellfish haemocytes.

Key words: Meretrix lusonia Roding, Corbicula fluminea Mullar, haemolymphocyte, classification,

二枚貝之血淋巴球分類與形態觀察