以結晶學的方法來探討豬苓湯抑制草酸鈣結石形成的機制; The inhibitory effect on the formation of calcium oxalate stone by Zhulingtang-a crystallization method

中 國 醫 藥 大 學 中 西 醫 結 合 研 究 所 碩 士 論 文

編 號 :GIICWM-94-9309 指 導 教 授 :陳 汶 吉 博 士 （ Wen-Chi Chen, MD, PhD） 論 文 題 目

以 結 晶 學 的 方 法 來 探 討

猪 苓 湯 抑 制 草 酸 鈣 結 石 形 成 的 機 制

The inhibitory effect on the formation of calcium oxalate stone by Zhulingtang-a crystallization method

以 結 晶 學 的 方 法 來 探 討 猪 苓 湯 抑 制 草 酸 鈣 結 石 形 成 的 機 制 研 究 生 ： 曾 慶 華 指 導 教 授 :陳 汶 吉 博 士 目 的 : 我 們 研 究 以 猪 苓 湯 來 抑 制 草 酸 鈣 結 石 的 可 行 性 ， 以 預 防 人 類 復 發 性 尿 路 結 石 症 。 方 法 ﹕ 第 一 步 我 們 在 實 驗 室 製 備 單 水 草 酸 鈣 結 晶 。 然 後 我 們 以 結 晶 學 分 光 儀 的 研 究 方 法 ， 在 結 晶 形 成 的 三 個 起 始 階 段 ， 即 結 晶 成 核 、 晶 體 成 長 、 晶 體 聚 集 ， 各 個 階 段 猪 苓 湯 抑 制 草 酸 鈣 結 石 形 成 的 抑 制 作 用 。 第 二 步 為 動 物 實 驗 ， 以 0.75% 乙 二 醇 餵 食 大 白 鼠 形 成 腎 臟 草 酸 鈣 結 石 作 為 模 型 。 然 後 以 不 同 劑 量 的 猪 苓 湯 和 0.75% 乙 二 醇 一 同 餵 食 三 週 及 四 週 ， 處 死 大 白 鼠 和 取 腎 切 片 ， 以 顯 微 鏡 觀 察 各 個 劑 量 在 腎 臟 產 生 草 酸 鈣 結 石 的 多 寡 ， 做 為 評 估 療 效 的 標 準 。 結 果 ﹕ 五 種 不 同 濃 度 的 猪 苓 湯 萃 取 液 ， 對 結 晶 成 核 誘 導 時 間 有 明 顯 延 遲 作 用 (p 值 <0.0001)。 五 種 不 同 濃 度 的 猪 苓 湯 萃 取 液 ， 對 結 晶 聚 集 的 抑 制 百 分 比 增 加 (p 值 <0.05)。 在 大 白 鼠 餵 食 乙 二 醇 ， 誘 導 產 生 腎 結 石 之 實 驗 中 ， 平均結晶沉積指數減少(p 值 <0.05)。

結論﹕猪 苓 湯 具 有 體 內 和 體 外 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 形 成 的 作 用 。 用 猪 苓 湯 治 療 尿 路 結 石 ， 在 大 白 鼠 產 生 結 石 模 型 抑 制 實 驗 是 具 有 療 效 的 。 猪 苓 湯 是 在 傷 寒 論 中 的 既 有 成 方 ， 將 猪 苓 湯 運 用 在 復 發 性 結 石 的 安 全 性 和 可 行 性 是 很 高 的 。 可 以 在 臨 床 使 用 。 關 鍵 字 : 猪 苓 湯 ， 尿 路 結 石 ， 草 酸 鈣

目 錄 第 一 章 前 言 … … … 1 第 二 章 背 景 介 紹 … … … 5 第 三 章 材 料 與 方 法 … … … 7 第 一 節 儀 器 與 設 備 … … … 7 第 二 節 實 驗 試 劑 … … … 7 第 三 節 實 驗 方 法 與 步 驟 … … … 9 實 驗 一 : 製 備 草 酸 鈣 晶 種 … … … 9 實 驗 二 : 結 晶 成 核 的 抑 制 作 用 … … … 9 實 驗 三 : 結 晶 成 長 的 抑 制 實 驗 … … … 1 0 實 驗 四 : 結 晶 聚 集 的 抑 制 實 驗 測 定 … … … 1 2 實 驗 五 : 大 白 鼠 餵 食 乙 二 醇 三 週 … … … 1 4 實 驗 六 : 大 白 鼠 餵 食 乙 二 和 猪 苓 湯 三 週 … … … 1 5 第 四 節 統 計 分 析 … … … 1 5 第 四 章 、 結 果 … … … 1 6 第 一 節 研 究 結 果 … … … 1 6 1 . 草 酸 鈣 晶 種 的 製 備 … … … 1 6 2 . 成 核 抑 制 作 用 … … … 1 7 3 . 晶 體 成 長 抑 制 作 用 … … … 1 8

4 . 晶 體 聚 集 抑 制 作 用 … … … 1 9 5.大 鼠 餵 食 乙 二 醇 和 猪 苓 湯 三 週 產 生 腎 結 石 之 實 驗 20 6.大 鼠 餵 食 乙 二 醇 和 猪 苓 湯 四 週 產 生 腎 結 石 之 實 驗 21 第 二 節 大 白 鼠 餵 食 乙 二 醇 產 生 腎 結 石 （ 照 片 ） … … … 22 第 五 章 、 討 論 … … … 2 4 第 六 章 、 結 論 … … … 2 9 參 考 文 獻 … … … 3 0 英 文 摘 要 … … … 3 8

第 一 章 、 前 言 尿 路 結 石 是 一 種 古 老 的 疾 病 ， 記 錄 最 早 發 現 的 尿 路 結 石 是 在 西 元 前 四 千 八 百 年 前 埃 及 的 木 乃 伊 （ 1）。 從 尿 路 結 石 的 流 行 病 學 觀 點 來 看 ， 此 疾 病 受 多 重 因 素 影 響 。 分 別 歸 納 為 內 在 因 子 與 外 在 因 子 。 內 在 因 子 包 括 遺 傳 、 年 齡 與 性 別 。 外 在 因 子 包 括 地 理 因 素 、 氣 候 與 季 節 、 水 份 的 攝 取 、 營 養 、 職 業 與 壓 力 。 從 物 理 化 學 觀 點 來 看 ， 結 石 的 形 成 ， 則 與 溶 質 的 飽 和 度 與 超 飽 和 度 有 關 （ 2）。 尿 路 結 石 的 罹 病 率 約 為 2%-3% （ 1）。 在 台 灣 地 區 尿 路 結 石 的 罹 病 率 為 9.6%（ 3）。 尿 路 結 石 最 常 見 的 成 份 是 草 酸 鈣 ， 佔 七 成 。 草 酸 鈣 結 石 若 是 未 治 療 其 復 發 率 在 一 年 內 有 10%， 五 年 內 有 35%， 十 年 內 有 50%（ 4）。 所 以 應 當 將 尿 路 結 石 當 作 如 同 糖 尿 病 以 及 高 血 壓 這 類 型 的 慢 性 病 一 般 ， 積 極 治 療 和 預 防 。 結 石 的 形 成 是 從 結 晶 開 始 的 ， 而 結 晶 的 形 成 ， 在 初 期 需 要 經 過 結 晶 成 核 、 晶 體 成 長 、 晶 體 聚 集 三 個 步 驟 （ 1）。 再 經 過 結 石 留 存 ， 然 後 才 形 成 結 石 。 而 可 以 調 節 晶 體 形 成 的 因 素 有 三 個 ： 抑 制 者 、 複 合 者 與 促 進 者 （ 5）。 針 對 結 石 形 成 步 驟 和 調 節 因 素 ， Wabner et al 等 學 者 嘗 試 用 橘 子 汁 （ orange juice） 以 做 為 降 低 結 石 發 生 的 危 險 因 子（ 6）。Gettman et al 嘗 試 用 蔓 越 莓 汁 (cranberry juice)

影 響 尿 石 因 子 （ 7）。 Itoh et al 嘗 試 服 用 綠 茶 （ green tea） 影 響 尿 石 因 子 （ 8）。 Honow et al 嘗 試 服 用 蘋 果 汁 （ apple juice）影 響 尿 石 因 子（ 9）。Atmani et al 嘗 試 服 用

Herniaria

hirsuta

的 萃 取 液 ， 以 影 響 尿 石 因 子 （ 10）。 Traxer et al 嘗 試 服 用 維 他 命 C（ ascorbic acid） 影 響 尿 石 因 子 ， 卻 適 得 其 反 （ 11）。 Thamilselvan et al 嘗 試 服 用 維 他 命 E， 利 用 它 的 抗 氧 化 作 用 來 影 響 尿 石 因 子（ 12）。雖 然 有 些 許 效 果，皆 不 如 服 用 檸 檬 酸 鉀（ potassium citrate）來 得 顯 著（ 13，14）。 另 外 Meyer et al 對 其 他 種 類 結 石 的 研 究 則 發 現 有 一 些 稀 有 金 屬 和 檸 檬 酸 複 合 物 ( trace metal-citric acid complexes )可 以 作 為 磷 酸 鈣 結 石 抑 制 者 (15， 16)。 Nakagawa et al 在 正 常 人 類 尿 液 中 找 到 結 晶 成 長 的 抑 制 因 子 GCI， 是 一 種 glycoprotein (17)。 Nakagawa et al 也 在 人 類 腎 臟 中 找 到 草 酸 鈣 結 晶 成 長 的 抑 制 因 子 (一 種 glycoprotein) ， 並 純 化 之 和 可 以 以 培 養 皿 取 得 ， 作 為 草 酸 鈣 結 石 形 成 機 轉 研 究 的 方 法 (18)。

制 草 酸 鈣 結 晶 的 作 用（ 19）。這 些 研 究 顯 示 運 用 猪 苓 湯 治 療 尿 路 結 石 是 具 有 療 效 的 。 但 是 它 的 作 用 機 轉 與 阻 止 結 晶 成 核 、 成 長 和 聚 集 是 本 研 究 探 討 的 目 的 。 由 於 內 科 在 尿 路 結 石 的 預 防 治 療 ， 遠 遠 不 及 外 科 治 療 現 存 的 結 石 。 內 科 治 療 包 括 增 加 飲 水 、 減 少 飲 食 中 蛋 白 質 攝 取 （ Robertson et al ,1979c； 1982）、 限 制 飲 食 中 鈣 的 攝 取 （ Sutton & Walker ）、 限 制 飲 食 中 鈉 的 攝 取 (Curhan

1993) 、限 制 飲 食 中 草 酸 根 的 攝 取 (Simon & Hudes, 1999)、 限 制 飲 食 中 磷 酸 根 的 攝 取 （ Shorr & Carter 1950）、 增 加 飲 食 中 纖 維 質 的 攝 取 (Shah et al, 1980; Tizzanni et al, 1983) 、 一 些 藥 物 如 Thiazides (Coe et al, 1988)、

Orthophosphates (Thomas , 1976)、 Sodium cellulose

phosphate (Blacklock & Mac Leod, 1974)、Allopurinol (Coe, 1977)、 Citrate (Pak et al, 1985; Sakhaee et al, 1991)、 Magnesium (Greshoff, 1974)等 ， `但 是 以 飲 食 控 制 自 發 性 高 鈣 尿 的 復 發 性 結 石 的 效 果 不 明 顯 。 Borghi et al 以 飲 食 中 限 鈣 ， 來 預 防 復 發 性 結 石 ， 效 果 也 不 彰 （ 20）。 Goldfarb et al 使 用 葡 萄 柚 汁 則 無 明 顯 抑 制 結 石 再 發 的 作 用 (21)。 對 於 現 在 已 存 在 的 結 石 ， 外 科 治 療 已 經 發 展 出 輸 尿 管 鏡 內 視 鏡 手 術 、

體 外 震 波 碎 石 術 、 經 皮 穿 腎 截 石 手 術 等 有 效 的 治 療 方 法 ， 超 過 90%以 上 的 結 石 已 經 不 需 要 以 開 刀 治 療 。加 上 傳 統 外 科 手 術 和 新 式 腹 腔 鏡 手 術 ， 對 於 現 存 的 結 石 來 說 ， 治 療 結 石 已 經 不 成 問 題 。 但 是 結 石 的 高 復 發 率 ， 使 得 我 們 需 要 尋 找 更 有 效 治 療 方 法 ， 來 預 防 結 石 的 再 發 生 。 這 是 我 們 的 研 究 動 機 。

第 二 章 背 景 介 紹 泌 尿 系 結 石 屬 中 醫 “ 石 淋 ＂ 範 疇 ， 金 匱 曰 ： “ 淋 之 為 病 ， 小 便 如 粟 狀 ， 小 腹 弦 急 ， 痛 引 臍 中 ＂ 。 猪 苓 湯 原 治 傷 寒 之 邪 傳 入 陽 明 或 少 陰 ， 水 熱 互 結 ， 邪 熱 傷 陰 ， 而 小 便 不 利 之 証 。 石 淋 之 為 病 ， 多 因 腎 陰 虛 而 膀 胱 溼 熱 。 臨 床 上 常 注 重 清 利 溼 熱 而 忽 略 養 陰 ， 一 味 通 淋 化 石 ， 使 本 以 已 陰 虛 者 更 甚 。 故 既 可 見 尿 頻 、 尿 急 、 尿 痛 或 不 暢 等 濕 熱 象 ， 又 見 脈 弦 細 、 煩 渴 等 陰 虛 証 。 趙 羽 皇 曰 ： 仲 景 猪 苓 湯 .其 旨 全 在 養 陰 .不 專 利 水 … 。 方 中 阿 膠 養 陰 ， 生 新 去 舊 ， 于 腎 中 利 水 ， 即 腎 中 養 陰 。 滑 石 甘 滑 而 寒 ， 于 胃 中 去 熱 ， 亦 于 胃 中 養 陰 。 佐 以 二 苓 之 淡 滲 行 之 ， 即 疏 濁 熱 而 不 瘀 壅 ， 亦 潤 真 陰 而 不 苦 其 燥 ， 源 清 而 流 有 不 清 者 乎 ？ 諸 藥 合 用 ， 利 水 而 不 傷 陰 ， 養 陰 而 不 留 邪 。 雖 無 通 淋 排 石 之 專 藥 ， 卻 審 因 論 治 ， 絲 絲 入 扣 。 猪 苓 湯 具 有 消 炎 、 利 尿 等 作 用 。 猪 苓 湯 及 澤 瀉 具 有 排 石 和 體 外 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 的 作 用 （ 19）。 這 些 研 究 顯 示 猪 苓 湯 在 治 療 尿 路 結 石 中 有 著 重 要 作 用 。 綜 上 所 述 ， 由 於 目 前 結 石 的 防 治 工 作 仍 然 未 盡 理 想 ， 積 極 尋 求 良 好 的 治 療 方 法 是 未 來 的 趨 勢。而 中 草 藥 的 治 療 是

可 以 選 擇 的 一 個 方 法，國 內 外 學 者 亦 有 用 中 草 藥 治 療 的 相 關 報 告，可 見 我 們 可 以 嘗 試 這 種 療 法。利 用 中 草 藥 可 以 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 吸 附 在 細 胞 表 面，或 是 將 已 經 吸 附 在 細 胞 表 面 的 結 晶 移 除，而 將 結 石 排 出。猪 苓 湯 是 一 個 有 潛 力 的 方 劑，但 是 它 的 作 用 機 轉 為 何，目 前 尚 無 相 關 研 究，在 本 研 究 中，我 們 以 結 晶 學 和 動 物 實 驗 的 方 法 來 探 討，猪 苓 湯 是 否 可 以 阻 止 結 石 成 核、成 長 和 聚 集，在 大 白 鼠 誘 石 實 驗 中。是 否 可 以 抑 制 大 白 鼠 腎 結 石 之 形 成 是 本 研 究 探 討 的 目 的 。

第 三 章 材 料 與 方 法 第 一 節 儀 器 與 設 備

本 研 究 所 使 用 之 儀 器 與 設 備 如 下 :

1.紅 外 線 光 譜 儀 ： Shimazu IR-7， Tokyo， Japan。 2.攪 拌 器 ： IKA ， China。

3.高 壓 消 毒 器 ： Tomin TM-328， Taiwan。 4.離 心 機 ： HERMLE Z200A， Germany。 5.乾 燥 機 ： DENG YNG DO45， Japan。

6.過 濾 膜：Millex-GV 0.22μ m filter，Millipore ， USA。

7.塑 膠 比 色 管 ： Semimicro Disposable Cuvette, Ratiolab， Germany。

8.石 英 比 色 管 ： Hellma 104.600-QG， Germany。 9.分 光 光 度 計 ： Hitachi U-2001， Japan。

10.恆 溫 循 環 水 槽 系 統 ： YIHDER BT-350， Taiwan。 11.超 音 波 震 盪 器 ： DELTA D150， Taiwan。

12.大 白 鼠 ﹕ 國 科 會，台 灣。Sprangue-Dawley,male。 第 二 節 實 驗 試 劑

1.本 實 驗 所 用 試 劑 皆 從 Sigma 公 司 購 得 ， 包 括 氯 化 鈣 、 草 酸 鉀 、 醋 酸 鈉 等 等 。

2.猪 苓 湯 ： 科 達 製 藥 股 份 有 限 公 司 ， 台 灣 台 中 。 3.乙 二 醇 ： Ethylene glycol 0.75%， Sigma， USA。

4.猪 苓 湯 萃 取 液 (科 學 中 藥 藥 粉 ) 製 備 步 驟 猪 苓 湯 (Zhulingtang) 包 含 五 種 中 藥 成 份 猪 苓 、 茯 苓 、 澤 瀉 、 阿 膠 、 滑 石 ， 各 種 成 份 等 量 。 科 學 中 藥 藥 粉 由 柯 達 製 藥 公 司 (台 灣 ‧ 台 中 )提 供 。 猪 苓 湯 萃 取 液 以 100公 克 藥 粉 加 入 500毫 升 蒸 餾 水 ， 然 後 在 蒸 汽 高 壓 鍋 加 熱 至 攝 氏 121度 15分 鐘 。 果 膠 狀 的 產 物 放 置 (溶 於 )在 750毫 升 蒸 餾 水 中 放 置 在 攝 氏 4度 環 境 中 7日 。 此 溶 液 用 1500轉 離 心 10分 鐘 。 製 備 完 成 猪 苓 湯 萃 取 液 (濃 度 為 82 mg/ml)。 此 溶 液 準 備 為 五 種 濃 度 3.125， 6.25， 12.5， 25， 50 毫 克 /毫 升 。

第 三 節 實 驗 方 法 與 步 驟 實 驗 一 : 製 備 草 酸 鈣 晶 種 1.緩 緩 的 加 入 100 毫 升 的 0.25M 草 酸 鉀 溶 液 至 100 毫 升 的 0.25M 的 氯 化 鈣 溶 液 上 ， 不 停 的 攪 拌 ， 並 維 持 在 85oC 下 ， 直 到 此 溶 液 的 pH 值 降 至 4.0 為 止 。 再 攪 拌 8 小 時 ， 然 後 靜 置 整 夜 。 2.靜 置 後，把 上 清 酸 液 緩 緩 倒 掉，用 去 離 子 水 洗 這 些 晶 種 ， 洗 得 此 混 和 液 的 pH 值 升 至 6.5。 製 備 好 之 晶 種 用 紅 外 線 光 譜 檢 查 確 定 為 單 水 草 酸 鈣 。 ＊ 利 用 HCl 和 NaOH 滴 定 至 適 當 PH 值 實 驗 二 : 結 晶 成 核 的 抑 制 作 用 *控 制 組 ： 1.先 分 別 配 好 100 毫 升 8.5mM 的 氯 化 鈣 溶 液 （ 內 含 200mM 的 氯 化 鈉 和 10mM 的 醋 酸 鈉，pH 5.7 緩 衝 溶 液 ） 和 100 毫 升 1mM 的 草 酸 鉀 溶 液（ 內 含 200mM 的 氯 化 鈉 和 10mM 的 醋 酸 鈉 ， pH 5.7 緩 衝 溶 液 ）， 而 在 使 用 前 先 用 0.22μ m 的 Millex-GV 膜 過 濾 以 去 除 會 影 響 實 驗 的 大 分 子 。 ＊ 利 用 HCL 和 NaOH 滴 定 至 適 當 PH 值 。

2.取 1ml 的 8.5mM 的 氯 化 鈣 溶 液 加 入 石 英 管 中 ， 在 37 ℃，500rpm 下 均 勻 的 混 合，再 加 入 0.1ml 的 DDW，再 加 入 1ml 的 1mM 的 草 酸 鉀 溶 液 ， 至 終 濃 度 為 4.25mM 的 鈣 離 子 和 0.5mM 的 草 酸 根 離 子 ， 在 OD620 下 ， 測 10 分 鐘 ， 每 10 秒 測 一 次 ( 22 )。 *實 驗 組 ： 3.取 1ml 的 8.5mM 的 氯 化 鈣 溶 液 加 入 石 英 管 中 ， 在 37 ℃ ， 500rpm 下 均 勻 的 混 合 ， 再 加 入 0.1ml 的 猪 苓 湯 萃 取 液 ， 最 後 再 加 入 1ml 的 1mM 的 草 酸 鉀 溶 液 ， 在 OD620 下 ， 測 10 分 鐘 ， 每 10 秒 測 一 次 。 *以『 200mM 的 氯 化 鈉 和 10mM 的 醋 酸 鈉 ， pH 5.7 的 緩 衝 溶 液 』 當 作 control 吸 光 值 。 *影 響 晶 體 成 核 活 性 的 計 算 方 法 如 下 ： 算 出 其 吸 光 值 改 變 量 到 達 control 最 高 吸 光 值 改 變 量 的 2.5% 時 所 需 之 時 間 。 實 驗 三 : 結 晶 成 長 的 抑 制 實 驗

約 1.5 mg/ml。 使 用 前 超 音 波 振 盪 30 分 鐘 ， 取 出 後 搖 晃 均 勻 使 用 。 2.再 把 此 3 ml 的 晶 體 混 合 液 ， 加 至 27ml 超 穩 定 ( metastable )的 草 酸 鈣 溶 液 中 ;此 溶 液 含 有 0.833mM CaCl2 及 0.167mM 的 草 酸 鈉 ， 俾 使 晶 種 的 最 終 濃 度 維 持 在 0.125mg/ml 以 上 。 *超 穩 定 (metastable)的 草 酸 鈣 溶 液 ： 先 把 配 置 好 的 溶 液 加 熱 至 100℃ ， 讓 草 酸 鈣 結 晶 溶 解， 再 置 於 室 溫 下 慢 慢 冷 卻 至 37℃ ， 放 置 於 37℃ 下 儲 存 。 3.取 出 2ml 的 晶 體 生 長 反 應 溶 液，加 入 0.1 ml 的 DDW， 並 維 持 在 37oC， 讓 其 反 應 40 分 鐘 。 反 應 後 ， 讓 溶 液 通 過 0.22μ m 孔 隙 的 濾 膜 ， 去 掉 晶 體 ， 再 用 214nm 的 光 源 測 此 澄 清 液 的 吸 光 值 ， 每 10 秒 測 一 次 。 實 驗 均 進 行 三 次 ， 取 平 均 值 作 為 統 計 之 用 。 *實 驗 組 ： 4.加 入 0.1 ml 的 猪 苓 湯 萃 取 液 至 2 ml 的 晶 體 生 長 反 應 溶 液 ， 並 維 持 在 37oC， 讓 其 反 應 40 分 鐘 。 反 應 後 ， 讓 溶 液 通 過 0.22μ m 孔 隙 的 濾 膜 ， 去 掉 晶 體 ， 再 用 214nm 的 光 源 測 此 澄 清 液 的 吸 光 值，每 10 秒 測 一 次。

實 驗 均 進 行 三 次 ， 取 平 均 值 為 統 計 之 用 。 說 明 1﹕ 以『 200mM 的 氯 化 鈉 和 10mM 的 醋 酸 鈉 ， pH 5.7 的 緩 衝 溶 液 』 當 作 control 光 值 。 說 明 2﹕ 晶 體 的 成 長 抑 制 以 下 列 方 式 計 算 抑 制 百 分 比 (%) = Ao-Ai / Ao *Ao 是 400 秒 時 對 照 組 的 吸 光 值 變 化 。 *Ai 代 表 加 入 中 藥 萃 取 液 時 的 吸 光 值 變 化 。 說 明 3﹕ IC50 的 數 值 是 以 線 性 迴 歸 法 求 得，X 軸 是 蛋 白 質 的 濃 度 ， Y 軸 是 抑 制 百 分 比 。 實 驗 四 : 結 晶 聚 集 的 抑 制 實 驗 測 定 這 個 實 驗 可 以 測 得 在 懸 浮 液 中 的 單 水 草 酸 鈣 聚 集 的 速 度 ， 和 在 當 有 中 藥 萃 取 液 存 在 時 ， 對 單 水 草 酸 鈣 的 聚 集 速 度 是 否 有 影 響 。 *控 制 組 ： 1.將 單 水 草 酸 鈣 晶 種 取 出 ， 懸 浮 在 10mM 的 醋 酸 鈉 緩 衝 溶 液 中 （ pH 5.7）， 內 含 200mM 的 氯 化 鈉 ， 晶 體 濃 度

3.在 要 使 用 之 時 ， 要 再 一 次 的 檢 查 pH 值 ， 並 再 放 在 超 音 波 下 震 盪 30 分 鐘 。 取 出 上 面 的 懸 浮 液 20ml， 再 加 入 1.0ml 的 DDW，以 20：1 的 比 例 下，在 37℃，150 rpm 下 搖 動 2 個 小 時 。 4. 2 個 小 時 後 ， 再 把 此 溶 液 混 合 均 勻 ， 再 快 速 的 取 出 2ml 加 入 比 色 管 中 ， 再 放 入 分 光 光 度 計 中 ， 在 1100rpm，37℃ 下，用 OD620 測 至 吸 光 值 穩 定 經 過 10 秒 ， 再 在 500rpm、 37℃ 下 ， 用 OD620 測 其 吸 光 值 至 180 秒，停 止 攪 拌 使 單 水 草 酸 鈣 晶 體 發 生 自 發 性 的 沉 澱，用 OD620 測 其 吸 光 值 至 480 秒，每 10 秒 測 一 次。 *實 驗 組 ： 1.將 單 水 草 酸 鈣 晶 種 取 出 ， 懸 浮 在 10mM 的 醋 酸 鈉 緩 衝 溶 液 中 （ pH 5.7）， 內 含 200mM 的 氯 化 鈉 ， 晶 體 濃 度 約 0.8mg/ml。 2.再 將 此 一 懸 浮 液 小 心 的 混 合 均 勻，再 放 在 超 音 波 下 震 盪 60 分 鐘 ， 並 放 在 37℃ 下 至 隔 天 。 3.在 要 使 用 之 時 ， 要 再 一 次 的 檢 查 pH 值 ， 並 再 放 在 超 音 波 下 震 盪 30 分 鐘 。 取 出 上 面 的 懸 浮 液 20ml， 再 加 入 1.0ml 的 猪 苓 湯 萃 取 液 ， 以 20： 1 的 比 例 下 ， 在

37℃ ， 150rpm 下 搖 動 2 個 小 時 。 4. 2 個 小 時 後 ， 再 把 此 溶 液 混 合 均 勻 ， 再 快 速 的 取 出 2ml 加 入 比 色 管 中 ， 再 放 入 分 光 光 度 計 中 ， 在 1100rpm，37℃ 下，用 OD620 測 至 吸 光 值 穩 定 經 過 10 秒 ， 再 在 500rpm、 37℃ 下 ， 用 OD620 測 其 吸 光 值 至 180 秒，停 止 攪 拌 使 單 水 草 酸 鈣 晶 體 發 生 自 發 性 的 沉 澱，用 OD620 測 其 吸 光 值 至 480 秒，每 10 秒 測 一 次。 說 明 1﹕ 影 響 晶 體 聚 集 活 性 的 計 算 方 法 如 下 ： 抑 制 百 分 比 % =【 (S0-St/S0)*100%】 *S0 是 未 加 猪 苓 湯 萃 取 液 的 吸 光 值 下 降 斜 率 。 *St 是 有 加 猪 苓 湯 萃 取 液 的 吸 光 值 下 降 斜 率 。 說 明 2﹕ 體 積 莫 耳 濃 度 ＝ 溶 質 莫 耳 數 / 溶 液 體 積 Ｍ ＝ ｎ /Ｖ （ 體 積 莫 耳 濃 度 的 單 位 為 Ｍ (莫 耳 /公 升 )） 。

實 驗 六 : 大 白 鼠 餵 食 乙 二 醇 和 猪 苓 湯 三 週 至 四 週 作 為 實 驗 組 ， 與 大 白 鼠 單 純 餵 食 乙 二 醇 作 為 對 照 組 。 處 死 大 白 鼠 取 腎，切 片 觀 察。( 高 劑 量 各 3隻，中 劑 量 各 界 3隻 ， 低 劑 量 各 3隻 ) 說 明 ： 1.高 劑 量 為 900mg/Kg/day 中 劑 量 為 600mg/Kg/day 低 劑 量 為 300mg/Kg/day 2.以 每 隻 鼠 重 量 約 300克 計 算，劑 量 為 人 的 10倍 劑 量 。 第 四 節 統 計 分 析 變 異 數 分 析 法 : 單 相 變 異 數 分 析 事 後 檢 定 : Tukey test

第 四 章 、 結 果 (每 個 重 要 實 驗 的 結 果 均 含 下 列 三 項 基 本 項 目 ) 第 一 節 研 究 結 果 1.草 酸 鈣 晶 種 的 製 備 紅 外 線 光 譜 檢 驗 ﹕ 吸 收 光 譜 位 於 1319 nm 處 為 草 酸 鈣 晶 體 之 特 徵 ， 在 3492 nm 至 3071 nm 處 有 連 續 的 吸 收 光 譜 代 表 是 單 水 草 酸 鈣 (Calcium oxalate monohydrate) 的 晶 體 。

2.成 核 抑 制 作 用 ﹕

Table 1. 在五種濃度的猪苓湯萃取液下，結晶成核的誘導時間 (Induction time, Ti, sec)

Experimental condition

Induction time (Ti, sec)

Significance (Turkey test)

control group 40 ±8.16 猪苓湯 3.125 mg/ml 23.33 ±4.71 0.353 猪苓湯 6.25 mg/ml 33.33 ± 4.71 0.994 猪苓湯 12.5 mg/ml 80 ±8.16 0.000 猪苓湯 25 mg/ml 76.67 ± 4.71 0.000 猪苓湯 50 mg/ml 13.33 ± 4.71 0.000 Turkey test, compared with control group

組間差異：六組之間有差異，尤其是在第四組和第五組最明顯。 事後檢定：Tukey test 在第四組與第五組 p 值 < 0.000，有意義。

3.晶 體 成 長 抑 制 作 用 ﹕

Table 2. 在五種濃度的猪苓湯萃取液下，結晶成長的抑制百分比(%)

Experimental condition

Inhibition (%) Significance (Turkey test)

猪苓湯 3.125 mg/ml -23.53 % 0.906 猪苓湯 6.25 mg/ml -23.53 % 0.906 猪苓湯 12.5 mg/ml -347 % 0.000

猪苓湯 25 mg/ml - -

猪苓湯 50 mg/ml - -

Turkey test, compared with control group 組 間 差 異 ： 四 組 之 間 無 明 顯 差 異 。 事 後 檢 定 ： Tukey test 無 明 顯 差 異 。

說 明 :中 藥 的 色 素 影 響 214 nm 的吸收光，致無法比色，所以最 後兩組放棄計算。

4.晶 體 聚 集 抑 制 作 用 Table 3. 五種濃度的猪苓湯萃取液下，結晶聚集的抑制百分比(%) Experimental condition Inhibition (%) Significance（Turkey test） 猪苓湯 3.125 mg/ml 42.86 % 0.183 猪苓湯 6.25 mg/ml 46.73 % 0.126 猪苓湯 12.5 mg/ml 19.37 % 0.848 猪苓湯 25 mg/ml 64.65 % 0.022 猪苓湯 50 mg/ml 58.11 % 0.042

Turkey test, compared with control group

組 間 差 異 ： 六 組 之 間 有 差 異 ，在第五組和第六組最顯著。 事 後 檢 定 ： Tukey test 在 第 五 組 與 第 六 組 p 值 < 0.05。

結 論：猪 苓 湯 對 體 外 草 酸 鈣 結 晶 的 成 核 有 抑 制 作 用。對 體 外 草 酸 鈣 結 晶 的 晶 體 成 長 無 抑 制 作 用。對 體 外 草 酸 鈣 結 晶 的 晶 體 聚 集 有 抑 制 作 用 。

5.大 白 鼠 餵 食 乙 二 醇 和 猪 苓 湯 三 週 ， 產 生 腎 結 石 之 實 驗 Table 4. 第一大組餵食三週的大白鼠中的四個小組的平均結晶沉積

指數（crystal deposition index）

組別\隻數 1 2 3 (Mann-Whitney test)Significance Group 3.1 2.6 2.6 2

Group 3.2 3 1.4 0.0 0.014 Group 3.3 0.0 2.5 0.0 0.000 Group 3.4 0.0 0.0 3 0.000

p value of Kruskal-Wallis test < 0.05

Mann-Whitney test, compared with Group 3.1 說明: 1. 以在 100 倍視野下結晶在幾個腎小管內形成結晶。由三 位不同人員確認數量後再取平均值。 2. 3.1 組為控制組 3.2 組為低劑量組 3.3 組為中劑量組 3.4 組為高劑量組

6.大 白 鼠 餵 食 乙 二 醇 和 猪 苓 湯 四 週 ， 產 生 腎 結 石 之 實 驗 Table 5. 第二大組餵食四週中的四個小組的平均結晶沉積指數

（crystal deposition index）

組別\隻數 1 2 3 _{(Mann-Whitney test)}Significance

Group 4.1 3 3 3

Group 4.2 0.0 0.0 3 0.000 Group 4.3 0.0 3 2.9 0.000 Group 4.4 3 2.6 0.0 0.000

p value of Kruskal-Wallis test < 0.05

Mann-Whitney test, compared with Group 4.1

說明: 4.1 組為對照組

4.2 組為低劑量組 4.3 組為中劑量組 4.4 組為高劑量組

結論﹕三組餵食低中高劑量產猪苓湯與對照組的平均結晶沉指

數（crystal deposition index）在統計學上有顯著差別。大 白鼠實驗中，顯現餵食猪苓湯可以顯著抑制結晶沉積。

第 二 節 大 白 鼠 餵 食 乙 二 醇 以 產 生 腎 結 石

圖 二 ： 對 照 組 大 白 鼠 餵 食 三 週 後 之 腎 切 片 (正 常 餵 食 )(100x)

圖 四 ：中 劑 量 猪 苓 湯 餵 食 組， 鼠 腎 切 片 (100 x)顯 示 有 少 量 的 結 晶 沉 積 。

圖 五 ： 低 劑 量 猪 苓 湯 餵 食 組 ， 鼠 腎 切 片 (100 x)顯 示 有 大 量 的 結 晶 沉 積 (100×)。

第 五 章 、 討 論 猪 苓 湯 在 體 外 抑 制 結 晶 的 形 成 三 個 步 驟 中 ， 在 抑 制 成 核 與 抑 制 晶 體 聚 集 這 兩 個 步 驟 明 顯 呈 現 抑 制 作 用 。 根 據 這 些 結 果 ， 猪 苓 湯 具 有 抑 制 結 石 形 成 的 潛 在 效 果 。 因 此 ， 將 來 在 臨 床 上 可 能 可 以 應 用 在 預 防 結 石 的 治 療 。 在 大 白 鼠 結 石 模 型 中 ， 餵 食 乙 二 醇 後 ， 大 白 鼠 產 生 的 結 石 ， 可 以 因 餵 食 猪 苓 湯 而 減 少 結 石 的 數 量 ， 而 且 與 劑 量 的 大 小 有 關 。 Suzuki 等 學 者 說 明 澤 瀉 單 味 藥 在 某 一 濃 度 範 圍 內 ， 是 具 有 強 烈 抑 制 結 石 成 核 、 晶 體 成 長 、 晶 體 聚 集 的 作 用 （ 23）。 本 實 驗 的 結 果 與 他 們 的 報 告 相 同 。 「 本 草 備 要 」說 明 澤 瀉 的 性 味 甘 淡 微 鹹，入 膀 胱 經 ， 功 能 為 利 小 便 ， 瀉 腎 經 之 火 邪 ， 功 專 利 濕 行 水 。 治 消 渴 痰 飲 ， 嘔 吐 瀉 痢 ， 腫 脹 水 痞 ， 腳 氣 疝 痛 。 淋 瀝 陰 汗 ， 尿 血 泄 精 ， 濕 熱 之 病 。 濕 熱 既 除 ， 則 清 氣 上 行 ， 又 能 養 五 臟 ， 益 氣 力 ， 起 陰 氣 。 補 虛 損 ， 止 頭 旋 ， 有 聰 耳 明 目 之

佐 藥 是 協 助 君 藥 治 療 兼 證 或 抑 制 主 藥 的 毒 性 和 峻 烈 的 性 味 。「 使 藥 」 是 引 導 各 藥 直 達 疾 病 所 在 或 有 調 和 各 藥 的 作 用 。 猪 苓 湯 以 茯 苓 、 猪 苓 、 澤 瀉 利 小 便 為 主 。 用 滑 石 利 水 清 熱 ， 佐 以 阿 膠 清 熱 養 陰 。 各 藥 互 相 取 其 主 要 作 用 ， 增 強 療 效 ， 減 少 併 發 頭 暈 目 眩 的 副 作 用 。 而 且 治 療 併 發 所 生 的 水 熱 互 結 和 小 便 出 血 。 所 以 不 選 擇 單 味 藥 ， 而 選 擇 現 存 的 方 劑 。 猪 苓 湯 最 早 出 現 在 「 傷 寒 論 」 中 用 於 治 療 陽 明 病 ， 脈 浮 發 熱 ， 渴 欲 飲 水 ， 小 便 不 利 。 猪 苓 湯 具 有 消 炎、利 尿 等 作 用。猪 苓 湯 及 澤 瀉 具 有 排 石 和 體 外 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 的 作 用（ 19）。王 建 紅 等 人 作 猪 苓 湯 抑 制 腎 結 石 形 成 的 作 用 機 理 研 究 ， 也 顯 示 猪 苓 湯 對 乙 醛 酸 溶 液 誘 發 的 腎 結 石 形 成 有 明 顯 抑 制 作 用 （ 24）。 這 些 研 究 顯 示，運 用 猪 苓 湯 來 治 療 尿 路 結 石，不 僅 僅 有 治 療 輸 尿 管 結 石 所 引 起 的 腎 絞 痛 以 及 幫 助 結 石 排 出 的 療 效 ， 而 且 對 發 生 第 一 次 結 石 的 患 者 和 再 發 性 結 石 的 患 者 ， 都 具 有 治 療 和 預 防 的 意 義 。 但 是 對 於 治 療 急 性 腎 絞 痛 時 ， 應 該 用 多 少 劑 量 ？ 對 於 預 防 結 石 再 發 ， 又 應 該 用 多 少 劑 量 ？ 目 前 尚 還 沒 有 定 論 ， 仍 然 需 要 作 進 一 步 的 大 規 模 的 研 究 。

猪 苓 湯 的 成 份 中 有 五 種 藥 物 ， 分 別 為 茯 苓

Poria

cocos

， 澤 瀉

Rhizoma alismatis

， 猪 苓

Polpyorus

umbellatus

， 滑 石

Talcum

， 阿 膠

Colla asini

。

茯 苓 具 有 利 水 滲 溼 功 用，用 於 水 溼 停 滯 所 致 的 小 便 不 利、泄 瀉、水 腫 等 症。亦 可 用 於 濕 熱 淋 濁。茯 苓 健 脾 補 中 多 用 於 脾 虛 濕 困 所 致 的 食 少 脘 悶 或 泄 瀉 等 症 。 茯 苓 為 補 益、滲 利 之 品，配 伍 不 同，能 補 能 瀉，與 補 氣 藥 同 用 則 健 脾，與 利 尿 藥 同 用 則 滲 濕。藥 理 作 用 主 要 在 利 水，有 抑 制 腎 小 管 重 吸 收 機 能 。 茯 苓 的 萃 取 物 Heteropolysaccharide ac-PCM0 在 動 物 實 驗 中，具 有 抗 腫 瘤 作 用 (25)。茯 苓 的 萃 取 物 Pachymic acid 在 實 驗 室 中，可 以 引 發 前 列 腺 癌 細 胞 凋 亡（ 26）。茯 苓 也 具 有 對 抗 慢 性 皮 膚 發 炎 反 應 性 疾 患 的 作 用，如 牛 皮 癬 （ 27）。 茯 苓 的 部 分 化 學 成 份 在 實 驗 中 ， 也 具 有 殺 線 蟲 的 作 用 （ 28）。 在 人 體 實 驗 中 ， 茯 苓 配 合 西 藥 ， 治 療 耳 鳴 具 有 明 顯 療 效 (29)。

的 作 用 。 藥 理 研 究 澤 瀉 利 尿 作 用 顯 著 ， 能 增 加 尿 量 和 尿 素 及 氯 化 物 的 排 泄 ； 又 有 輕 度 降 低 血 中 膽 固 醇 的 作 用 ， 故 可 能 對 動 脈 粥 樣 硬 化 症 有 緩 解 作 用 。 此 外 ， 尚 有 降 低 血 壓 和 血 糖 的 作 用。澤 瀉 的 萃 取 物 Alisol B acetate 可 以 引 起 前 列 腺 癌 細 胞 凋 亡 （ 30）。 澤 瀉 的 萃 取 物 ( Kanpou medicine )在 體 外 實 驗 中 ， 具 有 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 聚 集 與 成 長 的 作 用 （ 31）。 澤 瀉 雖 然 不 含 有 GAGs (glycosaminoglicans)， 但 是 卻 具 有 明 顯 得 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 形 成 、 聚 集 與 成 長 的 作 用 （ 32）。 猪 苓 主 要 作 用 也 是 利 水 滲 濕 ， 利 水 滲 濕 作 用 優 於 茯 苓，但 無 補 益 心 脾 之 力。用 於 水 溼 停 滯 所 致 的 小 便 不 利 、 泄 瀉、濕 熱 淋 濁 等 症。猪 苓 藥 性 較 茯 苓 為 涼，故 以 水 濕 為 病 偏 熱 者 用 之 較 宜 。 其 藥 理 作 用 主 要 在 利 尿 ， 效 用 比 茯 苓、木 通、淡 竹 葉、玉 米 鬚 為 強，是 由 於 抑 制 腎 小 管 重 吸 收 機 能 而 引 起 利 尿。猪 苓 在 臨 床 使 用 上 可 以 快 速 將 膀 胱 脹 尿（ 33）。猪苓 的 萃 取 物 polysaccharide（ PUP）在 小 鼠 實 驗 中，用 腹 膜 內 給 藥，對 罹 患 肝 臟 病 灶 小 鼠，可 以 增 強 細 胞 性 免 疫 作 用 （ 34）。 以 上 三 種 藥 物 都 著 重 於 利 水 滲 濕 作 用 。

若 再 加 上 阿 膠 、 滑 石 可 用 於 陰 虛 小 便 不 利 、 水 腫 等 症 。〈 即 猪 苓 湯 〉。 滑 石 利 水 通 淋 ， 性 寒 而 滑 ， 寒 能 清 熱 ， 滑 能 通 利，能 瀉 膀 胱 之 熱 結 而 通 利 小 便。滑 石 也 有 清 熱 解 暑 的 作 用。阿 膠 有 養 血 止 血 的 作 用，可 治 療 尿 血。藥 理 作 用 則 在 於 可 加 速 血 液 中 紅 血 球 和 血 紅 蛋 白 生 長 。 五 種 藥 物 中 ， 僅 有 澤 瀉 具 有 明 顯 得 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 形 成 、 聚 集 與 成 長 的 作 用 。 猪 苓 、 茯 苓 則 有 明 顯 利 尿 作 用 。 五 種 藥 物 萃 取 等 份 混 合 ， 在 抑 制 結 石 作 用 上 ， 具 有 療 效 。 猪 苓 湯 運 用 在 小 鼠 口 服 給 藥 的 研 究 上 ， 可 以 刺 激 網 狀 內 皮 系 統 ， 而 具 有 抗 腫 瘤 作 用 和 產 生 腫 瘤 壞 死 因 子 (TNF)，可 以 增 加 得 腫 瘤 小 鼠 的 存 活 率。（ 35， 36， 37）。 而 運 用 猪 苓 湯 來 治 療 尿 路 結 石 的 數 據 ， 應 當 再 廣 泛 的 收 集。賴 真 等 人 用 猪 苓 湯 治 療 泌 尿 系 結 石 40 例 分 析，治 療 排 石 有 效 率 達 87.5% (38)。 在 日 本 ， 鈴 木 明 用 猪 苓 湯 治 療 尿 路 結 石，也 有 良 好 的 治 療 效 果（ 39，40）。所 以 猪 苓

第 六 章 、 結 論

猪 苓 湯 具 有 排 石 和 體 外 抑 制 草 酸 鈣 結 晶 形 成 的 作 用 。 用 猪 苓 湯 治 療 尿 路 結 石 ， 在 大 白 鼠 產 生 結 石 模 型 抑 制 實 驗 是 有 效 的 。 將 猪 苓 湯 運 用 在 治 療 人 類 復 發 性 結 石 的 安 全 性 和 可 行 性 是 很 高 的 。

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The inhibitory effect on the formation of calcium oxalate stone by Zhulingtang-a crystallization method

Ching-Hua Tseng Professor: Wen-Chi Chen

P u r p o s e : W e e v a l u a t e d t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f Zhulingtang on the formation of calcium oxalate stone to

prevent human recurrent urolithiasis.

Materials and Methods: The first step, we prepared calcium oxalate monohydrate in our laboratory. Then we evaluated the inhibitory effect of Zhulingtang by

crystallization method (photospectrometer) in the 3 processes of initiation of crystal formation, including crystal nucleation, crystal growth and crystal aggregation. The second step was the rat model of renal calculi which was made by adding

0.75% ethylene glycol in drinking water for 3 to 4 weeks. The treatment group of rat was fed by different concentrations

Results: The delay of crystal neucleation induction time was statistically significant in 5 different concentrations of extracts of Zhulingtang compared with controls (p <0.0001). The inhibitory percentage of crystal aggregation were

significantly increased in 5 different concentrations of extracts of Zhulingtang (p <0.05). The average crystal deposition index was decreased in the rat model (p<0.05).

Conclusions: Zhulingtang had an inhibitory effect of calcium oxalate crystal formation both in vitro and in vivo. There was significantly inhibitory effect of stone formation in the rat’s model by Zhulingtang. Zhulintang is a traditional formula in “Shang han lun”. It is proposed that to treat human recurrent stone formation with Zhulintang is safe and effective. It can be applied for clinical use for the treatment of stone disease.