行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
子計畫一：創新之螢光奈米噴射液滴研究與近場全反射量測
(I)
計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC92-2212-E-002-088- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學應用力學研究所 計畫主持人： 黃榮山 共同主持人： 王安邦 報告類型： 精簡報告 報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 11 月 2 日
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行政院國家科學委員會專題研究計畫年度報告
奈米液滴產生器計劃-子計畫一:創新之奈米螢光噴射液滴研究
與近場全反射量測
計畫編號：NSC 92-2212-E-002-088 執行期限：92 年 8 月 1 日至 93 年 7 月 31 日 主持人：黃榮山 台灣大學應用力學研究所 Email: lshuang@mems.iam.ntu.edu.tw一、中文摘要
本文整合全反射螢光顯微術與微機 電製程技術，利用全反射光場以漸逝波激 發螢光，使全反射螢光顯微術具有離玻璃 基材 150 至 700 奈米尺寸等級以內的觀測 功能，並且其影像的訊號背景比遠高於其 他的顯微技術；而在橫向尺寸的功能也藉 著量測 1 微米的螢光粒子得到了驗證。另 外，配合速度每秒 30 張畫面的影像擷取 系 統 ， 可 對 標 定 螢 光 之 抗 原 分 子 Anti-IgG，進行即時偵測了解其從運動至 與抗體鍵結時之狀態，並加以分析。在單 分子偵測上，本文首次利用全反射螢光顯 微鏡即時觀察到在固液相單一抗原分子 Anti-IgG 結合於抗體的狀態；同時也觀察 到分子在流體邊界層運動行為，並成功地 追蹤並分析抗原分子在流體邊界層的三 度空間運動軌跡(空間範圍間距：X 軸 14.7 微米；Y 軸 1.3 微米；Z 軸 0.24 微米)與 速度表現。Abstract
TIRF microscopy is a well-suited technique for real-time imaging and monitoring of a single protein molecule in nano-layer fluidics due to its unique evanencent wave at the optically index-mismatch interaface that may excites fluorescences at the transparent near-wall region. Recent advances in charge coupled device (CCD) camera detection efficiency and speed have enabled the microscopy of temporal and spatial resolutions to be
far-reaching 0.033 s and 0.3 µm, respectively. Based on the fluorescent beads analysis, which are 1.1 µm in size, the capability of TIRFM for single molecules monitoring and tracking, even the measurement in lateral size of molecules was demonstrated.
二、計畫緣由及目的
由於一般的光學顯微鏡受限於光波長 的物理極限因素，使得光學顯微鏡的解晰 度約在微米等級，也因此當本計畫中的液 滴大小欲由十微米推向一微米甚至到零 點一微米時，目前用來觀測液滴的光學顯 微鏡技術均會現瓶頸，也因此勢必需要開 發一種新的技術，用來觀察到小於微米尺 度下之液滴現象。 而在觀察液滴從奈米噴頭噴出之動 態影像部分，由於光學顯微技術在高放大 率下，其工作區之景深也相對地變短，實 際上對實驗觀測技術是一大挑戰，因此文 獻 上 很 少 探 討 或 觀 測 約 微 米 等 級 的 液 滴，因此若要將觀測技術從目前的 10µm 往下推展到 10-1 m µ ，則必須採用新的觀測 技術與物理原理。 在本計畫中，提出利用全反射螢光顯 微鏡技術的概念，來觀察液滴撞擊在基板 上之現象，並由此推測其噴出的液滴是否 成功。由於此技術比傳統的螢光檢測技術 更能效的檢測出奈米等級的微小分子，不 論是在解析度上或是雜訊比上，皆能獲得2 有效的改善。此外由於螢光訊號是由 CCD 所 接 收 ， 因 此 收 訊 號 的 頻 率 可 以 達 到 200Hz，而一般掃描式的顯微鏡如共軛或 雙覺子顯微鏡大約只到達 0.1~5Hz，因此 全反射螢光顯微鏡技術的接收的頻率比 共軛焦或雙光子顯微鏡高出非常多，而擁 有顯影快速的優點使得此技術更能有效 的觀察出奈米液滴的表現。
三、研究方法
對於進入生物分子這種微奈米等級 尺寸領域的研究，須要有適當的儀器設備 以及符合其尺寸的技術配合，方能進行研 究並深入探討生物分子的微妙現象，以及 發現其實際在學術與產業上的應用。 因此，在本研究中，首先建立一套可 觀測在微奈米尺寸之活體生物分子的系 統－全反射螢光顯微技術。此技術雖已普 遍被應用於各領域的研究，但仍須要以光 學的知識，並對於系統中各元件的特性進 行深入了解，才得架設完成。配合實驗上 的需要，對於每一元件都須經過仔細的選 用與調整，並且整個光場的設計也相當的 重要。 再者，由於受到尺寸限制的需要，研 究中使用微機電技術製作晶片，達到微小 化的需求。所使用的材料以及製作方法都 需要考慮到是否能與生物分子結合，因此 其中有許多生物化學之相關知識是須要 了解的。根據研究目的，使用軟體設計適 合的電極與微流道，利用微機電技術製作 完成後，並以化學處理方法與生物結合。 兩項技術發展完畢，就需要生物的知 識來協助接下來的研究，如何以工程的角 度來進行對生物分子一些特別現象作探 討，須要一些知識的累積。例如生物分子 親合力、動力常數、以及生物物理與化學 等，都是在本研究中相當基礎的。因此， 研究的結果中，藉此探討在生物科學的發 現，並且討論其是否能實際在醫學或製藥 臨床有應用。四、 結論與成果
訊號背景比
高訊號背景比(SBR)是全反射螢光顯 微鏡的特性之ㄧ，因此也是驗證整個系統 是否已經架設完全的其中一項指標。為此 以微米或奈米尺寸的螢光珠樣本來作實 驗，製作流程如圖 4-1。開始實驗時，可 以先就所得影像做觀察，根據漸逝波的特 性，螢光珠一旦不在漸逝波的電磁場範圍 裡，就不會被激發。由於布朗效應的影 響，螢光珠會不斷地進出漸逝波的電磁場 範圍，因此所得到的即時影像，應該是呈 現光點閃爍的現象。 將螢光小珠以 pippete滴入有圓 形槽的載玻片 蓋上蓋玻片。 以快乾膠或透明指 甲油將邊緣黏緊， 以防液體滲出。 蓋玻片 載玻片 螢光小珠 pippete 圖 4 - 1 螢光珠樣本試片製作流程圖 圖 4 - 2 TIR 激發狀態下 0.2μm 螢光珠 (SBR=11.8) 橫向尺寸量側 為了測試全反射螢光顯微鏡在橫向(xy 平 面)的解析度，進行了對於 1.1µm 的螢光珠3 作量測。因此，首先需要將螢光珠固定蓋 玻片上，否則若螢光珠隨意漂動，會增 量測的困難度與誤差。螢光珠固定後，進 行全反射實驗，所得到影像為圖 4-3，在 圖上取三個點來作分析，觀察其尺寸是否 與實際相符。因此，在這實驗之前，先利 用掃描式電子顯微鏡(SEM)拍下(圖 4-5)， 來作實驗的對照組。 圖 4 - 3 固定化螢光珠之全反射圖 30 40 50 60 70 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 Distance(nm) In te n sity (a .u .) FWHM= 1013nm 1 圖 4 - 4 螢光珠 FWHM 分析圖 圖 4 - 5 螢光珠之 SEM 圖 分析結果顯示，在在全反射圖中，經 三個點分析平均值為 1.146 µm，而在 SEM 圖中螢光珠的平均直徑為 1.125 µm ；與 廠商所提供的資料 1.1 µm，標準差為 2.5% 作比較，其誤差值分別是 1.9 % 與 4.2 %， 顯示全反射螢光顯微鏡的確有能力可作 橫向尺寸的量測。然而，受限於光學的解 析度(約 200nm)的限制，雖仍可偵測到螢 光訊號，但真實的橫向尺寸就已經很難辨 認。 粒子即時偵側與影像分析 微小粒子的即時偵測是全反射螢光 顯微鏡的強大功能，配合影像處理軟體， 可 對 粒 子 在 加 電 壓 後 其 動 態 運 動 的 偵 測，並且可分析粒子的運動軌跡，以及其 運動速率等。在實驗中，在流道兩端加電 壓，觀察微粒子的運動狀態，利用 CCD 以 33 微秒(每一秒鐘擷取 30 個畫面) 的擷 取速度，拍下其動態變化，如圖 4-6 所示。 從圖中可以觀察到，相對於參考點，螢光 珠從圖右上角移動至左下角；並且其螢光 強度從弱轉強，再從強轉弱，這是因為螢 光珠漸進入漸逝波的激發範圍裡，此後又 漸漸離開，又根據螢光強度與界面距離 z 有關，可以就著螢光強度的不同，推算螢 光珠距離界面的不同位置。 0ms 66ms 99ms 132ms 165ms 198ms 33ms 圖 4 - 6 螢光珠受電壓驅動後在每一時間 位置變化圖 利用影像處理軟體中，追蹤粒子軌跡 的功能(圖 4-7)，可以得到粒子在每一時間 的位置，以及每一時間的速度，如圖 4-8
4 所示。。然而，粒子運動軌跡追蹤的探討， 對於蛋白質分子加電壓後，所產生的行為 變化，便顯得相當重要。例如，蛋白質分 子因所加電壓改變，可藉此功能得知其運 動行為，並討論蛋白質的電性特性，以及 蛋白質分子間之鍵結作用等。 圖 4 - 7 粒子運動軌跡追蹤 圖 4 - 8 粒子軌跡追蹤位置圖與速率圖
五、結論
本研究成功地以物鏡式的架設法完 成全反射螢光顯微鏡的架設。從原理到每 一個元件的設計選用，並配合冷卻式的 CCD 攝影機以及生物界常用的影像軟體 (Metamorph)，使整個系統卻是有即時偵測 的功能。以高訊號背景比測試，證明系統 的確架設成功；並成功地對 1.1µm 螢光珠 進行量測，驗證系統有橫向尺寸測量的功 能；再者對於在被加電壓的單粒子之動態 偵測與追蹤，在位置與速度上都能計算出 來，顯示全反射螢光顯微鏡的確有對單分 子偵測與分析的能力。六、參考文獻
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