寄生蟲與食物資源對台灣森鼠繁殖表現的影響

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 寄生蟲與食物資源對台灣森鼠繁殖表現的影響 Effects of parasites and food resources on reproductive performance in the Taiwan field mouse (Apodemus semotus). 研究生：游艾芸 Ai-Yun Yu 指導教授：李佩珍 Dr. Pei-Jen Lee Shaner 李壽先 Dr. Shou-Hsien Li. 中華民國 105 年 1 月. i.

(2) 謝誌終於，碩士生涯也走到了最後。當我提筆要開始寫謝誌時，心裡剩下的是滿滿的感激。我很感謝三年前可以有幸進入李佩珍老師的實驗室，在這個實驗室裡我從老師身上學到了好多。老師在學術上總是細心又耐心的指導我，從未因為我的遲鈍而放棄我。而除了學術上的指導外，在生涯上、感情上老師給的是不一樣又開放的觀點。對我來說，從老師身上學到的不只是學術，是對人、對事、對自己的態度全面的成長。另外，我也很感謝李壽先老師，老師不僅給我實驗室的資源進行實驗室的實驗，也給了我嚴格的指導，在老師的指導下使我對學術上有更深的理解。所有做過野外實驗的人都知道，野外實驗室很難單獨完成的。在那 5 個月的時間裡，孤寂的黑夜，冷颼颼的寒風，出奇不意的咬人貓還有在暗夜裡埋伏的黃鼠狼覬覦著我的樣本，每日每夜的睡眠不足，挑戰著我們的理智線…我很感謝那時，伶樺學姊總是幫著我，從第一刻到最後一刻都沒有離開我。若不是學姊，我必是難以完成野外實驗。另外，我也很感謝我的好趴呢─侯慶賀和陳建龍，因為有你們在，當我走在黑暗裡時並不覺得害怕。而我們也總是搞出傻事來，在神經線緊繃之下能和你們一起發笑真好。除此之外，我也很感謝所有幫助過我野外實驗的夥伴，佩真學姊、諠憶學姊、苡柔學姊、妞妞、家綉、仲康、沈育正等人，若不是你們熱心的幫忙，我無法完成艱辛的野外實驗。野外實驗雖然辛苦，卻也是這段時間裡最懷念的時光，一起摸黑、一起洗籠子、一起撿大便、一起做玻片、一起睡車上、一起看流星的晚上彷彿歷歷在目。在野外實驗室結束後，是看不見底的親子鑑定。很感謝李壽先老師實驗室的成員佳芬學姊、心怡學姊、志銘學長、伊鈞學姊、郁婷給我實驗上的指導與協助，也給了我許多研究上的建議。你們不僅使我在研究上成長，也使我在這段日子過得有趣且愉快。最後，再次感謝李佩珍老師、李壽先老師以及實驗室所有成員給我的幫助；感謝口試委員卓逸民老師，讓我順利通過口試並給我論文修改的建議；感謝呂國棟老師實驗室提供行為實驗儀器與指導；感謝雪霸國家公園提供住宿與研究環境；感謝國科會給予經費支持；感謝我的爮媽給我全力的支持，讓我沒有憂慮的好好念書、完成研究；感謝研究所這段期間一起努力、一起研究的同學們，有你們陪伴我不孤單；感謝我的室友郁婷、小瑄、怡恩、佳瞜、彥廷，聽我發牢騷、抒發壓力；感謝台灣森鼠們，謝謝你們的配合與犧牲讓我完成實驗。在這三年的時間，我成長了許多，未來我會更努力朝下一個目標前進!.

(3) 中文摘要根據生活史理論，在有限的資源下，自然選擇可優化(optimize) 生物在生存與繁殖間的資源分配，而最大化(maximize)其子代數或子代品質(此即生活史權衡，life history trade-off)。一般認為，寄生蟲與食物資源皆會影響生物的能量分配與獲得，進而影響宿主的繁殖表現；同時，由於雌雄兩性往往有不同的生活史，在面對寄生蟲與食物資源的影響時，可能有不同的權衡方式。本研究檢測內寄生蟲與種子食物資源對台灣森鼠(Apodemus semotus)繁殖表現(子代數與子代品質)的影響。2013 年我在雪霸國家公園內一處針闊混林進行野外操控實驗，包括有系統地挑選樣點給予種子添加，以及將所有捕捉之 A. semotus 隨機分配給予移除內寄生蟲藥物 Ivermectin 或水(控制組)。接著我利用 10 個微衛星基因座進行親子鑑定，並用捕捉標放資料計算子代的平均體重(子代品質的指標)。結果顯示，內寄生蟲移除對 A. semotus 子代數沒有影響，而食物資源可提高個體子代數；同時，內寄生蟲與食物資源並不影響 A. semotus 子代品質。本研究顯示，相較於內寄生蟲，食物資源對 A. semotus 的繁殖表現更為重要。此結果有助於我們了解外在因子如何影響宿主生活史策略與族群動態。由於本研究所估算的子代數與子代品質相當接近 A. semotus 的適存度，而非前人研究常使用的短期或單次的繁殖表現，因此本研究可作為內寄生蟲對宿主適存度無負面影響的一個重要案例。. 關鍵字：生活史、適存度、親子鑑定、齧齒目. i.

(4) Abstract Life history theory predicts that organisms allocate resources to survival and reproduction such that they maximize number or quality of their offspring. Parasites and food resources can both influence host energy budget, thereby affecting their reproductive performance. Furthermore, the influence of parasites and food resources on host reproduction may be different for males and females given their differences in life history trade-offs. Here I tested the effects of intestinal parasites and seed resources on the reproductive success (number and quality of offspring) of Apodemus semotus. I conducted a manipulated field experiment in 2013 at a mixed conifer-deciduous forest in the Shei-pa National Park, which included (1) seed addition to a set of systematically selected locations, and (2) parasite removal by randomly assigning adult A. semotus to either Ivermectin (i.e. parasite removal) or water treatment (i.e. control). I used 10 microsatellite markers for parentage assignment, and mark-capture data for assessing offspring body mass (the proxy for offspring quality). My results indicate that seed addition had a positive effect on the number of offspring, which is independent from parasite removal. Parasite removal did not influence the number of offspring. In addition, neither parasite removal nor seed addition affects offspring quality. The results suggest that food resource is more important than parasitism to the mice’s reproductive performance, which helps us better understand how extrinsic factors may shape life history strategy and population dynamics. Because the number and quality of offspring estimated in this study are more closely linked to the host fitness compared to many previous studies using short-term or ii.

(5) single-season reproduction data, my findings provide a solid case supporting non-negative effect of endoparasites on host fitness.. Keywords: fitness, life history, parentage assignment, rodentia. iii.

(6) 目錄中文摘要……………………………………………………i Abstract ……………………………………………………ii 前言…………………………………………………………1 材料方法……………………………………………………6 結果…………………………………………………………13 討論…………………………………………………………16 參考文獻……………………………………………………21 表……………………………………………………………24 圖……………………………………………………………30 附錄…………………………………………………………41. I.

(7) 前言根據生活史理論，在有限的資源下，自然選擇可優化(optimize) 生物在生存與繁殖間的資源分配，以維持最高的適存度(fitness; Stearn 1976)。由於寄生蟲能直接從宿主身上獲取資源、改變宿主攝食行為、限制其能量與養分的攝取(Scantlebury et al. 2007)或是誘發免疫反應(Schwanz 2006)，進而影響宿主的能量投資分配 (Michalakis & Hochberg 1994；Lochmiller & Deerenberg 2000)。因此，寄生蟲被認為是影響宿主生活史策略演化與族群動態的重要因子 (Sheldon & Verhulst 1996；Hudson et al. 1998；Watson 2013)。寄生蟲又可分為內寄生蟲(例如:線蟲、絛蟲、吸蟲等)與外寄生蟲 (例如:跳蚤、蜱、恙蟎等)，內寄生蟲與外寄生蟲分別生活於宿主的體內與體外，具不同的生活史週期(Degen 2006 回顧)。內寄生蟲長期生活在宿主體內使用宿主的組織或是與宿主競爭腸道中的養分，而外寄生蟲生活在宿主體外使用宿主的表皮組織或血液等(Degen 2006 回顧)。因此相較於外寄生蟲，內寄生蟲與宿主的關係可能更為密切，並扮演了影響宿主生活史演化的重要角色。繁殖為生活史中的關鍵事件，了解內寄生蟲對繁殖的影響有助於我們了解內寄生蟲如何影響宿主生活史的演化。在探討內寄生蟲對宿主繁殖影響的研究當中，常檢視寄生蟲對宿主第二性徵、配偶選擇以及繁殖表現的影響，或之間的相關性(Penn & Potts 1998; Poulin & Forbes 2012)。其中，第二性徵可能反映個體的身體狀況，常被異性個體作為配偶選擇的依據，使異性個體能利用第二性徵的表現，選擇身體狀況較佳的個體(Zahavi 1975)。舉例來說，Vergara等人(2012) 發表的研究當中發現，內寄生蟲的感染量與雄性紅松雞(Lagopus lagopus scoticus)眼睛上方紅色飾羽(comb)的面積呈負相關，顯示雄 1.

(8) 性紅松雞的紅色飾羽，可能為反映個體身體狀況的誠實訊號(honest signal)。另一方面，內寄生蟲也可能會影響宿主的配偶選擇，例如： Gourbal和Gbrion(2004)的研究中發現，沒有受到絛蟲感染的雄性小家鼠(Mus musculus)遇到受感染的雌鼠時，會減少嗅聞、舔、騎乘等行為，並且攻擊性更強，表示寄生蟲可能會影響宿主的配偶選擇，而降低宿主的繁殖機會。另外，關於寄生蟲對繁殖表現影響研究中， Vandegrift等人(2008)發現移除內寄生蟲延長雌性白足鼠 (Peromyscus leucopus)的繁殖期，使其在原本非繁殖季節，仍有繁殖表現，顯示寄生蟲可能會限制宿主繁殖時期。然而，相較於第二性徵、配偶選擇或是繁殖季長度，子代數更能反映寄生蟲對宿主生活史以及適存度的影響。目前關於內寄生蟲對野生哺乳動物子代數的研究結果並不一致。例如，Raveh等人(2011)的研究結果顯示，移除內寄生蟲的雄性哥倫比亞地鼠(Urocitellus columbianus)其子代數，與沒有移除的個體沒有差異。而Patterson和Schulte-Hostedde(2011)的研究則發現雄性東方花栗鼠(Tamias striatus)子代數與內寄生蟲量呈負相關，這兩篇研究結果顯示，內寄生蟲對雄性個體的繁殖可能沒有影響或是負面影響。Gooderham和Schulte-Hostedde(2011)的研究則同時檢測雌雄兩性紅松鼠內寄生蟲多樣性與子代數的關係，其結果發現內寄生蟲多樣性越高子代數越少。這些針對內寄生蟲對宿主子代數影響的研究，多為相關性檢測，無法醭清寄生蟲與宿主繁殖表現間的因果關係，因此還需要操控實驗以了解寄生蟲對宿主繁殖表現的影響。除此之外，過去的研究大多針對壽命較長的物種，研究期間只涵蓋宿主一生中的某一次繁殖(Neuhaus 2003；Gooderham & Schulte-Hostedde 2011；Raveh et al. 2011；Patterson & Schulte-Hostedde 2011； 2.

(9) Patterson et al. 2013)。例如，Gooderham和Schulte-Hostedde(2011) 的研究中，檢測了一年中雌性雄兩性紅松鼠(Tamiasciurus hudsonicus)子代數與內寄生蟲豐富度的關係，然而紅松鼠的壽命可長達8年，1歲達到性成熟後，一生中進行多次繁殖(McAdam et al. 2007)。若只檢測某次繁殖，可能無法反映寄生蟲對宿主終生繁殖表現的影響。另一方面，環境資源的多寡也會影響宿主的身體狀況以及繁殖投資(Boutin 1990；Prevedello et al. 2013；Ruffino et al. 2014)，進而改變寄生蟲對宿主的影響。目前已有少數研究暗示食物資源與寄生蟲可能共同影響宿主行為、生理和繁殖表現。例如Walsh(2013)的研究發現，野生白足鼠(P. leucopus)與鹿鼠(P. maniculatus)在覓食時，並不會避開有寄生蟲感染風險的區塊，作者推論，這是因為野外環境食物資源缺乏，造成宿主在覓食時無法同時兼顧寄生蟲風險。關於食物資源與寄生蟲對繁殖表現的影響，2003年Díaz和Alonso發現，給予食物資源的野生小林姬鼠(Apodemus sylvaticus)不僅有較佳的繁殖表現，內寄生蟲盛行率以及寄生蟲量也較低，顯示食物資源不僅影響繁殖表現，也影響宿主對寄生蟲的抵抗能力，因此推測食物資源可能降低寄生蟲帶來的負面影響，並與寄生蟲共同影響宿主的繁殖。然而過去研究多半僅操控其中一項因子(如僅移除寄生蟲或僅添加食物)，因此寄生蟲與食物資源對宿主繁殖表現的交互作用仍屬臆測，尚需雙因子操控實驗以進行深入的探討。食物資源以及內寄生蟲對雌雄兩性可能會有不同的影響，其差異可能來自兩性生理、行為與繁殖代價的不同。例如雌性哺乳動物在繁殖時頇面對懷孕與哺乳等大量的能量消耗過程，因此對於食物資源的需求可能較雄性高。同時，雌性個體對食物資源的需求可能使其較無 3.

(10) 法避開高寄生風險的食物區塊(Smith et al. 2006)。另一方面，雄性個體受到「免疫系統─雄性激素」間資源分配(immunity-testosterone trade-offs)的影響，當雄性個體增進睪固酮(testosterone)的分泌時可促進第二性徵的發育與激進行為(aggression)，以增加交配機會；然而，睪固酮對免疫系統有抑制的作用，使得雄性個體相較於雌性更容易受到內寄生蟲的感染。此外雄性較為激進的行為也可能增加個體間的接觸，導致雄性有較高的個體間傳染風險(Klein 2000, 2004)。因此在雌雄不同的能量權衡之下，內寄生蟲與食物資源對兩性繁殖的影響也可能不同。台灣森鼠(A. semotus) 分布於台灣海拔1500~3600公尺的山區 (Yu 1994)，全年皆可繁殖，但春末與秓初為明顯的繁殖高峰(Lin & Shiraishi 1992)。大部分的野外個體壽命不超過一年(Lin et al. 2014) ，雌性個體繁殖次數不超過兩次(Lin & Shiraishi 1992)，因此一年內能得知大部分個體終生的子代數，有助於了解內寄生蟲對宿主個體終生的影響。此外，目前已知台灣森鼠為許多線蟲(nematodes) 與絛蟲(cestodes)的宿主(Lo & Shaner 2015)。且近期的研究發現，移除內寄生蟲可能會提高雌性台灣森鼠繁殖投資(Lo & Shaner 2015)。另外，實驗室眷養之雌性台灣森鼠窩仔數顯著高於野外個體，顯示繁殖可能消耗雌性個體大量的能量，因此在食物量較缺乏的野外環境，雌性個體的繁殖無法達到與實驗室一樣大量的程度 (Lin & Shiraishi 1992)。上述特性顯示台灣森鼠為研究食物資源與內寄生蟲對宿主繁殖影響的適當材料。本研究欲了解內寄生蟲與食物資源對台灣森鼠雌雄個體繁殖表現長期的影響。藉由雙因子操控實驗，於環境中添加食物資源與移除腸道內寄生蟲，以親子鑑定得知個體子代數目。檢視內寄生蟲與食物 4.

(11) 資源對不同性別台灣森鼠繁殖表現的影響。本研究有以下四項待測假說: (1)內寄生蟲對台灣森鼠的繁殖表現有負面影響。(2)食物資源能提高台灣森鼠繁殖表現。(3)食物資源能降低內寄生蟲的負面影響。(4) 內寄生蟲與食物資源對雌性的影響大於雄性。. 5.

(12) 材料方法一、研究樣地與捕捉標放本研究於 2013 年 5 月至 9 月在雪霸國家公園武陵森林遊憩區內一處濱岸的次生針闊混和林中進行(24∘23’ 21.19’’ N, 121∘18’ 32.80’’ E, 1842 m )。樣地總面積約 8 公頃。樣地內每間隔 15 公尺設立 1 個樣點，每個樣點設 2 個活捉式陷阱，總計 332 個點位(圖一)。我以花生醬、綜合穀物、麥片的混和物與地瓜作為誘捕餌，於每月份之月初與月中各捕捉一次，每次連續捕捉 3 夜。受限於人力，332 個點位無法於同一夜全部進行捕捉，因此整個樣地分三區進行捕捉，每次捕捉約需 6-9 夜 (由於其他動物，特別是黃鼠狼，不時會干擾陷阱，以及颱風侵襲，我在 7 月初與 9 月初皆暫停捕捉一次)。研究期間整個樣地共捕捉 8 次，合計 15,936 籠夜。皆於傍晚開籠，翌日清晨巡檢。所有捕捉個體皆植入無線射頻標籤(radio frequency identification tag)作為個體辨識，同時採取耳朵組織(直徑約 1.5 mm) 浸泡於 95%EtOH 中保存、記錄基本形值：性別、體重(0.5 g)、成體或幼體(換毛與否)、繁殖狀態(雌性：陰道口開、懷孕、哺乳；雄性：睪丸下降)，並給予內寄生蟲移除處理(詳見「三、寄生蟲移除」)，所有個體在處理後，於原捕捉樣點釋放。二、食物資源添加樣區由南至北平均區分為六個區域，每兩個相鄰的區域即有一個為添加食物區域，另一個為無食物添加的控制組，因此全區共有三個食物添加區域以及三個無食物添加的控制組，添加食物組與控制組彼此交錯相鄰(圖一)。每個食物區域隨機選取 8 個食物站位置，食物站周圍 15 m 內不得設另一個食物站。每隔 14 天每個食物站添加 1 kg 高粱種子，相當於每個添加食物區域加入 8 kg 種子(食物添加量計 6.

(13) 算：每個食物區約包含 50 個點位，約 100 個捕捉籠。跟據過去捕捉紀錄，推估若有 50%的捕捉率，且每隻老鼠一天的食物量約 12g，則每 14 天 50 隻老鼠可消耗 8.4kg 的食物)。由於無法直接給予個體食物，因此我利用個體活動範圍是否與食物站位置有重疊，做為個體有無受到添加食物處理的依據；在這個分析中，個體活動範圍會向外增加 10m 的緩衝區。另外，約每一個半月(5 月初、6 月底、8 月初、 9 月底)對大於 20 g 以及沒有懷孕的個體進行抽血，抽取大約 0.2 ml 之血液，進行血球之碳同位素檢測。由於食物添加所用的高粱種子之穩定碳同位素值比環境中動植物的值還高(Shaner et. al. 2013)，因此可輔助判斷食物添加組是否確實使用添加的高粱種子。三、寄生蟲移除小於 17g 的個體大多數為無法繁殖的幼體(Lin & Shiraishi 1992)，因此達到 17 g 的個體按性別各自隨機分配為寄生蟲移除組與控制組，寄生蟲移除組給予口服型除蟲劑 Ivermectin 250 μg (Pedersen & Greives 2008；Lo & Shaner 2015)。控制組以清水取代 Ivermectin，以控制人為操作的影響。每月給予處理至多一次，且個體所屬之處理組別，在整個研究期間維持不變。雖然 Ivermectin 對成體不具毒性(Davis et. al.1999)，但也有研究顯示給予懷孕哺乳大白鼠(Rattus norvegicus)服用高劑量 Ivermectin(4 mg/Kg/day)會造成幼鼠發育遲緩或死亡(Poul 1988)。但本研究並未發現給予哺乳中台灣森鼠母鼠 Ivermectin 對幼體生長發育有負面影響(附錄一)。四、內寄生蟲定量給予處理的個體在每次處理前皆採 0.05 g 的新鮮糞便，並浸泡於 10 % formalin 內保存 1~5 天，之後將糞便置換到比重 1.27 的糖水溶液，將糞便用研磨棒磨碎，利用 0.25 m/m(300~400 μm)孔徑之濾網 7.

(14) 過濾，在 200 G 下離心 8 分鐘，使蟲卵浮於液體表層。利用 Pippetment 吸取表層液體，共 75 μl 樣本(分置於一片載玻片上，載玻片上有 3 個蓋玻片，每個蓋玻片有 25 μl 的樣本)。接著將玻片置於 45 ℃熱風循環式烘箱烘烤至乾。以指甲油封片後於光學顯微鏡下計數，所記錄到的蟲卵數以 FEC(fecal egg count, number of eggs per gram of fecal sample)值進行標準化。另外，我以屬為單位計算寄生蟲豐富度 (parasite richness)。五、開發親子鑑定分子標記本研究透過全基因組重定序的方式開發台灣森鼠微衛星基因座，做為親子鑑定的分子標記。首先，我利用 QIAGEN DNeasy Tissue Kit，自一隻來自研究樣地的雌性台灣森鼠耳朵組織(直徑約 1.5 mm)，萃取 DNA。將萃取出的 2.74μg DNA 透過 Illumina Hiseq 2000 進行全基因組測序(500 bp insertion size; 90 bp paired-end reads)。接著我從 NCBI database(Geer et al. 2010)下載小家鼠(M. musculus)的全基因組序列(GRCm38.p1)，利用 CLC Genomics Workbench 6.02 (CLC Inc., Aarhus, Denmark)，將台灣森鼠全基因組短片段序列對應(map)至小家鼠 2.7Gb 的全基因組序列上。我從序列中挑出大於 1Mb 的序列，使用 Msatcommander 1.0.8 (Rozen & Skaletsky 2000；Faircloth 2008)篩選以 4 個鹼基為單位，且具 8 個重複以上的微衛星基因座，並設計引子。引子設計限制 PCR(Polymerase Chain Reaction)產物不超過 450bp，TM 為 57.0 °C (54.0°C-65°C)，引子長度為 22bp(20bp-24bp)，其他參數為原始設定，同時以 M13R(5’-GGAAACAGCTATGACCAT-3’)或 CAG (5’-CAGTCGGGCGTCATCA-3’)接在兩條引子中其中一條的 5’端， 8.

(15) 並在 PCR 時加入於 5’端標示螢光(FAM, HEX, TAMRA)的 M13R(5’-GGAAACAGCTATGACCAT-3’)或 CAG (5’-CAGTCGGGCGTCATCA-3’) tag(Schuelke 2000)。引子設計完成後，我隨機挑選 60 組引子，並使用 24 隻來自研究樣地之台灣森鼠個體進行測試。每個 PCR 總反應體積為 10μl，包含大約 15-25ng 之台灣森鼠 DNA，0.05μM 或 0.5μM 之 forward 及 reverse 引子(連接 M13R 或 CAG 之引子為 0.05μM)，0.5μM 帶有螢光標記之 M13R 或 CAG，每種 dNTP 0.2mM，0.75U Taq DNA polymerase 和 1X PCR buffer for Blend Taq(TOYOBO, Bland Taq-Plus-)。PCR 反應模式為： 1. 95°C 2min X 1cycle 2. “95°C 30s → 60°C，- 0.5/cycle，30 s → 72°C，40s” X20cycle 3. “95°C 30s → 50°C，30 s → 72°C，40s” X24cycle 4. 72°C 7 min 我透過 ABI3730XL (Applied Biosystems)定序平台定序平台測定擴增產物的片段長度(基隆米克斯公司，台北。)，並使用 PeakScanner (Applied Biosystems)以及 GeneMarker Version 2.2.0 (SoftGenetics LLC)獲得各個體在不同基因座上之基因型。接下來我利用 CERVUS 3.0(Marshall et al. 1998)計算每個基因座的對偶基因頻率(allele frequency)以及 heterozygosities 之觀測值與期望值。另外我使用 GENEPOP 4.2 (Raymond & Rousset 1995；Rousset 2008 )檢測基因座是否符合哈溫定律(Hardy-Weinberg equilibrium)，並以 MICRO-CHECKER ver. 2.2.3 (Van Oosterhout et al. 2005)檢測是否存在 null alleles。六、親子鑑定我將野外採集之耳朵組織樣本以 LiCl 方法(修改自 Gemmel & 9.

(16) Akitama 1996)萃取 DNA。利用本研究所開發的微衛星基因座引子進行 PCR 並定序。接著以 Cervus 3.0 進行親子鑑定分析(Kalinowski et al. 2007)。分析步驟如下: 1. 除了第一期捕捉到的個體外(實驗前出生個體)，所有個體皆會以子代的身分進行親子鑑定。 2. 每隻子代以自身以外在實驗期間捕捉到的所有個體設為可能的雙親候選人，在雙親候選人中會排除與子代同期及更晚捕捉到的幼體。(例如：12647 為第三期捕捉到的個體，12647 設為子代；雙親候選人為，一至八期捕捉的所有個體扣除三至八期捕捉的幼體) 3. 親子鑑定模擬(Simulation)參數: a. Offspring: 10000 b. Candidate mother: 140(平均族群大小估計值) c. Probability sampled(mother): 133/140 = 0.95 (所有上標個體，但扣除處理前死亡以及只有幼體捕捉紀錄的個體/平均族群大小估計值) d. Candidate father: 203(平均族群大小估計值) e. Probability sampled(father): 195/203= 0.96 (所有上標個體，但扣除處理前死亡以及只有幼體捕捉紀錄的個體/平均族群大小估計值) f. Probability loci typed: 0.9609 (來自 allele frequency analysis) g. Probability loci mistyped: 0.01 (default) h. Minimum loci typed: 5 i. Calculate confidence using: Delta j. Confidence levels: Relaxed: 80%, Strict: 95% 4. 先篩選雙親─子代配對信心指數(trio confidence level )> 80%的親子配對。若 trio confidence level < 80%，挑選單一親代─子代 10.

(17) 配對信心指數(pair confidence level) > 80%的親子配對。 5. 刪除出生前(子代和母親的配對)，以及受孕前(子代和父親的配對) 給處理的配對，標準如下： (1) 首次捕捉為幼體之出生日推算：野外捕捉紀錄中，第一次捕捉到時為幼體，其體重最重為 16.5g；實驗室飼養紀錄中日齡 23 天之幼體最重體重為 15.4g，因此保守的推測野外捕捉到隻幼體至多為 23 日齡。 (2) 首次捕捉為成體之出生日推算：野外捕捉紀錄中第一次捕捉時為幼體的個體，在 15 天後(下一個捕捉期)皆可成長至成體，因此以 23 加上 15 天(38 天)做為第一次捕捉到時即為成體的日齡。 (3) 懷孕期為 20 天(Lin & Shiraishi 1992)，因此受孕日為出生日加 20 天。七、資料分析藥物處理和性別對寄生蟲量(FEC)的影響以 Generalized Liner Model(GLM)檢測。統計分佈為負二項式，固定因子為藥物處理、性別，並包含其交互作用，有無將藥物處理前寄生蟲量設為共變量並不影響結果，因此不包含共變量。藥物處理後寄生蟲豐富度(parasite richness)的影響以無母數 Kruskal-Wallis test 檢測。藥物處理後若有多次寄生蟲定量結果則取平均值進行統計。我以 Spearman correlation 檢測寄生蟲量與寄生蟲豐富度之關係。另外，為確認寄生蟲感染狀況是否有性別差異，我以 GLM 檢測藥物處理前雌雄兩性之寄生蟲量是否有差異，以 Kruskal-Wallis test 檢測豐富度是否有差異。我以 ANOVA 檢測利用活動範圍判斷為給予食物的個體，其碳同位素值是否高於沒有給予食物的個體。 11.

(18) 針對本研究主要的假說，我以 GLM 檢測食物添加與寄生蟲移除兩個因子對森鼠個體子代數與子代體重的影響，因為有些子代僅在幼體階段捕獲、有些僅在成體階段捕獲，所以分別檢測子代為幼體或成體兩種情況。子代數檢測中，統計分佈為負二項式，固定因子為寄生蟲移除、食物添加、性別，並包含所有交互作用。子代幼體體重檢測中，由於無食物添加組的樣本數不足(無食物添加組的雌性僅有 1 筆紀錄，雄性僅有 3 筆)，因此僅能檢測寄生蟲移除對子代幼體體重的影響。針對幼體體重檢測，我設定寄生蟲移除與親代性別為固定因子，包含其交互作用，並加入親代個體編號以及子代性別為隨機因子 (因台灣森鼠具有雌雄二型性，雄性略大於雌性)。針對子代成體體重檢測，我設定寄生蟲移除、食物添加與親代性別為固定因子，包含其交互作用，加入親代個體編號以及子代性別為隨機因子。由於個體對於藥物處理的反應程度可能不同，使寄生蟲量與豐富度呈連續分布，因此我以 Spearman correlation 分別檢測添加食物與沒有添加食物的個體之寄生蟲量、寄生蟲豐富度與子代數、子代體重之關係。針對這些相關性分析，我將不同性別的親代以及不同時期的子代(成體子代、幼體子代)分開檢測。幼體子代體重的檢測當中，因為沒有添加食物的組別樣本數不足(雌性個體的女兒樣本數為 0 筆，兒子樣本數為 1 筆；雄性個體的樣本數為 0 筆)，因此將有無添加食物的組別合併進行相關性檢測，但雄性個體在有食物添加組中女兒只有 2 筆、兒子 8 筆，因此只檢測兒子體重。在成體子代體重的檢測中，也因為沒有添加食物的組別樣本數不足(雌性個體的女兒樣本數為 4 筆、兒子樣本數為 6 筆；雄性個體的女兒樣本數為 1 筆、兒子樣本數為 6 筆)，因此也將有無添加食物的組別合併進行相關性檢測。. 12.

(19) 結果微衛星基因座我將定序獲得的台灣森鼠 32.2 Gb 全基因組短片段序列對應 (map)至小家鼠 2.7Gb 的全基因組序列後，獲得 271 條，總共約 1.7Gb 的台灣森鼠序列(平均覆蓋度為 5.6x)，其中包含 90 條大於 1Mb 的序列。我再從這 90 條大於 1Mb 的序列中篩選出 63,672 個符合條件的微衛星基因座，並設計出 1,456 組引子。從 1,456 組引子當中，我挑選了 60 組引子進行測試，其中 47 個基因座可以透過 PCR 被擴增， 33 個具有多態性，23 個在判讀上較容易，我從中挑選出 10 個基因座進行親子鑑定(表一)。. 寄生蟲移除效果 Ivermectin 能有效降低個體寄生蟲量，但對雄性的效果較強(表二與圖二)。雌雄兩性在處理後，寄生蟲移除組寄生蟲豐富度低於控制組(雌性：Chi-square=4.02，P=0.05，N=63；雄性： Chi-square=5.51，P=0.02，N=84；圖三)。寄生蟲量與豐富度間呈正相關(藥物處理前：rs=0.16，P =0.05，N=147；藥物處理後之寄生蟲移除組：rs=0.63，P <0.0001，N=69；藥物處理後之控制組： rs=0.21，P =0.06，N=78)。寄生蟲移除前雌雄兩性寄生蟲量與豐富度並無差異(寄生蟲量:Chi-square=1.05，P=0.31，N=147，豐富度： Chi-square=1.44，P=0.23，N=147)。. 食物添加效果被區分為食物添加個體，血球碳同位素值顯著高於沒有食物添加的個體(食物添加: δ13C = -20.5±0.2‰，N =79；無食物添加：δ13C = 13.

(20) -24.1±0.3‰，N=38；F1,117=48.96，P <0.0001，N=117)，因此根據個體活動範圍與食物站的重疊程度來區分食物添加與無食物添加組確實能代表個體有無添加食物的處理。. 內寄生蟲移除與食物添加對子代數與子代體重的影響內寄生蟲移除不影響個體子代數，而食物添加能提高個體子代數 (幼體子代數：表三與圖四；成體子代數：表四與圖五)。內寄生蟲移除與食物添加間無交互作用，性別與各處理間亦無交互作用。內寄生蟲移除對幼體子代平均體重沒有影響(表五與圖六)；內寄生蟲移除以及食物添加對子代成體平均體重沒有影響，內寄生蟲移除與食物添加間無交互作用，性別與各處理間亦無交互作用(表六與圖七)。. 寄生蟲量、豐富度與子代數、子代體重之關係雌性個體在無添加食物時，內寄生蟲量與子代數不相關(幼體： rs=0.30，P=0.18，N=22；成體：rs=0.30，P=0.18，N=22，圖八)，在食物添加時，內寄生蟲量與幼體子代數呈正相關，與成體子代數不相關(幼體：rs=0.32，P=0.05，N=39；成體：rs=0.22，P=0.19，N=39，圖八)。雄性個體在無添加食物時，內寄生蟲量與子代數不相關(幼體：rs=0.20，P=0.33，N=26；成體：rs=0.20，P=0.33，N=26，圖九)，在食物添加時，內寄生蟲量與子代數呈正相關(幼體：rs=0.29， P=0.03，N=57；成體：rs=0.26，P=0.05，N=57，圖九)。雌性個體在無添加食物時，內寄生豐富度與子代數不相關(幼體：rs=0.001， P=0.99，N=22；成體：rs=0.001，P=0.99，N=22，圖十)，在食物添加時，內寄生蟲豐富度也與子代數不相關(幼體: rs=0.20，P=0.23， N=39；成體：rs=0.10，P=0.56，N=39，圖十)。雄性個體在無添加 14.

(21) 食物時，內寄生蟲豐富度與子代數不相關(幼體：rs=0.12，P=0.55， N=26；成體：rs=0.12，P=0.55，N=26，圖十一)。在食物添加時內寄生蟲豐富度與子代數也不相關(幼體: rs=0.09，P=0.49，N=57；成體：rs=-0.04，P=0.79，N=57，圖十一)。雌性個體之內寄生蟲量與幼體子代體重沒有相關(女兒：rs=-0.14，P=0.75，N=8；兒子： rs=-0.43，P=0.16，N=12)，內寄生蟲豐富度與幼體子代體重也沒有相關(女兒：rs=-0.14，P=0.74，N=8；兒子：rs=-0.45，P=0.14，N=12)。雌性個體之內寄生蟲量與成體女兒體重呈負相關，與兒子不相關(女兒：rs=-0.53，P=0.03，N=17；兒子：rs=0.12，P=0.61，N=21)；內寄生蟲豐富度與成體女兒體重不相關與兒子體重呈正相關(女兒： rs=-0.32，P=0.21，N=17；兒子：rs=0.58，P=0.01，N=21)。雄性個體之內寄生蟲量及豐富度與成體女兒體重不相關(內寄生蟲量： rs=-0.18，P=0.46，N=20；豐富度：rs=-0.10，P=0.68，N=20)；與幼體兒子體重不相關(內寄生蟲量：rs=0.12，P=0.77，N=8；豐富度： rs=-0.40，P=0.33，N=8)，與成體兒子體重也不相關(內寄生蟲量： rs=-025.，P=0.29，N=20；豐富度：rs=0.18，P=0.44，N=20)。. 15.

(22) 討論本研究結果顯示移除內寄生蟲對台灣森鼠雌雄兩性個體之子代數皆沒有影響，而食物資源添加能增加雌雄兩性個體的子代數。同時，內寄生蟲與食物資源間沒有交互作用。在子代體重方面，內寄生蟲與食物資源皆不影響台灣森鼠的子代體重。雖然許多研究指出內寄生蟲對宿主生存、身體狀況或繁殖表現有負面影響(Watson 2013 回顧) 或是發現內寄生蟲量或豐富度與子代數呈負相關(Gooderham & Schulte-Hostedde 2011; Patterson & Schulte-Hostedde 2011)，進而推論內寄生蟲對宿主的適存度有負面的影響，但也有研究發現內寄生蟲對宿主子代數並沒有負面影響(Bloomer et al. 1995; Raveh et al. 2011)。寄生蟲的生存受到宿主提供的資源與免疫反應的限制，當宿主身體狀況良好時，雖然提供了寄生蟲良好的資源，但同時也可能具有較高的免疫反應對抗寄生蟲；相反的，若宿主身體狀況不佳，雖然會降低免疫反應，但同時也減少了寄生蟲的養分來源(Bize et al. 2008)。內寄生蟲長期生活在宿主體內，且成體終其一生不更換宿主，所以相較於外寄生蟲可能更受宿主身體狀況的影響，因此在不影響養分獲得以及宿主免疫的攻擊下，寄生蟲可能會降低對宿主的傷害。此外，小型哺乳動物為許多掠食者的獵物，具有較高的死亡率，其生活史策略可能傾向較早性成熟、較早生產，並在短時間哺育較大的窩仔數(Promislow & Harvey 1990; Chaoniv 1991)。因此，或許內寄生蟲對於繁殖策略傾向最大化子代數的物種而言，輕微的身體狀況影響，並不會造成繁殖上嚴重的負面效應。除此之外，還有其他可能的影響因素：(1)本研究當中只針對腸道寄生蟲給予處理，並未考慮其他寄生蟲的影響。例如，外寄生蟲也可能影響宿主的生存與繁殖，Lin等人(2014)針對同一個台灣森鼠族群 16.

(23) 的研究發現，外寄生蟲恙蟎(Trombiculid mites)寄生量與森鼠個體繁殖活動成負相關。因此，外寄生蟲可能對森鼠繁殖表現有負面影響，進而干擾我的實驗結果。(2)Ivermectin主要移除的是線蟲，雖然線蟲是台灣森鼠腸道中主要的寄生蟲類型(附錄二)，但腸道中還有其他不同類型之寄生蟲或是微生物，可能會與線蟲競爭或共生。過去即有研究指出，Ivermectin降低線蟲盛行率的同時會使絛蟲盛行率上升 (Padersen & Antonovics 2013)。本研究中，藥物處理後線蟲量顯著低於控制組，但是雌性的絛蟲量在藥物處理組則顯著高於控制組(附錄三)。因此絛蟲量的上升，可能造成雌性宿主負面的影響，使得藥物對宿主的正負影響相互抵消。然而雄性個體並未發現藥物處理組絛蟲量上升的現象，因此這個機制不適合解釋雄性子代數不受寄生蟲影響的結果。(3)由於本研究對象為野外族群，Ivermectin的藥效會受到個體在野外持續受感染的現象而削弱，因此可能會低估寄生蟲對宿主繁殖的影響。寄生蟲對宿主的影響也可能是繁殖策略的改變，而非適存度的高低。本研究將近5個月的野外實驗，對於壽命往往不超過一年的野外森鼠來說，5個月可能已包含許多成體一生中大部分可繁殖的時間，因此我所計算的個體子代數推測應相當接近個體一生的子代數，而非僅只一次繁殖的子代數。Lo和Shaner(2015)的研究中便指出，腸道寄生蟲可能影響雌性台灣森鼠繁殖投資的策略。此研究中發現，移除腸道寄生蟲且在兩個月中只繁殖一次的懷孕個體有較高的體重，懷孕個體的體重可能表示個體對子代的投資，因為體重越重的母親可能表示有越多的子代，或每一隻子代體重越重。同時也發現，移除寄生蟲的懷孕母鼠有較高的死亡率。生存與繁殖之間存在權衡的關係，當個體投資較高能量在繁殖時會降低其生存率(Stearn 1976)。所以，移除 17.

(24) 寄生蟲的雌性個體可能投資較多的能量在近期繁殖而降低了存活率，而沒有移除寄生蟲的雌性個體則可能延緩對繁殖的投資，維持較高的存活率，在這兩種情況下，個體一生的子代數可能相同。因此，寄生蟲可能使宿主生活史策略改變，導致我的研究中，並未發現寄生蟲對宿主繁殖表現有負面影響。許多研究結果顯示，增加食物資源能影響消費者的繁殖投資，進而影響其族群大小，以及族群波動(Boutin 1990；Prevedello et al. 2013；Ruffino et al. 2014)。本研究中食物資源提高了個體子代數，但對子代體重沒有影響，因此食物資源的增加，可能是透過增加一胎多子動物的子代數，影響族群數量與族群波動。然而，過去有研究認為添加食物是否影響個體繁殖表現，受到環境中原本食物資源量多寡的影響，例如低緯度地區被認為有較多的資源，因此個體繁殖表現或許較不受食物資源添加的影響(Ruffino et al. 2014)。本研究於低緯度、中海拔之次生針闊混和林進行，相較於溫帶或高山地區，應屬全年食物資源穩定的生態系統，但個體在食物資源的添加下，仍明顯提高子代數。顯示即使在低、中緯度地區，食物資源量可能還是對個體繁殖表現，甚至是族群動態有相當的影響。相較於雄性，雌性個體在懷孕哺乳時需消耗大量能量，繁殖可能受到環境資源的限制較大。然而本研究中，雌雄兩性在食物資源添加以及寄生蟲移除時反應相同，皆因食物資源添加提高子代數。顯示食物資源對於雄性個體繁殖的影響並不亞於雌性。本研究之親子鑑定結果可知台灣森鼠為多夫多妻的物種(附錄四)，在多夫多妻的物種中，雄性個體的繁殖成功與交配次數以及精子競爭有很大的關連(Wolff & Sherman 2007)。食物資源與養分的獲得能提高雄性精子的產量 (Martin et al. 2010)，因此對台灣森鼠雄性而言食物資源可能也是影 18.

(25) 響繁殖很重要的因子。雌雄兩性在無食物添加組的寄生蟲量與子代數不相關；食物添加組雌性個體寄生蟲量與幼體子代數呈正相關，食物添加組雄性個體寄生蟲量與子代數呈正相關。由本研究結果得知，食物資源能提高個體子代數。但對雌性個體而言，懷孕哺乳需耗費大量能量，因此當子代數增加時，能量的需求可能使得雌性個體無法避開有寄生風險的食物區塊(Smith et. al. 2006)，因此擁有較多子代的雌性個體可能會有較高的寄生蟲感染風險。而雄性個體在食物添加下，可能透過增加交配的次數提高子代數，在較多的接觸下可能同時提高了寄生蟲感染的風險。因此在食物添加組中，子代數增加的同時可能使寄生蟲量上升。另外，在個體感染之寄生蟲豐富度與子代數的關係中，雌雄兩性個體的寄生蟲豐富度，無論在有無食物添加下，皆與子代數不相關。從這些相關性的結果得知，寄生蟲量、寄生蟲豐富度與各體子代數的關係，可能是正向的或是沒有相關性，如此也間接呼應操作實驗的結果 ─內寄生蟲可能不會對宿主整體的繁殖有負面影響。本研究結合了食物資源與寄生蟲雙因子，探討兩者對宿主繁殖表現的影響，以及其交互關係。食物資源添加能提高個體總子代數，但不影響子代體重；而腸道寄生蟲對個體總子代數，以及子代體重沒有影響。過去許多研究認為寄生蟲對宿主為負面的影響(Neuhaus 2003; Gooderham & Schulte-Hostedde 2011; Patterson & Schulte-Hostedde 2011; Patterson et al. 2013)，但這些研究也多為相關性研究或是短期研究。相關性研究不能醭清寄生蟲與宿主繁殖間的因果關係；短期研究則專注於宿主單次或一年內的繁殖，可能會混淆寄生蟲對宿主生活史策略與宿主適存度的影響。本研究結果顯示對於壽命短且短時間大量繁殖的物種而言，內寄生蟲對宿主繁殖的影響. 19.

(26) 或許較小。另外，寄生蟲對宿主繁殖表現的影響比起食物資源，也可能涉及更複雜的生活史策略機制；因此，未來研究若能加入繁殖投資 (例如：懷孕次數、窩仔數)與親代存活率，以及外寄生蟲對宿主繁殖的影響等，將有助於我們更深入了解寄生蟲如何影響宿主的生活史策略。. 20.

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(30) 表一、10 個親子鑑定微衛星基因座 Locus name 2A2910 4A2131 5A672 5B59 6A496 8A472 9B878 14A594 17A410 17A501. Primer sequence 5’-3’. Repeat motif. Product size. N. NA. HO. HE. PHWE. F: *CATCAATTTATCCTCCACCCTC R: ATTTGTAGCTTGGGTTTGTCTC F: +ATTTCCATTCCAGAATCTCCAC R: TTGTTTAAAGGTGCAAGGTTTG F: *AAAGGTTTACAACTCCATACCC R: GAAGGAGTAAGATGCACAGAAC F: ATGCTGGTATTGTGTAGGATTG R: +TTAGTGTAGAGGAATGAGAGGC F: GTAAAGTTGTGCAATGTCAGC R: *TATAATGTCCTAGCTCTGTAGG F: AAAGGGAGGAGGAAGAAAGAAC R: +CCATTAGCACCATCTCTATTCG F: +AAGAGACAGTATTGAAAGCATG R: AGCTGAATTTACTCCAAGCATC F: CCTATGGAAGCTTTGTGAGTTG R: +ATAATTCAACCAAACCGTGTCC F: ACATATCTAGTTTCAAGCCAGC R: *CAAGTCTCATTGGGTCTATCTG F: *AGAGAATACAATATGGCACTGC R: ATAGTACCTCAGAACTCCAAGG. AAAC. 309~330. 382. 6. 0.560. 0.556. ACTC. 119~145. 380. 14. 0.818. AGAT. 218~258. 382. 9. AAAG. 174~201. 383. AGAT. 433~465. ACAT. 0.492. Null present no. non-exclusion probability 0.833. 0.839. 0.066. no. 0.471. 0.715. 0.718. 0.063. no. 0.685. 21. 0.880. 0.910. 0.259. no. 0.310. 377. 9. 0.782. 0.780. 0.997. no. 0.606. 345~405. 370. 13. 0.735. 0.844. 0.001. no. 0.471. AGAT. 391~423. 363. 9. 0.705. 0.851. 0.001. no. 0.466. ACAG. 445~475. 337. 15. 0.902. 0.905. 0.921. no. 0.327. AAAC. 142~177. 381. 15. 0.879. 0.857. 0.629. no. 0.446. ACAT. 333~368. 354. 13. 0.808. 0.853. 0.001. no. 0.463. *表示連接 CAG tag，+表示連接 M13R tag N 為樣本數，NA 為對偶基因數量，HO 為 heterozygosities 之觀測值，HE 為 heterozygosities 之期望值，PHEW 為哈溫平衡檢測。. 24.

(31) 表二、台灣森鼠寄生蟲移除效果的檢測。給予 Ivermectin 進行寄生蟲移除，以每克糞便中寄生蟲卵數表示寄生蟲移除效果。 Num DF Den DF. Chi-square. P. 寄生蟲移除. 1. 143. 15.95. <0.01. 性別. 1. 143. 0.62. 0.43. 寄生除移除 X 性別. 1. 143. 5.10. 0.02. (此分析樣本數：147). 25.

(32) 表三、寄生蟲移除與食物添加對台灣森鼠幼體子代數的影響。 Num DF. Den DF. F. P. 寄生蟲移除. 1. 316. 1.21. 0.27. 食物添加. 1. 316. 22.28. <0.01. 性別. 1. 316. 2.88. 0.09. 寄生蟲移除 X 食物添加. 1. 316. 0.06. 0.81. 寄生蟲移除 X 性別. 1. 316. 0.03. 0.87. 食物添加 X 性別. 1. 316. 2.11. 0.15. 寄生蟲移除 X 食物添加 X 性別. 1. 316. 0.28. 0.60. (此分析樣本數：324). 26.

(33) 表四、寄生蟲移除與食物添加對台灣森鼠成體子代數的影響。 Num DF. Den DF. F. P. 寄生蟲移除. 1. 316. 0.24. 0.63. 食物添加. 1. 316. 14.98. <0.01. 性別. 1. 316. 4.09. 0.04. 寄生蟲移除 X 食物添加. 1. 316. 0.30. 0.59. 寄生蟲移除 X 性別. 1. 316. 0.01. 0.91. 食物添加 X 性別. 1. 316. 2.84. 0.09. 寄生蟲移除 X 食物添加 X 性別. 1. 316. 0.08. 0.78. (此分析樣本數：324). 27.

(34) 表五、寄生蟲移除對台灣森鼠之幼體子代體重的影響。 Num DF. Den DF. F. P. 寄生蟲移除. 1. 18.28. 0.36. 0.56. 親代性別. 1. 18.28. 0.37. 0.55. 寄生蟲移除 X 親代性別. 1. 18.28. 0.02. 0.90. (此分析樣本數為 39). 28.

(35) 表六、寄生蟲移除與食物添加對台灣森鼠之成體子代體重的影響。 Num DF. Den DF. F. P. 寄生蟲移除. 1. 90.39. 0.03. 0.87. 食物添加. 1. 93.13. 1.34. 0.25. 親代性別. 1. 90.43. 0.01. 0.93. 寄生蟲移除 X 食物添加. 1. 93.07. 0.51. 0.48. 寄生蟲移除 X 親代性別. 1. 90.94. 0.47. 0.50. 食物添加 X 親代性別. 1. 90.48. 1.43. 0.24. 1. 96.43. 0.22. 0.64. 寄生蟲移除 X 食物添加 X 親代性別 (此分析樣本數為 135). 29.

(36) 圖一、實驗樣地。紅色線以內範圍為樣區，區分為黃色、綠色及藍色三個區塊，綠色點為樣點，黃色圓點為食物站位置。北. 50 公尺. 30.

(37) 圖二、寄生蟲移除對台灣森鼠寄生蟲量的影響。 F 為雌性，M 為雄性。白色長條圖為控制組，灰色長條圖為寄生蟲移除組。有*標示的組別表示寄生蟲量有顯著差異，長條圖底部為各組樣本數。. *. 36. 27. 42. 31. 42.

(38) 圖三、寄生蟲移除對台灣森鼠寄生蟲豐富度的影響。 (a)雌性。(b)雄性。W 為控制組，I 為寄生蟲移除組。 (a) 2≤ 平均寄生蟲豐富度 1≤ 平均寄生蟲豐富度<2 平均寄生蟲豐富度<1. (b). 32.

(39) 圖四、食物添加與寄生蟲移除之台灣森鼠個體幼體子代數。 (a)雌性。(b)雄性。NF 為無食物添加組，F 為食物添加組。白色成長條圖為控制組，灰色長條圖為寄生蟲移除組。長條圖底部為各組樣本數。 (a) 子代數(least squares mean). 1.4 1.2. 1 0.8 0.6 0.4. 0.2. 35. 36. 31. 29. 0. NF. F. (b) 子代數(least squares mean). 1.4 1.2. 1 0.8 0.6 0.4. 0.2 0. 42. 55. 41. 55. NF. F. 33.

(40) 圖五、食物添加與移除寄生蟲之台灣森鼠個體成體子代數。 (a)雌性。(b)雄性。NF 為無食物添加組，F 為食物添加組。白色成長條圖為控制組，灰色長條圖為寄生蟲移除組。長條圖底部為各組樣本數。 (a) 子代數(least squares mean). 1 0.8. 0.6 0.4. 0.2 0. 35. 36. 31. NF. 29 F. (b) 子代數(least squares mean). 1 0.8. 0.6 0.4 0.2 0. 42. 55. 55. NF. 41 F. 34.

(41) 圖六、寄生蟲移除組與控制組台灣森鼠個體之幼體子代體重。 F 為雌性、M 為雄性。白色長條圖為控制組，灰色長條圖為寄生蟲移除組。長條圖底部為各組樣本數。. 15. 9. 11. 35. 4.

(42) 圖七、寄生蟲移除與食物添加對台灣森鼠個體之成體子代體重的影響。 (a)雌性。(b)雄性。NF 為無食物添加組，F 為食物添加組。白色成長條圖為控制組，灰色長條圖為寄生蟲移除組。長條圖底部為各組樣本數。 (a). 13. 9. 23. 22. 13. 14. 23. 18. (b). 36.

(43) 圖八、台灣森鼠雌性個體子代數與寄生蟲量之相關。 (a)幼體。(b)成體。空心圓為食物添加組，三角形符號為無食物添加組。 (a). (b). 37.

(44) 圖九、台灣森鼠雄性個體子代數與寄生蟲量之相關。 (a)幼體。(b)成體。空心圓為食物添加組，三角形符號為無食物添加組。 (a). (b). 38.

(45) 圖十、台灣森鼠雌性個體子代數與寄生蟲豐富度之相關。 (a)幼體。(b)成體。空心圓為食物添加組，三角形符號為無食物添加組。 (a). (b). 39.

(46) 圖十一、台灣森鼠雄性個體子代數與寄生蟲豐富度之相關。 (a)幼體。(b)成體。空心圓為食物添加組，三角形符號為無食物添加組。 (a). (b). 40.

(47) 附錄一、給予哺乳之台灣森鼠(Apodemus semotus)一次性 Ivermectin 處理對幼體發育的影響一、實驗目的 Ivermectin 目前廣泛使用在動物醫療與畜牧業，能有效驅除腸道寄生蟲之線蟲。雖然 Ivermectin 對成體沒有毒性(Davis et.al. 1999)，但也有研究顯示給予懷孕哺乳大白鼠服用高劑量 Ivermectin(4mg/Kg/day)會造成幼鼠發育遲緩或死亡，而且哺乳時期對幼兒的影響可能大於懷孕時期(Poul 1988)。因此，本實驗欲檢測給予哺乳中母鼠 250μg Ivermectin(約相當於 0.5mg/Kg/day)，是否會影響幼兒成長發育與活動力。. 41.

(48) 二、材料方法捕捉、飼養與藥物處理於 2014 年 8 月至 11 月，於雪霸國家公園武陵森林遊憩區內的森林捕捉 9 隻懷孕母鼠。所有個體在捕捉後 48 小時內移至臺師大生命科學系動物飼養中心。每隻個體皆獨立飼養於飼養箱內，給予遮蔽所、滾輪以及充足的水(圖一、a&c)、食物與鹽塊，於每日 16:00-20:00 間進行餵食、身體狀況觀察，並且兩天測量一次體重。所有捕捉個體在分娩後 24 小時內，隨機分配為給予藥物組與控制組，藥物組給予 250μg Ivermectin(50μl volume)，控制組給予清水。兩組分別有 5 及 4 隻個體。生產前至幼鼠 7 日齡皆設置針孔攝影機，透過監視器觀察，降低干擾(圖一、b)。分娩後 24 小時內我進行了窩仔數控制，將每窩窩仔數調整為 4 隻幼鼠(有兩窩原本就只產下 3 隻幼鼠)，針對原窩仔數超過 4 隻的情況，移除多餘個體(不健康個體優先移除，例如體重特別輕、明顯血液循環不佳或肢體發展有問題的個體，每隻個體狀況相近，則隨機移除)。調整窩仔數的原因是為了避免不同窩仔數本身影響幼鼠發育，且過去研究顯示實驗室環境下森鼠每窩平均產 4 隻幼鼠(Lin & Shiraishi 1992)，因此窩仔數 4 隻應為合理的數量。以分娩日為幼鼠 1 日齡，於第 9 日齡後使用食用色素於幼鼠四肢上色(圖一、d)，做為暫時性標記，其後每兩天觀察補色。實驗結束後，9 隻母鼠中除了兩隻不明原因死亡外，其餘皆於原捕捉地放回；34 隻幼鼠中除了 6 隻在實驗結束後不明原因死亡外，其餘皆在 24 日齡至 36 日齡，於母親捕捉地釋放。. 42.

(49) 圖一、台灣森鼠飼養環境、監視系統與幼體標示。. a.飼養環境. b.針孔攝影監視. c.飼養箱內環境. d.個體標示. 43.

(50) 餵食之食物種類、供給量與營養組成食物包含每日 3g 根莖類、4g 新鮮蔬菜、4g 新鮮水果、5.4g 穀物，以及 1.6g 動物性蛋白質(每週食物供給量見表一)。每日餵食總量為 18g，哺乳母鼠(分娩後至幼鼠離巢)食物量增加為 1.5 倍，總量為 27g。(各食物營養成分詳見表二) 表一、台灣森鼠餵食之食物種類與每日供給量。食物種類. 各食物每日供給量週一、四. 週二、五. 週三、六. 週日. 根莖類. 地瓜(3g). 地瓜(3g). 地瓜(3g). 地瓜(3g). 蔬菜類. 玉米(4g). 發芽黃豆(4g). 南瓜(4g). 發芽黑豆(4g). 水果類. 蘋果(4g). 芭樂(4g). 奇異果(4g). 覆盆莓(4g). 穀物. 小薏仁(1.6g). 黑糯米(1.6g). 燕麥(1.6g). 小薏仁(1.2g). 黑糯米(1.6g). 燕麥(1.6g). 白米(1.6g). 黑糯米(1.2g). 燕麥(1.6g). 白米(1.6g). 小米(1.6g). 核桃(0.8g). 南瓜子(0.6g). 葵瓜子(0.6g). 松子(0.6g). 花生(0.8g). 麵包蟲(1g). 麵包蟲(1g). 麵包蟲(0.6g). 麵包蟲(1g). 蟋蟀(0.6g). 大麥蟲(0.6g). 水煮蛋白(1g). 小魚乾(0.6g). 動物性蛋白質. 44.

(51) 表二、食物營養成分分析。使用的食物種類及其營養成分，資料來源分述如下： 1. 熱量及營養成分皆為製造商所提供，各種類的製造廠商及產地分述如下: 種類. 製造廠商. 產地. 有機小薏仁. 正原國際有限公司(台北，臺灣). 加拿大. 有機黑糯米. 有機園生物科技有限公司(台中，臺灣). 臺灣. 有機燕麥. 正原國際有限公司(台北，臺灣). 美國. 青荷國際有限公司(桃園，臺灣). 澳洲. 有機小米. 綠指南貿易有限公司(台北，臺灣). 美國. 有機核桃. 簡單生活開發有限公司(桃園，臺灣). 美國. 有機南瓜子. 正原國際有限公司(台北，臺灣). 中國. 簡單生活開發有限公司(桃園，臺灣). 中國. 葵瓜子. 綠指南貿易有限公司(台北，臺灣). 中國. 松子. 簡單生活開發有限公司(桃園，臺灣). 中國. 花生. 富綠灣自然農場(台東，臺灣). 臺灣. 覆盆莓. 天時生技有限公司(台北，臺灣). 美國. 小魚乾. 經思確有限公司(台北，臺灣). 臺灣. 2. 熱量及營養成分參考行政院衛生福利部食品藥物管理署的臺灣地區食品營養成分資料庫(資料取得日期：2015/07/01) 3. Exotic Nutrition (http://www.exoticnutrition.com/limein.html) (資料取得日期 2015/07/01) 4. Examiner (http://www.examiner.com) (資料取得日期 2015/07/01). 45.

(52) 營養成分(%) 種類. 熱量. 蛋白質. (大卡/100 克). (crude protein). 小薏仁. 1. 黑糯米. 1. 燕麥. 1. 小米. 1. 核桃. 1. 南瓜子. 1. 葵瓜子. 1. 松子. 1. 花生. 1. 白米. 2. 地瓜. 2. 玉米. 2. 發芽黃豆. 2. 發芽黑豆. 2. 南瓜. 2. 蘋果. 2. 芭樂. 2. 奇異果. 2. 覆盆莓. 1. 麵包蟲. 3. 大麥蟲. 4. 蟋蟀. 4. 小魚乾蛋白. 2. 2. 脂肪. 碳水化合物. 水分. (crude fat). (carbohydrate). (water). 352. 10. 1. 78. 0. 347. 9.3. 3.3. 70.1. 0. 379. 13.1. 6.5. 67.7. 0. 390. 11.5. 10.1. 62.2. 0. 378. 11. 4.2. 72.8. 0. 702.4. 15.2. 65.2. 13.7. 0. 550. 32. 45. 5. 0. 607. 28.3. 47.1. 17.6. 0. 570. 23. 50. 17. 0. 596. 23. 48. 18. 0. 537. 31.3. 35.6. 2.8. 0. 183.1. 3.1. 0.3. 41. 0. 113.7. 1.8. 0.2. 25.4. 71.7. 106.9. 3.3. 2.5. 17.8. 75.7. 27.4. 5.4. 1. 1.3. 91.7. 68.9. 7.4. 2. 8.3. 81.3. 49. 1.7. 0.2. 11.1. 86.4. 51.6. 0.2. 0.1. 13.9. 85.5. 37.3. 0.7. 0.1. 9.6. 89.2. 55. 1.1. 0.2. 13.8. 84.2. 52. 1.2. 0.7. 11.9. _註一. 135. 49.6. 27.2. 6.9. _註一. 575.5. 46.8. 42. 2.6. _註一. 455.2. 70.6. 22.8. _註一. _註一. 335. 69.2. 4.4. _註一. 16.1. 49.1. 10.9. 0.2. 0.7. 87.6. 註一、無提供含量資訊. 46.

(53) 幼鼠發育觀察於 9 日齡至 23 日齡每兩天測量一次體重。同時於 9 日開始觀察發育狀況(是否長毛、是否開眼、是否長上門牙與下門牙、耳孔是否打開；圖二、a&b)、翻身(surface righting reflex，使幼鼠腹面朝上姿勢，測其翻身成功的秒數，四肢皆接觸地面為成功翻轉，若花費時間超過 30 秒，則為未成功翻身，重複三次，直到三次中有兩次低於兩秒時那天結束實驗)、爬行(locomotion，個體能運用四肢移動，個體可爬行後即可結束實驗)，並記錄其日齡。圖二、台灣森鼠幼鼠發育紀錄。. a.長牙(門牙破出牙齦). b.耳孔開. 47.

(54) 幼鼠肢體協調與活動力幼鼠於 21 日齡與 23 日齡進行 open-field activity 實驗以檢測藥物對自發性本能行為的影響，實驗進行方式為將個體置於 70X70X70cm 的壓克力箱內，以 EthoVision v2.3 (Noldus)紀錄移動軌跡、外圍與中心停留時間比例(中心區域為總面積四分之一)，同時觀察記錄站立、攀爬、跳躍、理毛、排便次數。實驗總共進行 15 分鐘，擷取中間 5 分鐘進行分析(圖三)。圖三、台灣森鼠幼鼠肢體協調與活動力實驗。. 70 公分 70 公分. a.行為實驗壓克力箱. b.移動軌跡(紅色線段). c.觀察行為. 48.

(55) 資料分析以 repeated measure ANOVA 檢測藥物對體重的影響；固定因子為藥物處理、日齡、母親分娩後體重，包含處理與日齡的交互作用；母親 ID(idenity)為隨機因子。以無母數 Kruskal-Wallis test 檢測 Ivermectin 對幼體發育、活動與行為的影響。. 49.

(56) 三、結果藥物對幼鼠體重成長影響藥物對幼鼠體重沒有影響，但給予藥物處理之幼鼠體重成長速率大於控制組(表三與圖四)。表三、藥物對台灣森鼠幼體體重成長的影響。 Num DF. Den DF. F. P. 處理. 1. 31. 2.17. 0.17. 日齡. 7. 224. 440.65. <0.01. 母親分娩後體重. 1. 31. 28.42. <0.01. 處理 x 日齡. 7. 224. 6.65. <0.01. Effect. 圖四、有無給予藥物之懷孕台灣森鼠的幼體體重成長曲線。實心黑線為給予藥物之個體的子代體重，灰色虛線為控制組個體的子代體重。. 體重(g, least sqares mean). 16 14. 12 10 8 6 4 2 0 9. 11. 13. 15. 17. 19. 日齡. 50. 21. 23.

(57) 藥物對幼鼠發育之影響控制組的幼鼠開耳孔的日齡較藥物組晚，除此之外，藥物對幼鼠發育日齡沒有影響(表四)。表四、藥物對台灣森鼠幼鼠發育日齡的影響。 Num DF Chi-square. P. 藥物組. 控制組. 平均日齡±標準差. 平均日齡±標準差. 長毛. 1. 0.00. 1.00. 9.0±0.0. 9.0±0.0. 上門牙. 1. 0.65. 0.42. 11.3±1.0. 11.6±1.0. 下門牙. 1. 2.05. 0.15. 11.0±0.7. 11.4±0.8. 耳孔. 1. 4.95. 0.03. 13.0±0.0. 13.5±0.9. 開眼. 1. 0.34. 0.56. 15.4±0.9. 15.6±1.0. 翻身. 1. 2.04. 0.15. 9.2±0.6. 9.6±1.0. 爬行. 1. 0.01. 0.91. 11.0±1.7. 11.3±2.2. 51.

(58) 藥物對幼鼠肢體協調與活動力影響藥物對 21 日齡幼鼠部分肢體協調與活動力有影響(內圈停留時間較長、理毛次數較多)，但這些影響在 23 日齡時即消失(表五)。因此整體來說藥物組與控制組幼鼠有相同的肢體協調與活動力。. 52.

(59) 表五、藥物對台灣森鼠幼鼠肢體協調與活動力的影響。藥物組. 控制組. (平均值±標準差). (平均值±標準差). 0.78. 2208.72±922.78. 2327.71±1396.71. 4.96. 0.03. 0.15±0.11. 0.07±0.07. 1. 0.10. 0.75. 1.67±2.11. 2.56±3.41. 攀爬次數(次數/ 5min). 1. 0.93. 0.33. 32.39±13.96. 25.75±15.96. 跳躍次數(次數/ 5min). 1. 0.97. 0.32. 20.44±24.12. 29.94±24.96. 理毛次數(次數/ 5min). 1. 4.18. 0.04. 3.06±1.43. 1.94±1.29. 排便次數(次數/ 5min). 1. 2.41. 0.12. 3.78±2.18. 2.56±1.75. 1. 0.03. 0.86. 1669.17±864.85. 1578.05±740.64. 內外圈停留時間比(內/外). 1. 0.04. 0.85. 0.12±0.04. 0.21±0.16. 站立次數(次數/ 5min). 1. 1.94. 0.16. 0.78±1.48. 4.75±9.78. 攀爬次數(次數/ 5min). 1. 0.02. 0.88. 24.33±18.06. 23.13±13.95. 跳躍次數(次數/ 5min). 1. 0.02. 0.89. 14.61±14.61. 16.25±20.08. 理毛次數(次數/ 5min). 1. 2.62. 0.11. 3.28±2.92. 2.06±1.69. 排便次數(次數/ 5min). 1. 0.10. 0.75. 6.05±3.33. 6.00±2.85. DF. Chi-square. p. 1. 0.08. 內外圈停留時間比(內/外). 1. 站立次數(次數/ 5min). 日齡 21 總移動距離(cm). 日齡 23 總移動距離(cm). 53.

(60) 參考文獻 Davis, J.A., Paylor, R., McDonalod, M.P., Libbey, M., Ligler, A., Bryant, K. & Crawley, J.N. (1999). Behavior effect of ivermectin in mice. Laboratory Animal Science, 49, 288-296. Lin, L.K. & Shiraishi, S. (1992). Reproductive biology of the Formosan wood mouse, Apodemus semotus. Journal of the Faculty of Agriculture, Kyushu University, 36-3, 183-200. Poul, J.M. (1988). Effect of perinatal ivermectin exposure on behavioral development of rat. Neurotoxicology and Teratology, 10, 267-272.. 54.

(61) 附錄二、本研究樣地台灣森鼠之腸道寄生蟲盛行率(prevalence)為所有檢測個體中有感染寄生蟲的比例。寄生感染量(parasite load)以每克糞便寄生蟲卵數(FEC) 表示。本資料包含 147 隻個體(63 隻雌性個體，84 隻雄性個體)。盛行率寄生感染量中位數寄生蟲類型屬名 (感染個體數/總個體數) (5-95th 百分位) 線蟲(nematode) 0.10 (14/147) 0 (0-408) Trichuris spp. / Capillaria spp. 線蟲(nematode) 0.03 (4/147) 0 (0-0) Syphacia spp. 線蟲(nematode) 0.03 (5/147) 0 (0-0) Physaloptera spp. 線蟲(nematode) 0.96 (141/147) 3200 (128-26923) Strongyle nematodes 線蟲(nematode) 0.05 (7/147) 0 (0-0) Ascaris spp. 線蟲(nematode) 0.02 (3/147) 0 (0-0) Strongyloides spp. 絛蟲(cestode) 0.11 (16/147) 0 (0-544) Hymenolepis spp.. 55.

(62) 附錄三、Ivermectin 對台灣森鼠線蟲與絛蟲量的影響。為檢測 Ivermectin 是否對不同種類的內寄生蟲有不同程度的影響，我以 Generalized Liner Model 分別檢測藥物對每克糞便中線蟲 (nematode)與絛蟲(cestode)蟲卵數的影響。藥物處理、性別與其交互作用設為固定因子。結果顯示 Ivermectin 能有效降低線蟲量，但對條蟲的影響則會隨宿主性別而異(表一與圖一)。給予 Ivermectin 的雌鼠條蟲顯著高於控制組，但給予 Ivermectin 的雄鼠條蟲卻是顯著低於控制組。表一、Ivermectin 對台灣森鼠線蟲與絛蟲量的影響。線蟲 Num DF. Den DF. 條蟲. X2. P. X2. P. 藥物處理. 1. 142. 42.23. <0.01. 8.60. <0.01. 性別. 1. 142. 7.27. 0.01. 2.02. 0.15. 藥物處理 X 性別. 1. 142. <0.01. 1.00. 59.24. <0.01. 56.

(63) 圖一、有無給予 Ivermectin 之台灣森鼠的線蟲與絛蟲量。 (a)線蟲。(b)絛蟲。F 為雌性，M 為雄性。白色長條圖為控制組，灰色長條圖為寄生蟲移除組。有*標示的組別表示寄生蟲量有顯著差異。 (a). *. *. 36. 42. 27. 42. (b) *. *. 36. 27. 42. 57. 42.

(64) 附錄四、台灣森鼠之多夫多妻婚配結果。 (a)多夫，同一窩仔來自 1-2 位父親。利用幼體的捕捉時間以及相近捕捉樣點可推測為同一窩的子代。 Litter ID. Mother ID. 1. 209388. 2. 237302. 3. 237323. 4. 237327. 5. 237389. Father ID. Offspring ID. 209307. Offspring First capture date. First capture site. First capture age. 11835. 2013/08/26. 24∘38’ 79.6’’ N, 121∘18’ 32.8’’ E. juvenile. 237367. 12680. 2013/08/25. 24∘38’ 77.4’’ N, 121∘30’ 90.7’’ E. juvenile. 209225. 12647. 2013/06/25. 24∘39’ 09.4’’ N, 121∘30’ 83.8’’ E. juvenile. 237338. 12662. 2013/06/26. 24∘39’ 10.9’’ N, 121∘30’ 89.7’’ E. juvenile. 12660. 2013/08/25. 24∘38’ 75.6’’ N, 121∘30’ 84.8’’ E. juvenile. 12691. 2013/08/25. 24∘38’ 77.1’’ N, 121∘30’ 87.7’’ E. juvenile. 12699. 2013/08/27. 24∘38’ 78.2’’ N, 121∘30’ 83.0’’ E. juvenile. 237386. 12695. 2013/08/17. 24∘39’ 17.1’’ N, 121∘30’ 86.3’’ E. juvenile. 237396. 12650. 2013/08/18. 24∘39’ 20.0’’ N, 121∘30’ 89.0’’ E. juvenile. 209690. 12614. 2013/09/24. 24∘38’ 76.8’’ N, 121∘30’ 81.7’’ E. juvenile. 209654. 12602. 2013/09/24. 24∘38’ 78.1’’ N, 121∘30’ 81.4’’ E. juvenile. 237345. 58.

(65) (b)多妻，單一雄性與 1-3 位雌性個體配對，並產下子代。 No.. Father ID. 1. 209225. 2. 209681. 3. 4. 5. 6. 237345. 237367. 237378. 237386. Mother ID. Offspring ID. 237302. Offspring First capture date. First capture age. 12647. 2013/06/25. juvenile. 237325. 209328. 2013/08/13. adult. 237379. 209379. 2013/07/29. adult. 209696. 209366. 2013/07/26. adult. 12660. 2013/08/25. juvenile. 12691. 2013/08/25. juvenile. 12699. 2013/08/27. juvenile. 209383. 209418. 2013/09/24. adult. 209388. 12680. 2013/08/28. juvenile. 12690. 2013/07/26. juvenile. 209338. 2013/07/27. adult. 209373. 209456. 2013/09/24. adult. 237327. 12695. 2013/08/17. juvenile. 237301. 12666. 2013/07/31. adult. 209370. 209492. 2013/09/24. adult. 237323. 237323. 59.