行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
家畜選性繁殖技術之開發 II. 牛與豬 SMCY 特異性抗體之製
備
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2313-B-110-006- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立中山大學生物醫學研究所 計畫主持人： 薛佑玲 計畫參與人員： 陳立人、蔡淵智、楊鎮榮 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
家畜選性繁殖技術之開發II. 牛與豬SMCY 特異性抗體之製備 計畫類別：√ 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：91－2313－B－110－006－ 執行期間：91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 計畫主持人：薛佑玲 共同主持人：陳立人 計畫參與人員：蔡淵智、楊鎮榮。 本成果報告包括以下應繳交之附件： □赴國外出差或研習心得報告一份 □赴大陸地區出差或研習心得報告一份 □出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 □國際合作研究計畫國外研究報告書一份 執行單位：國立中山大學、生物醫學研究所 中 華 民 國 九十三 年 二 月 十八 日一、中文摘要： 家畜、禽選性繁殖技術（sex pre-selection），生產期望性別的後裔，長久以 來一直為畜牧業者所努力與期待。經由雄性性別特異性基因（sex-specific loci） SMCY 的選殖與操作（manipulation），利用免疫方法，以製備性別特異性抗體 （anti-SMCY antibody）的方式結合哺乳動物帶有 Y 染色體的精子，分離攜帶 X 與 Y 染色體精子，繼而進行人工受精，以達家畜選性繁殖是本研究之目標。 乳牛與豬之 SMCY 基因 cDNA 估計在 3.5~4.5 Kb 之間，在本研究的第一年計畫 中，完成部分cDNA 選殖與定序工作。所獲得牛與豬之 SMCY 部分 cDNA 序 列，旋即利用生物資訊學 motif-based 演算法原理，進行 T 細胞抗原決定區（即 epitopes）之預測，並與其他哺乳動物 SMCY 基因組成進行比對。經鑑識 epitope 區之 DNA 序列以 PCR 方式予以增殖，並選殖至 PCR II (TA cloning) 與 pcDNA3.1 表現型載體，再轉染至 Cos-7 哺乳動物細胞株，進行免疫反應，並 進一步進行抗原抗體表現測試。本年計畫以測試模式動物小鼠 SMCY 抗體進 行選性繁殖之可行性。構築於pcDNA3.1，具特異性 SMCY epitope 表現載體， 則分別以DNA 疫苗（DNA vaccine），亦即直接皮下注射帶有SMCY epitope 之 重組載體以產生抗體或轉染至哺乳動物細胞株後，以細胞免疫方式進行動物抗 體製備。所得之抗體先以 Western blotting 法分析其特異性，並釐清其在經精 子細胞表現位置，繼而評估此分子免疫法應用於家畜攜帶 X 或 Y 精子區分之 可行性。 關鍵詞：選性繁殖、SMCX、SMCY、抗體。 二、英文摘要：
Sex pre-selection in livestock offspring to produce dairy cows and specific male and females lines for heterosis in swine are important economic goals in animal husbandry. SMCY (Selected Mouse cDNA on the Y chromosome) encodes one of the H-Y antigens that cause antibody response from male individual when skin grafting even between inbred lines. A further application on sex pre-selection reproductive system using immunological method against chromosome Y-specific gene, SMCY epitopes, in domestic mammals has been proposed here. The first year of this project was to clone the bovine and porcine SMCY cDNA. Partial porcine and bovine were cloned and sequenced successfully. The objectives of this investigation (the 2nd year) was to identify potential bovine and porcine SMCY cDNA epitopes via bioinformatics methodologies, i.e., motif-based algorithms, and followed by the generation of bovine and porcine SMCY epitope-specific antibodies. The identified, potential SMCY epitopes were then be amplified by PCR technology, cloned into PCR II and further subcloned into pcDNA3.1 expression vectors that carry CMV promoter. Recombinant expression vectors that contain specific SMCY epitope were subcutaneous injection directly into rabbits to generate specific antibodies or transfected into Cos-7 mammalian cell lines for expression and further subcutaneous injection to generate specific antibodies. The mouse was used as our model organism for mammals to test the feasibility of this technology. The
三、計畫緣由與目的： 近年來，經濟動物生產事業隨著各項生物科技及生殖技術之蓬勃發展，已經不 再挶限於傳統的育種與選拔工作。「選性繁殖」長久以來為畜牧生產業著一直期望之 目標，希望能控制並操縱家畜禽後代之性別以生產具有經濟價值之子畜。就酪農業者 而言，酪農需要母牛來泌乳，因此酪農對於繁殖母牛的期望較公牛為高；生產高品質 的鵝肝及鵝肉的業者則是偏好公鵝；種豬業著則期望可藉由選性繁殖篩選出品系良好 之公豬與母豬品系。因此，能正確的操作選性繁殖，無疑對整個畜產業之產值及全世 界之食物供給皆是非常重要。 目前胚性別鑑定以控制哺乳類動物性別的技術已有相當程度之進展。主要是以 分離自發育六至七天的胚葉細胞，進行體外的分子性別鑑定後，再以胚移置 (embryo transfer) 的方式進行生產特定性別的後裔。此種使用分子鑑定以檢定性別的檢出率 低、檢定時間長，往往也因胚胎受損而使胚移置後受胎率降低。另一種控制性別的技 術為將精液中帶有X 及 Y 染色體的精子分離，再將已分離分別攜帶 X-及 Y-染色體精 子與卵結合進行體外授精及胚移置，即可得到所期望性別之子畜。目前唯一成功將攜 帶X-及 Y-染色體精子分離的為美國 Johnson 等人，依據攜帶 X-及 Y-染色體精子的核
苷酸含量不同之原理利用流式細胞儀分析系統進行分離，其準確率高達90%以上。但 此一方式在單位時間內可以檢定的精子數量少以及處理與回收的精子數目有限，尚不 足以直接應用於人工授精所需之精子劑量。同時，由於流式細胞儀相當昂貴、精子樣 本遭受螢光和雷射照射傷害等因素使得此方式未能普及。因此如何迅速地一次分離足 夠在正常人工授精繁殖系統下的精子數目，而且不損及精子之活力與型態，更不影響 其授精後的生育能力，為目前研究學者所努力之目標。 免疫分離為目前用來分離帶有 X-及 Y-染色體精子最具潛力之方式，藉由攜帶 X-或是 Y-染色體精子表面之特異蛋白質進而製備抗體進行分離。而 H-Y 抗原為哺乳 類動物Y 染色體上所會表現的一段特有的胜肽片段，並於 1994 年由 Agulink 等人於 小 鼠 之 Y 染 色體 發 現帶有 此 H-Y 抗 原 之 Smcy (Selected mouse cDNA on Y chromosome ) 基因。本研究之目的即為利用生物資訊法及分子生物法選殖牛與豬之
SMCX 及 SMCY 基因，並進一步利用生物資訊學之方式推測牛與豬 SMCY 之 H-Y 抗
原之胜肽片段，期許未來應用於選殖繁殖系統上。本研究並同時以小鼠為模式動物，
藉以測試該策略之可行性。未來期應用此已分離之攜帶X-及 Y-染色體之精液於畜產
業，以建立單一期望性別仔畜的商業生產體系。
四、結果與討論：
1. 利用生物資訊法搜尋 EST 基因資料庫荷蘭乳牛及台灣黑豬 SMCX/SMCY 基因 至2002 年十二月為止，dbEST 共計有牛 (Bos taurus) 348,859 個 EST；豬 (Sus scrofa) 285,432 個 EST 序列；而 TIGR Gene Index 則亦包括相對量的 EST 序列，此些 ESTs 係我們賴以進行生物序列探勘的最佳來源。因此將人類 SMCX (NM_004187) 與 SMCY (NM_004653) 基因利用 NCBI Blast_N 進行 dbEST 之比對。比對結果得到數 十個ESTs 與牛 SMCX 具有高度的同源性；數十個 ESTs 與豬 SMCX 及二個 EST 與豬 SMCY 亦具有高度同源性的序列，此些序列經轉譯成蛋白質系列後僅留下在蛋白質序 列層面上與 SMCY 具有高度相似者進一步進行 EST contigs 組合。在牛與豬的 ESTs 所可以組合的序列含蓋整個 SMCY 序列，均達 80-90％之間，顯示 ESTs 確為選殖新 穎基因重要且頗具價值的來源。
2. 分子生物法選殖荷蘭乳牛與台灣黑豬之 SMCY
長 (full length cDNA) 選殖。此外，一個具有高力價（3.8x107）的豬睪丸cDNA 庫（黃 等、未發表資料）亦在本實驗中，利用Dig（Digoxigenin, random-primed DNA labeling reactions with DIG-11-dGTP）呈色法分別以二個豬的 SMCY cDNA 片段（451、688bp） 與GAPDH cDNA (1,000 bp)作為正對照組（positive control），進行 cDNA 庫的篩選， 由於睪丸為高度表現SMCY 基因者，此 cDNA 庫力價甚高，預計篩選到 SMCY cDNA 的機率很高。Agulnik 等人於 1997 年所發表利用馬的白血球 (lymphocyte) 進行 SMCX 與 SMCY 之 RT-PCR。因此，在本實驗中亦以牛與豬血液中之白血球萃取 RNA 進行 選殖。由於部份牛與豬之 SMCX 已於本實驗中自 ESTs 序列獲得，因此取雌性個體之 RNA 利用引子對 BovSMCXY-F/BovSMCXY-R 及 PorSMCXY-F/ PorSMCXY-R 進行選 殖與定序以確認其序列。由於雄性個體同時具有 SMCX/SMCY 同源高保留基因，因 此本實驗利用RT-PCR 之方式將所得到之雄性 SMCX/SMCY 或雌性 SMCX 基因片段 利用載體接合分別選殖進入大腸桿菌 (E. coli) 中，再予以定序及比對分析序列。藉 由定序分析時鹼基 (base) 之重疊 (overlap)，並與雌性個體 SMCX 進行比較，以獲得 牛與豬之 SMCY 序列。所選用的 DNA 片段選殖系統為 pGEM-T Easy Vector System (Promega, USA)。載體中包含抗氨比西林基因 (ampicillin-resistant gene) 與β-半乳糖 酶 (β-glactosidase) 的 lac z 基因作為篩選，將有插入片段而破壞載體上之 lac z 基因 而導致呈現白色單一菌株挑出分析。利用此方式，每一段RT-PCR 之片段皆挑選至少 10 個單一菌株進行定序分析。所選殖之片段至少含蓋 SMCX/SMCY 之轉譯區，圖三 為公牛分別利用引子對BCxy1-F/ BCxy1-R 及 Bovxy2-F-/ Bovxy2-R 進行 RT-PCR 之電 泳圖，將此些片段回收後進行TA cloning 選殖，並進行定序分析。
為了獲得 SMCX 及 SMCY 之全長 cDNA， 採用 Clontech SmartTM RACE cDNA Amplification Kit，RACE 之原理圖於附錄三。在豬的 RACE PCR 中選殖到 5’RACE， DNA 電泳圖附於圖四。在 UV box 下可以些微的看到 5’RACE 的電泳圖在 2,000bp 有 兩條條帶，一條較清楚；一條量較少，經由照片系統輸出，則是只能觀察到較明顯的 條帶。經過十個單一菌株之定序後，卻仍然只有豬SMCX 的序列，直到挑到 40 個單 一菌株時，才出現SMCY 的序列。porSMCY3-F 及 bovxy2-R 引子對經過擴增之後， 進一步確認。在進行豬3’RACE 時出現多條 DNA 條帶，分析小鼠及人之 SMCX/SMCY 基因序列發現在3’UTR (untranslate region) 的部分具有多段的 oligo dT，除此之外， 亦可能由於3’end 之序列產生二級結構造成干擾而無法利用 RACE 的方式進行選殖。 3. 荷蘭乳牛與台灣黑豬之 SMCX/SMCY 序列分析 將每段RT-PCR 之序列會挑選至少十個單一菌株。並利用載體上之 SP6 及 T7 引 子片段結合位置為定序反應之引子，繼而利用雙去氧核苷酸定序法定序插入之RT 片 段。本實驗之定序反應之產物經由成大醫院病理部之ABI377 自動定序儀 (PE-Applied Biosystems, USA) 電泳分析之。經由電腦判讀之核苷酸序列先經由人工方式比對所得 序列是否完整，並刪除載體部分序列。利用Clustal W 及 SeqWeb 軟體進行多重序列 並列分析。序列比對結果發現，每段雄性個體的豬牛RT-PCR 片段皆為相同的序列， 並無發現鹼基有重疊之現象。並將序列與豬及牛之SMCX/SMCY EST 及雌性個體序 列進行比對發現在雄性個體和雌性個體所定序到的序列皆為牛或豬之 SMCX 基因片
段。將所得到的豬與牛RT 片段、EST 片段與豬 5’RACE 片段利用 Tigem 生物資訊中 心的CAP 軟體進行 DNA 序列之組合，並得到豬與牛之 SMCX 全長。牛 SMCX 全長
片段的重組及演化的分析。核苷酸的分析結果發現在小鼠、人類、豬與牛的 SMCX 在5’及 3’非轉譯區 (5’ or 3’ end untranslated region, 5’ or 3’ UTR) 保留性較轉譯區 低，人牛、豬的5’UTR 後半部有八成以上的相同度；但與小鼠的 5’UTR 則是完全不 相同。並將人、小鼠、豬與牛SMCX 蛋白質進行 GCG 巨分子序列分析之 pretty box 軟體比較其蛋白質間的相似度，得到人、小鼠、牛與豬全長 SMCX 之蛋白質並列分 析圖，可觀察小鼠、人、牛與豬之 SMCX 相似度都高達九成以上，其中又以豬與牛 SMCX 之間相似度為最高，達 96.6%。在序列的分析結果發現，牛與豬 SMCX 蛋白 質全長分別於於第 1,370-1,372 與豬於 1,368-1,370 胺基酸位置會有三個胺基酸因 alternative splicing 的現象，而造成有個體內 SMCX 基因具有兩種轉錄形態。此段胺 基酸序列為GKR，核苷酸序列為 GGTAGGAGA，此種現象亦於小鼠及人類的 SMCX 中存在。 目前基因資料庫中只有人類與小鼠 SMCX 及 SMCY 基因全長，對於其功能仍是 不清楚。因此，利用SeqWeb 的 HmmerPfam 及 Prosite (http://expasy.nhri.org.tw) 來進 行domain 的分析，以預測其蛋白質功能。HmmerPfam 主要為搜尋 Pfam 資料庫，該 數據庫演算法基於隱馬爾可夫模型 (Hidden Markov Models, HMM) 進行分析。Prosite 軟體則可針對 SWISS-PORT、TrEMBL 資料庫或新發現的蛋白質進行 patterns 或是 domain 的預測。此類蛋白質資料庫皆已將目前已知功能的大量蛋白質進行數據化的 統整分析，利用比對分析的方式來尋找具有意義的保留性區域以及會形成特殊結構的 序列而建立的資料庫。分析的結果將具有可信度之domain 示於表四，其中 jmjN 是轉 錄因子、ARID 為 DNA 結合位置 (binding domain)、PHD-finger 為 zinc finger domain、 zf-C5HC2 的結構為八個 zinc ligand 結合區亦具有 DNA 結合之能力。綜合上述 domain 功能之總合，結果與前人所分析 SMCX/SMCY 蛋白質功能相似，基因之功能應與核 苷酸結合及轉錄調節具有相當之相關性。
4. 預測 SMCY 基因之 H-Y 抗原
在本實驗中得到部分之SMCY 序列進行 H-Y 抗原的預測。由前人研究得知，H-Y 抗原序列確認所用的方式，必需利用免疫的方式使MHC 分子與 H-Y 抗原形成複合 體，並表現於細胞表面。再將該細胞表面之分子分離，並利用高效率液相層析層進行 抗原的確認，最後經由定序比對後才能確定其H-Y 抗原序列。但由於此實驗龐大複 雜，再者，目前生物資訊之蓬勃發展，已經有許多資料庫為針對不同MHC 分子所辨 認之胜肽片段進行整合分析，若能利用預測的方式，將可篩選出具有H-Y 抗原潛力 之胜肽序列並減少許多實驗上繁複的工作。有鑑於此，近幾年來許多科學家致力於開 發新的計算演算法來預測會引起T 細胞 (T cell) 免疫反應的抗原決定位置胜肽序列 (epitope)。 MHCⅠ較 MHCⅡ容易預測的原因在於 MHCⅠ所辨別之胜肽數目為 9-12 個胺基 酸；而MHCⅡ則為 9-25 個胺基酸。H-Y 抗原是被 MHC class I 分子所辨認，目前共 有兩個免費網路生物資訊中心可進行針對MHC I 所辨認之抗原進行預測。由 Parker 發 展 的 “ BIMAS ” (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/, NIH, USA) 及 Rammensee 團隊所發展的“SYFPEITHI”(http://www.syfpeithi.de, DFG, Germany)。 SYFPEITHI 是依據大量天然結合物 (ligand)的短胜肽序列與序列資料庫中已被確認 的蛋白質功能區胜肽序列 (motif) 所建立的矩陣 (matrices)，抗原決定位置的預測為 其中一個部分。BIMAS 則是單一的針對不同的白血球抗原，其 MHC 所會辨認的胜 肽片段電腦計算化。兩種演算化在近年已有許多成功的實例針對體內大量的抗原進行 T 細胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) 抗原決定位定位置之確認。因此，利用此兩個 軟體進行SMCY cDNA 序列 H-Y 抗原之預測，將預測的結果與 SMCX 蛋白質相同的 序列去除預測結果共得到十個由八個胺基酸所組成；七個由九個胺基酸所組成的抗原 片段，此預測之結果將可提供作為進一步生產單株抗體之應用。
4. 模式動物小鼠 SMCY 抗體之製備
由於小鼠體積小、繁殖週期短與容易操作等優點，再加上小鼠 Smcy 基因全長業 已經選殖，數個 epitopes 已經實驗證實（而非僅是經由生物資訊學方法預測者），本 實驗因此針對其中某一抗原決定區（即 TENSGKDI[H-Y/K(k)]進行 peptide 之合成， 並接上carrier protein，進行兔子免疫，依一般 complete 與 incomplete Freund’s Adjuvant 免疫法，為期四周，目前已進行至第三週，收集有三次免疫的血清，即將進行抗體特 異性測定。
五、計畫成果自評：
本計畫已成功選殖豬與牛 SMCX 基因全長 cDNA，然豬與牛之 SMCY cDNA 完成 率未及100%係由於 H-Y antigen 在血液理的表現不如預期量高，但包含 H-Y antigen epitope 部分則以成功予以定序，並未影響本年度計畫，即生產性別特異性抗體以供 之進行選性繁殖應用。惟未完成部分，目前已採取自 SMCY 表現量相當高之睪丸組織 所建構的cDNA 庫進行特異性 cDNA 片段篩選，預計在近期內可以完成篩選與定序 並發表。同時，在小鼠模式的測試上，我們已成功合成含有抗原決定區的peptide 序 列，並藉由carrier protein 來進行免疫兔子生產抗體的工作。 六、參考文獻：
Johnson, L. A. Sexing mammalian sperm for production of offspring: the state-of-the- art.
Anim Reprod Sci 60-61 93-107 (2000).
Moruzzi, J. F. Selecting a mammalian species for the separation of X- and Y-chromosom bearing spermatozoa. J Reprod Fertil 57 319-23 (1979).
Parker, K. C., Bednarek, M. A. and Coligan, J. E. Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J
