利用酵素水解豬血生產含生物活性胜且具生理機能性之產品(3/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

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利品(3/3)

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2214-E-002-007- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學食品科技研究所 計畫主持人： 蔣丙煌 報告類型： 完整報告 處利方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 10 月 31 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

■ 成 果 報 告

□

期中進度報告

利用酵素水解猪血生產含生物活性胜肽

且具生理機能性之產品

計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫

計畫編號：NSC 93－2214－E－002－007

執行期間：

93 年 08 月 01 日 至 94 年 07 月 31 日

計畫主持人：蔣丙煌

共同主持人：

計畫參與人員：魏任廷

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：□精簡報告 ■完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、

列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年■二年後可公開查詢

執行單位：國立臺灣大學食品科技研究所

中 華 民 國 九 十 四 年 十 月 三 十 一 日

摘要

猪隻全血液中約有

17 ~ 18 %之粗蛋白質，為一良好的動物性蛋白質

來源。本研究分別以猪血球、血漿、去纖維蛋白原血漿為受質，於幾種

酵素組合下進行水解，探討生產生物活性胜肽的可行性。其中以血球為

受質，添加複合酵素(trypsin、chymotrypsin、 thermolysin)進行水解，水

解

6 hr，可得到較佳抑制ACE能力之水解物，IC

50

為

0.58 mg/ml；水解 10

hr可得到較佳的清除DPPH自由基，清除能力為 64.9%，而且將該水解液

添加在含有β-amyloid(25-35)之RBE4 培養液中，RBE4 細胞存活率可由

67%升高至 82%，具潛在預防Alzheimer's Disease效果。血球之酵素水解

液亦具有其他機能性，包括還原力、促進皮膚纖維母細胞增生、免疫調

節、抑制腫瘤細胞生長等，雖然所表現之效果未優於其他已知產品或研

究，但在一水解產品中同時存在各類機能性亦屬難得。

綜合上述結果，猪血球水解液在抑制

ACE 能力、清除 DPPH 自由基

優於許多動植物蛋白水解液，且同時具潛在預防

Alzheimer's Disease 效

果及存在其他功能性，為值得發展成產品。因此，為有效率生產含生物

活性胜肽且具生理機能性之產品，本研究進一步利用膜反應器系統連續

式量產。當酵素受質比為

1/5，駐留時間 100 min，於操作 2hr 以後，透

流液抑制

ACE 活性及清除 DPPH 自由基效果則維持穏定 steady state，抑

制

ACE 率達 86%、清除 DPPH 自由基效果達 54%。繼續延長操作時間

至

6 小時，該二項機能性未有顯著變化。整體研究結果，在連續式膜反

應器生產下，能有效利用猪血生產含生物活性胜肽產品，同時也因節省

酵素使用量及具初步脫色的效果，更降低生產成本及提高消費大眾對產

品接受度。

關鍵詞：猪血、酵素水解、生物活性胜肽、機能性

Abstract

Porcine blood with 17~18% protein content is a good source of protein

for food. In this study, hydrolysates of red blood corpuscle, blood plasma and

defibrinated blood plasma were prepared by enzymatic hydrolysis with

several proteases, and evaluated for the possibility of using the enzymatic

processes for manufacturing bioactive peptides. Results showed that the

hydrolysate produced by hydrolyzing red blood corpuscle with the mixture of

trypsin, chymotrypsin and thermolysin had the highest ACE inhibitory

activity (IC50 = 0.58 mg/ml) and the highest scavenging effect on DPPH

(scavenging effect = 64.9%) after 6 hours and 10 hours hydrolysis,

respectively. And for the potential protection against Alzheimer's disease,

adding this hydrolysate into the RBE4 cell culture medium which contained

β-amyloid (23-25) could raise the survival rate of RBE4 cell from 67% to

82%. In respect of other functionalities, including reducing power,

proliferation effect on the skin fibroblast WS1 cell, immunomodulatory

effect, anti-proliferative activity on the tumor cell line, although the

hydrolysates did not show superior capabilities than the other well-known

products, this study proved that the hydrolysate did possess such

functionalities mentioned above.

Because of the health-promoting functions possessed by the hydrolysate

of red blood corpuscles, attempt was made to evaluate the possibility of

manufacturing the product continuously using enzymatic membrane reactor.

It was found that when the enzyme/substrate ratio was at 1/5 and the

residence time 100 min, the system reached a steady state processing

condition in 2 h. The ACE inhibitory activity of the product during steady

state process was 86%, and its scavenging effect on DPPH was 54%. The

steady state process could be maintained for at least 6 h. It was also found

that the membrane process decolorated the enzyme hydrolyzed product, and

improved the appearance of the product. Therefore, it can be concluded that

hydrolyzing the red blood corpuscles in a membrane reactor with a mixture

of proteases is a potentially feasible method for producing a

health-promoting product.

Keywords: porcine blood, enzymatic hydrolysis, bioactive peptides,

目錄

一、前言………1

二、文獻整理………1

(一)血液的組成……….………1

(二)血球……….………..………..…2

(三)血漿……….………2

(四)蛋白質之酵素水解……….………2

(五)生物活性胜肽……….………4

(六)膜過濾……….6

(七)膜反應器……….…7

三、研究目的………...8

四、研究方法………...8

五、結果討論……….11

(一)一般成分……….………..11

(二)猪血水解液機能性分析……….….……….………12

(三)機能性水解液區分………...14

(四)膜反應器連續式生產…..……….14

六、計畫成果自評……….15

七、參考文獻……….15

表次

表一、猪血液組成………..…………20

表二、血液中主要脂肪酸組成………...………...20

表三、血漿蛋白基本性質………..21

表四、血球、血漿及去纖維蛋白原血漿凍乾粉末之組成分..21

表五、猪血球酵素(A)混合酵素[ trypsin, chymotrypsin,

thermolysin ], (B) alcalase 水解過程雙胜肽

Carnosine 之變化情形………...………....22

表六、猪血酵素水解液抑制

ACE 活性………22

表七、猪血酵素水解液清除

DPPH 自由基效果………….…23

表八、猪血酵素水解液還原力………...…………23

表九、猪血酵素水解液刺激

RAW 264.7 細胞釋放 TNF-α….24

表十、以混合酵素(Trypsin、Chymotrypsin、Thermolysin)

水解猪血球

6 小時之水解液其四個分子量區之 ACE

IC

50

………...……….……….…………...25

表十一、以混合酵素(Trypsin, Chymotrypsin, Thermolysin)

水解猪血球

10 小時之水解液其四個分子量區之

圖次

圖一、血液的主要成份………..…26

圖二、腎酵素及血管收縮素系統中血管收縮素轉化酶的催

化反應………...………….…27

圖三、猪血球水解液膠體層析圖…………..………28

圖四、猪血球水解液促進

WS1 細胞增生機能。酵素：

(A)Trypsin , (B) mixture of Trypsin, Chymotrypsin、

Thermolysin……….…29

圖五、猪血球、血漿、去纖維蛋白原酵素水解液抑制

(A)B16F10, (B)Hep G2 腫瘤細胞增生效果………..…30

圖六、Transferrin 抑制(A)B16F10, (B)Hep G2 腫瘤細胞

增生效果………..……31

圖七、不同濃度

β-amyloid(25-35)對 Neuro2A 細胞存活數

影響………..32

圖八、添加混合酵素(Trypsin, Chymotrypsin, Thermolysin)

酵素水解猪血球液於含

β-amyloid(24-35)培養基中對

Neuro 2A 細胞的影響………32

圖九、添加(A) Alcalase, (B)複合(trypsin, chymotrypsin,

thermolysin) 酵素水解猪血球液於含 β-amyloid 培

養基中對

RBE4 細胞的影響……….33

圖十、於不同酵素/受質比及駐留時間下膜反應器連續式操

作對猪血球酵素水解液抑制

ACE 活性之影響………34

圖十一、於不同酵素/受質比及駐留時間下膜反應器連續式

操作對猪血球酵素水解液清除

DPPH 自由基之

影響……….34

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

利用酵素水解猪血生產含生物活性胜肽

且具生理機能性之產品

Enzymatic hydrolysis of porcine blood to yield products containing bioactive

peptides and possessing healthy promoting functionalities

計畫編號：NSC 93-2214-E-002-007

執行期限：93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日

主持人：蔣丙煌 教授 國立臺灣大學食品科技研究所

計畫參與人員：魏任廷 國立臺灣大學食品科技研究所

一、前言 近年來國人在藥補不如食補的觀念影響 之下，保健食品的市場佔有率逐年提高。現 今利用各種動植物蛋白質生產生物活性胜肽 (bioactive peptides)且具保健功能之產品已有 相當多的研究，如：抗菌性胜肽[1-3]、類鴨 片胜肽[4-6]、血管收縮素轉化酶抑制劑(ACEI) 及 降 血 壓 效 果 [7-10]、免疫活性胜肽[11- 13]、抗氧化胜肽[14-16]、抗腫瘤 [17-18]、 保護細胞免受β-amyloid 攻擊[19] 等活性。 臺灣地區每年家畜屠宰量相當可觀。每 頭 猪 隻 採 血 量 約 3 公升，全血液中約有 17-18%粗蛋白質[20]，為一良好的動物性蛋 白質資源。目前除少部分猪血製成猪血糕、 猪血塊供食用或做為肥料、飼料外，其餘大 部分均以廢棄物方式處理。此不僅易造成環 境污染，且為蛋白質資源之一大浪費。在動 物性保健食品中以雞精類之產品最受國人的 喜好，若能以該產品的模式應用於猪血蛋白 質酵素水解物上，確立其生理功能後，應可 開發更具價值之機能性食品。 二、文獻整理 (一)血液的組成 血 液 由 血 球(blood corpuscles) 和 血 漿 (blood plasma)所組成。血球又分紅血球(red blood cell)、白血球(white blood cell)、血小板 (blood platelet)。紅血球的最主要功能是運送 氧氣，白血球與免疫有關，血小板則是與凝 血作用有關。血漿則是血球懸浮於內之液 體，可運送養分與廢物。 新鮮血液之總固形物約 20.9%，其中 86~91%為蛋白質，脂肪量少於 1%，灰分中 以鐵為最重要[21]。血漿及紅血球的水分含量 分別為 89% 及 63%[22]。表一為血液中的一 般組成[20]，另將主要成分表示於圖一。 以下分別介紹血液的成分： 1、血液蛋白質 血液蛋白(blood proteins)分為血漿蛋白 ( plasma proteins )與血球蛋白(globin)。血球 蛋白主要成份是血紅素，而血漿蛋白則可 再分為血清白蛋白(serum albumin)、血清球 蛋 白 (serum globulin) 與 纖 維 蛋 白 原 (fibrinogen)。 (1)血球蛋白 血 紅 素 (hemoglobin) 之 分 子 量 為 64,500，由 4 個多胜鏈組成( 2 條 142 胺基 酸組成之α-蛋白鏈和 2 條 152 胺基酸組成 之β-蛋白鏈 )，各鏈之間以非共價性交互 作用維持空間構形安定性。在血球蛋白中 間則是原血紅素(heme)，原血紅素乃原紫 質 IX(protoporphyrin IX)與中心一鐵原子 所組成。 (2)血清白蛋白 分子量約66,000 ~ 68,000，為 582 個 胺基酸組成之單鏈結構[23]。在循環系統 中負責運輸各類脂肪酸，以及維持血液滲 透壓等重要工作。世界上每年需求量在 300 噸以上。 (3)血清球蛋白 又可分為真球蛋白(euglobulin)、假球 蛋白(pseudoglobulin)。另一種分類為 α-， β-，γ-球蛋白；α-球蛋白( α-globulin )為醣

蛋 白(glycoprotein) 與 脂 蛋 白 (lipoprotein) 所 構 成 ， 可 與 血 球 蛋 白 結 合 成 珠 蛋 白 (hapto- globin)；β-球蛋白(β-globulin)則以 與 金 屬 離 子 結 合 成 金 屬 結 合 蛋 白 (metal-binding protein)形式存在；γ-球蛋白 (γ-globulin)則由 4 個多胜鏈( 2 個重鏈，2 個輕鏈 )所組成，它可以與外來抗原結 合，具重要的免疫功能。 (4)纖維蛋白原 分子量約340,000[24]的大分子，多由 肝臟製造。可經由凝血酵素催化，達成體 內重要的凝血反應。 (5)微量蛋白質 除了上述量較多的蛋白質外，尚有數 十種以上的微量蛋白質存在於血漿中，各 具 有 特 殊 的 生 理 用 途 。 其 中 凝 血 因 子 VIII(Clotting Factor VIII)若是功能不健全

或缺乏，即會造成 A 型血友病之生成。 經臨床証明，猪的凝血因子 VIII 在注入 患者體內後，可有效治療其症狀，且引起 之抗體反應遠較注入人的凝血因子 VIII 濃縮品要來得低。此外，不會有感染AIDS 或肝炎等病毒之可能，具有很高的利用價 值[25-27]。 2、血液中胺基酸 血液含有豐富胺基酸，其中以離胺酸 (lysine)、白胺酸(leucine)含量最高，甲硫胺 酸(methionine)及異白胺酸(isoleucine)則是 限制胺基酸。要食用時，最好搭配甲硫胺 酸及異白胺酸含量多的食物種類(如穀類)。 3、血液中脂質 血 液 中 脂 質 含 量 約 272 ～ 447 mg/100ml。主要脂肪酸組成如表二[96]。 4、血液中鐵質 血液中的鐵含量約占 0.3~0.4%，遠較 其他畜產品高，且近九成為血質鐵( heme iron )結合型式存在。膳食中鐵的來源分為 血質鐵及非血質鐵( nonheme iron )兩類，血 質鐵可不經轉換成離子型式而直接為小腸 黏膜所吸收[28]。 5、血液中其他微量成份 維生素(vitamin)A、B 群、C，菸鹼酸 (nicotinic acid) 、 葉 酸 (folic acid) 、 泛 酸 (pantothenic acid)等；胰島素(insulin)、降血 鈣素(calcitonin)等內分泌素；乳酸去氫酵素 (lactate dehydrogenase) 、 鹼 性 磷 酸 酵 素 (alkaline phosphatase)等酵素，與縮水肌氨 酸(creatinin)，尿素(urea)等代謝產物。 (二)血球 利用簡單的離心，即可將血球與血漿分 開。分開後的血球，可再進一步分為原血紅 素及血球蛋白。其中的原血紅素是色素，可 以供作食品添加用，而且內含豐富的血質 鐵，可以再進一步製備成鐵劑。 (三)血漿 綜合前述主要的血漿蛋白，整理其基本 資料於表三[97-98]。 (四)蛋白質之酵素水解 1、蛋白質水解產物之簡介 (1)分類 若以分子量的分佈範圍作為分類基 礎，蛋白質水解產物可略分為三大類：經 輕微、中度和高度水解所得之蛋白質水解 產物[29, 100]。 蛋白質經過高度水解後，其產物的分 子量大多小於500Da，且不具有分子量大 於5kDa 的胜肽。由於此類水解產物的分 子 量 極 小 ， 無 法 被 抗 體 中 的 辨 識 群 (determinant)所辨識，所以不會引起人體 過敏反應。因此經過高度水解後的蛋白質 適 合 應 用 於 低 過 敏 性 嬰 兒 食 品 配 方 (hypoallergenic infant formula)中。

中度水解後的蛋白質，其水解產物的 分子量分佈範圍較廣。與未經水解的蛋白 質相比，此類蛋白質水解物的粘度較低， 具熱安定性，功能性佳。有別於高度水解 後的蛋白質，中度水解後的蛋白質水解產 物並不具有低過敏性的特點，不適於添加 在嬰兒食品配方中。但由於此類蛋白質水 解產物營養價值高、功能性佳，且較未經 水解的蛋白質易於消化吸收，故適合添加 於成人營養配方食品，如運動飲料、體重 控制配方以及老年人的飲食中。 (2)特性及應用 水解反應有利於蛋白質溶解度的提 昇。經過水解後的蛋白質，在其等電點附 近的溶解度有明顯的改善[30-32]。這主要 是因為蛋白質經過水解之後，分子量降 低，且暴露出許多游離化的胺基( amino group ) 和羧基( carboxyl group )，此二官

能基可增加蛋白質水解產物的親水性，進 而提昇它的溶解度。 蛋白質水解物在高溫下不容易形成 聚集，縱使某些蛋白質水解產物在高溫下 形成聚集，但其聚集物溶解度佳，故並無 沉澱產生[33]。 蛋白質水解物的乳化特性與其水解 率有相當密切的關係。經過適當水解後的 酪 蛋 白 和 乳 清 蛋 白 ， 其 產 物 乳 化 活 性 ( emulsion activity )佳，但是乳化安定性有 下降的驅勢。這是由於適度的水解反應可 以將在蛋白質內部的疏水性胺基酸暴露 於外，而疏水性胺基酸又因可吸附於水與 油或水與空氣的界面，故具有乳化活性。 以化學方法水解蛋白質，由於水解程 度較完全，因此比較沒有苦味的問題。倘 若以酵素水解蛋白質，基本上，會受酵素 種類、受質以及水解條件的不同，而產生 不同程度的苦味。蛋白質水解產物的苦味 性，可能與胜肽的分子量及其疏水性胺基 酸含量的多寡與位置有關[34]。 2、蛋白質水解方式 蛋白質可利用酸分解而形成游離胺基 酸，並藉由水解物pH 值的降低以抑制腐敗 菌生長[35-36]。雖然以酸來水解蛋白質之 效率遠高於酵素水解之方式，但酸水解不 僅會破壞水解物原有之功能特性，並使得 L-form 之胺基酸轉變為 D-form 胺基酸，因 而 形 成 如 lysinoalanine 等 毒 性 物 質 [37-38]，此外，也可能會含有微量的 mono- chloropropanol (MCP)及 di-chloropropanol (DCP)等致癌物質[39]。酸水解常用的無機 酸為鹽酸、硫酸或磷酸[40-41]，而有機酸 則為甲酸、丙酸[42]和檸檬酸[43]，亦有利 用各種有機酸與無機酸混合酸來進行水解 者[43-45]。 蛋白質亦可利用酵素水解。目前，酵 素水解方式已逐漸取代酸水解方式。酵素 對蛋白質之水解作用使產物具有分子量降 低、離子性基數目增加及疏水性基露等特 性[46]，使得蛋白質之官能性質產生變化， 酵素切斷蛋白質之胜肽鍵使其成為小分 子，水解率值愈高表示鍵被切斷之數目愈 多。蛋白質受酵素作用時，可依序分解成 proteose、peptone、peptides，最後分解成游 離胺基酸，因此水解程度不同時，水解物 含氮化合物之組成亦不相同。水解前後分 子量的大小亦會影響產物之成膠能力、乳 化性質、濃稠度、風味、免疫性及溶解性 等功能性質[47]。進行蛋白質酵素水解時， 酵素的種類、酵素對受質的濃度、水解系 統之pH 與離子強度、受質本身的性質、水 解時的溫度及時間等皆會影響水解率的強 弱與最終水解液之性質[48]。 3、影響酵素水解蛋白質之因子 (1)酵素種類 酵素之種類會直接影響蛋白質的水 解率以及水解物的特性。比較各種蛋白酵 素對沙丁魚肉的水解能力，使用的蛋白酵 素包括alcalase、actinase、proleather 等鹼 性蛋白酶，neutrase、papain 等中性蛋白 酶，以及mosin、pepsin、neulase 等酸性 蛋白酶。在這些酵素之最適作用條件下， 鹼性蛋白酶水解沙丁魚肉之蛋白質溶解 率較酸性、中性蛋白酶為高，這是因為鹼 性蛋白酶之活性較酸性、中性蛋白酶強， 故蛋白質水解率也較高[49]。而無論是使 用酸性或鹼性蛋白酶皆隨水解作用時間 之延長，水解物之pH 值都趨向中性[50]； 又細菌分泌的蛋白分解酵素的活性較真 菌佳[49]；釀造常用之麴菌有 Aspergillus oryzae 和 A. sojae 兩種，其中以 A. oryzae 可分泌較高活性之澱粉分解酶、酸性蛋白 酶和acid carboxypeptidase，而 A. sojae 分 泌 之 麩 胺 醯 胺 分 解 酶 和 endopoly- galacturonase 的活性較高[51-52]。 (2)pH 值與溫度 酵素在進行蛋白質水解時，多半選擇 其最適的pH 值與溫度作用範圍，影響所 及的是酵素活性所能表現出的程度。一般 的蛋白質水解酵素最適pH 值約在 7.0 左 右，最適溫度約在 30~50℃，當超過 50 ℃時，則內生性酵素開始失活[38, 44, 49 , 53-54]。自家消化的水解作用在中性 pH 進行時，主要的水解酵素為 trypsin 或 trypsin-like enzyme[55]，而 pH 值低於 5.5 以下時，則以pepsin 之作用為主[42]；以 鳳梨酵素水解蛋白質時，在pH5.0、溫度 40 與 50℃時，其胜肽鍵的平均長度是 3.9 及2.4，而在 pH7.0、溫度 40 與 55℃，其

胜肽鍵的平均長度則是 4.8 及 2.8，顯示 當pH 由 5 改變至 7 時，會有較多大分子 胜肽聚集的現象[56-57]。 (3)酵素濃度 酵素與基質的比例(E/S)影響了蛋白 質水解時的分解速率，假如酵素與基質的 濃度達到飽和後，就可以強迫每個可用的 酵素分子與基質作用，由於沒有自由的酵 素存在，使得其間的碰撞機率達到最大， 否則酵素濃度太低時會降低水解反應速 率，而濃度太高反而提高生產成本。將濃 度0.1%至 0.4%之 Alcalase 水解脫脂沙丁 魚肉，結果發現，隨著酵素濃度的增加， 水解率也隨之提高[58]；雖然水解初期的 效果以濃度高者較佳，但水解率並不因為 水解時間的延長而繼續提昇，這是因為水 解產物對酵素與基質間發生抑制作用，而 減緩了反應速率[59]。 (五)生物活性胜肽 1、生物活性胜肽的來源 近年來很多胜肽從細菌、真菌、植物、 動物等中被純化出來，証明具有生物活性 (bioactive) ， 而 被 稱 為 生 物 活 性 胜 肽 (bioactive peptide)。生物活性胜肽可以從天 然食品中分離出來，也可以藉由水解蛋白 質後產生。這些食品包含了牛乳、米糠、 玉米、蛋白、魚肉、大豆、小麥、黑麥(rye)、 膠原質(collagen)、血液等，其中以牛乳蛋 白水解物被研究最多。 2.生物活性胜肽的種類與功能 (1)抗菌胜肽

包含了cyclic peptides、 glycopeptides 和 lipopeptides 。 例 如 nisin, lactocin, subtilin 可用來當作食品的天然防腐劑 [60-61]。猪脊髓中亦分離出具有抑菌之活 性胜肽[1, 62]。 (2)類鴉片胜肽( opioid peptide ) 類鴉片胜肽是第一種被廣泛研究的 生物活性胜肽。主要作用在神經系統，如 痛覺接收的調節、鎮靜、促進睡眠等。這 類胜肽多來自牛乳、魚、大豆、穀類蛋白 的水解物。由酪蛋白水解產物中分離出來 的 類 鴉 片 胜 肽 有 casomorphins 和 casoxins，其中 casomorphins 有類似鴉片 的作用，反之，casoxins 則具拮抗作用。 Lactorphins 是一由乳清蛋白水解產物中 所分離出來的類鴉片胜肽。為了與內生性 類鴉片胜肽(endorphins)有所區別，由食物 中所分離出來的類鴉片胜肽，統稱為外生 性類鴉片胜肽( exorphins )。這些胜　均具 有X-Tyr-Phe、Tyr-X-X-Phe 或 Tyr-X-X-Tyr 的 胺 基 酸 片 段 ， 使 其 發 揮 類 鴉 片 作 用 [63] 。 由 β-casein 水 解 所 得 之 β-casomorphins ，可以延長食物在腸胃中 停留時間，增加食物中水分和電解質被吸 收的機會，而達到抗腹瀉功能。另外， β-casomorphins 還可藉由調節進食後胰島 素和生長激素釋放抑制因子的分泌而影 響代謝。 (3)酵素調節胜肽 包含了caerulein, cholecystokinin, 和 glutathione。這些胜肽對很多人體生化代 謝途徑中的酵素扮演調控的角色。最著名 的 就 是 被 用 來 做 抗 血 壓 劑 的 angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor 。 由 蛇 毒 液 中 發 現 有 ACE inhibitory peptide 後[64]，便有許多學者 以水解蛋白質、合成或萃取的方法得到各 種 不 同 的 ACE inhibitory peptides [65-68]。以 collagenase 水解明膠，由水解

產物中分離出9 種不同的 ACE inhibitory

peptide，首先由食物來源蛋白質中分離出

來者。以trypsin 水解牛乳酪蛋白而得 ACE

inhibitory peptide [65]；亦有自猪血漿中分 離出之ACE inhibitory peptide，其胺基酸 序列為Leu-Val-Leu [68]；1996 年 Park 等 也以4﹪trichloroacetic acid 處理猪血漿， 再經過濾層析得到IC50 值為 2μM 的 ACE inhibitory peptide ， 其 胺 基 酸 序 列 為 Gly-Val-His-Gly-Val [69]；Matsui 等( 1993) 亦以 alkaline protease 水解沙丁魚肉而得 之[70]。另也有學者以 thermolysin 水解 α-玉 米 膠 蛋 白(α-zein) 而 產 生 許 多 ACE inhibitory peptides，這些胜肽大多由三個 胺基酸所組成，其中抑制能力較好的有： Leu-Arg-Pro、Leu-Ser-Pro、Leu-Glu-Pro。 它們均在 C—終端有一個 proline 殘基 [66]，但也有學者發現不具此一特性的 ACE inhibitory peptides [67]。

包 含 了 oxytocin 、 vasopressin 、 prolactin、gastrin 等。這些胜肽在重要生 理代謝及生長發展中，扮演著荷爾蒙或調 節荷爾蒙反應的角色[71]。 (5)免疫活性胜肽 包含了 interleukins 和 interferons 等 可活化及調節免疫系統的重要胜肽。其中 有 些 是 從 牛 乳 及 小 麥 蛋 白 質 中 發 現 的 [72]。Paker 等( 1984 )發現由酪蛋白水解 產生的免疫胜肽可刺激老鼠及人體巨噬 細胞的吞噬作用，保護老鼠免受Klebsiella pneumoniae 所感染。Parker 等認為此因為 免疫胜肽能夠刺激 T 細胞及自然殺手細

胞( natural killer cell )的增生和成熟，增強 免疫能力[73]。Kayser and Meisel (1996) 由 牛 乳 蛋 白 中 分 離 出 之 胜 肽 ， 利 用 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) 螢 光 物 質，測定人體淋巴球細胞DNA 複製現象 及利用[3H]leucine 測定胞蛋白質合成情 形，發現可促進淋巴球DNA 複製及蛋白 質合成，因此顯示其可刺激淋巴球增生效 果，增加人類非專一性之免疫能力[11]。 (6)抗氧化胜肽 一些蛋白質水解產生的胜肽可抑制 自氧化反應及 hydroperoxide 的含量，並 阻止對人體有害的自由基形成。這些胜肽 大多可抓住重金屬或促進 hydroperoxides 的分解，例如Carnosine(β-Ala-His)即在很 多 動 物 肌 肉 中 存 在 。 此 外 已 知 如 卵 白 [74]、紅豆、大豆等蛋白質水解物皆具有 抗氧化性[75-78, 100]。 Chen 等(1995) 以五種蛋白質水解酵 素水解 β-大豆球蛋白(β-conglycinin)，比 較蛋白質水解程度與其抗氧化活性之相 關性，發現水解物之抗氧化活性與水解程 度並不一定是正相關[77]。Yamaguchi 等. (1979)以十種酵素水解大豆蛋白，利用硫 氫酸鐵法在500 nm 測吸光值，結果得知 水解率(hydrolyzating ratio)最高(34%)者 達氧化誘導期的時間卻最短；水解率最低 (5%)者達氧化誘導期的時間卻非最長。某 些酵素之水解率雖只有 9%、8%與 6%， 但抗氧化活性卻是十種酵素水解液中最 強者，約達25 天[76]。林(1999)利用各種 酵素來水解鯖魚肉，發現各酵素水解物皆 有抑制亞麻油酸自氧化能力。林推測酵素 水解所產生之胜肽種類是決定抗氧化性 強弱之主要因子，與水解時間之長短關係 不大[79]。 Chen 等(1996) 研究大豆蛋白水解液 於亞麻油酸中，在不同pH 值下對抗氧化 活性之影響，結果發現，添加大豆蛋白水 解液可以使抗氧化活性明顯增加，且 pH 值介於 6.7-6.9 時對抑制亞麻油酸自氧化 反應有最佳之延緩效果[78]。Shahidi and Amarowicz (1996)以不同濃度之 capelin protein hydrolysates (CPH)及 seal protein hydrolysates (SPH) 添 加 在 β-carotene / linoleate 模式系統中，發現 CPH 這一組 中，除了含1 mg CPH 者，其餘濃度在各 時間階段裡皆有顯著之抗氧化活性，其中 添加5 mg 與 10 mg CPH 者其抗氧化能力 相似，並明顯優於添加1 mg 與 2 mg CPH 者；在SPH 組中，添加 5 mg SPH 者在 60 及 75 分鐘時與添加 10 mg SPH 者在所 測時間內皆表現出促氧化作用，而添加1 mg SPH 者在 45、105 及 120 分鐘時與添 加2 mg SPH 者在 30-120 分鐘內和控制組 無明顯差異，其餘時間中也只有微弱的抗 氧化活性[80]。 Chen 等(1996) 指出大豆蛋白水解物 之 小 分 子 胜 肽 中 ， 抗 氧 化 活 性 較 強 的 Leu-Leu-Pro-His-His (LLPHH) 與 BHT 及 BHA 比較，發現同在 8×10-7~ 4×10-4M 的 濃度範圍內，抗氧化活性大於 BHA；除 了 BHT 之外，整體來說，濃度與抗氧化 活性之間並未有良好的正相關性，須視樣 品本身的性質給予最適濃度來決定抗氧 化活性。為得知大豆蛋白酵素水解液中抗 氧化性最強部分之分子量[78]，Yamaguchi 等(1979)以 Sephadex G-25 分離水解液並 測量抗氧化活性，發現抗氧化活性最強處 之 分 子 量 略 高 於 維 生 素 B12( 分 子 量 1357.4)，而分子量較低處其抗氧化活性則 較弱[76]。Chen 等(1995) 將抗氧化活性 較強之大豆蛋白 Protease S 水解物利用 Sephadex G-25 分離之，發現分子量接近 1400 Da 之胜肽類含量最多[77]。林(1999) 將抗氧化活性較強之鯖魚肉水解物利用 Superdex peptide 預注管柱進行劃分，結

果顯示分子量在 660-920 Da 範圍內之胜 肽類為鯖魚肉酵素水解物中具有較強抗 氧化活性之化合物。綜上結果可知，小分 子胜肽具有較強的抗氧化活性[79]。

Bishov and Henick (1972) 以 Hydrolyzed vegetable protein (HVP) 與 BHA 及生育醇(tocopherol, vitamin E)同時

作用，發現 HVP 與 BHA、Vitamin E 具 有抗氧化之相乘效果(synergistic effect) [81]。Chen 等(1996) 以大豆蛋白中的三 種成分 (glycinin、β-conglycinin 及 basic 7S globulin) 利用酵素水解，結果顯示此 三 種 成 分 之 水 解 液 本 身 的 抗 氧 化 性 較 低，但與抗氧化劑併用後其抗氧化活性有 明顯的上升，其中以 BHA 的效果為最 佳，次為tocopherol，而 BHT 的效果居末 位[78]。 (7)抗高血壓胜肽 血 管 收 縮 素 轉 化 酶

(angiotensin-converting enzyme, ACE) 屬 於 腎 酵 素- 血 管 收 縮 素 系 統 (rennin- angiotensin system, RAS)的一員，如圖 2

其作用是將 Angiotensin Ⅰ(不活化型)水 解 生 成 具 有 強 力 血 管 收 縮 作 用 的 Angiotensin Ⅱ，且使具有血管擴張作用 的 緩 激 素(bradykinin) 降 解 而 失 去 其 作 用，故血壓因而上升[101-102]。如果能阻 斷這個酵素的作用，便可舒緩血壓上升的 現象。ACEI (血管收縮素轉化酶抑制劑) 可與 ACE 結合，影響 ACE 活性，減緩 angiotensin II 的生成與 bradykinin 的破 壞，因此，如果飲食中含有 ACEI，對於 減 輕 高 血 壓 的 症 狀 ， 應 有 正 面 的 效 果 [103]。Oshima 等在 1979 年就已經從食 品蛋白質中分離出具有降血壓功能的胜 肽

，

能夠有效的遏阻血壓升高。[104]； Masuda 等於 1996 年曾利用先天性高血 壓 大 鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)進行活體試驗，結果發現由發酵乳 萃取出來的ACEI 胜肽可以有效地降低老 鼠血壓[105]；而類似的實驗，有很多學者 嘗試過，亦有相當好的結果。取自食品的 ACE 抑制物，來源主要是食品蛋白質的 水解產物，包括酪蛋白(casein)、玉米蛋白 (zein)；或是經由肉類水解獲得，如沙丁 魚肉、鰹魚肉[106]。 利用不同的基質與酵素水解，其產物 的 ACE 抑制活性不同。陳等(1997) 以 pepsin 水解大豆蒸煮汁，獲得 ACE 抑制 活性很高的胜肽片段[107]；而 Arihara 等 人以猪之骨骼肌為原料，選用9 種酵素分 別進行水解，結果以pepsin 水解液抑制率 30%為最低、thermolysin 水解物抑制率 86%為最高[108]。Jeon 等將鱈魚水解物進 行超過濾膜分離，結果相較於全水解液， 3kD 以下區分物提升了 5 倍抑制能力 [109]。 ACEI 胜 肽 相 較 於 ACEI 藥 物 (Captopril 等)用於治療高血壓具有許多優 點，不但生活品質和新陳代謝不受到影 響，對於氣喘、慢性肺阻塞的病人也可以 使用，同時可避免使用ACEI 藥物所帶來 的副作用。 (8)其他胜肽 有些由莢豆類、雞豆、扁豆及黃豆來 的胜肽具有抑制癌症誘發作用[82]。從酪 蛋白(casein)經 trypsin 水解來的 caseino- phosphopeptides (CPP)可和帶正電荷的鈣 離子結合，抑制磷化鈣沉澱，提高鈣離子 的溶解度，增進人體對鈣的吸收。大部分 的CPP 均具有 SerP-SerP-SerP-Glu-Glu 胺 基酸片段[83]。 (六)膜過濾 膜過濾一般應用於工業上的純化、分離 與濃縮等單元操作上，依所使用之膜孔徑大 小分為（1）精密過濾 ( microfiltration,簡稱 MF ) （2）超過濾( ultrafiltraion,簡稱 UF ) (3) 奈 米 過 濾(nanofiltration, NF) （ 4 ） 逆 滲 透 ( reverse osmosis,簡稱 RO )。一般是用分子量 劃 分 數 值( molecular weight cut-off, 簡 稱 MWCO )來表示所區分之最大分子量。精密 過濾膜所能區分之分子範圍約在 0.02 - 2.0 μm 之間，操作壓力約在 1 - 5 bar 之間；超 過濾膜所能區分之分子約在0.002- 0.2 μm， 即約為 500 - 300,000 Dalton 之分子，操作 壓力約在 1 - 10 bar 之間；奈米過濾能區分 200-1000Dalton 之分子；逆滲透的操作原理 乃是在溶質濃度較高的一側施予一高於溶液 兩側之滲透壓差之壓力，迫使水由高溶質濃 度側往低溶質濃度側移動，進而達到濃縮的

目的。逆滲透膜孔徑在 5 – 15 Å 以下，操作 壓力約在 20-80 bar 之間。 過濾膜之選擇是膜分離加工能否成功之 重要關鍵。迄今市售的超過濾膜種類繁多， 雖然都標明分子量劃分數值 ( MWCO )，但 是 由 於 材 質 的 不 同( cellulose acetate ； polysulfone；polyether；polyamide；teflon； alumina 等 )，縱使 MWCO 的值相同，其 實際分離效果也可能不同。綜合而言，在選 擇分離膜時所需考慮的條件有下列幾點： 1、耐熱性 --- 操作之溫度除了考慮膜作用 之最適溫度， 溫度越高，進料液體之黏度 較低，有利於膜分離操作， 同時在較高的 溫度下操作，可以抑制常溫性微生物之生 長。 2、耐壓性 --- 物質通過膜的速率隨著操作 壓力的增加而增加，故使用耐壓性較佳之 膜較適合。 3、耐酸鹼性 --- 酵素作用有其最適之酸鹼 值；且實際操作時， 經常會使用酸鹼等溶 液來清洗膜系統，耐酸鹼性較佳的膜較適 合。 4、區分能力 --- 必需能將不同大小分子有 效區分。 在膜過濾操作上，除了膜的選擇外，裝 置( module )的選擇亦相當重要。膜過濾的裝 置有很多種，常見的有管狀、螺旋狀、平板 狀與中空纖維狀。各種裝置均有其優劣之 處，需做適當的選擇。 進行膜分離時，通過膜的部分稱為透流 液( permeate )，不能通過的部分稱為滯留液 ( retentate )。透流速率( permeation rate ) 簡稱 透流率( flux )，是決定操作效益的主要因 素。影響透流率的因素有操作壓力、流速、 溫度、原料的性質及組成成份。

(七)膜反應器 生物反應器與膜結合的概念是以生物催 化劑(酵素或微生物)不能通透膜，而在反應中 生成之小分子產物可以通過半通透膜為基 礎。酵素反應於一連續式攪拌反應槽( CSTR ) 內進行反應，反應液連續不斷地循環流過超 過濾膜裝置，酵素與未反應之受質因分子量 大於膜分離孔徑，因此不會穿過膜可連續不 斷地在系統中循環，而產物則因分子量小於 膜分子量劃分而隨透流液穿過膜。酵素於系 統中重複使用，使得產率增加。由於酵素是 均勻地分佈於溶液中，因此可以避免質傳限 制。 目前常見的有三種形式的連續式攪拌膜 反應槽：終端式攪拌槽( dead-end stirred cells, DESC )、循環式膜反應器( membrane recycle reactors, MRR )、串連式膜反應器( cascade membrane reactors, CMR )。 1、終端式攪拌槽( DESC )： 大多數討論酵素膜反應器的文獻皆屬 此類。操作時，酵素滯留於系統中，而受 質溶液則不斷地以與透流液相同的速度加 入系統中。為了改善反應速率並降低濃度 極化的現象，因此整個系統必需加以攪 拌。此系統之效率遠低於循環式膜反應器。 2、循環式膜反應器( MRR )： 於一連續式攪拌槽( CSTR )內進行反 應，反應液連續不斷地循環流過超過濾膜 裝置，酵素與未反應之受質因分子量大於 膜分離孔徑，因此不會穿過膜可連續不斷 地在系統中循環，而產物則因分子量小於 膜分子量劃分而隨透流液穿過膜。酵素於 系統中重複使用，使得產率增加。由於酵 素是均勻地分佈於溶液中，因此可以避免 質傳限制。此系統最常使用於天然聚合 物，如蛋白質與碳水化合物之水解。 3、串聯式膜反應器(CMR ): 由於連續式攪拌反應槽中，轉換速率 偏低，此乃是由於系統中受質濃度較低所 致。為克服此限制，可以用將連續式攪拌 反應器以串聯方式加以解決。目前常見的 串聯式膜反應器有下列兩種，一是每一段 使用一分離膜，進料於第一段送入反應器 中，而已反應之溶液則經膜過濾後，透流 液進入下一段反應器中，滯留液則回到此 段。此類反應器較為昂貴，但常用於多種 酵素反應的操作，如從澱粉生產高果糖糖 漿。而另一種則是在最後一段使用分離 膜，構造較為簡單，酵素等不能通透膜者 滯留於膜中後返回第一段反應槽中。此設 計的優點在於只使用一分離單元，但無法 做串聯式反應。 選擇膜反應器中使用之酵素，需考慮下 面幾個因素： 1、反應速率要高 ---- 反應速率會影響反應

器的設計。 2、酵素的取得要方便且價格低。 3、酵素作用之酸鹼值、最適作用溫度與長 期操作之穩定性。 4、酵素分子之大小 ---- 酵素分子量太小， 有部份會透過膜而損失，重新添加之機率 變大，操作成本因而提高。 三、研究目的 每頭猪隻採血量約 3 公升，全血液中約 有17-18%粗蛋白質，為一良好的動物性蛋白 質資源。目前大部分均以廢棄物方式處理， 此不僅易造成環境污染，且為蛋白質資源之 一大浪費。由於猪血的蛋白質含量豐富具有 生產生物活性胜肽的潛力，且利用各種動植 物蛋白質生產生物活性胜肽已有相當多的研 宄，但是其中鮮少有利用血液蛋白來研究， 因此，本研究期利用猪血為原料，以酵素水 解方式生產生物活性胜肽。其中，猪血可經 簡單的離心分離成血球及血漿。由於血漿中 的 纖 維 蛋 白 原(fibrinogen) 和 凝 血 因 子 Ⅷ (Clotting Factor Ⅷ) 對血友病患者治療有很 高的利用價值，因此以冷凍沈澱法將其沈澱 分離出來，供治療用途。然而該上清液仍含 有大量的蛋白質，亦可作為本研究的酵素水 解基質之一，再加上血球及血漿二部分，合 計三種受質供作酵素水解，探討生產生物活 性胜肽的可行性。 四、研究方法 (一)樣品製備 全猪血液於桃園縣中美肉品之屠宰場採 集，採集後迅速添加檸檬酸鈉(抗凝血劑)使最 終濃度達 0.5% w/v；全血經由離心(6000×g) 15 分鐘，分離血球及血漿，兩分離液儲存於 -20°C 備用；一部份血漿利用冷凍沈澱法[84] 製備成去纖維蛋白原血漿。血球、血漿、去 纖維蛋白原血漿分別凍乾儲存，待作為後續 酵素水解基質。 (二)批式酵素水解 分別以磷酸緩衝溶液將血球、血漿、去 纖維蛋白原血漿配製成濃度為 1%之受質溶 液。酵素則使用兩工業上常用酵素 Alcalase 及 Flavourzyme ( 購 自 Novo Nordisk,

Bagsvaerd, Denmark)及三種粗酵素 trypsin (購自 Biocon, Nagoya, Japan), chymotrypsin 及 thermolysin ( 購 自 Sigma, St. Louis, USA)，水解條件之溫度、pH、酵素分別為 I: 38°C, 7.0, trypsin、II: 35°C, 7.5, trypsin、 chymotrypsin 及 thermolysin 之 1:1:1 混合 物，III: 55°C, 7.5, Alcalase，IV: 55°C, 7.0, Alcalase 及 Flavourzyme 之 1:1 混合物。將 2 ml 0.5% 酵 素 溶 液 加 至 50 ml 受 質 溶 液 中 (E/S=1/50)，並於 0， 2， 6， 10， 24 小時 取樣。取樣之水解液於100℃ 加熱 15 分鐘， 使水解酵素失活，並離心(23400× g) 15 分 鐘，上清液於4℃儲存備用。 (三)游離胺基酸及複合胺基酸分析[85] 0.3 ml 10% 5-sulfosaliclic acid (SSA) 加

入1.2 ml 水解液，於 4℃下靜置 30 min 後，4

℃下離心(6000×g)10 分鐘。上清液以 0.45 μm 濾 膜 過 濾, 並 以 高 效 胺 基 酸 分 析 儀 分 析 (Beckman 6300, Fullerton, CA, USA)。 (四)胜肽濃度測定[86] 25ml 100mM sodium tetraborate、2.5ml 20 ﹪ SDS 、 1 ml OPA (40 mg ο- Phthaldialdehyde 溶 於 甲 醇 中 ) 、 100 μl β-mercaptoethanol，上述藥品用棕色瓶定量至 50 ml，取 2 ml 混合液加 50 μl sample 反應 兩分鐘後立即測340nm 吸光值，標準曲線以 1、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/ml Leu-Gly 製作。 (五)水解率(Degree of hydrolysis)測定[87] 1、胺基態氮(amino nitrogen) 取 0.25ml 水解液，置於棕色試管中， 加入 2ml 0.2125M 磷酸緩衝液(pH 8.2)及 2ml 0.1% OPA ， 於 50 ℃ 下 振 盪 反 應 60min(全程注意避免光照)，最後加入 4ml 0.1N HCl 終止反應。並於室溫下靜置至少 30min 後測定波長 340nm 之吸光值。 2、反應液總氮(total nitrogen) 取反應 0hr 之 0.1ml 酵素水解液(酵素 液先於沸中水中加熱 10min，再加入基質 液)，置於分解管中，加入 4 ml 6N HCl，減 壓抽氣並真空封管。再將分解管置入 110 ℃溫箱內，反應 24hr，水解液加入 2ml 蒸 餾水減壓濃縮去除鹽酸至乾，再溶於 1ml 蒸餾水中，以OPA 法測定取出完全水解液。 3、標準曲線建立 以0.25 ml之不同濃度 0.25 mM、0.125

mM 及 0.025 mM 的L-leucine 溶 液 替 代 樣 品，其餘步驟與樣品液的處理相同。 DH(%) = h-h0/htot-h0 × 100% h：酵素水解液胺基態氮的濃度 h0：未水解前之胺基態氮的濃度 htot：完全水解液中胺基態氮的濃度 (六)一般成分分析 1、水分 依A.O.A.C. (1984)方法測定。取大約 3 g 之凍乾樣品於預先乾燥之坩鍋，並記錄 樣品與坩鍋重，置於105℃之乾燥箱中 8 小 時。取出後置於乾燥器內放冷，稱至衡重 並由以下公式計算水分含量。 水分(%) =（A+B-C）/ A × 100 A：樣品重 B：坩鍋重 C：105℃乾燥後之樣品與坩鍋之總重 2、粗脂肪 參考A.O.A.C.（1984）方法，以 Soxhlet 裝置，秤取適量樣品先行於圓筒濾紙中， 105℃烘箱乾燥 4h，以乙醚萃取法萃取。 3、粗蛋白質 係以凱氏法(Kjeldhl method)(A.O.A.C., 1984)加以分析。取 0.5 g 凍乾樣品加入 20 mL 硫酸，以凱式氮分解裝置（Model 2006, Foss tecator, Sweden）分解後以凱式氮蒸餾 裝置（Model 2100, Foss tecator, Sweden）測 得樣品之總氮量。所得之總氮含量值再乘 以6.25，即為樣品粗蛋白質之含量。 4、灰分之測定 精秤2 g 凍乾樣品，置入已恆重的坩堝 中，以550-600℃之灰化爐灰化，至成乳白 色為止。取出放入乾燥器中，冷卻後稱量。 灰分量依下式計算： 灰分(%) = W1－W0 / S ×100 W0：坩堝恆重(g) W1：樣品灰化後之坩堝恆重(g) S ：樣品重(g) (七)清除 DPPH 自由基測試[88] 首先取1 ml 樣品，加入 4 ml 75 μM 的 DPPH(甲醇溶液)，充分混合下靜置 60 min， 然後在波長 517 nm 處檢測其吸光值，並以 α-tocopherol 及 BHT 作正控制組。 % Inhibition=(A -A-A )/A ×100%

A0反應前吸光值 A 反應後(添加萃出物)吸光值 AS萃出物本身的吸光值 (八)還原力測試[89] 取0.5 ml 不同水解時間之水解物，加入 0.5 ml 0.1 M Phosphate buffer (pH 6.6)及 0.5ml 0.1% Potassium ferricyanide，於 50℃水 浴20 分鐘後，冰浴快速冷卻，加入 0.5 ml 10%

trichloroacetic acid (trichloroacetic acid in 95% ethanol)溶液，再用 0.45 μm 膜過濾處理去除 不溶物，其濾液再加入 4ml 蒸餾水及 0.8ml 0.1 ferric chloride (氯化鐵溶在 3.5% HCl)溶 液，混合均勻於10 分鐘後測定 700 nm 之吸 光值並以100, 200 ppm Vit C 作還原力比較。 ( 九 ) 抑 制 血 管 收 縮 素 轉 化 酵 素 (ACE) 活 性 [90-91] 取300µl 0.33mM hippuryl-his-leu 及 30μl 水 解 液 ， 再 加 入 50μl 0.16U/ml ACE( 以 300mM NaCl 之 100mM 硼酸緩衝液 pH 8.3 配製)，於 37℃水浴槽內振盪反應 30 分鐘 後，加入380μl 之 1N HCl 終止反應。在空白 組(blank)是以蒸餾水替代酵素水解液。控制 組中，同樣以蒸餾水替代酵素水解液，但在 未加入酵素之前先加入380μl 之 1N HCl，其 餘步驟與樣品液相同。反應終止後各加入 1.5ml 乙酸乙酯，激烈振盪 15 秒，萃取反應 中的hippuric acid。再離心(1800×g) 5 分鐘， 取上層液 1ml，置入另一試管內。將此試管 水浴加熱至乾燥為止，再加入1ml 蒸餾水， 測水溶液在波長228nm 之吸光值。 (十)機能性水解液區分[92] 採 用 中 空 纖 維 狀 之 超 過 濾 膜(Hollow fiber ultrafiltration membrane)進行分離，使用 之超過濾膜之分子量區分(Molecular weight cut-off)分別為 1000、3000 及 10,000 Da。使 用之操作溫度為 25℃，壓力為 20 psi。首先 將400ml 水解液以 10k Da 的膜進行分離，分 離 過 程 繼 續 補 充 去 離 子 水 ， 使 透 流 液 (permeate)體積為原體積之 6 倍，最後使滯流 液(retentate)體積為 100ml，透流液濃縮成 300ml，如此可區分得到分子量小於 10 kD 的 透流液及分子量大於10 kD 的滯留液，再將 此部分所得之滯留液以3000 、1000Da 的膜 進行分離，依上述方法可得四個區分(>10000, 10000~3000, 3000~1000, <1000 Da)。結構簡 圖如下：

(十一)抑制癌細胞增生測試[93] 將濃度1×104/ml細胞分散於 96 well培養 盤中(100μl/well)隔夜培養後，於每well內加 入10μl水解液，培養 24 小時後，將培養液換 成 不 含FBS 血 清 之 培 養 液 ， 並 加 入 50μl 2mg/ml MTT，培養 2 小時後，將well內溶液 移除，並加入 150μl DMSO混合均勻後，於 570nm測定吸光值。 (十二)Raw 264.7 細胞培養及 TNF-α 分析 1、Raw 264.7 細胞培養 Raw 264.7 購自財團法人食品工業發 展 研 究 所 細 胞 保 存 中 心 。 培 養 於 90% DMEM 、 10% FBS、100 units/ml penicillin 及 100 μg/ml streptomycin培養基，並放置 5% CO2、37℃恆溫培養箱，當細胞數達 4× 107 /mL以上時進行繼代培養。欲進行實驗 時，當細胞增殖至 9 成滿時，以刮刀將細 胞取下，計算細胞數，取適當細胞濃度種 於24 well microplate中(每well 900 μl培養 液，細胞數1×105)，培養 24 h後，更換無血 清培養基並添加100 μl樣品培養 72h後，將 培養液取出進行細胞激素含量分析。 2、TNF-α 分析

使用R&D SYSTEMS Duoset cytokine kit 測定巨噬細胞株 Raw 264.7 分泌之細胞 激素含量，測定方法依照廠商提供的操作 步驟進行。 加入100 μl 0.8 μg/ml Capture Antibody 於 96 well 中，於室溫下放置隔夜(14~16 hr)。 將液體吸出，並以Wash Buffer 清洗三 次(每次 200 μl，且須移除乾淨)，最後一次 清洗完後，把盤子倒置於衛生紙上。加入

300 μl/well Block Buffer，於室溫下放置至

少1 小時，如前步驟清洗三次。 加入 100 μl standard 或 sample( 細 胞 培 養 液 ) ， 放 置 2hr，如前步驟清洗三次，加入 100 μl/wall Detection Antibody，放置於室溫 2 hr，如前 步 驟 清 洗 三 次 ， 加 入 100 μl/well Streptavidin-HRP ， 避 光 放 置 於 室 溫 20 min，如前步驟清洗三次，加入 100 μl/well Substrate Solution ， 避 光 放 置 於 室 溫 20 min，加入 50 μl/well Stop Solution 終止反應

並溫和確實混合均勻，迅速測定450 nm 吸 光值(並且最好以 540nm 或 570nm 校正)。 以標準品製作之檢量線如下： y = 0.0005x + 0.0553 R2 = 0.9862 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 500 1000 1500 TNF-a (pg/ml) OD 45 0 (十三)WS1 細胞培養 WS1 購自財團法人食品工業發展研究所 細胞保存中心。培養於 90% MEM 、 10% FBS 、 200 units/ml penicillin 及 200 μg/ml streptomycin培養基，並放置 5% CO2、37℃ 恆溫培養箱，當細胞數達1×106 /mL以上時進 行繼代培養。欲進行實驗時，當細胞增殖至 9 成滿時，以trypsin-EDTA將細胞取下，計算 細 胞 數 ， 取 適 當 細 胞 濃 度 種 於 96 well microplate中(每well 90μl培養液，細胞數 5× 103)，培養 24 h後，更換無血清培養基並添加 10 μl樣品培養 24 h後，進行MTT分析。 (十四)保護細胞免受 β-amyloid 攻擊分析[93] 1、Neuro 2A 細胞培養 Neuro 2A購自財團法人食品工業發展 研究所細胞保存中心。培養於89% MEM 、

10% FBS、1% NEAA、100 units/ml penicillin 及 100 μg/ml streptomycin培養基，並放置 5% CO2、37℃恆溫培養箱，當細胞數達 1 ×106 /mL以上時進行繼代培養。欲進行實驗

適當細胞濃度種於96 well microplate中(每 well 90μl培養液，細胞數 5×103)，培養 24 h 後 ， 更 換 為 1% 血 清 及 15μM β-amyloid(25-35)培養基或含僅 1%血清，並 添加10 μl樣品培養 48h後，進行MTT分析。 2、RBE4 細胞培養[94] RBE4 細胞株感謝由Dr. Roux提供。培 養於44% α-MEM 、 44% Ham’s F10、10% FBS 、 1% penicillin/streptomycin 、 1% Geneticin、0.1% bFGF培養基，並放置於 5% CO2、37℃恆溫培養箱，當細胞數達 1×106 /mL以上時進行繼代培養。欲進行實驗時， 當細胞增殖至9 成滿時，以trypsin-EDTA將 細胞取下，計算細胞數，取適當細胞濃度 種於96 well microplate中(每well 90μl培養 液，細胞數 5×103)，培養 48 h後，更換為 1%血清及 15μM β-amyloid(25-35)培養基或 含僅 1%血清，並添加 10 μl樣品培養 48h 後，進行MTT分析。 (十五)MTT 分析 MTT 是一種 tetrazolium salt，全名是 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyl-tetraz olium bromide，為一黃色的染劑，它可被活 細 胞 吸 收 並 被 粒 線 體(mitochondria) 中 的 succinate tetrazolium reductase (一種 succinate dehydrogenase)還原成藍色的 formazan，常用 於檢測藥物對細胞的生長及存活的影響。 測試時先將培養液移除，加入 50 μl 的 MTT solution (2 mg/ml MTT in PBS)，二小時 後，將MTT solution 移除，並加入 150 μl 的 DMSO，混合均勻後迅速測波長 570 nm 的吸 光值，吸光值越高則表示細胞數越多。 (十六)膜反應器操作 1、膜反應器系統 系 統 使 用 中 空 纖 維 型 分 離 膜 （A/G Technology Polysulfone Membrane ； UFP-3-c-4MA），分子篩為 3000 Daltons， 纖維管徑0.5 mm，膜表面積為 0.065 m2， 於 25-50℃下操作時進口壓力上限為 45 psi，pH 值適用範圍為 2-13。 整個反應系統以玻璃二重保溫缸配合 恆溫水槽，維持進料槽與反應槽酵素水解 所需要的溫度，兩槽內以電磁攪拌攪拌， 反應液體積以液面高度維持控制器（level controller）配合電磁閥維持，使進料速度與 膜反應器條件在 35℃ 與 pH 7.5；反應體 積為 500 mL，受質濃度為 1%，酵素為組合 trypsin、chymotrypsin、thermolysin。操作 時間為 6 小時。溶液在反應槽中駐留時間 （residence time, RT）之計算方式為：RT = 反應液體積/透流速率。 2、操作步驟 使用之受質為 1%之猪血溶於 0.1M, pH 7.5 磷酸緩衝液中，攪拌溶解。首先將 受質溶液充填於保溫的反應槽中，加入所 需酵素濃度的酵素量，使酵素均勻分散於 受質溶液中。利用調整膜進出口壓力使透 流率維持一定，反應液以幫浦打入超過濾 膜中，透流液（含有可自由通透膜之胜肽） 經流量計後以容器收集，而滯留液則重回 到反應槽中繼續水解，此時，進料槽的幫 浦打入與收集之透流液等量的受質溶液進 入反應槽，使反應體積維持恆定。膜反應 器構造圖如下： 五、結果與討論 (一)一般成分 1、組成分分析 三種受質(血球、血漿及去纖維蛋白原 血漿)凍乾粉末的組成分分析結果如表四， 三種受質中蛋白質含量均大於 75%，其 中，凍乾血球的蛋白質含量最高，達85%。 另外，三種受質中血漿及去纖維蛋白原血 漿灰分含量較高，可能與採血時，添加抗 凝血劑(檸檬酸鈉)有關。

2、水解過程 pH 變化 受質於酵素水解過程中，水解液之氨 含量會隨著水解時間增長而增加(data not shown)。其中，動物死後其ATP會受到酵素 作用產生一連串的分解過程：ATP→ADP →AMP，而AMP會受 5'-nucleotidases作用 降解為IMP與NH3，其含量則與核苷酸酶活 性有關，這三種受質水解液氨含量之增加 可能與上述因子有關，且顯示血球、血漿 中可能存在自消化酵素作用。也由於水解 液之氨含量增加，可能造成水解液pH值改 變。 經分析各水解過程pH 變化，pH 值變

動幅度小於±0.1(data not shown)，主因為水 解在緩衝溶液中進行。因此水解過桯可以 維持各酵素組合可以在較佳的 pH 環境下 進行水解。 3、胺基酸及雙胜肽含量分析 有文獻證實雙胜肽anserine、carnosine 具有抗氧化等能力，而本研究分析各水解 條件之水解液中anserine、carnosine 含量， 發現各水解液中皆無 anserine 存在，而血 球以trypsin、chymotrypsin、thermolysin 組 成之混合酵素或使用單一酵素 Alcalase 可 發現水解過程會產生 carnosine，該含量變 化如表五。 (二)猪血水解液機能性分析 1、抑制血管收縮素轉化酶測試 因生物活性胜肽之功能性，可能與其 胺基酸序列及胜肽N 端 C 端有關連性，而 利用酵素水解生產活性胜肽中，酵素的種 類決定了胜肽的N 端 C 端。本研究選擇文 獻中常用於生產生物活性胜肽且水解條件 在 中 性 環 境 之 酵 素(trypsin, chymotrysin, thermolysin, alcalase, flavozyme 等)來水解 猪血成分，期望能得到較佳的生物活性且 避免水解後因中和產生大量鹽類。水解時 採 單 一 酵 素 或 混 合 具 相 近 水 解 條 件(pH, Temp)之酵素進行水解。由表六結果顯示， 使用單一酵素trypsin 水解之水解液，其抑 制ACE 活性較差，其中血漿及去纖維蛋白 原血漿最差，可能與trypsin 僅能對特定胺 基酸序列進行剪切，因而未能有效水解受 質，產生較多的ACEI 胜肽，此外，也可能 因為血漿部份含有水解酵素抑制劑所致 [110]。若使用複合的 trypsin. chymotrypsin. thermolysin 酵素水解血球，隨著水解時間 增加，ACE 抑制活性快速增加，水解血球 6 小時，可達到最佳的 ACE 抑制效果，IC50 為0.58 mg/ml，與具良好抑制 ACE 活性之 酪蛋白水解液[111]擁有相近活性，與前人 研究比較，雖以 thermolysin 水解 Chicken muscle、Ovalbumin 及 Chum Salmon Muscle 效果稍優於本研究結果[111-114]，但因其單 純以 thermolysin 作為酵素，成本非常高 昂，並不適合用於工廠量產。另外，文獻 指出ACE 抑制劑多為含有 2 ~12 個胺基酸 的短鏈胜肽，水解物的水解程度越高，其 平均胜肽鏈就越短，因而可能得到對血管 收素轉化酶抑制活性較高的產物。使用膠 體管柱層析得到水解液分子量分佈如圖三 所示，隨著水解時間增加，分子量逐漸集 中於1002~1450 Da 之間，約為 9~13 胺基 酸所組成之胜肽。水解超過 6 小時後，水 解物之抑制ACE 活性逐漸降低，可能是過 度水解造成活性胜肽降解成小分子胜肽或 胺基酸。 2、清除自由基能力測試 水解液清除 DPPH 自由基能力方面如 表七所示。使用複合的trypsin. chymotrypsin. thermolysin 酵素，隨著水解時間增加，清 除自由基能力增加，水解血球10 小時所得 到之水解液有最佳的清除自由基效果，捕 捉能力為64.9%。以 500 ppm tocopherol、 500 ppm BHT 及 10mg/ml Carnosine 這三個 已知具強抗氧化能力的物質對照比較，捕 捉能力分別為90.0% 、90.6%及 82.6%。由 先前分析胺基酸及雙胜肽含量結果中，清 除 DPPH 自由基效果較佳者，其皆含有相 當量之carnosine。前人研究中，以 Actinase 及papain 水解 porcine myofibrillar proteins

之清除 DPPH 自由基效果為 65%及 70%， 與本研究結果相近[115]。 3、還原力測試 水解液之還原力如表八所示。還原力 之測定參考1988 年Oyaizu之方法 [89]，分 析樣品對赤血鹽(potassium ferricyanide)中

Fe3+還原成Fe2+之亞氰錯離子，而此亞氰錯 離子再與Fe3+生成亞鐵氰化鐵即普魯士藍 (Prussian blue)，普魯士藍在 700nm下有較 強之吸光值，吸光值越高即還原力愈強。 使用單一酵素trypsin 酵素水解，隨著 水解時間增加，水解液還原力增加。水解 血球24 小時所得到之水解液有較佳的還原 力，OD700 為 0.223，在其他受質與酵素組 合中，還原力普遍均不佳。與已知具強還 原力的物質100 ppm、200 ppm ascorbic acid 對 照 比 較 ， 其 OD700 分 別 為 0.830 及 1.483，水解液之還原力不佳，但仍顯示水 解液中之仍少部份胜肽具有還原力。 4、胜肽免疫調節活性 以酵素水解液刺激巨噬細胞株 RAW 264.7，探討其是否能刺激細胞產生 TNF-α 細胞激素，藉以觀察猪血水解液是否具有 免疫調節機能。由表九的結果顯示，本研 究所使用的酵素對血球、血漿及去纖維蛋 白原血漿，均具有些許刺激RAW 264.7 巨 噬細胞分泌 TNF-α。與已知可誘發巨噬細 胞之 Lipopolysaccharide (LPS)相比較，1 μg/ml LPS 可刺激 Raw 264.7 細胞產生 1436 pg/ml TNF，使用 Alcalase 水解血球 10 小時 及 使 用 複 合 trypsin 、 chymotrypsin 、 thermolysin 水解血漿，可分別產生 692 及 601 pg/ml TNF-α。而市售雞精則具有刺激 RAW 264.7 分泌 TNF-α 1101 pg/ml 的效果 [116]。其效果較佳，可能是由於市售雞精 採萃取方式生產，萃取而得的多是大分子 胜肽或蛋白質，因此對RAW 264.7 可產生 外來物刺激的效果，相對於酵素水解液多 為小分子物質，因此效果較差。 5、促進纖維母細胞增生 以皮膚纖維母細胞WS1 觀察水解液對 皮膚細胞的增生表現。如圖四(A)結果顯 示，未經水解之猪血球，不具有促進 WS1 細胞增生效果，但經過trypsin 水解 2 小時 後，對WS1 增生效果在 113%，但統計後無 顯著差異，於水解10 小時可達最高 124%； 如使用trypsin、chymotrypsin、 thermolysin 酵素，由圖四(B)結果顯示，水解 2 小時， 即可達到最高136%，但是隨著水解時間增 加，增生效果並不再提升，整體上增生效 果並不顯著。而以血漿或去纖維蛋白原血 漿為受質，於各組酵素水解下，均未能促 進WS1 細胞增生(data not shown)。

由 McFarland 及 Holliday 的研究中 [117]，於培養基中添加 carnosine(一種雙胜 肽)，可促進纖維母細胞 MRC-5 增生。由於 先前分析胺基酸及雙胜肽含量結果中，猪 血球經過酵素水解後，會產生 carnosine 雙 胜肽，而猪血漿及去纖維蛋白原血漿均未 能生成carnosine，因此促進 WS1 細胞增生 效果，推論可能源自於 carnosine，另外， 於前人研究中[118]，膠原蛋白胜肽片段對 於皮膚細胞亦具增生效果，因此猪血球水 解液中，可能其他胜肽亦具有促進皮膚細 胞增生效果。 6、抑制腫瘤細胞生長 本 研 究 以 單 獨 Alcalase 酵 素 及 Alcalase、Flavozyme 兩混合酵素水解猪血 球、血漿、去纖蛋白原血漿並於不同水解 時間取樣，測試水解液抑制B16F10 及 Hep G2 腫瘤細胞生長效果，結果顯示水解液並 沒有顯著的抑制效果(圖五)。前人的研究顯 示[119]，牛乳之乳鐵蛋白對腫瘤細胞有顯 著的抑制效果，另外，也有學者研究[120]， 經過酵素水解後，可大大的提升乳鐵蛋白 之抑制腫瘤細胞增生效果；而乳鐵蛋白與 本研究之血漿中運鐵蛋白結構十分相似， 故以transferrin 運鐵蛋白對兩腫瘤(B16F10, Hep G2)進行測試，結果顯示(圖六)，當 tranferrin 濃度達 1 mg/ml 時 B16F10 仍無顯 著的效果，但對Hep G2 時即有顯著的抑制 增生效果。故推論水解液中仍具有抑制腫 瘤細胞增生之活性胜肽，但是其於水解液 中含量少，故無法顯現。 7、保護神經細胞 Neuro 2A 及腦血管上皮 細胞RBE4 避免受到 β-amyloid 攻擊 前人研究推論β-amyloid 為一種神經毒 [121] ， 可 造 成 腦 部 功 能 不 正 常 ， 且 與 Alzheimer's Disease 息息相關，β-amyloid 藉 由誘導培養的神經細胞走向細胞凋亡產生 氧化壓力或其他原因而促使細胞死亡。而 β-amyloid 中以 25~35 序列最具毒性[122]。

因Neuro 2A 廣泛被使用的神經模式細胞，

β-amyloid(25-35)及水解液一同培養，以確 認水解液對神經細胞的保護作用。 由結果顯示，隨著 β-amyloid 濃度上 升，Neuro 2A 細胞存活數降低，當 β-amyloid 15 μM 時，與控制組(未含 β-amyloid)相比， 細胞存活67%，並以 β-amyloid 15 μM 進行 後續實驗。於Neuro 2A 培養液中，添加猪 血酵素水解液，由結果顯示，水解液對 Neuro 2A 並無抑制生長或促進增生的現象 (data not shown)。

當於 Neuro 2A 培養液中，一併添加 β-amyloid 及猪血酵素水解液時，由圖八結 果 顯 示 ， 使 用 trypsin 、 chymotrypsin 、 thermolysin 水解 10 小時，可保護 Neuro 2A 細胞，細胞存活數 75%，但保護效果並不 顯著。以血漿或去纖維蛋白原血漿為受 質，於各組酵素水解下，均未能保護Neuro

2A 細胞避免受到 β-amyloid 攻擊(data not shown)。 對Neuro 2A 細胞保護效果不佳，可能 是前人以Neruo 2A 模式測試 β-amyloid 攻 擊研究中，主要以酚類、flavonoid、維生素 E 等來保護細胞，尚無學者以蛋白質或胜肽 作為樣品，因此可能胜肽能提供之保護效 果在 Neuro 2A 細胞無法顯現。在另一學 者，則分別以胺基酸及雙胜肽測試其保護 RBE4 細胞避免受到 β-amyloid 攻擊細胞結 果[19]，因此本研究進一步依該模式測試猪 血水解液的功能性。 當於 RBE4 細胞培養液中，一併添加 β-amyloid 及猪血酵素水解液時，由圖九(A) 結果顯示，使用Alcalase 水解 10 小時，可 保護 RBE4 細胞，細胞存活數 80%，但保 護效果並不顯著。由圖九(B)結果顯示，使 用複合trypsin、chymotrypsin、 thermolysin 水解10 小時，可保護 RBE4 細胞，細胞存 活數 82%。以血漿或去纖維蛋白原血漿為 受質，於各組酵素水解下，均未能保護 RBE4 細胞避免受到 β-amyloid 攻擊(data not shown)。 因β-amyloid 藉產生氧化壓力，誘導培 養的神經細胞走向細胞凋亡，而於先前的 研 究 ， 以 複 合 trypsin 、 chymotrypsin 、 thermolysine 水解猪血球 10 小時，可達到 較高的清除 DPPH 效果，與 RBE4 的保護 效果趨勢相同，因此，推論猪血水解液可 保護RBE4 細胞免受 β-amyloid，與水解液 抗氧化性相關。另外，於前人研究中[19]， carnosine 及 β-alanine 具有保護老鼠腦部 RBE4 細胞避免受到 β-amyloid 攻擊，由先 前 分 析 胺 基 酸 及 雙 胜 肽 含 量 結 果 中 ， trypsin、chymotrypsin、 thermolysine 水解 猪血球後，水解液含 carnosine，可能也是 貢獻保護效果的來源。 (三)機能性水解液區分 由先前的機能性分析中，得知猪血球經 混合酵素trypsin、chymotrypsin、thermolysin 水解後，可獲得較佳的 ACE 抑制能力及 DPPH 自由基清除效果，為瞭解功能性胜肽 主要分佈的分子量範圍，以利後續膜反應器 設計的參考，本研究進一步利用濾析將水解 液依分子量區分。於抑制 ACE 活性上(表 十)，以 1~3 kDa 間之 IC50 值最低，顯示此 區分為水解液主要提供抑制 ACE 酵素活性 者。於清除 DPPH 自由基方面(表十一)，分 子量1~3 kDa 之區分對於水解液清除自由基 的貢獻較大，而分子量小於1 kDa 者次之。 由先前分析胺基酸及雙胜肽含量結果中，於 不同酵素與受質的水解條件下所製備之水解 液之中，有二水解液具較好的清除自由基效 果 ， 且 經 分 析 各 個 水 解 液 中 anserine 及 carnosine（已知之具有抗氧化性之雙胜肽） 含量，也發現僅此兩水解液含有carnosine 雙 胜肽，且其含量隨著水解時間增加而上升， 且以水解24 小時含量最高。但是，本研究發 現此二水解液最具清除DPPH 能力之水解時 間為10 小時，且於水解 24 小時反而降低其 抗氧化能力，而藉由濾析區分之實驗結果可 以推論水解液中除了carnosine 具清除 DPPH 自由基外，分子量1~3 kDa 之胜肽也同樣具 有重要的地位，也因此水解24 小時，使大分 子量之胜肽水解成較小分子之胜肽，故水解 液之清除DPPH 自由基能力下降。 (四)膜反應器連續式生產 為能連續式生產生物活性胜肽，本研究 藉由膜反應器方式，以猪血球為受質，使用 組合酵素(trypsin、chymotrypsin、thermolysin) 於反應器內將受質水解，並使分子量小於3k Da 胜肽，能隨時透流出膜，不再被水解，同

時連續式加入受質，使反應體積維持一定， 連續式生產生物活性胜肽。另外，為能得到 較佳連續式生產條件，實驗中改變不同酵素/ 受質比及駐留時間等條件，期能得到生產生 物活性胜肽的較佳連續操作方式。 1、抑制血管收縮素轉化酶測試 由圖十結果顯示，以E/S 比為 1/100， 駐留時間為 100min 時，隨著操作時間增 加，透流液之抑制ACE 活性也逐漸提升， 操作6 hr 時，抑制率達 56%，同時表示整 體反應器在操作 6 hr 時仍無法達 steady state。當 E/S 比提高至 1/10，駐留時間 100 min 時，雖使抑制 ACE 活性上升，但 6hr

內仍未達 steady state，再把 E/S 比提高至

1/5 時，於操作 1 hr 時，即可取得抑制 81% ACE 活性之產物，於操作 2hr 以後，抑制 ACE 活性則維持穏定 steady state，抑制率

達86%，操作 6 hr 時，抑制率仍未有減少的 現象，表示酵素活性於6 hr 操作時間內沒 有顯著的變化。 雖然提高E/S 比，將增加酵素使用量， 而使操作成本上升，且容易造成過度水 解，不利於批式水解環境生產生物活性胜 肽。但在膜反應器系統中，因酵素於反應 起始添加後，即不再加入，一直留於反應 器中，連續水解受質，且受質維持在一定 的駐留時間下，使活性胜肽不致於過度水 解而損失，因此總體而言，提高酵素濃度 是對本研究膜反應器連續生產生物胜肽， 可有效加速生產活性胜肽速度。 2、清除 DPPH 自由基能力測試 在膜反應器連續生產 DPPH 自由基能 力測試上，在不同酵素/受質比及駐留時間 等條件下，與抑制血管收縮素轉化酶測試 有相同現象，在E/S 比為 1/100 時，6 hr 內 清除 DPPH 自由基結果逐漸上升，未能達 到steady state，當提高 1/5 時，操作 2hr 所 獲得之透流液清除 DPPH 自由基效果可達 54%，繼續延長操作時間，清除自由基效果 未有顯著變化。 六、計畫成果自評 研究結果證實猪血球酵素水解液於體外 試驗具有降高血壓及抗氧化活性，而且將該 水解液添加在含有 β-amyloid(25-35)之 RBE4 培養液中，RBE4 細胞存活率可提升，具潛 在預防Alzheimer's Disease 效果。相較於擁有 良好抑制 ACE 活性之酪蛋白水解液[111]具 有相近活性，且優於許多其他動植物水解液 之研究結果。另外，血球之酵素水解液亦同 時具有其他機能性，包括還原力、促進皮膚 纖維母細胞增生、免疫調節、抑制腫瘤細胞 生長等，雖然所表現之效果未優於其他已知 產品或研究，但在一水解產品中同時存在各 類機能性亦屬難得，因此值得發展為產品。 所以本研究在已蒐集的文獻中，首先運用膜 反應器方式，連續式生產生物活性胜肽。此 連續式生產方式，除可快速連續生產活性胜 肽及有效節省酵素使用量外，亦可避免蛋白 質或胜肽過度水解而損失其活性，同時也因 具初步脫色的效果，使暗紅色之猪血球水解 液，經膜過濾後，轉變成金黃色，更提高消 費大眾接受度。 雖然血漿及去纖維蛋白原血漿於本研究 測試的多種生物活性中，均未發現具有較顯 著的機能性，然而該二受質亦含豐富蛋白 質，如以廢棄物處理實屬可惜，在相關前人 研究中[124]，牛血漿經酵素水解後，具有顯 者的 antigenotoxic 效果，因此後續血漿水解 液如繼續朝該方向研究或者往其他方向加以 利用，將能增廣猪血酵素水解液之用途，及 有效利用環境資源。 七、參考文獻

[1] Lee DG, Kim DH, Park Y, Kim HK, Kim HN, Shin

YK, Choi CH, Hahm KS. 2001. Fungicidal effect of antimicrobial peptide, PMAP-23, isolated from porcine myeloid against Candida albicans. Biochem Biophys Res Commun 282:570-574.

[2] Park Y, Lee DG, Jang SH, Woo ER, Jeong HG, Choi

CH, Hahm KS. 2003. A Leu-Lys-rich antimicrobial peptide: activity and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta 1645:172-182.

[3] Powers J–PS, Hancock REW. 2003. The

relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides 24:1681-1691.

[4] Anne PL. 2001. Bioactive peptides derived from

bovine whey proteins: opioid and ace-inhibitory peptides. Trends in Food Sci Technol 11:347-356.

[5] Dhulster P, Kapel R. Froidevaux R,

Nedjar-Arroume N, Fertin-Bazus A, Choisnard L, Guillochon D. 2002. Advancement in intermediate opioid peptide production in an enzymatic membrane reactor assisted by solvent extraction. Desalination 148:221-216.