肌肉生長抑制素單體型和優秀運動選手相關性之探討

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(1)國立臺灣師範大學. 運動科學研究所. 碩士學位論文. 肌肉生長抑制素單體型和優秀運動選手相關性之探討. 研究生：陳宗泰指導教授：謝伸裕. 中華民國九十九年八月中華民國臺北市.

(2) 肌肉生長抑制素單體型和優秀運動選手相關性之探討研究生：陳宗泰指導老師：謝伸裕. 2010 年 8 月. 摘要肌肉生長抑制素 (myostatin) 又名為第八生長分化因子-8 (growth and differentiation factor-8, GDF-8)，主要的作用為抑制肌肉過度地生長。 Myostatin 基因位於人體第二對染色體長臂 32.2 處，共由 9262 對鹼基對所組成。目前已知不論是藉由人工方式或自然突變使 myostatin 基因百分之百喪失其功能後，此動物的肌肉量將明顯大於相同物種的 1~2 倍。至今，已有至少 20 種 myostatin 基因多型性被發現於不同人種中。目的：本研究探討臺灣地區優秀舉重和體操運動員之 myostatin 基因單體型頻率是否有別於對照組。方法：本研究採集國內優秀舉重和體操選手 41 位及控制組 50 位之 DNA 檢體，進行 myostatin 基因定序和單體型分析後，以 SPSS 統計套裝軟體進行相關的統計顯著性檢定，以 χ 2. -test 檢定法進行 (α=.05) 。結果：沒有任何舉重選手帶有 MSTN. +2278 G/A (rs35481413) A 對偶基因者；體操選手帶有 MSTN +2278 G/A (rs35481413) A 對偶基因者的比例為 8.3%；對照組則為 3.1%，但未達顯著差異 (p>.05)。在單體型分析部分，並未發現優秀運動員和對照組之間的明顯差異 (p>.05) 。結論：優秀運動員的 myostatin 基因多形性和單體型頻率未和對照組有明顯差異，意指 myostatin 基因可能無法用來分辨優秀運動員，如：舉重與體操選手。. 關鍵詞：生長變異因子-8、基因多形性、對偶基因、舉重、體操 i.

(3) Association of myostatin gene haplotype with elite athletes August 2010. Student: Zong-Tai Chen Advisor: Shen-Yu Hsieh. Abstract Myostatin in animals is also called growth and differentiation factor-8 (GDF-8). It is a negative regulator of skeletal muscle growth. The myostatin gene on chromosome 2 (2q32.2) of human is composed by 9262 bases. Individual muscles of the mutant animals can be as much as two times larger than those of their normal species if the myostatin gene lost it’s functions. At the moment, there were more than 20 myostatin ploymorphisms discovered in different human races. Purpose: To investigate whether myostatin gene haplotypes of elite weight lifters and gymnasts in Taiwan are different from controls. Methods: We examined 41 elite athletes (weight lifter and gymnast) and 50 controls, myostatin genotypes and haplotypes was identified by sequencing. Differences were evaluated using SPSS χ 2 -test (α=.05). Results: The frequency of myostatin +2278 G/A (rs35481413) A allele was higher in gymnasts and controls as compared to elite weight lifters (8.3% / 3.1% / 0%), but was not statistically significant (p > .05). In the part of haplotype analysis, there was no significant difference between elite athletes and controls (p > .05). Conclusion: Myostatin polymorphisms and haplotypes of elite athletes in this study was not significantly differ from controls, it means that myostatin gene may not be a candidate gene for searching elite athletes, especially for weight lifers and gymnasts. Key words: GDF-8, polymorphisms, allele, weight lifer, gymnast. ii.

(4) 謝誌三年前，我選擇了分子生物學作為我的研究方向，因為我對於生物與生俱來的運動能力感到好奇，但我並沒有任何紮實的科學知識基礎，於是我秉持著單純的喜好進入長庚大學實驗室從零學起，同時旁聽台師大和長庚大學的生科系課程，當初的我感到充實愉快。如今，很難相信我已經完成了這項艱鉅的任務，長期往返台北和桃園甚至在實驗室過夜已不算稀奇，回首這三年，我要感謝的人真的很多。幫助我的人不計其數，首先是我的指導老師-謝伸裕老師，是您引領我進入這個學術研究的殿堂，且盡力督導我的學業表現；口試委員-謝玲玲和謝錦城老師，在論文審查時悉心斧正，提供我許多寶貴的意見；最樂觀的麗玲學姊，您是我實驗操作和研究靈感的導師；最耐心和熱心的志雄學長，是您帶我渡過最艱困的實驗流程，您總是不厭其煩地為我解釋各種實驗上的問題，您的好心腸真的讓我特別感動；活潑開朗的暉慈學姊和已畢業的國豪學長，也是幫我解決無數的實驗難題；其他實驗室的夥伴包括：柏帆、姿汶、怡廷、蕙謙、易廷學長、峻逸學長、嘉縈學姊、建芳、喵喵學姊、克柔、彥熹…等等，你們都適時地給予我不可或缺的幫助。最後，當然是我最摯愛的父母親，你們的全力支持絕對是我最. iii.

(5) 大的靠山，讓我沒有後顧之憂；千盈則是我最大的精神支柱，謝謝妳在水深火熱的時候還能體諒和信任我，讓我在苦悶的日子裡獲得心靈上的紓解和安定感。謝謝各位。宗泰 2010 年 8 月 23 日. iv.

(6) 目次中文摘要……………………………………………………………………………i 英文摘要……………………………………………………………………………ii 謝誌…………………………………………………………………………………iii 目次…………………………………………………………………………………v 表次…………………………………………………………………………………vii 圖次………………………………………………………………………………viii. 第壹章緒論一、問題背景………………………………………………………………1 二、研究目的………………………………………………………………3 三、研究假設………………………………………………………………3 四、名詞操作性定義………………………………………………………3 五、研究的重要性…………………………………………………………4. 第貳章文獻探討一、前言……………………………………………………………………5 二、Myostatin 蛋白質的結構和特性……………………………………5 三、Myostatin 基因多形性………………………………………………10 四、結語……………………………………………………………………13. 第參章材料與方法一、研究對象………………………………………………………………14 二、實驗流程………………………………………………………………15 三、實驗步驟………………………………………………………………16 四、統計分析………………………………………………………………20. 第肆章結果一、Myostatin 基因多形性………………………………………………21 二、單體型分析……………………………………………………………26. v.

(7) 第伍章討論一、Myostatin 基因多形性和優秀運動員的相關性……………………30 二、結論和建議……………………………………………………………34. 引用文獻…………………………………………………………………35 附錄一、受試者告知同意書…………………………………………38 附錄二、引子序列、PCR 反應條件及產物大小…………………40 附錄三、定序反應之指定溶液的調配比例和 PCR 反應條件 …………………………………………………………… 42 作者小傳…………………………………………………………………43. vi.

(8) 表次表 3-1、受試者基本資料……………………………………………14 表4-1、運動員和對照組之-1814 -/A、-1792 T/C 和 -1760 G/C基因型和對偶基因分佈……………………………22 表 4-2、運動員和對照組之+463 A/- 和+2078 A/T 基因型和對偶基因分佈…………………………………………23 表 4-3、運動員和對照組之+2278 G/A 基因型和對偶基因分佈……24 表 4-4、舉重組、體操組和對照組之+2278 G/A 基因型和對偶基因分佈………………………………………………24 表4-5、運動員和對照組之+3121 T/C 和+3160 A/G基因型和對偶基因分佈…………………………………………25 表4-6、運動員和對照組之 5’ -promoter區的單體型分析和分配頻率………………………………………………26 表4-7、運動員和對照組之Intron 1區的單體型分析和分配頻率……………………………………………………27 表4-8、運動員和對照組之Intron 2區的單體型分析和分配頻率……………………………………………………28 表 5-1、與他國 MSTN MAF 相互對照表 I……………………………30 表 5-2、與他國 MSTN MAF 相互對照表 II…………………………31. vii.

(9) 圖次圖 2-1、Myostatin pathway 推測圖…………………………………9 圖 3-1、核酸自動定序儀……………………………………………19 圖 3-2、基因定序之結果判讀………………………………………19 圖 4-1、MSTN 基因序列中的八個基因多形性位點示意圖…………28 圖 4-2、MSTN +2278 G/A (rs35481413) 基因型之 PCR-RFLP 判讀結果……………………………………………………29. viii.

(10) 1. 第壹章緒論一、問題背景肌肉生長抑制素 (myostatin) 又名為第八生長分化因子 (growth and differentiation factor-8, GDF-8)，當動物的肌肉生長抑制素基因突變或被抑制時，將無法轉譯出肌肉生長抑制素蛋白質，導致動物的肌肉量將會明顯比一般同種同齡的動物大 (McPherron, Lawler, & Lee, 1997) 。人類亦是如此， Schuelke 等 (2004) 發現一個有著肌肉量大的德國小孩，其肌肉生長抑制素基因為相當罕見的突變型，在出生後六天的他的股四頭肌肌肉量已是同性同齡嬰兒的兩倍。據了解而得知此孩童的母親曾經是位傑出的運動員，且其肌肉生長抑制素基因亦有突變的跡象，所以此孩童的突變情形很可能和家族遺傳有關，此外，可能由於擁有比一般人還要大的肌肉量的關係，此孩童在四歲半時已能平舉三公斤的啞鈴。由此研究可知，人類肌肉生長抑制素基因的表現很可能和肌力息息相關。事實上，在人類當中，這種肌肉生長抑制素基因突變的人相當罕見，因此近幾年的研究較偏向於肌肉生長抑制素基因多形性 (polymorphism) 的方向，畢竟基因多形性的種類和變異頻率比基因突變要高出許多，而且基因突變往往會伴隨著某些先天性疾病的.

(11) 2. 發生，就運動領域的研究員來說，提前預知運動選手負面的生理狀態是較不樂見的。在美國國家生技資訊中心. (National Center for. Biotechnology Information,NCBI) 的網路資料庫中已詳細記載著數十個肌肉生長抑制素基因多形性位點和族群基因頻率等訊息，最近 Zhang 等 (2008) 對中國漢族進行肌肉生長抑制素基因多形性分析，在 32 位受試者中共發現 17 個肌肉生長抑制素基因多形性位點，其中六個位點未曾被報導過，可見肌肉生長抑制素基因多形性仍有研究的空間，特別是對於肌力和肌肉量的調控將是體育運動界所重視的。長久以來，舉重是臺灣體育發展的重點項目之一，近幾年來在國際賽場上也有不錯的表現，特別是 2008 年北京奧運會，兩位舉重女將陳葦綾和盧映錡為臺灣取得兩面寶貴的銅牌，此外，另外兩位名將楊景翊和王信淵亦分別獲得男子組 56 公斤級的第四名和第七名，和獎牌擦身而過，可見臺灣的舉重表現是有目共睹且具發展性。不可否認，舉重是一項強調全身性肌力的運動項目，藉由本研究期盼能夠進一步發現肌肉生長抑制素基因多形性和臺灣地區優秀舉重運動員的關係，進而提供有志於從事於競技運動者在選擇運動項目或型態上的建議。.

(12) 3. 二、研究目的本研究的目的在於探討臺灣地區優秀舉重運動員之肌肉生長抑制素基因多形性和單體型 (haplotype) 頻率與對照組的相關性。. 三、研究假設藉由肌肉生長抑制素基因多形性和單體型的頻率推測優秀舉重和體操運動員比對照組更易展現肌力的因素。. 四、研究限制 (一) 樣本數有限本研究所找尋的運動員皆為國內頂尖的選手，因此在實驗組的樣本數可能會受到限制。然而，當本研究定序 100 人時，所忽略的變異位點之較小對偶基因變異頻率理論上已小於 0.01，已是可被接受的範圍。. 五、名詞操作性定義 (一) 單體型 (haplotype) 在本研究中是指一組位於單一染色體特定區域的 SNP 組合。.

(13) 4. (二) 基因定序 (sequencing) 基因定序是本研究的實驗步驟之一，主要目的在於辨別某段基因的 DNA 序列之鹼基代碼，包括：腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T)、鳥嘌呤 (G) 和胞嘧啶 (C)。. 六、研究的重要性本研究從分子生物的角度探討優秀運動員成功的先天因素，待發現更多和傑出選手相關的基因多形性後，將能提供有志於從事於競技運動者在選擇運動項目和運動型態上的建議。.

(14) 5. 第貳章文獻探討一、前言肌肉生長抑制素 (myostatin) 又名為第八生長分化因子 (growth and differentiation factor-8, GDF-8)，是轉化生長因子β (transforming growth factor-beta, TGF-β) 蛋白家族的一員，主要在生物的骨骼肌中表現。最早是 McPherron, Lawler, & Lee (1997) 首次研究肌肉生長抑制素對調控肌肉生長的影響，發現此基因突變 (mutant type) 的老鼠其肌肉量約為未突變 (wild type) 老鼠的兩倍。此後，有許多學者紛紛開始對肌肉生長抑制素進行廣泛性地研究，對象從老鼠、牛、魚到人類；研究層次從蛋白質到最原始的 DNA 序列的變異；研究目的從基本功能到醫療運用。. 二、肌肉生長抑制素蛋白結構和特性 (一) 結構肌肉生長抑制素蛋白是由 376 個胺基酸所組成，具有 TGF-β 家族的三個主要特徵： 1. 一個能夠分泌訊息的序列。 2. N 端 (N-terminal) 有一個蛋白質水解的原胜肽 (propeptide) 區。 3..

(15) 6. C 端. (C-terminal) 包含九個半胱氨酸. (cysteine) 殘基. (residues) (McPherron 等, 1997)。. (二) 表現形式 McPherron 等 (1997) 觀察老鼠於胚胎期各階段和各部位的肌肉生長抑制素信使 RNA (messenger RNA, mRNA) 表現，發現肌肉生長抑制素 mRNA 早在老鼠交配後 (post-coitum) 第 9.5 天就表現於成長中的胚胎組織，主要是表現於發展中體節 (somites) 的肌節 (myotome) 。此外，肌肉生長抑制素 mRNA 之表現在各部位的肌肉中所佔的比例也有明顯的不同。除肌肉外，許多研究也在不同組織中發現肌肉生長抑制素 mRNA 或蛋白質，例如 Sharma 等 (1999) 就在心肌細胞和心藏的普金氏纖維 (Purkinje fibers) 中發現肌肉生長抑制素蛋白。此外，Ji 等 (1998) 在乳腺中發現肌肉生長抑制素 mRNA 的表現。. (三) 生物功能 McPherron 等 (1997) 藉由基因標的 (gene targeting) 將老鼠的肌肉生長抑制素基因剔除，發現肌肉生長抑制素基因突變型同型合子 (homozygous mutant) 的老鼠之肌肉量明顯大於其他同時出生的異型合子 (heterozygous) 和野生型 (wild type) 老鼠。.

(16) 7. 不論是肌纖維增殖. (hyperplasia). 或肌纖維肥大. (hypertrophy)，都是造成肌肉量明顯增加的因素。此外，Thomas 等 (2000) 發現透過去除肌肉生長抑制素功能而解除對肌肉母細胞 (myoblasts) 增生的管制是肌肉量增加更深一層的原因。因此，肌肉生長抑制素主要的作用為抑制肌肉過度生長，對於調節動物肌肉量扮演重要的角色。. (四) 作用機轉由體內分泌的訊號分子組成的轉化生長因子 β 大家族約含有 30種蛋白，包括骨形態發生蛋白和激活素 (activins)，而肌肉生長抑制素只是其中之一。除調節細胞功能外，轉化生長因子β蛋白還參與發育和致癌作用。它們通過II-型和I-型轉化生長因子β受體及細胞內受動器 (Smads) 將訊號傳輸給細胞核。其中Smad蛋白家族在轉化生長因子β路徑中扮演關鍵的角色，當細胞膜上接受器激活時，可以活化Smad，使Smad由細胞質轉移到細胞核內，扮演轉錄因子 (transcription factors) 的作用，以便激活與轉化生長因子β有關的基因表現 (Derynck & Zhang，2003)。在研究中發現，經過肌肉生長抑制素基因改造的老鼠肌肉中表現出 ActRIIB 缺乏酵素區域的型式，這些老鼠的肌肉量比控制組大 125%，因此他們認為 II-型轉化生長因子β受體 ActRIIB 可能會調.

(17) 8. 節活體中肌肉生長抑制素的作用 (Lee & McPherron，2001 )。肌肉生長抑制素和其他轉化生長因子β 家族成員一樣在同一條訊息路徑中作用，包括 Smad 的磷酸化。研究已指出 Smad2、 Smad3 和 Smad4 與肌肉生長抑制素訊息傳遞有關，然而 Smad7 和 Smurf1 則是和肌肉生長抑制素的訊息抑制有關 (Zhu 等, 2004)。當肌肉生長抑制素和卵泡抑制相關基因 (Follistatin-related gene, FLRG) 、生長和分化因子相關的血清蛋白 -1 (Growth and differentiation factor-associated serum protein-1,GASP-1)、 human. small. glutamine-rich. tetratricopeptide. repeat-. containing protein (hSGT) 、 Titin-cap (T-cap) 、卵泡抑制素. (Follistatin) 或肌肉生長抑制素原胜肽結合時，活化的肌肉生長抑制素二元體會和 II-型轉化生長因子β受體 ActRIIB 結合，然後 ActRIIB 將被 I-型轉化生長因子β受體 (ALK4 或 ALK5) 招募和活化。Smad2 和 Smad3 將接著活化並與 Smad4 聚集後，轉移到細胞核並活化標的基因的轉錄作用，Smad7 和 Smurf1 則是扮演訊息抑制的角色，如 (圖 2-1)。.

(18) 9. 圖 2-1. 肌肉生長抑制素作用路徑推測圖【圖片摘自：Joulia-Ekaza & Cabello (2007)】. 卵泡抑制素 (Follistatin, Foll) 、卵泡抑制相關基因 (FLRG)、生長和分化因子相關的血清蛋白-1 (GASP-1)、hSGT (human small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein) 和 T-cap (Titin cap) 為不同的肌肉生長抑制素結合蛋白，它們皆參與了肌肉生長抑制素作用的調節。 Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 和 Smurf1：為不同的細胞內受動器，作用為將訊息傳遞給細胞核，以便激活肌肉生長抑制素的基因表現。.

(19) 10. 在組織培養研究中，肌肉生長抑制素會增加 C2C12 肌肉母細胞細胞週期蛋白依賴性激酶抑制因子 p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor p21) 的量，並減少 C2C12 肌肉母細胞細胞週期蛋白依賴性激酶 2 (cyclin-dependent kinase 2, Cdk2) 的活性，致 S 階段 (S phase) 的細胞數量減少 (Thomas 等, 2000)。此外，肌肉生長抑制素雖然會造成肌肉母細胞分化的失敗，不過在細胞增生和分化的情況下，細胞的凋亡率不但不增加反而減少，意即肌肉生長抑制素對肌細胞生長的抑制並非細胞凋亡所造成的結果 (Joulia-Ekaza & Cabello，2007)。. 三、肌肉生長抑制素基因多形性 (一) 肌肉生長抑制素基因多形性之位點和頻率人類肌肉生長抑制素基因位於第二對染色體長臂 32.2 處 (Ma 等 , 2001)。 Ferrell 等 (1999) 首次報導此基因的六個多形性 (polymorphisms) 位點，由於其中五個位點位於表現序列 (exon)，所以會導致肌肉生長抑制素基因所轉譯出的胺基酸有所改變，分別為位於表現序列 1 (exon1) 的 A55T，表現序列 2 (exon2) 的 K153R、E164K、P198A 和 I225T，然而，這些核苷酸的變異頻率.

(20) 11. 非常低，例如兩種相較於其他多形性變異比例較高者分別為表現序列 1 的 A55T 和表現序列 2 的 K153R ，其較少對偶基因頻率 (minor-allele frequency，MAF) 在非裔美國人中分別約為 0.12 與 0.16，而高加索人的 MAF 又比非裔美國人低，可見肌肉生長抑制素基因多形性的罕見性。在過去已有不少研究針對世界各地不同族群進行肌肉生長抑制素基因多形性的分析和統整，雖然在亞洲族群中的中國人與日本人皆指出其罕見性 (Saunders 等，2006) ，但文中所統計的肌肉生長抑制素基因多形性僅限於表現序列上的變異。Zhang 等 (2008) 針對 32 位中國人進行肌肉生長抑制素基因定序 (sequencing) 分析，共發現 17 個肌肉生長抑制素基因多形性位點，其中六個位點是未曾被報導過的，且多位於插入序列 (intron)，唯有一個是位於表現序列。每個多形性位點之 MAF 平均約為 0.15，相較於過去的研究，此 MAF 在亞洲人種已高出許多，意即在亞洲人中，肌肉生長抑制素蛋白質之功能、活性和結構皆可能存在著未知的變異性。. (二) 肌肉生長抑制素基因多形性和肌肉量的關係許多研究已證實肌肉生長抑制素基因受到抑制或突變的動物，其肌肉生長抑制素蛋白將會缺乏或不具功用，以致肌肉量大增。然而是否肌肉生長抑制素基因多形性也會影響肌肉量呢？.

(21) 12. Ferrel 等 (1999) 發現肌肉生長抑制素 K153R 與 A55T 基因多形性和肌力訓練後的肌肉量無明顯相關，其對偶基因頻率分別為 K:R = 0.90:0.10 與 A:T = 0.97:0.03，可見野生型對偶基因頻率和 MAF 仍然維持高度差距可能仍是無法達統計性顯著的原因之一。. (三) 肌肉生長抑制素基因多形性和肌力的關係目前已知不論是藉由人工方式或自然突變使肌肉生長抑制素基因百分之百喪失其功能後，此動物的肌肉量明顯大於相同物種的 1~2 倍，不過在肌力方面就不如肌肉量來的顯著，可能是因肌肉量大到阻礙動作空間而無法展現肌力 (Amthor 等， 2007)。除此之外，人類肌肉生長抑制素基因多形性和肌力的關係也已有少數研究發表過，例如 Seibert 等 (2001) 就對年紀介於 70~79 歲的非裔美國人和高加索之高齡女性分析其肌肉生長抑制素基因多形性和肌力的關係，結果發現 K/K 基因型 (wild type) 者 (n=264) 的平均肌力最大，其次為 K/R 基因型者 (n=19)，肌力最小的一組為 R/R (mutant type) 基因型者 (n=3)，雖然此結果並未達顯著差異，不過也似乎透露著擁有肌肉生長抑制素 K135R 基因多形性之 MAF 者的肌力並非較大。由於研究者所觀察的肌肉生長抑制素基因多形性位點主要著重於表現序列上的位點，因此就算受試者有上百位，卻也會因較低的變異頻率而無法在統計上呈現顯著的意義。.

(22) 13. 四、結語經由以上的文獻探討，肌肉生長抑制素基因多形性和人類肌肉量與肌力的關係仍未明朗，筆者認為原因包括以下兩點：. (一) 肌肉生長抑制素基因多形性位點雖多，但相關研究太少，且這些研究多針對於肌肉生長抑制素表現序列上的變異，並沒有對表現序列以外的序列進行較全面性地研究，例如：插入序列、5’- 啓動序列 (5'-promoter) 、3’- 非轉譯區(3’untranslated region, 3'-UTR) 等。. (二) 肌肉生長抑制素基因多形性 MAF 頻率偏低以致於較難達到顯著差異。. 為解決以上問題並有意義地運用於運動科學領域，因此本研究決定以有別以往的多形性分析方式，試圖找出和國內傑出運動選手相關的肌肉生長抑制素單體型。.

(23) 14. 第參章材料與方法一、研究對象本研究中，召集國內曾經獲得過全國性錦標賽以上層級前 3 名的優秀舉重和體操選手共 41 人為實驗組。舉重選手 10 男 10 女，共 20 人；體操選手 17 男 4 女，共 21 人；另外召集非體育相關科系且無以上運動習慣者或其他項目之業餘好手 30 男 20 女，共 50 人為對照組，受試者基本資料列於表 3-1。研究者讓每位受試者瞭解本研究的目的和過程後發給「受試者須知及同意書」(附錄一)，並在所有受試者的同意之下採集 10ml 的血液。. 表 3-1 受試者基本資料實驗組. 對照組. 舉重. 體操. 性別. 10 男 10 女. 17 男 4 女. 30 男 20 女. 總人數. 20. 21. 50.

(24) 15. 二、實驗流程召集受試者抽血/採集口腔黏膜 DNA 萃取聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 電泳、照膠重新測試條件. 產物完整純化. 產物不純. 無產物. 切膠. 基因定序定序反應結果不佳. 找尋 SNP 位點 Haplotype 分析統計分析. PCR-RFLP.

(25) 16. 三、實驗步驟 (一) DNA 萃取在受試者禁食八小時的情況下採集手臂靠近橈或尺靜脈血 10 ml。本研究以傳統酚/三氯甲烷/異戊醇，3-甲基丁醇 (phenol / chloroform / isoamyl alcohol) 方法進行 DNA 的萃取。將抽取到的血液樣本置入離心機以 3000 rpm 離心 15 分鐘後，加入紅血球溶解緩衝液 (lysis buffer) 將紅血球打破後再以 3000 rpm 離心 15 分鐘，緩緩倒掉紅血球溶解緩衝液後吸取白血球至含有 500 μl TE 9 的 1.5ml 微量小管 (eppendorf tube) 後，以 40 ul 蛋白質分解酵素 K (proteinase K) 完全水解，加入比例為 25/24/1 之酚/ 三氯甲烷/異戊醇，3-甲基丁醇混合溶液將 DNA 萃取出，以 100﹪ 酒精沉澱 DNA，並以 75﹪酒精洗去鹽類，將 DNA 離心烘乾後加入適量 TE 溶液備用，並以分光光度計 (spectrophotometer) 測 OD260/280 (吸光值) 來得知 DNA 的質與量，並加入適量的 TE 來調整 DNA 的濃度。. (二) 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction) 合成設計好的肌肉生長抑制素基因之 9 對引子 (primer) 後，便可開始進行聚合酶連鎖反應 (PCR)，將肌肉生長抑制素基因序列進行擴增。PCR 反應溶液包含 dH 2 O、10X reaction buffer、.

(26) 17. forward primer、 reverse primer、DNA polymerase 及 genomic DNA。引子序列、PCR 反應條件及產物大小列於 (附錄二)。. (三) PCR 產物的純化 (purification) 結束 PCR 反應後，將反應後的檢體進行洋菜膠 (agarose gel) 電泳分析，藉由 UV 光將膠體中的微量 PCR DNA 產物顯像以確認產物的純度使否適合進行定序反應，此時即可針對那些有產物的剩餘檢體進行純化。本實驗的純化主要以 Geneaid Gel / PCR Fragments Extraction Kit 為耗材，主要分為以下四個步驟：. 1. 檢體的準備 (sample preparation) 加入 100μl 的 DF buffer 到 22μl 的檢體中，並將溶液混合均勻。. 2. DNA 結合 (DNA binding) 加入檢體到組裝好的離心管後進行 8000 rpm 離心 30 秒，離心後將下清液倒掉。. 3. 洗淨 (wash).

(27) 18. 加入 500μl 的 Wash Buffer 到離心管中，再以 8000 rpm 離心 30 秒後去除下清液，再以 13200 rpm 的轉速離心 2 分鐘後置於 55 °C 烘箱烘乾。. 4. DNA 洗脫 (DNA elution) 更換離心管後加入 20μl 的 Elution Buffer 到新離心管中，靜置 3 分鐘後以 13200rpm 的轉速離心 2 分鐘即可。. (四) 肌肉生長抑制素基因定序分析 (sequencing) 先將待測物的濃度訂出（run acrylamide gel，mspI marker），各取 6 ng DNA 模板 (template) 後依序加入 autosequencer kit 的指定溶液，包括 premix (BigDye)、primer、5X BigDye buffer 及 ddH 2 O。進行 PCR 定序反應後將產物沉澱後上機（核酸自動定序儀，ABI Prism 3130 Genetic analyzer） (圖 3-1)，指定溶液的調配比例和 PCR 定序反應條件列於 (附錄三)。.

(28) 19. 圖 3-1. 核酸自動定序儀. 圖 3-2. 基因定序之結果判讀.

(29) 20. (五) 聚合酶鏈鎖反應-限制性片段長度多形性分析 (PCR-RFLP, polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) 將已放大複製出來的 DNA 以 Taq1 作為限制酶 (restriction enzyme) 做特定位置的切割，再經過 6% 的聚丙烯胺膠 (polyacrylamid gel, PAAG) 的電泳後進行溴化乙錠 (ethidium bromide) 染色後，即可透過自動膠體照相分析系統 (auto gel catcher) 拍照，進行基因多形性之判讀。. (六) 基因單體型 (haplotype) 分析在基因定序後以 CromasPro Version 1.5 套裝軟體讀取檔案資料，再以 Stephen ’s algorithm 電腦軟體的方式進行單體型分析，找出所有單體型種類和頻率。. 四、統計分析數據資料以 SPSS 統計套裝軟體進行統計分析。相關的統計顯 2. 著性檢定以χ -test 檢定法進行，統計顯著定為α=.05。.

(30) 21. 第肆章結果一、肌肉生長抑制素基因多形性本研究一共為 91 位實驗對象進行肌肉生長抑制素基因定序，所觀察的基因多形性位點繁多，因此大至上以功能性分段的方式進行呈現，依序為：5’- promoter、Exon 1、Intron 1、Exon 2、 Intron 2 和 3’- UTR。 (一) 5’-promoter 區的基因多形性位點在 5’-promoter 區中所觀察的 SNP 位點有三個，分別為 -1814 -/A、 -1792 T/C (rs3762547) 和 -1760 G/C (rs3762546)，在將受試者分為優秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，其基因型和對偶基因頻率皆未達顯著差異 (p > .05)，結果如表 4-1 所示。.

(31) 22. 表4-1 運動員和對照組之-1814 -/A、-1792 T/C 和 -1760 G/C 基因型和對偶基因分佈 SNP. -1814 -/A. -1792 T/C (rs3762547). -1760 G/C (rs3762546). Genetype/Allele. 運動員. 對照組. -/-. 24 (75%). 38 (76%). -/A. 8 (25%). 11 (22%). A/A. 0. 1 (2%). -. 56 (87.5%). 87 (87%). A. 8 (12.5%). 13 (13%). T/T. 24 (75%). 34 (69.4%). T/C. 8 (25%). 14 (28.6%). C/C. 0. 1 (2%). T. 56 (87.5%). 82 (83.7%). C. 8 (12.5%). 16 (16.3%). G/G. 15 (48.4%). 25 (50%). G/C. 16 (51.6%). 22 (44%). C/C. 0. 3 (6%). G. 46 (74.2%). 72 (72%). C. 16 (25.8%). 28 (28%). P .698 .563. .661 .332. .349 .454. (二) Exon 1 區的基因多形性位點在 Exon 1 區中所觀察的 SNP 位點有三個，分別為 +194 G/A (rs34094280)、+306 C/T (rs34191156) 和+307 G/A，在所有受試者中並未發現任何基因位點的變異情形。. (三) Intron 1 區的基因多形性位點在 Intron 1 區中所發現的 SNP 位點有 2 個，分別為 +463 A/- (rs11333578) 和+2078 A/T (rs2293284)，在將受試者.

(32) 23. 分為優秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，其基因型和對偶基因頻率皆未達顯著差異 (p > .05)，結果如表 4-2 所示。. 表4-2 運動員和對照組之+463 A/- 和+2078 A/T基因型和對偶基因分佈 SNP +463 A/(rs11333758). +2078 A/T (rs2293284). Genetype/Allele. 運動員. 對照組. A/A. 18 (52.9%). 23 (48.9%). A/-. 16 (47.1%). 21 (44.7%). -/-. 0. 3 (6.4%). A. 52 (76.5%). 67 (71.3%). -. 16 (23.5%). 27 (28.7%). A/A. 23 (79.3%). 14 (73.7%). A/T. 6 (20.7%). 5 (26.3%). T/T. 0. 0. A. 52 (89.7%). 33 (86.8%). T. 6 (10.3%). 5 (13.2%). p .323 .289. .454 .455. (四) Exon 2 區的基因多形性位點在 Exon 2 區中所發現的 SNP 位點有 5 個，分別為 +2174 T/G、+2246 A/G (rs1805086)、+2278 G/A (rs35481413)、 +2380 C/G 和+2462 T/C，在將受試者分為優秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，+2278 G/A (rs35481413) 基因型和對偶基因頻率未達顯著差異 (p > .05)，結果如表 4-3 所示，而其餘四個位點則未發現任何變異情形。此外，當本研究以定序方式辨別受試者的 +2278 G/A (rs35481413) 基因型時，發現實驗效果不彰，不是訊.

(33) 24. 號紊亂就是缺乏訊號而難以判讀，以至於缺失值 (missing data) 過多，因此本研究又針對此位點以 PCR-RFLP 的方式來辨別受試者的基因型 (圖 4-2)，盡力將缺失值減到最低，以達較高的統計信度。表 4-3 運動員和對照組之+2278 G/A 基因型和對偶基因分佈 SNP. Genetype/Allele. 運動員. 對照組. G/G. 35 (92.1%). 45 (93.8%). G/A. 3 (7.9%). 3 (6.3%). A/A. 0. 0. G. 73 (93.5%). 93 (96.9%). A. 3 (6.5%). 3 (3.1%). +2278 G/A (rs35781413). p .545 .543. 然而再將運動員組細分為舉重組、體操組並且和對照組進行比較時，發現+2278 G/A (rs35481413) 對偶基因頻率和基因型雖未達顯著差異 (p > .05)，但 p 值明顯比分兩組比較時縮小很多，結果如 4-4 所示。表 4-4 舉重組、體操組和對照組之+2278 G/A 基因型和對偶基因分佈 SNP. +2278 G/A (rs35781413). Genetype/Allele. 舉重組. 體操組. 對照組. p. G/G G/A A/A. 20 (100%) 0 0. 15 (83.3%) 3 (16.7%) 0. 45 (93.8%) 3 (6.2%) 0. .126. G. 40 (100%). 33 (91.7%). 93 (96.9%). .136. A. 0. 3 (8.3%). 3 (3.1%).

(34) 25. (五) Intron 2 區的基因多形性位點在 Intron 2 區中所觀察的 SNP 位點有 4 個，分別為 +3121 T/C (rs3791784)、+3160 A/G (rs3791783)、+4343 G/A 和 +4414 G/A，在將受試者分為優秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，基因型和對偶基因頻率皆未達顯著差異 (p > .05)，結果如表 4-5 所示，而+4343 G/A 和+4414 G/A 此兩點在本研究中由於未發現任何變異情形，所以並未列入表五之中。. 表4-5 運動員和對照組之+3121 T/C和+3160 A/G基因型和對偶基因分佈 SNP +3121 T/C (rs3791784). +3160 A/G (rs3791783). Genetype/Allele. 運動員. 對照組. T/T. 28 (90.3%). 42 (95.5%). T/C. 3 (9.7%). 2 (4.5%). C/C. 0. 0. T. 59 (95.2%). 86 (97.7%). C. 3 (4.8%). 2 (2.3%). A/A. 16 (51.6%). 22 (51.2%). A/G. 15 (48.4%). 18 (41.9%). G/G. 0. 3 (7.0%). A. 51 (77.3%). 62 (72.1%). G. 15 (22.7%). 24 (27.9%). p .336 .339. .311 .297. (六) 3’-UTR 區的基因多形性位點在 3’-UTR 區中所觀察的 SNP 位點有一個，為+5616 G/A，然.

(35) 26. 而此 SNP 在 87 為受試者中並未發現任何基因位點的變異情形。. 二、單體型分析在單體型分析的部分，本研究亦將整條 myostatin 基因以分段的方式進行分析，依序為 5’-promoter 區、intron 1 區和 intron 2 區。 (一) 5’-promoter 區的單體型分析和分配頻率在本研究當中，此區段共有三個 SNP 位點，並且形成八種 haplotype 型式，其中四種型式並不存在於本研究的對象中，包括： -CG、ATC、ATG 和 ACG，而存在的四種分別為-TC、-TG、-CC 和 ACC，然而在將受試者分為優秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，基因型和對偶基因頻率未達顯著差異 (p > .05)，結果如表 4-6 所示。表4-6 運動員和對照組之5’-promoter區的單體型分析和分配頻率序列區段 5’- promoter. Haplotype. 運動員. 對照組. -TC. 8 (13.3%). 11 (11.2%). -TG. 44 (73.3%). 71 (72.4%). -CC ACC. 0 8 (13.3%). 3 (3.1%) 13 (13.3%). (二) Intron 1 區的單體型分析和分配頻率. p .577.

(36) 27. 在本研究當中，此區段共有兩個 SNP 位點，並且形成四種 haplotype 型式，其中 AT 型式並不存在於本研究的對象中，而存在的三種分別為 AA、-A 和-T，然而在將受試者分為優秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，基因型和對偶基因頻率未達顯著差異 (p > .05)，結果如表 4-7 所示。. 表4-7 運動員和對照組之Intron 1 區的單體型分析和分配頻率序列區段 Intron 1. Haplotype. 運動員. 對照組. AA. 43 (76.8%). 28 (73.7%). AT. 0. 0. -A -T. 8 (14.3) 5 (8.9%). 5 (13.2%) 5 (13.2%). p .806. (三) Intron 2 區的單體型分析和分配頻率在本研究當中，此區段共有兩個 SNP 位點，並且形成四種 haplotype 型式，其中 CG 型式並不存在於本研究的對象中，而存在的三種分別為 TA、TG 和 CA，然而在將受試者分為優秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，基因型和對偶基因頻率未達顯著差異 (p > .05)，結果如表 4-8 所示。.

(37) 28. 表4-8 運動員和對照組之Intron 2區的單體型分析和分配頻率序列區段 Intron2. Haplotype. 運動員. 對照組. p. TA. 45 (72.6%). 60 (69.8%). TG. 15 (24.2%). 24 (27.9%). CA CG. 2 (3.2%) 0. 2 (2.3%) 0. .845. 3001~3506 (exon1) 5295~5668 (exon2). 8092~10029 (exon3). 單位：base pair 圖 4-1. MSTN 基因序列中的八個基因多形性位點示意圖.

(38) 29. 基因型 G/G ↓. 459 bp 367 bp. Marker. G/A ↓. 400 bp 300 bp. 100 bp 92 bp. 圖 4-2 MSTN +2278 G/A (rs35481413) 基因型之 PCR-RFLP 判讀結果.

(39) 30. 第伍章討論本章節分為以下兩個部分進行討論：一、肌肉生長抑制素基因多形性和優秀運動員的相關性。二、結論和建議。. 一、肌肉生長抑制素基因多形性和優秀運動員的相關性本研究發現 8 個 myostatin 基因多形性位點，並且和 Zhang 等 (2008) 相互對照的 MAF (minor allele frequency) 結果相當類似，如表 5-1 所示，由此可見 myostatin 基因在不同人種中存在著些微差異，而台灣人在此基因當中則是較為偏向漢民族的。表 5-1 與他國 MSTN MAF 相互對照表 I SNP 位置 -1814 -1792 -1760 +463 +2078 +2278 +3121 +3160 +4343 +4414 +5616. SNP. ->A T>C G>C A>A>T G>A T>C A>G G>A G>A G>A. 歐洲人. 非洲人. 亞洲人. 0 .15. .07 .64. .18 .31. .02. 0. 0. 0 0. 0 .07. .03 .18. 中國人 (Zhang) .14 .14 .23 .22 .14 .03 .03 .23 .02 .02 0.02. 台灣人 (本研究) 運動員. 對照組. .125 .125 .258 .235 .103 .041 .048 .227 0 0 0. .130 .163 .28 .287 .132 .032 .023 .279 0 0 0.

(40) 31. 在過去的研究中，國外學者多次嘗試在人類的 myostatin 基因之 Exon 區段當中發現新的 SNP 位點，因為此區段的變異將可能會改變轉譯出來的胺基酸，本研究結合 Saunders 等 (2006) 的研究結果統整於表 5-2，以便對照比較。結果發現除了+2278 G/A 位點以外，其餘八個位點皆未出現任何變異情形，顯然和非裔美國人大不相同。表 5-2 與他國 MSTN MAF 相互對照表 II Allele. Exon. SNP. SNP 位置. M A F 非裔美國. 歐洲. 台灣運動員. 非運動員. 60I. I. ATC→ATT. +180. .020. .000. 0. 0. R65H. I. CGT→CAT. +194. .013. .000. 0. 0. 102S. I. AGC→AGT. +306. .020. .000. 0. 0. D103N. I. GAT→AAT. +307. .007. .000. 0. 0. M129R. II. ATG→AGG. +2174. .020. .000. 0. 0. K153R. II. AAG→AGG. +2246. .197. .036. 0. 0. E164K. II. GAG→AAG. +2278. NA. NA. .041. .032. P198A. II. CCA→GCA. +2380. NA. NA. 0. 0. I225T. II. ATT→ACT. +2462. NA. NA. 0. 0. 粗體字為變異位點。NA：Not available in dbSNP. (一) +2278 G/A (rs35481413) 和運動表現 +2278 G/A (rs35481413) 是位於 myostatin 基因中的 Exon 2 區段內的一個 SNP 位點，其第 164 個胺基酸的改變是由穀胺酸 (E) 轉變為賴胺酸 (K) (Zhang 等，2008)。當本研究將受試者分為優.

(41) 32. 秀運動員組和對照組進行卡方檢定後，其基因型和對偶基因頻率未達顯著差異 (p > .05) ，然而再將優秀運動員分為舉重組和體操組，並且和對照組進行對偶基因比較後，發現 p 值顯著下降，在查看其原因時發現在舉重的 20 位運動員當中並未發現任何人在此位點產生變異，而體操 18 位運動員當中就有三位的基因型為異型結合子，雖仍未達統計上的顯著差異，但仍不免令人感到好奇和聯想，再對照體操運動員和控制組的 MAF 分別為 8.3%和 3.1%，由此可推知體操運動員和控制組的 MSTN +2278 G/A 基因型是較為相似的，導致此結果的原因可能有以下兩點： 1. 舉重和體操在運動型態上的差異根據中華民國體操協會規則所載，在競技體操中，所謂的「男子六項」包括：地板、鞍馬、吊環、單槓、雙槓和跳馬。其評分重點包括平衡、空間、方向、藝術性和動作多樣化 (黃淑貞 & 張秀卿，2007) 。因此不難發現相對於舉重項目而言，競技體操更為注重協調和藝術性，而非單純的量化評分方式，可能是由於這些特性的關係而導致體操運動員並不如舉重運動員來的壯碩，反而是增添少許勻稱感。 2. 受試者樣本不夠多由於國內頂尖的舉重和體操運動員本來就不是特別多，因此較.

(42) 33. 容易受到樣本數的限制，或許未來在增加實驗組和對照組樣本數的同時，即可更加明確的了解此位點和優秀運動員之間的關聯性。理論上，在成熟的多胜肽中的變異位點可能會透過多胜肽和 ActRIIB 受器的結合來影響蛋白質分解的過程，類似這樣的過程可能會轉變 myostatin 抑制肌肉生長和發展，進而影響肌力的展現 (Joulia-Ekaza & Cabello，2007)。根據 NCBI 的統計資料顯示，並沒有任何西方研究發現有關於此位點的變異資料，因此 +2278 G/A (rs35481413) 似乎仍有許多值得進一步研究的空間。例如：此位點是否真的符合本研究的假設，具有足以影響亞洲人肌肉大小或功能的遺傳性因素，特別是針對舉重運動員。 (二) Myostatin K153R 和運動表現在過去的研究當中，myostatin 基因多形性較多提及 K153R 這個位於 Exon 2 的 SNP，不過在本研究當中並沒有發現任何人在此位點產生變異，此外，Zhang 等 (2008) 在中國人當中也得到相同的結果，由此可知此位點的變異可能在漢人中的比例是極低的，雖然發現在非裔美國人當中擁有 A/G 或 G/G 基因型者的最大收縮力量基礎值明顯高於 A/A 基因型者 (Kostek, Angelopoulos, & Clarkson, 2009)。.

(43) 34. 二、結論和建議 (一) 結論 Myostatin 基因單一位點基因多形性與單體型和優秀運動員並無明顯關係，因此可能無法用來分辨優秀舉重和體操選手的候選基因。. (二) 建議根據本研究的結果，期許在未來的研究提供以下幾項建議： 1. 增加整體受試者人數，以提升研究信度。 2. 進一步探討 MSTN +2278 G/A (rs35481413) 對於人體的生理機轉。.

(44) 35. 引用文獻黃淑貞、張秀卿 (2007)。試述女子競技體操規則的變化與技術發展的格局。大專體育，90，39-42。 Amthor, H., Macharia, R., Navarrete, R., Schuelke, M., Brown, S. C., Otto, A., et al. (2007). Lack of myostatin results in excessive muscle growth but impaired force generation. Proceedings of The National Academy of Sciences, 104, 1835-1840. Derynck, R., Zhang, Y.E. (2003). Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling. Nature. 425 (6958), 577-584. Ferrell, R. E., Conte, V., Lawrence, E. C., Roth, S. M., Hagberg, J. M., & Hurley, B. F. (1999). Myostatin inhibition and performance frequent sequence variation in the human myostatin (GDF8) gene as a marker for analysis of muscle-related phenotypes. Genomics, 62, 203-207. Fedoruk, M. N., & Rupert, J. L. (2008). Myostatin inhibition: a potential performance enhancement strategy?. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports, 18 (2), 123-131. Ivey, F. M., Roth, S. M., Ferrell, R. E., Tracy, B. L., Lemmer, J. T., Hurlbut, D. E., et al. (2000). Effects of age, gender, and myostatin genotype on the hypertrophic response to heavy resistance strength training. Journal of Gerontology: Medical Sciences, 55A (11), M641-M648. Ji, S., Losinski, R. L., Cornelius, S. G., Frank, G. R., Willis, G. M., Gerrard, D. E., et al. (1998). Myostatin expression in porcine tissues: tissue specificity and developmental and postnatal regulation. American Journal of Physiology, 275, R1265-R1273. Joulia-Ekaza, D., Cabello, G. (2006). Myostatin regulation of muscle development: Molecular basis, natural mutations, physiopathological aspects. Experimental Cell Research, 312, 2401-2414. Kostek, M. A., Angelopoulos, T. J., Clarkson, P. M., Gordon, P. M., Moyna, N. M.,.

(45) 36. Visich, P. S., et al (2009). Myostatin and follistatin polymorphisms interact with muscle phenotypes and ethnicity. Medicine and Science in Sports and Exercise, 41 (5), 1063-1071. Lee, S.J., McPherron, A.C. (2001). Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proceedings of The National Academy of Sciences. 98 (16), 9306-9311. McPherron, A. C., Lawler, A. M., & Lee, S. J. (1997). Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature, 387, 83-90. Ma, K., Mallidis, C., Artaza, J., Taylor, W., Gonzalez-Cadavid, N., & Bhasin, S. (2001). Characterization of 50-regulatory region of human myostatin gene: Regulation by dexamethasone in vitro. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism, 281, E1128-E1136. McPherron, A. C., & Lee, S. J. (1997). Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proceedings of The National Academy of Sciences, 94, 12457-12461. Saunders, M. A., Good, J. M., Lawrence, E. C., Ferrell, R. E., Li, W. H., Nachman, M. W. (2006). Human adaptive evolution at myostatin (GDF8), a regulator of muscle growth. American Journal of Human Genetics. 79, 1089-1097. Schuelke, M., Wagner, K. R., Stolz, L. E., Hubner, C., Riebel, T., Komen, W., et al. (2004). Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child. New England Journal of Medicine, 350, 2682-2688. Seibert, M. J., Xue, Q. L., Fried, L. P., Walston, J. D. (2001). Polymorphic variation in the human myostatin (GDF-8) gene and association with strength measures in the women’s health and aging study II cohort. Journal of The American Geriatrics Society, 49, 1093-1096. Sharma, M., Kambadur, R., Matthews, K. G., Somers, W. G., Devlin, G. P., Conaglen, J. V., et al. (1999). Myostatin, a transforming growth factor-b superfamily member, is expressed in heart muscle and is upregulated in cardiomyocytes after infarct. Journal of Cellular Physiology, 180, 1–9..

(46) 37. Thomas, M., Langley, B., Berry, C., Sharma, M., Kirk, S., Bass, J., et al. (2000). Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. Journal of Biological Chemistry, 275, 40235-40243. Wagner, K. R., Liu, X., Chang, X., & Allen, R. E. (2005). Muscle regeneration in the prolonged absence of myostatin. Proceedings of The National Academy of Sciences, 102 (7), 2519-2524. Zhang, Z. L., He, J. W., Qin, Y. J., Hu, Y. Q., Li, M., Zhang, H., et al. (2008). Association between myostatin gene polymorphisms and peak BMD variation in Chinese nuclear families. International Osteoporosis Foundation and National Osteoporosis Foundation. 19 (1), 39-47. Zhu, X., Topouzis, S., Liang, L.F., Stotish, R.L. (2004). Myostatin signaling through Smad2, Smad3 and Smad4 is regulated by the inhibitory Smad7 by a negative feedback mechanism. Cytokine. 26 (6), 262-272..

(47) 38. 附錄一. 受試者同意書.

(48) 39.

(49) 40. 附錄二引子序列、PCR 反應條件及產物大小 PCR 反應編號. #. 引子序列 (5’→ 3’). 溫度. 時間. 主要循環. (base pairs). 94°C 94°C 51°C 72°C 72°C. 5’ 1’ 30” 1’40” 10’. 34. 1491. 94°C 94°C 51°C 72°C 72°C. 5’ 1’ 30” 1’40” 10’. 34. 1418. 94°C 94°C 51°C 72°C 72°C. 5’ 1’ 30” 1’40” 10’. 34. 1579. 94°C 94°C 51°C 72°C 72°C. 5’ 1’ 30” 1’40” 10’. 34. 1487. 94°C 94°C 55°C. 34. 489. 72°C 72°C. 5’ 30’’ 30” 1’ 10’. 94°C F: CAT TAT TTG TAG GAT GTT GAT GCA C 94°C 54°C R: TAC ACA CAC ACA CAT GTT TTA CTT C 72°C 72°C. 5’ 30’’ 30” 1’ 5’. 34. 540. 94°C. 5’ 30’’ 30”. 34. 755. F: CTT GTT TGA CCT CAT CTG 1 R: TAC TGC TGG AAA TCT GAG. F: CTC TAT TCT CTG CTC CCA 2 R: GAA ACA GCT CCT AAC ATC. F: GGC TGT GTA ATG CAT GTA 3 R: TCT ACT AAT TCC TGA GGC. F: TCA AAT AGG TCT GGA GCA 4 R: TTT TTT CTC CCA GAA GGG. 5-1. 5-2. F: CCT ATG AAA CAC TCC CTT GAT ACT CT R: GCT GCC TTA GCA TTC TTG TGC. F: GTA CAA ATT TAG GGT TAC TCT TCT G 5-3. 產物大小. 94°C 54°C.

(50) 41. R: TGC AGG TGT CTA AAA GAC TAT ACA. F: GTG CAG GTG TCT AAA AGA 6 R: TGA AAT TAA GTA CCA CAG GC. F: TAC TCC CAC AAA GAT GTC 7 R: TAC TAA GGC ACA AAG ACA TG. F: GAA AAC CCA AAT GTT GCT TC EX R: TGT CTA GCT TAT GAG CTT AGG G. #. F: forward primer, R: reverse primer EX: 用以辨識 MSTN +2278 G/A 的引子. 72°C 72°C. 1’ 5’. 94°C 94°C 51°C 72°C 72°C. 5’ 1’ 30” 1’40” 10’. 34. 1382. 94°C 94°C 51°C 72°C 72°C. 5’ 1’ 30” 1’40” 10’. 34. 1169. 95°C. 10’. 95°C 52°C 72°C 72°C. 1’ 45” 1’ 5’. 35. 459.

(51) 42. 附錄三定序反應之指定溶液的調配比例和 PCR 反應條件指定溶液的調配比例 Premix (BigDyeV3.1). 1. Template (purified DAN) Primer. 2 6pmole/μl. 5X buffer. 1.5. ddH2O. 4.5. Total volume. 10 單位：μl. PCR 反應條件 PCR 反應溫度 96°C 96°C 50°C 60°C (Hold) 20°C. 時間 2’ 10” 5” 4’. 主要循環. 34.

(52) 43. 作者小傳姓名：陳宗泰出生年月：民國 74 年 7 月 30 日出生地：澎湖縣學歷：國立臺灣師範大學運動科學研究所 (2007~) 國立臺南大學體育學系畢業 (2003~2007) 澎湖縣立馬公高級中學畢業 (2000~2003) 專業證照：C 級桌球教練證跆拳道國際二段術科專長：桌球、跆拳道.

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