行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
在胚胎發育過程中 ATP 對運動神經 L 型鈣離子通道調
節作用之研究
計畫類別：■個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：NSC90－2320－B－110－007－
執行期間：89 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
計畫主持人：劉昭成
共同主持人：
計畫參與人員：廖怡萍
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立中山大學生物科學系
中
華
民
國九十一年十月二十七日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
在胚胎發育過程中 ATP 對運動神經 L 型鈣離子 通道調節作用之研究 計畫編號：NSC90－2320－B－110－007－ 執行期限：89 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日 主持人：劉昭成 中山大學生物科學系 計畫參與人員：廖怡萍 中山大學生物科學系 中文摘要 胚胎期運動神經與肌細胞形成突觸 是一非常複雜的過程，除了藉由直接碰觸 使神經與肌細胞膜上的細胞黏合因子相互 作用之外，突觸前及突觸後細胞之間的電 流訊號或化學滋養因子之分泌對神經突觸 的發育、成熟與維持更是息息相關。根據 先前的研究顯示，在胚胎期的爪蟾神經、 肌細胞培養中，運動神經末梢與神經傳遞 物質 acetylcholine（ACh）共存於同一 突 觸 泡 的 adenosine 5’-triphosphate （ATP）即是這種重要物質之一。本計畫 意外發現現今頗熱門的IL-17 在胚胎時期 的運動神經發育也扮演重要角色：IL-17 能在極短的時間內有效增加神經傳遞物質 的釋放頻率，而這種作用係經由促進鈣離 子經由N 及 L 型鈣離子管道進入神經末梢 所引起，本計畫結果提供在胚胎發育早期 神經發育與免疫之間的關連性一個重要的 證據。 英文摘要Development, maintenance and
modulation of synapses depends on
molecular interactions between the pre- and
postsynpatic cells. At developing
neuromuscular junctions, factors secreted from the presynaptic nerve terminals may affect the development of postsynaptic acetylcholine receptor clusters and muscle
contractile properties. Adenosine
5'-triphosphate (ATP) has long been
considered a potential candidate for a neurotrophic factor, since ATP is known co-stored and co-released with acetylcholine (ACh) in the peripheral nervous system. Our currently results raise the possibility the cytokine interleukin-17 (IL-17) might be a trophic factor for developing motoneurons.
IL-17 dose-dependently enhances the
spontaneous ACh secretion at the
developing neuromuscular synapse.
Pretreatment with either N-type
(ω-conotoxin) or L-type (Nifedipine and
Verapamil) Ca2+ channel blockers partially
reverse the IL-17-induced potentiation. Co-treatment the culture with N- and L-type
Ca2+ channel blockers effectively abolished
such potentiation. Our observations provided the first evidence the IL-17 plays a important role in the maturation of developing neuromuscular synapses.
緣由與目的
細胞素（Cytokine）是指生物 體內影響細胞生長和分裂的任何物質，例 如：生長因子（growth factor）、生物活性 太（biologically active peptide），其中包括介 白素-1α、β（interleukin-1α、β，IL-1α、 β）、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、tumor necrosis factorα、β、γ（TNFα、β、γ）等等， 這一類蛋白質最早是被認為與免疫系統 （immune system）的作用有關（Liping et al.,2001），當作一種訊息者（messenger）， 負責生物體內免疫系統中細胞與細胞之間 的溝通（cell-cell communication），在訊息分
子和接受體細胞兩者之間是以流動形式
（circulating type）或黏附形式（adherent
type ） 作 為 溝 通 模 式 （ Tamas and Marianne,1993）．但是，生物體內另一個更 重要的訊號傳遞系統莫過於是神經系統 （nervous system）。理論上，免疫系統和 神經系統的訊息傳遞路徑是不相同的．但 是，在 1950～1970s 年間，許多學者發現 在神經系統與內分泌系統之間具有重要的 連結，概括的說，就是在荷爾蒙（hormone） 產生器官與接受器受到神經支配，經由神 經訊號作用可以將正確的 hormone 攜帶至 正 確 的 位 置 ， 稱 為 是 神 經 內 分 泌 學 （Neuroendocrinology）。有些學者利用神經 內 分 泌 學 的 觀 念 發 現 到 淋 巴 球 （lymphocytes ） 上 具 有 神 經 傳 導 物 質 （neurotransmitters）的接受體或是在神經細 胞/神經膠細胞上存在細胞素的接受器，而 提出神經免疫學（Neuroimmunology），主 要研究神經訊號對於免疫系統（Immune system）/免疫反應（immune response）的重 要性（Bartfai and Schultzberg，1993 ）．所 以，細胞素便顯得十分的重要。 隨 著 對 細 胞 素 的 了 解 越 清 楚 時，就有越多的證據證明細胞素在神經系 統與免疫系統之間扮演一個重要橋樑．例 如：早先研究認為當神經系統受到損傷時 會影響免疫反應（ Spector，1984）、另外 有研究指出在某些外傷的狀況下，神經元 （neuron ） 能 夠 有 合 成 細 胞 素 的 能 力 （Jacque et al.,1994 ） ， 如 當 海 馬 回 （hippocampus）受到傷害時神經元會誘導 IL-1α和 TNFα的合成．到目前為止有關細 胞激素與神經系統之間的關係研究較清楚 的有 IL-1 和 TNFα具有調控一些神經調節 物質（neuromediators）合成及修正離子的 流動的能力（Jacque et al.,1994）；IL-1 會誘 導慢波睡眠的產生和當週邊神經損傷時會
刺激神經生長因子（nerve growth factor,NGF）
的合成（Lindholm et al.,1987）；當 rat 的腦
受傷後 IL-2 的生物活性（bioactivity）會上
昇（Nieto-Sampedro and Berman,1987）；在
海馬回的切片中發現 IL-2 會促使 K +誘發
ACh 釋放的能力下降（Araujo et al.,1989）；
在出生 rat 中腦邊緣系統（mesolimbic）神 經元中，IL-2 是一種有效能的調節劑，主 要 是 經 由 N-methyl-D-aspartate （ NMDA ） receptor 活性的調節進而改變中腦邊緣系 統突處的適應性（synaptic plasticity）（Jiang et al.,2001）等等。 本 實 驗 所 研 究 的 主 題 是 interleukin-17s（IL-17s），一種經由被活化
的記憶型T 細胞（activated memory T cells）
所產生的細胞素，最早是被認為是一種強
效的proinflammatory cytokine，但近來由於研
究顯示 IL-17s 或是其受體都和之前已知的
一些interleukin 無相似 structural domain，所
以，被學術界正式定名為 interleukin-17s。 就其它動物的情況，IL-17 可促進其他的細 胞素/化學素（chemokines）的產生，然而 其在神經系統的角色則仍不是十分清楚． 因此本實驗主要目的是以運動神經-肌突 觸所形成的神經-肌細胞接合（NMJ）作為 動物模式來探討 IL-17 對於突觸前的神經 元、突觸後的肌細胞或是兩者之間具有生 理的調控反應，以及在神經訊息傳遞中所 扮演的角色，及其訊息傳遞機制。 結果與討論 在胚胎發育其的神經肌細胞混 合培養中，我們可以清楚的發現 IL-17 可 以 有 效 的 促 進 神 經 釋 放 神 經 傳 遞 物 質 acetylcholine 的頻率，這種促進作用產 生的速度頗快，而且可以維持約 10 分鐘以 上(見圖 1)。IL-17 對神經釋放 ACh 的促 進作用有其濃度的敏感性，如圖三所示， IL-17 可以隨著濃度的增加而增加其對神 經活性的促進作用，在我們所示的濃度 中，大約 50 ng/ml 的 IL-17 可以達到最 大的作用。 神經末梢活性的增加與細胞內 鈣離子濃度的上升有很大的關係，造成細 胞內鈣內鈣濃度的上升大致可以歸因於下 述兩種：一種是細胞外的鈣離子經由細胞 膜上的鈣離子通道進入細胞內，另一種方 式則是鈣離子從細胞內的鈣離子儲存池時
放出來而造成細胞內的鈣離子濃度上升。 為了進一步了解 IL-17 促進神經傳遞物質 釋放的作用，我們進一步做了以下的探 討：當我們把細胞外的溶液換成不含有鈣 離子的 Ringer 溶液時，發現 IL-17 對神 經釋放神經傳遞物質的促進作用不見了！ 為了更進一步肯定細胞外鈣離子在這裡的 角色，我們在正常的培養皿溶液中加入鎘 離子（Cd）來阻斷細胞模上的鈣離子通道， 發現在這種鈣離子無法經由鈣離子通道進 入細胞的情況下，IL-17 的作用便不復存 在。因此從這個實驗中，我們可以得到充 分的證據顯示細胞外鈣離子的流入神經細 胞是造成 IL-17 產生作用的原因（圖二）。 由於細胞膜表面的鈣離子種類 很多種，為了釐清鈣離子通道參與的種 類，我們接下來以各種鈣離子通道的阻斷 劑來進一步探討 IL-17 的作用機轉。我們 發現當在培養皿中加入 L type 鈣離子通 道阻斷劑 nifedipine 或 verapamil 時， 會部份阻斷 IL-17 對神經的促進作用（圖 三）。若先以 IL-17 來引發神經促進神經 傳 遞 物 質 的 釋 放 作 用 之 後 在 加 入 nifedipine 或 verapamil 經過一段時間 之後仍可以有效部份抑制 IL-17 的促進作 用，顯示 L 型鈣離子通道是 IL-17 的作用 過程中所必須活化的途徑之一。在另外的 實驗中我們同時也發現，N 型鈣離子通道 阻 斷 劑ω-conotoxin 也 可 以 部 份 阻 斷 IL-17 的作用，當同時加入 L 型鈣離子通 道及 N 型鈣離子通道阻斷劑之後，可以發 現 IL-17 的作用幾乎可以完全被阻斷掉， 顯示 IL-17 的作用可能是經由同時活化 N 及 L 型鈣離子通道，進一步促進神經釋放 神經傳遞物質，至於 IL-17 如何造成鈣離 子通道打開而造成神經傳遞物質的釋放增 加，則需要更進一步探討。 IL-17 在身體其他地方的角色 已經漸漸被發現，然而在神經系統則尚無 任何報導出現。IL-1 及 IL-6 已經被報導 在神經損傷時扮演重要角色，IL-17 是否 也會在神經組織受損傷之後被大量合成及 釋放? 本計畫的研究成果是第一個探討 IL-17 在神經系統的功能，我們發現在胚 胎神經發育時期，IL-17 可以增進神經釋 放 ACh 的活性，而神經活性的增加有助於 胚胎早期神經與肌細胞間突觸的穩定建立 與功能的成熟，這或許和神經發育早期有 大量的 monocyte 會從血液中轉移入神經 系統變成 microglia，他具有吞噬早期神 經 細 胞 因 為 得 不 到 滋 養 後 所 進 行 的 apoptosis，此時若 microglia 會釋放出 大量的 IL-17，則可以幫助已經得到滋養 而存活的神經細胞加速成熟而建立良好的 突觸，這些假設將有待進一步的探討。 計畫成果自評 本計畫結果提供在胚胎發育早 期神經發育與免疫之間的關連性一個重要 的證據。這是第一個有關於IL-17 如何影 響胚胎時期神經發育的發現，本計畫結果 與所引發眾多後續的研究將可清楚釐清神 經與免疫細胞激素間的關係。 參考文獻
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