外側疆核的麩胺酸受器與場地制約行為 - 政大學術集成

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(1) . 國立政治大學神經科學研究所碩士論文. Glutamate receptor in the lateral habenula and place conditioning 外側疆核的麩胺酸受器與場地制約行為. 研究生：張綺紋指導教授：廖瑞銘博士. 中華民國一○三年七月. .

(2) . 謝誌四年漫長的研究所生活終於告一個段落，能夠完成這本論文，要感謝的朋友太多。首先，非常感謝我的指導教授廖瑞銘老師，在這四年中除了學術上的指導外，在生活上給予我很多啟發，謝謝老師在最後撰寫論文的過程中，一字一句不斷地修正我不成熟的句子。謝謝我的口試委員趙知章老師以及陳景宗老師，感謝他們在口試時給予我許多建議，讓我可以順利地畢業。感謝一路上教導我的學長姊們，映伶學姊很有耐心地教我 CPP 行為實驗，同時也給我很多實驗上的建議。峰逵學長耐心地教我如何製作報告用的投影片，幫忙我下載 pubmed 找不到的文獻檔案。謝謝欣華學姊和幼屏學姊提點我報告該注意的地方，讓我的口頭報告表現越來越好。謝謝鈺婷與淳聿幫我解決實驗室裡機器發生的問題，協助我順利收完所有實驗數據。謝謝文馨和碩甫兩位小幫手們的幫忙，讓我的實驗可以加快腳步完成。謝謝我的好夥伴珮珮，總是在我最需要幫忙的時候伸出援手。謝謝于姐，從入學到畢業的所有行政事務都悉心地幫我處理，並且在我遇到挫折的時候，一直給予我很多的鼓勵和支持。謝謝一起在研究所努力的同學們，曉涵、文瑜、鉉豐、之懿，在這四年來不斷地為我加油打氣。謝謝雅群在我寫論文與準備口試的時候，給我非常多的鼓勵還有跟我分享很多好吃的食物。謝謝智宇總是很有耐心並附上微笑聽我沒來由的抱怨以及很有義氣地成全我買一送一任何優惠活動。謝謝宗翰學長和室友楊璧華在最後修改論文階段，用最獨具一格的方式帶給我很多歡笑。謝謝爸爸、媽媽和弟弟，有你們的包容與支持讓我可以無後顧之憂完成學業。謝謝佛光黃智偉老師，在我的大學階段，引領我認識神經科學的奧妙，並且鼓勵我進修研究所。感謝我大學時代好朋友們，謝謝王珣從大學時代和我進實驗室後，就一直擔任我實驗室裡最佳夥伴，一起討論實驗，希望我們畢業後都可以早點睡覺。謝謝陳慧鈴三不五時就會從高雄寄一堆好吃的食物給我，讓我充滿活力繼續寫論文。謝謝蒙宛筠常跟我分享好吃好玩的任何事情。經歷過這一階段，才有今天的論文內容。結果不能說盡善盡美，不過終究在自己的努力下完成。雖然四年來充滿許多離奇的災難，幸運的是，我有一位對我超級寬容 I I.

(3) . 的指導教授，讓我學會從這些小災難中找到解決的方法並且感受到復活的暢快，讓我往後面對任何生活中所發生的事情都將抱持著樂觀且積極面對的態度，而這本論文成為我一個值得回憶的逗點。最後，謝謝現在正在天堂快樂吱吱叫的鼠太郎們阿顯與小著，謝謝祢們總是乖乖地合作與奉獻，陪伴我度過小吱女孩的日子。. II.

(4) . 摘要制約性場地作業為一種廣泛地被使用於測試環境與藥物連結學習的制約行為作業，藉此制約的學習檢測藥物引發的場地偏好或厭惡的效果。該作業探討常見於具有上癮性的藥物，其神經作用機制證實與多巴胺傳導系統有關。近年來在神經解剖證據與功能性研究上，發現外側疆核藉由麩胺酸將神經訊息投射到腹側頂蓋區，對中腦多巴胺神經元扮演抑制效果，進而影響個體對酬賞動機行為表現。外側疆核本身是否具有影響酬賞動機行為或相關的制約行為仍然不清楚。本研究探討外側疆核的麩胺酸受體是否對於場地制約作業行為之形成有所影響，以麩胺酸的 AMPA 與 NMDA 之致效劑與拮抗劑直接微量注射於大鼠的外側疆核測試之。實驗一的結果顯示 AMPA 注入外側疆核無法產生場地制約作業偏好或是厭惡表現；而麩胺酸 AMPA 受體的拮抗劑 CNQX 會有制約的效果，唯在中劑量與高劑量有不同的行為表現；在中劑量 (0.4 μg) 的 CNQX 注入外側疆核時會形成制約性場地偏好效果的趨勢；而在高劑量則出現制約性場地嫌惡效果。實驗二的結果顯示 NMDA 與其拮抗劑 AP5 注入外側疆核時，皆無法產生制約性場地偏好或嫌惡效果。實驗三的結果顯示腹腔注腔 1mg/kg 的安非他命可有效形成制約性場地偏好，而注入 CNQX (0.4 μg) 於外側疆核並未形成任何制約性場地反應；當這項 CNQX 操弄結合安非他命處理，安非他命的制約場地偏好行為未受影響。實驗四結果顯示 AP5 注入外側疆核會抑制安非他命引發的制約性場地偏好行為。綜合以上的實驗結果，麩胺酸藥物單獨注入到外側疆核對大白鼠習得場地制約的影響有限，麩胺酸受體拮抗劑對安非他命引發的制約場地偏好行為習得歷程，不如預期設想的單純。外側疆核上麩胺酸受體與中腦多巴胺系統之間，可能還有其他不同的神經傳導物質調控酬賞動機相關的制約行為。. 關鍵字：外側疆核、制約性場地作業、AMPA、CNQX、NMDA、AP5. . III.

(5) . Abstract The place conditioning task is an animal model that tests the formation and performance of conditioning association between the environment or contextual cues with drug effect. It is commonly used to measure the rewarding and aversive effects of psychoactive drugs. The neuronal circuit underlying this animal behavior has been confirmed to be related to the dopamine (DA) system. As shown by recent neurophysiological and anatomical studies, the lateral habenula (LHb) may inhibit the DA reward system via its glutamatergic efferents projected to the midbrain dopaminergic neurons. However, at the behavioral level, whether the LHb could regulate the DA related reward motivation and its learning are still unknown. The present study was then designed to examine the role of LHb in the place conditioning task via the local infusions of drugs that activate or block glutamatergic AMPA or NMDA receptors. The results of Experiment 1 showed that the intra-LHb infusion of AMPA did not produce any significant effects on place conditioning. In contrast to AMPA, CNQX showed dose-related effects. CNQX (0.4 μg) nearly produced an effect of conditioned placed preference (CPP), whereas CNQX (1.6 μg) caused an effect of conditioned place aversion (CPA). In Experiment 2, neither NMDA nor AP5 infused into the LHb had produced place conditioning. The following two experiments investigated the effects of CNQX and AP5 on the CPP induced by systemic amphetamine.. Experiment 3 showed that amphetamine (1 mg/kg). significantly induced CPP, and such an effect was not affected by the intra-LHb CNQX (0.4 μg). In Experiment 4, intra-LHb infusion of AP5 (1.5 μg) attenuated the amphetamine induced CPP. In summary of the above results, the intra-LHb injections of the glutamatergic drugs had a limited effect on place conditioning. The glutamatergic AMPA and NMDA receptor blockade in LHb had mixed results. IV.

(6) . These results indicate that the proposal regarding to inhibitory regulation of LHb on the DA reward system may be more complicated than it was initially thought, at least dependent on what being measured.. Keywords: lateral habenula, place conditioning, AMPA, CNQX, NMDA, AP5. V.

(7) . 目錄謝誌............................................................................................................................................. I 摘要...........................................................................................................................................III Abstract ................................................................................................................................... IV 目錄.......................................................................................................................................... VI 表次........................................................................................................................................ VIII 圖次.......................................................................................................................................... IX 緒論............................................................................................................................................ 1 一、多巴胺與酬賞行為.................................................................................................... 1 二、疆核的神經解剖........................................................................................................ 2 三、外側疆核與酬賞相關行為........................................................................................ 4 四、外側疆核的麩胺酸受體............................................................................................ 6 五、制約性場地行為........................................................................................................ 7 六、研究目的.................................................................................................................... 8 實驗材料與方法......................................................................................................................10 一、受試者......................................................................................................................10 二、藥物..........................................................................................................................10 三、腦部埋管手術.......................................................................................................... 11 四、顱內藥物注射.......................................................................................................... 11 五、制約性場地學習作業..............................................................................................12 六、灌流程序與組織切片..............................................................................................13 七、實驗步驟..................................................................................................................14 八、統計分析..................................................................................................................15 結果..........................................................................................................................................16 實驗一：AMPA與CNQX注入外側疆核與場地制約行為...............................................16 . VI.

(8) . 實驗二：NMDA與AP5 注入外側疆核與制約性場地行為..........................................17 實驗三：外側疆核注入CNQX對安非他命引發場地制約行為的影響 ........................18 實驗四：外側疆核注入AP5 對安非他命引發場地制約行為的影響 ..........................19 討論..........................................................................................................................................20 結論..........................................................................................................................................26 參考文獻..................................................................................................................................27. . VII.

(9) . 表次表一：實驗受試在探測期 (前測) 待在兩配對箱時間的統計結果.................36. . VIII.

(10) . 圖次圖一：外側疆核埋管位置之組織學檢驗結果。..................................................................38 圖二：實驗一 (A) 不同劑量的AMPA注入外側疆核對制約性場地行為的影響結果 ....39 圖三：實驗一 (A) AMPA注入外側疆核在制約期的自發性活動量 ................................40 圖四：實驗一 (B) 不同劑量的CNQX注入外側疆核對制約性場地行為的影響結果....41 圖五：實驗一 (B) CNQX注入外側疆核在制約期的自發性活動量................................42 圖六：實驗二 (A) 不同劑量的NMDA注入外側疆核對制約性場地行為的影響結果 ...43 圖七：實驗二 (A) NMDA注入外側疆核在制約期的自發性活動量 ...............................44 圖八：實驗二 (B) 不同劑量的AP5 注入外側疆核對制約性場地行為的影響結果.......45 圖九：實驗二 (B) AP5 注入外側疆核在制約期的自發性活動量....................................46 圖十：實驗三CNQX (0.4 μg) 注入外側疆核，對安非他命引發制約性場地行為的影響結果..........................................................................................................................................47 圖十一：實驗三的受試在制約期接受不同藥物處理的自發性活動量..............................48 圖十二：實驗四AP5 (1.5 μg) 注入外側疆核，對安非他命引發制約性場地行為的影響結果..........................................................................................................................................49 圖十三：實驗四的受試在制約期接受不同藥物處理的自發性活動量表現......................50 . . IX.

(11) . 緒論. 一、多巴胺與酬賞行為 James Old 和 Peter Milner (1954) 將電極埋進大白鼠的腦中，並利用操作型制約 (operant conditioning) 行為作業，大白鼠在接受電刺激後，會持續按壓曾經接受過電刺激的桿子，讓腦部接受到電刺激。該實驗結果顯示發現大白鼠對腦部自我電刺激 (self stimulation) 產生強烈的偏好，諸多後續研究報導證實其行為與多巴胺 (dopamine; DA) 神經傳導有關 (Wise, 2004)。中腦多巴胺投射路徑主要從黑質體 (substantia nigra) 和腹側頂蓋區 (ventral tegmental area) 投射到前腦的相關腦區，從中腦的黑質體投射到紋狀體 (striatum) 路徑，稱為黑質紋狀體多巴胺系統 (nigrostriatal DA system) ，其功能主要與運動有關。中腦的腹側頂蓋區除投射到依核 (nucleus accumbens) 外也投射到海馬體 (hippocampus) 及杏仁體 (amygdala) 的系統相關腦區，此路徑被稱為邊緣多巴胺系統 (mesolimbic DA system)，其主要功能在於支配酬賞與動機相關行為，包括藥物酬賞和藥物成癮。此外，腹側頂蓋區投射到前額葉皮質 (prefrontal cortex) 的路徑，被稱為皮質多巴胺系統 (mesocortical DA system)，其功能主要與高階認知活動 (如：計畫和問題解決) 有關 (Wise and Rompre, 1989; Pierce and Kumaresan ,2006; Björklund and Dunnett, 2007)。針對酬賞行為的中樞神經機制而言，從直接操弄依核的研究證實該行為功能與邊緣多巴胺系統有關。大白鼠接受多巴胺系統神經毒素 6-OHDA 破壞後，再進行自我注射 (self-administration) 行為作業上發現會降低對於心理興奮性藥物 (psychostimulants) 如古柯鹼 (cocaine) 或是安非他命 (amphetamine) 所帶來的酬賞價值 (Caine and Koob, 1994; Gerrits and van Ree, 1996)。在利用制約性場地行為 (place conditioning task) 作業為測試的研究中，將安非他命直接注入依核，能引發制約性場地偏好行為 (conditioned place preference) (Carr and White, 1983)， . 1.

(12) . 將多巴胺 D1 受體拮抗劑 (antagonist) SCH23390 和多巴胺 D2 受體拮抗劑 raclopride 直接注入到依核，能抑制安非他命注入依核所引發制約性場地偏好行為 (Liao, 2008)。乙醯膽鹼類的 muscarinic 受體拮抗劑 scopolamine 或 nicotinic 受體拮抗劑 mecamylamine 直接注入到腹側頂蓋區，會抑制周邊注射古柯鹼所引發制約性場地偏好的學習與表現 (Shinohara et al., 2014) 。根據以上的研究證據顯示，腹側頂蓋區投射到依核路徑所屬的邊緣多巴胺系統，對於酬賞動機相關行為功能扮演重要的影響角色。近年來對酬賞動機與學習的神經基礎，皆朝向神經網絡 (reward circuitry) 的概念探討 (Ikemoto, 2010) 。針對藥癮行為的酬賞動機之習得與表現歷程，邊緣多巴胺系統是扮演關鍵角色 (Nestler, 2005) 。唯近期神經網絡有關研究指出，尚有其他大腦區域參與支配或調整藥物與自然酬賞物質涉入的酬賞動機行為，例如：疆核 (habenula) 。. 二、疆核的神經解剖在神經解剖學研究上發現，疆核的位置鄰近第三腦室，海馬體下方與視丘 (thalamus) 上方，其屬於背側間腦傳導系統 (dorsal diencephalic conduction system) 中的一個主要腦區。疆核連結前腦邊緣系統 (limbic system) 與中腦 (midbrain) ，並且調控中腦的單胺類 (monoaminergic) 神經元，包含以血清素 (serotonin) 為主的內側縫核 (median raphe nucleus) 、背側縫核 (dorsal raphe nucleus) 和多巴胺神經元為主的腹側頂蓋區、黑質體緻密部 (substantia nigra pars compacta) 以及膽鹼性神經元 (cholinergic) 為主的側邊背側頂蓋區 (laterodorsal tegmental nucleus ) (Lecourtier and Kelly, 2007; Geisler and Trimble, 2008; Bianco and Wilson, 2009; Aizawa et al., 2012; Shelton et al., 2012) 。過去研究發現疆核涉及一些行為功能，包含對於止痛 (Mahieux and Benabid,1987) 、壓力的反應 (Heldt and Ressler, 2006) 、日夜節律 (Paul et al., . 2.

(13) . 2011)、空間記憶(Lecourtier et al., 2004)、注意力(Lecourtier and Kelly, 2005)、憂鬱症(Li et al., 2011; Sourani et al., 2012)、精神分裂 (Lecourtier et al., 2004) 以及酬賞相關行為等 (Sutherland and Nakajima, 1981; Morissette and Boye, 2008; Wang et al., 2009) 。以上這些文獻報告的疆核實驗操弄，並未針對疆核的次級區域進行檢測。依照解剖位置與神經化學傳遞物質等異質性的分析，疆核可區分為外側疆核 (lateral habenula) 和內側疆核 (medial habenula) 。其中，外側疆核接受其他腦區訊息方面，主要包含內側前額葉皮質 (medial prefrontal cortex)、Broca 氏對角帶 (diagonal band of Broca)、內側蒼白球 (internal segment of the globus pallidus，在齧齒類動物稱為腳內核 entopeduncular nucleus)、腹側蒼白球(ventral pallidum)、依核、腹側頂蓋區、下視丘 (hypothalamus)、側視前區 (lateral preoptic area) 與交叉上核 (suprachiasmatic nucleus)。外側疆核的輸出訊息主要經由後屈束 (fasciculus retroflexus) 傳送至腹側頂蓋區、依核、內側縫核、背側縫核、黑質體緻密部、內側被蓋核 (rostromedial tegmental nucleus) 和側邊背側頂蓋區 (Herkenham and Nauta, 1977; Herkenham and Nauta, 1979; Sutherland, 1982; Lecourtier and Kelly, 2007; Geisler and Trimble, 2008)。利用順行神經元追蹤劑 (anterograde tracer) 注入外側疆核，腹側頂蓋區上的神經元出現來自外側疆核上的追蹤劑標誌；在腹側頂蓋區上注入逆行神經元追蹤劑 (retrograde tracer) ，外側疆核上的神經元有來自腹側頂蓋區的追蹤劑標誌，這類實驗結果證實外側疆核與腹側頂蓋區有連結的關係 (Gruber et al., 2007; Geisler et al., 2007; Brinschwitz et al., 2010; Gonçalves et al.,2012; Stamatakis et al.,2013) 。電刺激激發外側疆核上的神經元，則可以抑制腹側頂蓋區與黑質體上高達 97%的多巴胺細胞活動 (Christoph et al., 1986; Ji and Shepard, 2007)。Lecourtier 等人 (2008) 分別利用電刺激和麩胺酸 AMPA 類受體拮抗劑 LY293558 操弄外側疆核，並結合微透析技術 (microdialysis) 記錄前額葉皮質、依核以及紋狀體多巴胺濃度，發現當麩胺酸拮抗劑 LY293558 抑制外側疆核，同時會增加這三個腦區的多巴胺濃度， . 3.

(14) . 而在電刺激外側疆核則發現降低依核的多巴胺濃度。從以上電生理或神經化學的文獻證實外側疆核與多巴胺之間互為此消彼長的關係：當實驗操弄抑制外側疆核上的神經元時，在中腦中的多巴胺神經元處於活躍的狀態；反之，當外側疆核興奮時，則會抑制中腦多巴胺的神經元活性。. 三、外側疆核與酬賞相關行為除外側疆核的神經解剖和電生理記錄研究外，行為神經科學研究也證實外側疆核與中樞多巴胺中腦邊緣系統有密切關係 (Carvey et al.,1987; Sandyk, 1991; Ellison,1994)。相較於多巴胺與酬賞相關行為的豐碩研究資料，外側疆核在酬賞相關行為功能的實驗證據較少。 Friedman 等人 (2010) 分別以腦深層電刺激 (deep brain stimulation) 與神經毒素兩種方法操弄外側疆核，探討外側疆核對以古柯鹼為酬賞物的自我注射作業上的行為影響。大白鼠在學會壓桿得到古柯鹼後，實驗者將其外側疆核以神經毒素毀除，發現不影響大白鼠之前行為的習得。利用電刺激外側疆核時，則會影響大白鼠的表現；在高頻 (100 赫茲) 電刺激時，不影響大白鼠在習得自我注射的行為表現；而在低頻 (10 赫兹) 電刺激時，增加大白鼠的壓桿反應，提高大白鼠對古柯鹼所帶來的酬賞價值；另外，在高低頻交互 (10 赫茲與 100 赫茲) 電刺激的狀況下，大白鼠則減少壓桿反應，意即降低大白鼠對古柯鹼的酬賞價值。Friedman 等人 (2011) 在隨後的一項研究，以相同的壓桿得到酬賞物的動物行為模式，但將酬賞物從古柯鹼替換成蔗糖液 (sucrose)，發現電刺激外側疆核對蔗糖液所帶來的酬賞價值的影響效果，與之前文獻所使用古柯鹼作為酬賞物的實驗結果近似。這兩篇文獻的實驗結果證實毀除外側疆核的大白鼠，不影響其對自然性 (natural) 酬賞物或是非自然 (non-natural) 酬賞物所帶來的酬賞價值，前者為蔗糖液，後者則為古柯鹼。並且也證明外側疆核接受不同頻率的電刺激，使大白鼠對酬賞物有不同的行為反應，表示外側疆核上可能有興奮與抑制兩類的神經元存在。 . 4.

(15) . Gifuni 等人 (2012) 使用神經毒素鵝膏蕈酸 (ibotenic acid) 毀除大白鼠的外側疆核，發現不影響其在自發性活動量 (locomotor activity)，周邊注射安非他命於此大白鼠，自發性活動表現量增加；接著實驗者利用自我刺激 (intracranial selfstimulation) 作業，探討外側疆核對於制約性酬賞相關行為的影響效果。首先實驗者將電擊直接埋置內側前腦束 (medial forebrain bundle) ，此腦區被過去文獻資料證實與酬賞系統有關 (Hernandez et al., 2006) ；在大白鼠壓桿時，內側前腦束接受到電刺激，此電刺激對大白鼠有酬賞價值的作用，使大白鼠增加壓桿行為；當大白鼠學會此行為後，將外側疆核以神經毒素毀除，大白鼠在自我刺激的行為表現不受影響。爾後，注入安非他命至大白鼠體中，發現安非他命影響大白鼠的增加壓桿反應率以及降低酬賞閾值。此研究結果發現外側疆核在制約性酬賞相關行為的角色，可能透過影響多巴胺系統造成行為的改變。利用微量注射的方式將安非他命注入至外側疆核中，發現大白鼠在自我刺激作業上，對於腦部的刺激所得到的酬賞並不會因為外側疆核接受安非他命而產生變化； (Duchesne and Boye, 2013) 。在高低頻 (10 赫茲與 100 赫茲) 交互的電刺激和光基因刺激技術 (optogenetic stimulation) 興奮大白鼠的外側疆核的神經元活性，在大白鼠制約性場地行為作業中，發現受試避開先前與電刺激配對的環境，表現出制約性場地厭惡行為 (conditioned place aversion) (Friedman, et al., 2011; Lammel et al., 2012; Shabel et al., 2012) 。 Matsumoto 和 Hikosaka 在靈長類的電生理研究上，使用工具性制約作業，訓練猴子的眼睛跟著電腦螢幕上的目標物方向移動，接著出現聲音，猴子就會得到果汁作為酬賞物。研究者在測試階段，把酬賞物出現的機率以 50%比例隨機出現，在猴子面對酬賞物未出現的情況，發現其外側疆核上的神經元呈現活躍的狀態，多巴胺神經元則呈現抑制的狀態。由此發現，外側疆核對中腦多巴胺酬賞動機行為扮演抑制的效果。爾後，研究者將測試階段所出現的酬賞物機率，改為以三種不同機率 (100%、50%、 0%) 方式出現；除此之外，研究者把酬賞物 (果汁) 改為厭惡刺激 (在猴子臉上噴氣 (airpuff) ) ，記錄猴子的外側疆核的電生理反應。發現猴子在完全不會出現果汁的線 . 5.

(16) . 索和 100%和 50%會在臉上噴氣的線索出現時，在外側疆核上神經元活性增加的狀況；而在 100%和 50%會出現果汁和不會在臉上噴氣的線索出現時，外側疆核的活性則處於下降的狀況 (Matsumoto and Hikosaka, 2007, 2009) 。以上的實驗結果顯示外側疆核對於個體在面對厭惡刺激或遇到預期的酬賞未出現的情況下，外側疆核的神經元處於活躍狀態，而在預期的酬賞的線索出現時，則會降低外側疆核上神經元的活性。由此推知外側疆核的角色與負向情緒的調控有關，使個體能夠因應生活中所出現的負向情緒事件 (如：憂鬱、壓力) 。上述以靈長類動物在酬賞刺激的高等認知研究中，顯示個體在日常生活中面對厭惡刺激或是預期的酬賞未出現時，在大腦外側疆核的神經元同時被激發，並抑制中腦多巴胺的神經元活性，從神經元的活性改變，進而改變個體的行為活動。在鼠類受試的酬賞性相關制約學習作業研究中，顯示當外側疆核神經活性改變時，會影響酬賞相關行為作業，唯行為受影響仍有不一致的結果。儘管針對外側疆核對於酬賞相關行為研究上有不同的實驗結果，針對外側疆核本身是否具有影響酬賞動機行為或相關的制約行為目前尚未釐清。. 四、外側疆核的麩胺酸受體麩胺酸 (glutamate) 是中樞神經系統主要興奮型神經傳遞物質，其受體主要分為離子通透性受體 (ionotropic glutamate receptor) 與蛋白信使受體 (metabotropic glutmate receptor) ；就離子通透性受體而言，其可分為三種不同類型的受體：AMPA 受體、NMDA 受體、Kainate 受體。在外側疆核的神經解剖研究上，指出外側疆核接受來自前腦與中腦的神經訊息，過去研究使用逆行神經元追蹤劑注入腹側頂蓋區或是使用順行神經元追蹤劑注入側下視丘 (lateral hypothalamus) ，皆發現外側疆核有來自腹側頂蓋區的追蹤劑。研究證實外側疆核接收來自側下視丘、側視前區、基底核 (basal ganglia) 神經訊息，並將神經訊息投射到腹側頂蓋區和內側被蓋核 (Kowski et al., 2008; Li et al., 2011; Shabelet al., 2012; Lammel et al., 2012; Poller et al., . 6.

(17) . 2013) 。運用免疫組織化學染色 (immunohistochemistry) 技術，分別將 GABA 合成酵素標記上螢光物質 GAD65 與 GAD67 以及麩胺酸轉運蛋白 (transporter) VGLUT2 上標記螢光物質，結果發現在外側疆核主要含大量的麩胺酸和少部分 GABA 神經傳導物質 (Geisler et al., 2007; Omelchenko et. al., 2009; Brinschwitz et al., 2010; Li et al., 2011; Shabelet al., 2012) 。 Stamatakis 和 Stuber (2012) 利用電生理 (electrophysiology) 研究，在外側疆核神經元以及腳內核投射到外側疆核路徑的神經元上，注入麩胺酸 AMPA 類的抑制劑後，發現大幅降低外側疆核神經元的放電頻率。此外，將 GABAa 受體抑制劑 picrotoxin 滴在外側疆核上的細胞神經元並且利用電壓嵌制 (voltage-clamp recording) 的技術，量測 AMPA 和 NMDA 兩類的麩胺酸的電流最大值與電壓關係 (I-V curve)，發現 AMPA 誘發之電流較為 NMDA 大，這項研究結果顯示在外側疆核上的神經元，主要以麩胺酸 AMPA 類受體為主。此外，同時注入麩胺酸 NMDA 與 AMPA 兩類受體的拮抗劑 AP5 和 DNQX，會大幅降低外側疆核神經元的放電頻率 (Zuo et.al., 2013) 。上述研究中證明外側疆核藉由麩胺酸並經外屈束將神經訊號傳送到腹側頂蓋區和內側被蓋核，為了瞭解麩胺酸藥物對於外側疆核扮演興奮還是抑制神經活性的角色，本研究利用麩胺酸兩種不同受體 AMPA 與 NMDA 的藥物操弄外側疆核，探討其對制約性場地行為的效果影響。. 五、制約性場地行為制約性場地作業廣泛地被使用於檢測藥物引發正向酬賞或負向嫌惡效果，此動物模式主要是根據 I. Pavlov(1927)的古典條件化歷程 (classical conditioning) 學習理論，實驗動物經過環境線索的制約刺激 (conditioned stimulus) 與非制約刺激 (unconditioned stimulus) 如藥物或食物等物質同時配對數次，爾後單獨出現場地的制約刺激即可引發動物其制約後行為。當非制約刺激具有正向酬賞效果時，受試會趨 . 7.

(18) . 向於先前與非致約刺激所配對的環境時，表示受試有制約性場地偏好行為；反之，當非制約刺激具有負向嫌惡效果時，受試則會避開曾與非制約刺激配對的環境時，受試則表現出制約性場地厭惡行為 (Bardo and Bevins, 2000; Cunningham et al., 2006) 。制約性場地偏好行為的神經作用機制，經研究證實與中腦多巴胺系統傳導系統有密切關係 (Everitt and Wolf, 2002; Wise, 2004; Buccafusco, 2009)。近年來有一些研究利用場地制約的行為模式，探討外側疆核對這種制約行為的歷程所扮演之角色。Friedman 等人 (2011) 利用高低頻交互 (10 赫茲與 100 赫茲) 的電流刺激外側疆核與環境進行配對後，大白鼠在制約性場地行為作業表現出避開曾與電刺激配對的環境。另外，使用光基因刺激實驗技術直接活化大白鼠外側疆核上的神經元並與環境進行配對，發現在制約性場地行為作業上，大白鼠避開外側疆核曾經被活化的環境，與電刺激的行為結果相似 (Lammel et al., 2012; Shabel et al., 2012) 。 Stamatakis 等人 (2013) 將光基因刺激技術直接活化腹側頂蓋區投射到外側疆核 (VTA-LHb) GABA 路徑，發現大白鼠在即時性場地偏好 (real-time place preference) 行為作業上，趨向於先前活化腹側頂蓋區投射到外側疆核路徑所配對的環境。上述研究結果顯示，活化外側疆核的神經元，造成大白鼠對於其行為作業有負向嫌惡效果表現；抑制外側疆核的神經元，則對大白鼠具有正向酬賞效果，使大白鼠趨向於先前與非致約刺激所配對的環境。. 六、研究目的神經解剖研究證實外側疆核接受來自前腦邊緣系統的神經訊息，並藉由麩胺酸神經元投射到中腦多巴胺神經核區。電生理與神經化學研究證實外側疆核上的神經元與多巴胺神經元相互調節的關係；外側疆核的神經元被激發時，抑制中腦多巴胺的神經元活性；相反地，抑制外側疆核神經元活性，則使中腦多巴胺神經元活性增加，然而這個外側疆核與中腦多巴胺系統的交互作用關係，是否得以對應到行為層面的酬賞動機與學習，迄今仍無一致的定論。這個交互作用背後的機制之謎，首先須要對外側疆 . 8.

(19) . 核本身是否具有影響酬賞相關行為反應有所釐清，然後對兩個腦區之間的交互作用之澄清，才可望獲得有效的檢測。對於外側疆核本身是否具有影響酬賞動機行為或相關的制約行為，目前尚未有研究利用藥理方式探討。基於外側疆核含有麩胺酸的離子通透性受器之研究實證，本研究採用麩胺酸 AMPA 類與 NMDA 類受體的藥物，操弄外側疆核的神經活性，並藉由制約性場地行為模式，探討外側疆核對於酬賞行為中所扮演的神經機制。本研究分為四個實驗。實驗一為麩胺酸 AMPA 類受體致效劑 (AMPA) 與拮抗劑 (CNQX) 注入外側疆核，探討大白鼠對於制約性場地行為作業的表現。實驗二為利用麩胺酸 NMDA 受體致效劑 (NMDA) 與拮抗劑 (AP5) 注入外側疆核，探討大白鼠對於制約性場地行為作業的表現。實驗三為 AMPA 類受體拮抗劑 (CNQX) 注入外側疆核，探討對於安非他命引發場地制約行為影響。實驗四為 NMDA 類受體拮抗劑 (AP5) ，對於安非他命引發場地制約行為表現的影響。. . 9.

(20) . 實驗材料與方法. 一、受試者本研究採用 Wistar 品系之雄性大白鼠為實驗受試者，自樂斯科生物科技股份有限公司購入後，飼養於國立政治大學行為神經實驗室動物房，動物房內維持於 12 小時晝夜週期，自動調節器控制早上 8:00 到晚上 8:00 為光照期 (另 12 小時為暗期) ，室溫維持在攝氏 22 ± 2 度。每隻大白鼠單獨飼養於鐵籠，在飼養與實驗全期供應充分的食物及飲水。所有實驗均在光照周期時進行，約從早上十點到下午五點。大白鼠在進入實驗室動物房到行為實驗開始前，實驗者每天會對每隻大白鼠進行的安撫 (taming) 操作。安撫程序為實驗者抓握大白鼠至懷中 3 至 5 分鐘，使大白鼠習慣實驗者的抓取與摸觸，以降低大白鼠在行為實驗中可能產生的緊張。本研究的相關動物實驗步驟及流程，經過國立政治大學動物實驗管理小組審核通過後執行，受試的使用與照料均遵循行政院農委會頒布有關動物實驗規定的相關條例，並參考美國 National Institute of Health (NIH) 的相關規定。. 二、藥物本研究的行為實驗所使用的藥物有麩胺酸 AMPA 類受體的致效劑 AMPA ((S)-α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 與拮抗劑 CNQX (6-Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione)，以及麩胺酸 NMDA 類受體的致效劑 NMDA (N-methyl-D-aspartate) 和拮抗劑 AP5 (D-(-)-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid)。這四種藥物皆購自於 Tocris Bioscience (Ellisville, MO, USA) ：其中的 AMPA、NMDA 和 AP5 皆溶於 0.9%的生理食鹽水，而 CNQX 則溶於 DMSO 溶液 (Ghalandari-Shamami et al., 2011) 。以上四種藥物溶解實驗所需的劑量，皆以顱內微量注射的方式施打。安非他命 (D-amphetamine sulfate) 則購自 Sigma Chemical . 10.

(21) . Co. (St. Louis, Mo., USA) ，依實驗所需劑量溶於 0.9%的生理食鹽水，此藥物以腹腔注射 (I.P.) 為施打方式，每次注射藥物的量均固定為每一公斤體重施予一毫升 (1 ml/kg) 。. 三、腦部埋管手術大白鼠在體重達 300-350 克時，接受顱內鋼管埋植手術 (intra-cranial cannula implantation)。首先，藉由腹腔注射 1ml/kg 的複合型麻醉劑 Zoletil 50 (Virbac Laboratories, France) 麻醉大白鼠。待大白鼠呈現麻醉狀態後，剃除顱毛後再固定於腦部立體定位儀 (stereotaxic apparatus; DKI-900) 上。使用優碘消毒頭部後，劃開頭皮並清除頭蓋骨上結締組織，以囪門 (bregma) 為參考座標軸原點，根據 Paxinos 與 Waston (2007) 圖譜，於兩側的外側疆核座標點採：囪門前後距離-3.6 mm、側邊距離±0.7 mm、深度距離-3.8 mm。手術係將鋼管埋植於外側疆核上方 1.0 mm 的立體座標處，鋼管的規格為外徑 0.63 mm，內徑長度為 0.33 mm，全長為 15 mm。手術另於頭骨上放入三根小螺絲作為鋼管結合牙科膏 (acrylic dental cement) 的支撐點。最後以牙科膏包埋固定雙側鋼管與拴住頭骨上的三根螺釘，穩固鋼管位置。待牙科膏乾燥固定後，以細鋼絲插入鋼管內，避免注射鋼管阻塞或感染。手術完成時，在大白鼠的大腿肌肉部注射 0.2 ml 的抗生素 (penicillin- streptomycin, 20,000 IU) ，以減少傷口可能引起的發炎與感染。動物在手術完成後經歷一週恢復期，開始進行後續的藥物施打及行為實驗。. 四、顱內藥物注射大白鼠進行顱內藥物注射時，以注射針 (規格 31 號) 和聚乙烯管 (PE20) 連接於微量注射筒 (Hamilton microsyringe, 2μl) 上。注射前，將聚乙烯管與注射筒注入蒸餾水，使管內充滿蒸餾水，接著將注射筒向後拉一小段，吸入一小段空氣至筒內， . 11.

(22) . 避免蒸餾水與藥物混淆，導致藥物的濃度被稀釋。接著，將欲注射的藥物溶液由注射針吸入聚乙烯管內。在微量注射時，先將受試適度握住，取出留置鋼管中預防阻塞的細鋼針後，接著將注射針同時置入兩邊鋼管內，使注射針的針尖突出 1.0 mm。經由微量幫浦 (microinjection pump) 推動微量注射筒，將藥物溶液左右兩側同時注入外側疆核，每側注入藥物溶液為 0.2 μl，注射速率為每分鐘 0.066 μl，在三分鐘內完成微量注射。當藥物注射完後，將注射針留置鋼管內一分鐘，使藥物擴散於目標區後，再將注射針緩慢取出。然後，將預防阻塞用的細鋼針再次插回鋼管內。. 五、制約性場地學習作業制約場地行為測試箱本研究採用的制約場地行為測試箱，所使用的檢測箱包含兩個壓克力製的箱子。兩個制約箱的長寬高分為 37cm × 36cm × 60.5 cm，兩箱子其中一個制約箱，牆壁為寬 4 公分黑白相間的直條紋，為條狀鐵條 0.5 公分平行排列的地板環境，稱作黑箱；另一個制約箱牆壁則為白色搭配邊長 0.5 公分網狀鐵架的地板環境，稱作白箱。在兩側箱相鄰面右下方底部，有一個 15 cm × 15 cm 大小的孔洞以供受試者來回穿梭。在此檢測箱上方 52 cm 架設有感知光耦合元件 (Change Coupled Device)，用來記錄實驗期大白鼠活動。. 制約性場地作業實驗程序動物受試隨機分配到控制組與實驗組，制約性場地作業訓練程序共進行八天，分為三個階段：探索期 (前測) 、制約訓練期、測試期 (後測) 。在行為實驗前，實驗者會將動物受試用推車運送到行為測試空間，並靜待五分鐘後才開始進行實驗。制約性場地行為實驗程序詳敘如下。一、探索期 (前測) ：受試者自由穿梭於兩側的配對箱十分鐘，並以電腦紀錄受試者十分鐘在兩配對箱所待的時間。 . 12.

(23) . 二、制約訓練期：依據受試者在制約前期在兩制約箱所待的時間，使用對抗平衡設計 (counter-balanced) 來減少可能產生的誤差，即一半動物受試接受控制液與前測偏好的箱子配對，藥物和前測非偏好的箱子配對；而另一半受試則將控制液與前測非偏好箱進行配對，藥物和前測偏好的箱子配對。此階段依照實驗設計，將藥物以顱內注射或是腹腔注射方式於受試動物的外側疆核後，放置進入制約箱。制約期為三十分鐘，期間中電腦會記錄受試行走的距離，受試者每天進行一次制約性場地訓練，單數天進行控制液配對，雙數天接受藥物劑量制約訓練，此程序重複三次共六天。三、測試期 (後測) ：受試歷經探索與訓練期 (共 7 天) 後，在制約訓練期結束的後一天 (第八天) 進行制約後期，其實驗程序與前測相同。若受試者停留在藥物配對箱的時間將較控制液配對箱停留時間多，即表示受試者對於和藥物配對的箱子形成制約性場地偏好。. 六、灌流程序與組織切片完成所有的行為檢測後，將大白鼠以腹腔注射過量的 Chloral hydrate (30 mg/kg) 進行深度麻醉，待大白鼠深度麻醉後，開胸進行灌流程序。將大白鼠的胸腔沿著肋骨剪開，剪開右心房讓血液流出，並以 0.9%生理食鹽水注入左心室直到將血液置換，再以 24%福馬林緩衝液 (formalin buffer) 替代生理食鹽水注入左心室，當大白鼠呈現肌肉僵硬後，將腦取出並浸泡在保存液，並且放置冰箱冷藏。大腦保存液泡製方式為 165 ml 的純水分別加入 24%福馬林 100 ml、12.2g 的蔗糖與一片生理食鹽水藥片 (phosphate buffered saline tablet; Sigma chemical Co., St. Louis, Mo., USA) 混合而成。經過 4-7 天的後固定 (fixation) 與抗凍保存，後進行鼠腦的組織切片染色。切片時，將鼠腦包埋在冷凍包埋膠 (Tissue-Tek; Sakura Finetek U.S.A) 並置於冷凍切片機 (Leica, Jung CM1800) 上，以厚度 40 μm 進行冠狀切片 (coronal section)，將目標區域的腦組織切片貼附在塗有蛋白膠 (gelatin) 薄膜的載玻片上，靜置一段時間讓組織切片水氣晾乾後，進行 cresyl violet 做為染料進行染色。染色完成後使用蓋 . 13.

(24) . 片膠進行蓋片程序，最後將染色後的腦組織切片與大白鼠的腦部圖譜 (Paxinos and Watson, 2007) 進行比對，只有中樞埋管位置正確的受試之行為數據資料才進行統計考驗分析。. 七、實驗步驟實驗一：AMPA 與 CNQX 注入外側疆核本實驗在制約期的藥物與場地配對時，將 AMPA 或 CNQX 注入外側疆核，探討其是否讓大白鼠形成場地制約行為。在實驗一 A 部分的受試，分五組接受 AMPA 的劑量 (0, 0.01, 0.02, 0.1, 0.2 μg) 反應測試，即採用受試者間設計。實驗一 B 部分，亦採用受試者間設計，受試分成四組接受 CNQX (0, 0.1, 0.4, 1.6 μg) 的劑量反應測試。. 實驗二：NMDA 與 AP5 注入外側疆核本實驗的設計及步驟和實驗一相似，唯測試的藥物是麩胺酸 NMDA 類受體致效劑與拮抗劑。實驗二 A 的受試，分為四組接受不同劑量的 NMDA (0, 0.5, 1, 2 μg) 劑量處理。實驗二 B 的受試，分為四組接受不同 AP5 (0, 0.5, 1, 1.5 μg) 的劑量處理。. 實驗三：外側疆核注入 CNQX 對安非他命引發場地制約行為的影響效果。本實驗的場地制約行為模式，係利用周邊注射安非他命形成制約場地偏好行為。受試以隨機方式分為兩大組，分別在制約期，將 AMPA 類受體拮抗劑 CNQX (0.4μg) 及控制液注入外側疆核外，接著這兩大組再個別細分兩小組，分別以腹腔注射方式施打安非他命 (1 mg/kg) 及生理食鹽水。實驗中每位受試所經之制約性場地行為作業，以及所涉及的藥物注射和行為測試等一般性實驗步驟均如同前述之共同實驗方法。. 實驗四：外側疆核注入 AP5 對安非他命引發場地制約行為的影響效果。本實驗的設計與實驗三雷同，唯外側疆核注入的藥物採 AP5 (1.5μg) 。 . 14.

(25) . 八、統計分析本研究針對制約性場地偏好作業的探索期 (前測) 是否有對制約箱形成先天偏好，以各組動物受試在制約前於兩個制約箱的時間，使用成對 t 考驗進行統計分析檢驗。關於制約場地偏好的指標，採動物受試在後測期間的藥物制約箱及非藥物制約箱的停留時間，並結合藥物劑量操弄變項，以二因子變異數分析考驗 (analyses of variance; ANOVA) (藥物劑量 x 制約邊) ，另外以成對 t 考驗進行各組自行的場地制約效果：如果在藥物制約箱停留時間大於非藥物制約箱時間，表示大白鼠對於制約場地有偏好行為；反之，則表示對於制約場地有嫌惡行為。關於自發性活動量的分析，動物受試在制約訓練期在藥物配對箱及非配對箱各三天的自發性活動資料，以二因子變異數分析考驗 (兩側制約箱 x 三次制約訓練) 。本研究所有資料均以平均值 ± 標準誤 (mean ± sem) 方式呈現，統計考驗的顯著性以 p<0.05 為標準。相關的統計分析均透過統計套裝軟體 SPSS16.0 版 (SPSS Inc, Chicago, USA) 進行。. . 15.

(26) . 結果本研究的受試在前測探索階段，對實驗所採用之制約箱未形成先天制約偏好 (unconditioned preference)，受試待在兩配對箱的時間沒有統計考驗之顯著差異：以全部實驗 38 批動物的平均值 ± 標準誤計算而言， (黑箱 296.6 ± 13.6 秒，白箱 292.1 ± 13.4 秒)。另外就各實驗完成制約及藥物處理的每組受試而言，其在前測時於兩側箱滯留的時間，經成對 t 檢定考驗檢測，所有大致顯示受試對制約箱不具有制約前的先天偏好，結果於(表一)。圖一呈現本研究操弄外側疆核微量注射藥物的組織學檢驗結果。圖一 A 表示外側疆核埋管位置在大鼠腦譜 (Paxinos and Waston, 2007) ，圖一 B 為微量注射埋管位置組織切片的實際照片 (實驗 37 批的 11 號受試) ，圖一 C 為腦圖譜圖示微注射管落於外側疆核的位置點分布。. 實驗一：AMPA 與 CNQX 注入外側疆核與場地制約行為圖二所示的是實驗一 A 有關制約性場地行為學習的結果：不同劑量的 AMPA 以二因子 ANOVA 統計結果顯示「藥物劑量」和「配對邊」主要效果和「藥物劑量 x 配對邊」交互作用皆未達顯著的效果 (p>0.05) 。圖三為實驗ㄧA有關受試在制約訓練期的行為活動量之變化，其中圖A至圖E分別呈現各組接受AMPA不同劑量的操弄。二因子ANOVA的結果顯示，「0 μg」、「0.02 μg」、「0.2 μg」組在統計考驗「配對邊」、「嘗試次」以及「配對邊 x 嘗試次」之檢測，皆無顯著的效果 (p>0.05) 。而在圖三B的「0.01 μg」組，統計結果顯示「配對邊」有顯著的主要效果 (F(1,4)=12.63，p<0.05)，在「嘗試次」及「配對邊 x 嘗試次」之考驗，均沒有顯著性 (p>0.05)。在圖三D的「0.1 μg」組，其統計結果顯示「嘗試次」有顯著的主要效果 (F(2,10)=4.391，p<0.05)，而「配對邊」與「配對邊 x 嘗試次」之考驗未達顯著意義 (p>0.05)。 . 16.

(27) . 圖四為實驗一B不同劑量的CNQX在制約性場地行為學習的結果，二因子ANOVA 統計結果顯示，「藥物劑量」與「配對邊」兩個主要效果皆未達到顯著性(p>0.05)，但「藥物劑量 x 配對邊」交互作用達到顯著差異， (F(3,32)=5.94，p<0.005)，進一步進行單純主要效果檢定，發現在 1.6 μg組的受試則表現出場地制約厭惡的效果 (p<0.05)。而在 0.4 μg組的受試表現出趨近於制約性場地偏好的效果，該統計考驗未達顯著性，只有趨近顯著意義 (p=0.06)。圖五為實驗ㄧB受試在制約訓練期的行為活動量之變化，其中圖A至圖D分別呈現各組接受CNQX不同劑量的操弄。以二因子ANOVA統計結果，顯示在「0 μg」組在「嘗試次」主要效果達顯著差異 (F(2,16)=19.16, p<0.001)，「配對邊」與「嘗試次x 配對邊」交互作用未達到顯著差異 (p>0.05)。在圖五B「0.1 μg」組，統計結果顯示「嘗試次」主要效果達顯著差異 (F(2,14)=4.36, p<0.05)，在「配對邊」以及「配對邊 x 嘗試次」的交互作用效果皆無顯著的效果 (p>0.05)。在圖五C「0.4 μg」組，統計結果顯示「嘗試次」與「配對邊」主要效果，皆無顯著差異 (p>0.05)，在「配對邊 x 嘗試次」交互作用效果達顯著差異 (F(2,14)=4.26, p<0.05)。在圖五D「1.6 μg」組，統計結果顯示「配對邊」、「嘗試次」以及「配對邊 x 嘗試次」皆無顯著的效果(p>0.05)。. 實驗二：NMDA 與 AP5 注入外側疆核與制約性場地行為圖六為實驗二 A 不同劑量的 NMDA 對於制約性場地行為學習的結果，二因子 ANOVA 統計結果顯示「藥物劑量」和「配對邊」以及「藥物劑量 x 配對邊」交互作用之考驗，皆未達顯著的效果 (p>0.05)。圖七為實驗二A的受試在制約訓練期的行為活動變化量，其中圖A至圖D分別呈現各組接受NMDA不同劑量的操弄。以二因子ANOVA統計考驗，在圖七A的「0 μg」組在「嘗試次」有顯著的主要效果 (F(2,14)=6.20, p<0.05)，在「配對邊」及「配對邊 x 嘗試次」交互作用之考驗未達顯著性 (p>0.05)。在「0.5 μg」和「1 μg」以及「2 μg」的劑量，統計考驗結果顯示「嘗試次」和「配對邊」以及「嘗試次x 配對邊」交互作 . 17.

(28) . 用之考驗皆未達顯著性 (p>0.05)。圖八為實驗二B：不同劑量的AP5 在制約性場地行為學習的結果，二因子ANOVA 統計考驗結果顯示「藥物劑量」主要效果俱顯著差異性 (F(3,19)=5.43, p<0.01)，但在「配對邊」以及「藥物劑量x配對邊」交互作用皆未達到顯著 (p>0.05) 。圖九為實驗二B中受試在制約訓練期下自發性活動量的變化。其中圖A至圖D分別表示各組不同劑量AP5 的操弄，二因子ANOVA的統計結果顯示，「0 μg」、「0.5 μg」、「2 μg」組，在「嘗試次」和「配對邊」主要效果和「嘗試次x 配對邊」交互作用的統計考驗，皆未達到顯著意義 (p>0.05) 。而在圖九C的「1 μg」組，統計結果顯示在「嘗試次」有顯著的主要效果 (F(2,8)=6.93, p<0.05) ，在「配對邊」以及「配對邊 x 嘗試次」交互作用之考驗，則未達到顯著性 (p>0.05) 。. 實驗三：外側疆核注入 CNQX 對安非他命引發場地制約行為的影響圖十為實驗三的場地制約資料，各組在兩邊配對邊所停留的時間，進行雙尾t檢定考驗。統計結果顯示接受生理食鹽水的CNQX組，在兩邊配對邊的時間並未達到顯著水準 (T(7)=0.4, p>0.05) ，表示未能產生場地制約行為。接受安非他命的控制組，待在與安非他命配對邊的時間顯著大於另一側配對邊的時間 (T(11)= 2.32, p<0.05 ) ，由此得知安非他命可有效形成場地制約偏好行為。接受安非他命的CNQX組，其停留於安非他命制約配對邊中累積的時間顯著多於另一側非制約配對邊 (T(11)=2.82, p< 0.05) ，顯示外側疆核注入CNQX並在腹腔注射安非他命，形成場地制約偏好行為。圖十一為實驗三各組受試在制約訓練期的行為活動變化量，其中圖A至圖C分別呈現各組接受不同藥物的操弄，以「注入外側疆核的藥物-周邊注射藥物」標示組別。二因子ANOVA分析，結果顯示圖十一A為CNQX-SAL組在「配對邊」與「嘗試次」以及「配對邊x嘗試次」交互作用之考驗皆未達到顯著性 (p>0.05) 。圖十一B為 DMSO-AMPH組的結果，在「配對邊」以及「配對邊 x 嘗試次」交互作用之考驗皆達到顯著性 (F(1,11)=79.45, p<0.0001; F(2,22)=5.69, p<0.05 ) ，在「嘗試次」則未達到 . 18.

(29) . 顯著性效果 (p>0.05)。圖十一C為CNQX-AMPH組的統計結果顯示，在「配對邊」以及「配對邊 x 嘗試次」交互作用之考驗皆達到顯著性 (F(1,11)=23.34, p<0.01; F(2,22)=6.5, p<0.01 ) ，在「嘗試次」則未達到顯著性效果 (p>0.05) 。. 實驗四：外側疆核注入 AP5 對安非他命引發場地制約行為的影響圖十二為實驗四的場地制約結果，各組資料經雙尾t檢定考驗，結果顯示只有接受周邊注射安非他命與外側疆核注入生理食鹽水之組，其停留在藥物配對制約邊所累計的時間顯著多於另一側非制約邊 (T(10) = 3.83，p< 0.01)。其餘三組的t檢定考驗，都無顯著差異 (p>0.05) 。圖十三為實驗四各組在制約訓練期的行為活動量的變化，其中圖A至圖D分別呈現各組接受不同藥物的操弄，以「注入外側疆核的藥物-周邊注射藥物」標示組別。二因子ANOVA統計結果顯示，圖十三A的SAL-SAL組，在「嘗試次」主要效果達到顯著差異 (F(2,14)=7.23, p<0.01) ，在「配對邊」以及「配對邊 x 嘗試次」交互作用之考驗，皆未達到顯著性 (p>0.05) 。圖十三B的AP5-SAL組，在「嘗試次」和「配對邊」主要效果和「嘗試次x 配對邊」交互作用的統計考驗，皆未達到顯著意義 (p>0.05) 。圖十三C以及D的統計結果，均顯示在「配對邊」有顯著的主要效果 (F(1,10)=14.86; F(1,7)=29.4, p<0.005) ，而在「嘗試次」以及「配對邊 x 嘗試次」交互作用之考驗，則未達到顯著性 (p>0.05) 。. . 19.

(30) . 討論本研究是利用制約性場地行為作業，透過中樞注射麩胺酸受體藥物的方式探討外側疆核的功能角色。實驗一測試麩胺酸 AMPA 類受體藥物對於制約性場地行為作業的影響效果，從注入 AMPA 受體拮抗劑 CNQX 至外側疆核的結果發現只有高劑量 1.6 μg 組形成制約性場地厭惡的效果。相較於 CNQX 結果，AMPA 的劑量操弄對大白鼠沒有產生偏好或是厭惡的制約性場地行為。實驗二測試麩胺酸 NMDA 類受體藥物，結果顯示 NMDA 與其拮抗劑 AP5 注入外側疆核皆無法產生制約性場地的效果。實驗三測試 CNQX 注入外側疆核對於安非他命引發制約性場地偏好行為的影響效果，從中發現腹腔注腔安非他命可以有效形成制約性場地偏好，而單獨注射注入 CNQX 於則未形成任何場地制約反應。這兩種操弄結合，即 CNQX 注入外側疆核與周邊注射安非他命，仍見受試會引發制約性場地偏好。實驗四測試外側疆核注入麩胺酸 NMDA 受體拮抗劑 AP5，對安非他命引發制約性場地偏好行為的影響效果，結果顯示單獨 AP5 注入外側疆核不具產生制約性場地的效果，而此 AP5 注入外側疆核會抑制安非他命引發的制約性場地偏好行為。. 麩胺酸藥物注入外側疆核與制約性場地行為在實驗一以及實驗二分別採用AMPA與NMDA類的麩胺酸受體的致效劑與拮抗劑注入外側疆核，結果發現只有AMPA類受體拮抗劑CNQX (見圖四)，會造成大白鼠在制約性場地行為作業有明顯的行為改變，但所形成的場地制約效果依特定的劑量而有不同方向之變化：以二因子ANOVA統計結果中發現在CNQX的高劑量「1.6μg」處理下，有制約場地嫌惡之效，而在CNQX中「0.4μg」組的大白鼠，顯示只有制約性場地偏好的趨勢 (p=0.056) 。然我們針對「0.4μg」組在後側的兩配對箱所待時間數據，另以雙尾t檢定進行統計考驗，發現藥物配對箱的時間顯著高於另一配對箱 (T(7)=2.71, p<0.05) 。由此可見，在「0.4μg」組的大白鼠會產生制約性場地偏好行為，唯其效 . 20.

(31) . 果略弱。另外關於AMPA「0.2 μg」組的效果 (圖二)，二因子統計的結果雖未達顯著性，但該組數據經雙尾t檢定，發現AMPA「0.2 μg」組在後側的兩配對箱所待時間數據，控制液配對箱的時間顯著高於另一箱 (T(2)=-5.51, p<0.05) ，有制約場地嫌惡之效。雖然這樣的統計考驗結果支持該組受試有形成制約性場地嫌惡，但由於此組的樣本數過少，此項行為結果之推論有待增加樣本數驗證之。過去文獻中從周邊注射麩胺酸 AMPA 與 NMDA 類受體藥物探討制約性場地行為，發現在 AMPA 類受體拮抗劑 NBQX (30 mg/kg) 引發小鼠對制約性場地有嫌惡的表現，但同為 AMPA 受體拮抗劑 CNQX (10 mg/kg) 以及 GYKI52466 (5 mg/kg) 無法引發大白鼠產生制約性場地偏好或是厭惡的效果 (Mead and Stephens,1999; Kawasaki et al.,2005)。但也有不一致結果的報導，如 GYKI52466 (4.8 mg/kg) 會引發產生場地偏好效果 (Gray et al., 1999)。在周邊注射 NMDA (15, 30 mg/kg) 及其拮抗劑 dizocilpine (0.5 mg/kg) 皆引發大白鼠對於制約場地作業上表現出場地偏好 (Panos et al.,1999)；L-701,324 (0.5 mg/kg) 與 dizocilpine (0.05 mg/kg) 則無法引發制約性場地偏好或嫌惡表現 (Kotlińska and Biała,1999; Kawasaki et al.,2005) 。就上述研究而言，從周邊注射麩胺酸類受體藥物，即使同屬麩胺酸 AMPA 或是 NMDA 類的藥物，對制約性場地行為作業有不同的表現。這個不一致的行為藥理實驗結果，除了各實驗室所採用的受試品系或行為測試步驟不盡相似外，藥物施打的劑量亦是實驗結果差異的關鍵之一。儘管麩胺酸類藥物經周邊注射有不一致結果，其藥理機制仍被認為與中樞大腦有關 (Tzschentke, 2007) 。本文研究所探測的外側疆核接受此類藥物作用，亦可屬這項思維的科學研究。由於過去文獻很少有使用 AMPA 與 NMDA 類受體藥物注入外側疆核的行為藥理研究，尤其是探討外側疆核與制約性酬賞相關作業之文獻更是缺乏。於此本研究中的實驗一與實驗二所採用的劑量範圍則參考與外側疆核迴路有關腦區：腹側頂蓋區及依核 (Zahm, 1999; Lecourtier and Kelly, 2007; Jhou et al., 2009; Polleret al., 2013; Stamatakis et al., 2013) ，並以自主活動量的行為反應和制約性作業兩種行為模式為指標 (Pulvirenti et al.,1994;Svensson et al., 1994; Schenk and Partridge, 1997; 張 . 21.

(32) . 雅惠,1998; Cornish et al., 2001; David HN et al., 2004; Ghalandari-Shamami et al., 2011)。這三個腦區有不同神經傳導物質的受體分佈，可能是造成實驗一與實驗二發現這四種麩胺酸受體的藥物注入至外側疆核所引發的制約性場地作業有侷限的效果影響。. 麩胺酸藥物注入外側疆核與制約訓練期間的運動活動量變化先前研究利用神經毒素毀除外側疆核或電刺激興奮外側疆核，發現不影響動物受試在自發性行為活動量的表現 (Pobbe and Zangrossi, 2008; Gifuni et al., 2012; 林禧岳, 2012) 。本研究在實驗一與實驗二，分別記錄動物受試在制約訓練期中進行制約性場地作業時的自發性活動量，發現 NMDA 與 AP5 兩組在制約訓練期間，大白鼠的行為活動量皆不受藥物處理影響。但 AMPA 以及 CNQX 部分劑量中，發現 AMPA 在「0.01 μg」組發現「配對邊」和「0.1 μg」組的「嘗試次」皆有顯著的主要效果，以及 CNQX「0 μg」與「0.1 μg」兩組在「嘗試次」皆有顯著的主要效果。進一步分析三個制約訓練期，發現大白鼠接受藥物注射下，不影響其自主活動量。在實驗三與實驗四發現注入麩胺酸拮抗劑，發現不會影響大白鼠在制約訓練期的行為活動量，這個結果發現與實驗一和實驗二的結果相一致；大白鼠在制約訓練期於安非他命配對環境下增加行為活動量，此實驗結果與過去文獻利用周邊注射安非他命增加動物受試的行為活動量相一致 (Bardo et al., 1999)。. 麩胺酸拮抗劑對安非他命引發制約性場地偏好行為之探討過去利用電生理或是神經化學等研究，皆證實外側疆核主要藉由麩胺酸調節中腦多巴胺的神經元活性。在實驗三與實驗四發現周邊注射 1 mg/kg 安非他命，可以引發制約性場地偏好行為，這個結果與過去以周邊注射安非他命的文獻的結果相一致 (Bardo et al., 1999; Shen et al., 2014) 。 Shabel等人 (2012) 結合免疫組織化學染色技術證實外側疆核上的神經元以麩 . 22.

(33) . 胺酸受體為主，他們運用光基因刺激技術刺激外側疆核，發現當外側疆核被激活時，動物受試會產生制約性場地厭惡反應。根據此項實驗證據，本研究假設注入麩胺酸致效劑，藉由興奮外側疆核，可能會因此導致中腦多巴胺活性下降，動物受試在制約性場地作業上有厭惡的表現；反之，將麩胺酸拮抗劑至外側疆核，藉由抑制外側疆核上的神經元活性會使中腦多巴胺神經元活性增加，進而使動物受試引發制約性場地偏好行為。但本研究結果，並未測到注入麩胺酸至外側疆核對於制約性場地作業的行為影響。這可能與目前探討外側疆核的制約性場地行為作業不同的實驗程序所致，過去文獻採用DPP (directed place preference) 作業，該作業與制約性場地作業不同的地方是在制約期時，大白鼠在兩個制約箱穿梭時，其中一個制約箱，實驗者會刺激動物受試的外側疆核，直到大白鼠到另外一個非制約箱時刺激才會結束；當下一次大白鼠跑到與刺激做配對的制約箱時，實驗者再次刺激大白鼠的外側疆核，直到大白鼠離開配對制約箱。實驗數據的計算方式為 (非配對制約箱配對制約箱相減除以總時間) ，得到的數據如果是正值對制約環境產生厭惡表現，負值則為偏好 (Shabel et al., 2012; Stamatakis et al.,2013) 。這個作業模式與本研究所使用制約性場地作業有所差異，在制約性場地作業，大白鼠經過三次制約嘗試次的訓練：分別與配對及非配對制約箱，在後測階段，大白鼠必須經由之前制約配對的經驗，表現出對這兩個不同制約箱的喜好程度。DPP的作業模式與一般所用的制約性場地行為作業有所不同，前者在於大白鼠當下對兩個不同制約箱的喜好做反應，而後者涉及到大白鼠在測試期間必須依靠制約期藥物與環境配對的經驗，於後測時表現制約行為反應。目前針對外側疆核與制約行為功能研究，大多探討動物受試的行為表現階段，在此階段研究出現不一致的實驗結果：神經毒素毀除外側疆核或是直接將安非他命注入，皆不影響動物受試已經學會的操作式制約酬賞相關行為 (如：自我注射、自我刺激) (Friedman et al., 2010, 2011; Gifuni et al., 2012; Duchesne and Boye, 2013) 但在電刺激外側疆核研究，發現不同頻率的電刺激會影響動物受試對自我注射作業的行為改變 (Friedman et al., 2010, 2011) 。從上述幾篇的文獻資料，推測外側疆核上可能有不同類型的神經元投射到邊緣多巴胺系統，影響外側疆核在制約性酬賞相關作業 . 23.

(34) . 的表現效果。對於外側疆核在制約行為的習得階段研究，僅有幾篇文獻利用迴避學習 (avoidance learning) 作業探討，動物受試在該作業必須將制約刺激 (聲音) 和非制約刺激 (電擊) 配對連結，爾後當聲音出現時，動物受試必須作出正確逃避反應，否則就會遭受到電擊。實驗者分別在學習階段與表現階段利用不同頻率的電刺激動物受試的外側疆核，發現動物受試在迴避學習作業上的表現，會隨著電刺激的頻率增加，使動物受試在作業上降低正確反應的表現。動物受試在學會迴避學習作業後，利用電刺激外側疆核，發現動物受試原本學會的行為不會受到外側疆核的操弄而影響表現 (Shumake et al., 2010; Ilango et al., 2013) 。由上述的文獻資料，發現外側疆核參與調控動物受試在迴避學習作業上的習得階段，但外側疆核在制約性酬賞相關作業的習得階段所扮演的角色，卻鮮少的實證研究探討。本研究所測的場地制約行為，屬於藥物作用於這項行為作業的習得 (acquisition) 階段。雖然從實驗結果未獲得外側疆核的麩胺酸參與此行為習得之明顯證據，但其是否參與制約場地偏好行為的表現 (performance) 仍有待進一步實驗去釐清。一般而言，制約行為的習得建立及後續表現，不盡然都由某一個特定腦區所支配或調控。關於外側疆核近期之神經化學研究，發現該腦組織除了有麩胺酸 AMPA 與 NMDA 類受體，也含有多巴胺、GABA 類以及血清素受體存在 (Meye et al., 2013) 。此外，在外側疆核上可依照位置與化學特性分為外部 (lateral) 與內部 (medial) 兩個次級區域；外側疆核的外部次級區域主要接受自基底核與腳內核的神經訊息，經由麩胺酸將神經訊息傳遞到內側被蓋核，內側被蓋核再以 GABA 將神經訊息傳到腹側頂蓋區與黑質體；而內部次級區域則接受 Broca 氏對角帶等邊緣腦區直接藉由麩胺酸疆神經訊息傳到腹側頂蓋區以及內側縫核與背側縫核，雖然這兩種路徑皆會把訊息傳到腹側頂蓋區，但所傳送的神經傳導物質卻不相同 (Herkenham and Nauta, 1977; Kim, 2009; Gonçalves et al., 2012; Proulx et al., 2014)。在 Good 等人 (2013) 利用電生理記錄技術，發現多巴胺 D4 受體受到多巴胺致效劑的刺激，興奮外側疆核的內部次級區域的神經元活性，增加此區域的麩胺酸釋放或是抑制 GABA 的釋放；以上兩篇屬於離體 (in vitro) 的實驗結果。據此，推論當麩胺酸受體藥物注入外側疆核後，藉著麩胺酸將 . 24.

(35) . 神經訊息以間接或是直接的路徑投射到腹側頂蓋區，而本研究所使用的微量注射技術，將藥物注入外側疆核，無法進一步解析藥物灌入擴散至外側疆核的次級區域。根據過去的文獻發現外側疆核的次級區域俱有異質性的結構與功能，但微量注射藥物的實驗操弄對測量此腦區的功能則受限，這可能是造成本研究的制約性場地作業的行為效果不顯著的原因之一。. . 25.

(36) . 結論本篇論文中使用 AMPA 與 NMDA 類的受體藥物注入外側疆核，發現只有在 AMPA 類的受體拮抗劑 CNQX，對制約性場地行為作業有明顯的行為改變。然而在 CNQX 所形成制約性場地效果，會依特定的劑量而有不同方向的變化：在高劑量 (1.6 μg) 出現制約性場地嫌惡效果，而在中劑量 (0.4 μg) 則發現有制約性場地偏好的趨勢。當 CNQX 與 AP5 分別操弄與安非他命結合，發現注入 CNQX (0.4 μg) 於外側疆核並未形成任何制約性場地反應；當這項 CNQX 操弄結合安非他命處理，安非他命的制約場地偏好行為未受影響，AP5(1.5 μg)注入外側疆核則會抑制安非他命引發的制約性場地偏好行為。綜合以上的實驗結果，麩胺酸藥物單獨注入到外側疆核對大白鼠習得場地制約的影響有限，麩胺酸受體拮抗劑對安非他命引發的制約場地偏好行為習得歷程，不如預期設想的單純。外側疆核上麩胺酸受體與中腦多巴胺系統之間神經迴路，可能還有其他不同的神經傳導物質調控，進而影響酬賞動機相關的制約行為，需要進一步的研究驗證。. . 26.

(37) . 參考文獻張雅惠 (1998) 麩胺酸對心理興奮劑引發場地偏好行為之探討。未發表之碩士學位論文，國立政治大學心理學研究所。林禧岳 (2012) 電刺激大鼠側疆核對區辨性低頻操作式制約行為的影響。未發表之碩士學位論文，國立政治大學神經科學研究所。 Aizawa H, Kobayashi M, Tanaka S, Fukai T, Okamoto H (2012) Molecular characterization of the subnuclei in rat habenula. J Comp Neurol 520:4051–4066. Bardo MT, Valone JM, Bevins RA (1999) Locomotion and conditioned place preference produced by acute intravenous amphetamine: role of dopamine receptors and individual differences in amphetamine self-administration. Psychopharmacology (Berl) 143:39-46. Bardo MT, Bevins RA (2000) Conditioned place preference: what does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology (Berl) 153:31-43. Björklund A, Dunnett SB (2007) Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci 30:194-202. Brinschwitz K, Dittgen A, Madai VI, Lommel R, Geisler S, Veh RW (2010) Glutamatergic axons from the lateral habenula mainly terminate on GABAergic neurons of the ventral midbrain. Neuroscience 168:463-76. Bianco IH, Wilson SW (2009) The habenular nuclei: a conserved asymmetric relay station in the vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 364:1005-20. Caine SB, Koob GF (1994) Effects of mesolimbic dopamine depletion on responding maintained by cocaine and food. J Exp Anal Behav 61:213-21. Carr GD, White NM (1983) Conditioned place preference from intra-accumbens but not intra-caudate amphetamine injections. Life Sci 33:2551-7. Carvey PM, Kao LC, Klawans HL (1987) The effect of bilateral kainic acid-induced 27.

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