國立臺灣大學牙醫專業學院臨床牙醫學研究所 碩士論文
Graduate Institute of Clinical Dentistry School of Dentistry
National Taiwan University Master Thesis
調節性 T 細胞與介白素-1β、介白素-6 以及變形生長因子 -β於口腔鱗狀上皮細胞癌之表現
Regulatory T cells and the Expression of Interleukin-1β, Interleukin-6 and Transforming Growth Factor-βin Oral
Squamous Cell Carcinoma
唐宗凡 Tang, Tzung-Fan 指導教授：賈景山 教授
李正喆 臨床副教授 Advisor: Prof. Chia Jean-San
Associate Prof. Lee Jang-Jaer 中華民國 99 年 6 月
June, 2010
1
目錄
中文摘要………....………...………..6
英文摘要………..………...………... .. 8
第一章 序論及文獻回顧………...………...………..10
1.1 第一節 口腔鱗狀上皮細胞癌之概論… ….…………...………..…10
1.1.1 口腔鱗狀上皮細胞癌之流行病學………...……..……...10
1.1.2 口腔鱗狀上皮細胞癌之危險因子..………...…………...10
1.1.2.1 菸草製品………...……….11
1.1.2.2 酒精………...……….11
1.1.2.3 檳榔………...……….11
1.1.2.4 其他因素………...………….12
1.1.3 口腔鱗狀上皮細胞癌之治療及預後..………...……....12
1.2 第二節 免疫與癌症…..………..……..….…... 13
1.2.1 腫瘤的微環境………...…..13
1.2.2 腫瘤微環境中的免疫細胞…..………...13
1.2.3 發炎與癌症………..………...14
1.2.4 腫瘤逃逸的機制……….………...15
1.3 第三節 調節性 T 細胞……..……….………...………...15
1.3.1 Treg 細胞調控免疫的機制…...………...…...16
1.3.2 Treg 細胞與癌症………..………...……….16
1.3.3 Treg 細胞與口腔鱗狀上皮細胞癌………...……….…..17
1.4 第四節 細胞激素的調控……..…….………...……...17
1.4.1 介白素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)…….………....………..18
1.4.1.1 IL- 1β 對免疫反應的影響………...……...18
1.4.1.2 IL- 1β 對細胞癌化的影響……….19
1.4.1.3 IL- 1β 對腫瘤侵入性的影響………...19
1.4.1.4 IL- 1β 與口腔鱗狀上皮細胞癌……….20
2
1.4.2 介白素-6(Interleulin-6, IL-6)…...………...20
1.4.2.1 IL-6 與口腔鱗狀上皮細胞癌………...………..21
1.4.3 變形生長因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β)………...,,,21
1.4.3.1 TGF-β 對免疫系統的調控………....….22
1.4.3.2 TGF-β 與口腔鱗狀上皮細胞癌……….22
第二章 材料與方法………...24
2.1 第一節 實驗樣本…………..………..………...24
2.2 第二節 標本之固定與包埋………..………..………...24
2.3 第三節 免疫組織化學染色………..…….……….. ……....24
2.3.1 反應藥劑………...…..24
2.3.2 初級抗挺的選擇………..………...….24
2.3.3 實驗步驟………...…..25
2.4 第四節 免疫組織化學染色後之觀察與記錄……..……….……...26
第三章 結果………...………...28
3.1 第一節 Interleukin-1β、interleukin-6、transforming growth factor-β 以及 Foxp3 於口腔鱗狀上皮細胞癌之表現……….………...…28
3.2 第二節 Interleukin-1β、interleukin-6、transforming growth factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果之間的相關性………...………...28
3.3 第三節 Interleukin-1β、interleukin-6、transforming growth factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果與各項臨床變數間及組織病理學參數的關係…….…28
3.4 第四節 Interleukin-1β、interleukin-6、transforming growth factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果與各項風險因子的關係……….30
3.5 第五節 Interleukin-1β、interleukin-6、transforming growth factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果與存活時間的關係……….31
第四章 討論……….…..………..32
第五章 結論……….………...36
第六章 附表與附圖……….37
參考文獻………...65
3
表目錄
表1 : IL-1β、IL-6 及 TGF-β 於 OSCC 腫瘤細胞上之陽性染色之標記指數(Labeling Index)、強度(Intensity)及平均標記分數(Labeling score) ……….37 表2 : IL-1β、IL-6 及 TGF-β 於 OSCC 基質細胞及浸潤之免疫細胞上陽性染色之標記指
數(Labeling Index)………...38 表3 : IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp3 於 OSCC 中各項標記指數、強度、標記分數之相
關性……….………...….39 表4 : 年齡與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標記分數
之相關性……….40 表5 : 性別與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標記分數
之相關性………...…..41 表6 : 腫瘤位置與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標記
分數之相關性………...…. 42 表7 : 腫瘤大小(T)與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標 記分數之相關性………...………..43 表8 : 淋巴結轉移(N)與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、
標記分數之相關性………...…...44 表9 : 腫瘤分期期數(Stage)與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、
強度、標記分數之相關性………..………...…...46 表10 : 腫瘤細胞分化程度與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強
度、標記分數之相關性………..………...…...47 表11 : 淋巴管或血管侵犯與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強
度、標記分數之相關性………..………..………...………..48 表12 : 轉移淋巴結之膜外擴散與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、
強度、標記分數之相關性………..………...………....49 表13 : 腫瘤復發與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標記
分數之相關性………..………...…...50
4
表14 : 酒精攝取與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標記 分數之相關性………..………...…...51 表15 : 嚼食檳榔與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標記 分數之相關性………..………...…...52 表16 : 抽菸與 IL-1β、IL-6、TGF-β 與 Foxp 各項陽性染色標記指數、強度、標記分數 之相關性………..………...…...53
5
圖目錄
圖1: IL-1β 於 OSCC 組織切片中的表現………...54
圖2: IL-6 於 OSCC 組織切片中的表現………...55
圖3: TGF-β 於 OSCC 組織切片中的表現……….………..56
圖4: Foxp3 於 OSCC 組織切片中的表現……….…...57
圖5: Kaplan-Meier 生存曲線與 IL-1β 癌細胞標記指數之關係……….58
圖6: Kaplan-Meier 生存曲線與 IL-1β 基質與浸潤之免疫細胞標記指數之關係……….59
圖7: Kaplan-Meier 生存曲線與 IL-6 癌細胞標記指數之關係………...60
圖8: Kaplan-Meier 生存曲線與 IL-6 基質與浸潤之免疫細胞標記指數之關係………...61
圖9: Kaplan-Meier 生存曲線與 TGF-β 癌細胞標記指數之關係...62
圖10: Kaplan-Meier 生存曲線與 TGF-β 基質與浸潤之免疫細胞標記指數之關係…….63
圖11: Kaplan-Meier 生存曲線與 Foxp3 之標記指數之關係………..64
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中文摘要
背景：口腔鱗狀上皮細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)的發生以及生長與發 炎反應有很高的相關性，而發炎反應則是由介白素-1β(interleukin-1β, IL-1β)以及介白 素-6(interleukin-6, IL-6)等促發炎反應的細胞激素來調控。然而在腫瘤的微環境中適應 性免疫細胞卻是被抑制的。調節性T 細胞(regulatory T cell, Treg)的功能主要是藉由變 形生長因子(Transforming growth factor-β, TGF-β)等細胞激素的調控，對免疫系統造成
抑制。調節性T 細胞的抗發炎能力，或許有助於腫瘤的控制，然而也有可能幫助腫瘤
逃離免疫系統的監測，進而幫助腫瘤的生長。因此本研究欲觀察，能產生抗發炎反應 的Treg 細胞以及 TGF-β，與能促進發炎反應的 IL-1β 以及 IL-6 於 OSCC 中的表現，
以及其與臨床以及組織病理上各項參數之相關性。
材料與方法：本研究利用免疫組織化學染色方法，觀察Foxp3、TGF-β、IL-1β 以及 IL-6 於71 例於 1999 年至 2004 年間於台大口腔顎面外科接受手術切除治療之 OSCC 患者 組織中的表現。並分別評估Foxp3、TGF-β、IL-1β 以及 IL-6 於 OSCC 腫瘤細胞以及 基質中的表現。Foxp3、TGF-β、IL-1β 以及 IL-6 於 OSCC 中之表現與各項臨床與病理 之參數的關係，則使用Pearson product-moment correlation coefficient、Student’s t test、
Kruskal-Wallis H test 以及 Mann-Whitney U test 來評估。Foxp3、TGF-β、IL-1β 以及 IL-6 於OSCC 中之表現與患者存活之關係則使用 Kaplan-Meier survival analysis 來評估。
結果：所有的病例皆表現Foxp3 以及 IL-6，而 IL-1β 以及 TGF-β 則各有一個病例未表 現。Foxp3、TGF-β、IL-1β 以及 IL-6 之各項表現於彼此之間或是細胞激素本身互有相 關性。於早期的腫瘤中Foxp3 的表現量較晚期腫瘤為高，而晚期的腫瘤中 IL-1β 於腫 瘤細胞中表現則較早期為高。此外，TGF-β 於超過 50%的腫瘤細胞中表現則患者的累 積存活率越好。
結論：OSCC 是一高度發炎的腫瘤，IL-1β 於較具侵犯性的腫瘤之腫瘤細胞中表現較 高，Foxp3 則於較早期的腫瘤細胞表現較高。具有菸酒檳榔等不良習慣的患者，IL-1β
於腫瘤細胞中，而IL-6 於腫瘤基質中的表現較高，但 Treg 的表現較低，使腫瘤偏向
發炎的環境。另外，TGF-β 於腫瘤中表現超過 50%腫瘤細胞，則累積存活率較高，表 示TGF-β 對 OSCC 的預後是有幫助的。於本研究中，Foxp3、IL-1β 以及 IL-6 對於 OSCC
7
的存活率以及預後是沒有影響的。
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Abstract
Background: The occurrence and progression of oral squamous cell carcinoma (OSCC)
are highly correlated with inflammation, which is mediated by pro-inflammatory cytokines, including interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6). But the adaptive immune cells are suppressed in the tumor microenvironment. Regulatory T cells (Tregs) suppress immune response through transforming growth factor-β (TGF-β) mediation. Tregs may suppress inflammatory response and help the control of tumor, but also may support tumor to escape from immune surveillance and promote tumor progression. The study was to investigate the expression of Treg and TGF-β, which exert anti-inflammation, and IL-1β and IL-6, which promote inflammatory response in OSCC and their associations with clinical and pathological features.
Materials and methods: Surgical specimens from 71 patients treated for OSCC at
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, National Taiwan university hospital, were evaluated for Foxp3, TGF-β, IL-1β and IL-6 expression by immunihistochemical staining.
The expression of Foxp3, TGF-β, IL-1β and IL-6 in OSCC cancer and stromal cells were evaluated respectively. Associations of Foxp3, TGF-β, IL-1β and IL-6 expression with clinical and pathological features were evaluated by using Pearson product-moment correlation coefficient, Student’s t test, Kruskal-Wallis H test and Mann-Whitney U test.
Associations of Foxp3, TGF-β, IL-1β and IL-6 expression with survival of patients from OSCC were evaluated by using Kaplan-Meier survival analysis.
Results: All patients showed Foxp3 and IL-6 expression. IL-1β and TGF-β have one case didn’t show any positive expression in tumor and stromal cells respectively. The expression of Foxp3, TGF-β, IL-1β and IL-6 were correlated with themselves or each
9
others. Compared early stage with advanced stage tumor, the expression of Foxp3 was higher in early stage, and the expression of IL-1β in tumor cells was higher in advanced stage. The higher expression of TGF-β in tumor cells was associated with better cumulative proportion surviving.
Conclusions：OSCC is a highly associated with inflammatory response, and the expression
of IL-1β was higher in more invasively tumor, and Foxp3 expression was higher in early stage tumor. If the patients had smoking and/or alcohol drinking and/or betel quid chewing, the expression of IL-1β was higher in cancer cells and IL-6 was higher in stromal cells, but the amount of Tregs were lower. This result indicates that these habits deviate tumor to more inflammatory microenvironment. If over 50% tumor cells express TGF-β, the cumulative proportion surviving would be higher, indicating TGF-β associated with better prognosis. In this study, the expression of Foxp3, IL-1β, IL-6 have no impact on the survival and prognosis of OSCC.
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第一章 序論及文獻回顧
1.1 第一節 口腔鱗狀上皮細胞癌之概論
1.1.1 口腔鱗狀上皮細胞癌之流行病學
全球每年口腔癌的發生病例為275000人，佔所有惡性腫瘤的2.5% (Ferlay J 2002)。而口腔鱗狀上皮細胞癌 (Oral squamous cell carcinoma, OSCC)為口腔中發生率 最高之癌症，尤其是於較低收入的社會階層，其中以年齡較高的男性更為常見。而超 過45歲而得到口腔鱗狀上皮細胞癌的群組，有90%都曾接觸過如菸、酒等已知的危險 因子 (Ferlay J 2002)。
OSCC是世界上發生率第八高的癌症，但是在部分地區如法國北部、東歐、南美 洲以及東南亞具有更高的盛行率 (Moore et al. 1999; Moore et al. 2000a; Moore et al.
2000b)。在印度更是高達所有癌症中的30%至40% (Desai 1983)。
依據中華民國行政院衛生署的統計資料，於2006年，口腔癌已經成為台灣發生率 第六名的癌症，且為台灣男性發生率第四名的癌症。而死亡率則從1986年的每十萬人 中2.2人，提升至2008年的每十萬人中9.6人，於20年間增加了4.36倍。男性於2008年口 腔癌死亡率更高達每十萬人中17.9人。口腔癌的發生從1989至1993年間，主要年齡層 集中在50至59歲之間。然而從1993到2000年間，口腔癌好發的年齡層則降至40至49歲 之間。同樣的趨勢也發現在死亡率上，口腔癌的死亡年齡中位數與其他癌症相比是較 為年輕的，從1989年至1999年的十年間，從58歲降至54歲，然而在1999至2008年間，
並沒有明顯的變化。
OSCC明顯的好發於男性，一研究分析1985至1996於南臺灣的703位OSCC患者，
發現男女的比例為51:1 (Chen et al. 1999)。也有研究報告指出，OSCC的患者組成約為 90%至93%男性與7%至10%女性 (Liao et al. 2008)，顯示了男性與女性的差距，這可能 是因為女性嚼食檳榔的比例較少的緣故 (Chen et al. 2008)。
1.1.2 口腔鱗狀上皮細胞癌之危險因子
OSCC的細胞來源為oral keratinocyte，細胞的DNA突變可能是自發性的，然而接 觸 到 致 癌 因 子 可 以 增 加 突 變 的 機 率 。 此 外 ， 人 體 內 異 質 物 代 謝 酵 素(Xenobiotic metabolizing enzyme, XME)的基因變異，也會影響到致癌因子的代謝 (Scully et al.
11
2000a; Scully et al. 2000b; Scully et al. 2000c)。許多危險因子能夠增加細胞突變的機 率，尤其是使用菸草製品與喝酒的影響特別重要。其他如嚼檳榔、日光的曝曬、游離 輻射、人類乳突病毒(Human papilloma virus, HPV)或是其他的感染，以及免疫力不全 的狀態皆與口腔鱗狀上皮細胞癌的發生有關係。
1.1.2.1 菸草製品(Tobacco)
菸草製品的使用為OSCC的主要危險因子之一 (Hirota et al. 2008; Vallecillo Capilla et al. 2007)。這包括了有煙菸草製品以及無煙菸草製品 (Warnakulasuriya and Ralhan 2007)，雖然有學者提出無煙菸草製品對於致癌風險的影響是較小的 (Boffetta 2008)。
菸草製品的使用會產生致癌物質，如TSNA（tobacco-specific nitrosamines），一種 自由基，會造成許多酵素的改變 (Brunnemann et al. 1996; Hoffmann and Hoffmann 1997)。
重度的菸草製品使用者產生OSCC的風險為一般人的20倍，並且存在著劑量─反應 關係(dose─response relationship)，表示風險會隨著每天所抽菸的數量以及所抽的時間 增加。其他形式的菸草製品也是危險因子，有研究證實在印度Trivandrum市，菸草的 嚼食是產生OSCC最強的危險因子，並且也存在著劑量─反應關係 (Muwonge et al.
2008)。
1.1.2.2 酒精(Alcohol)
酒 精 ( 乙 醇 /ethanol) 會 被 醇 脫 氫 酶 (alcohol dehydrogenase/ADH) 氧 化 成 乙 醛 (acetaldehyde)，乙醛可能是一種致癌物質 (Boccia et al. 2009)，之後乙醛會被醛脫氫脢 (aldehyde dehydrogenase/ALDH)分解為不具致癌性的醋酸鹽(acetate)。重度的酒精攝取 會使OSCC產生的機率提高五倍，並且具有劑量─反應關係 (Pelucchi et al. 2008)。重 度的菸草使用者與酒精攝取，對於產生OSCC的風險會比兩者產生的風險相乘還要來 的 更 高 (Hashibe et al. 2009) 。 酒 精 的 攝 取 會 誘 導 黏 膜 以 及 肝 臟 中 cytochrome P450-2E1-dependent microsomal biotransformation system 的啟動，而使菸草產生的致 癌前驅物活化 (Seitz and Cho 2009)。
1.1.2.3 檳榔(betel-quid)
檳榔已經被證實對人體會有致癌的可能 (Carpenter et al. 2005; Guh et al. 2007;
12
Jacob et al. 2004; Merchant et al. 2000; Reichart and Nguyen 2008; Thomas et al. 2007;
Thomas et al. 2008)，而全球約有20%的族群有嚼食檳榔的習慣 (Cogliano et al, 2004)。
檳榔子(areca nut)中的檳榔素(arecoline)可能會阻斷腫瘤抑制基因(Tumor suppressor gene, TSG) p14、p15以及p16，以及抑制p53 TSG，造成上皮細胞的DNA無法修復，並 促進DNA的傷害 (Chen et al. 2008; Cheong et al. 2009; Park et al. 2008; Takeshima et al.
2008; Tsai et al. 2008)。檳榔導致的致癌風險也與檳榔的種類有關，食用檳榔花具有最 高的風險，檳榔葉則具有較低的風險 (Lee et al. 2005)。在台灣，嚼食檳榔與口腔癌的 發生有很強的相關性，將近80%因口腔癌而死亡的患者有嚼食檳榔的習慣。同時具有 嚼食檳榔、吸菸和飲酒的人較無上述口腔習慣的人，其罹患口腔癌的機率高出123倍，
而其中三種口腔習慣的比較，又以單獨嚼食檳榔罹癌的機率最高 (Liao et al. 2008)。
1.1.2.4 其他因素(other factors)
全世界大約有25%的口腔癌患者歸因於菸草製品的使用(包括抽菸或嚼食菸草)，
7-19%是因為飲酒，10-15%是因為營養不良，而在嚼食檳榔盛行的區域則有超過50%
的患者有嚼食檳榔的習慣 (Petti 2009)。然而，也有部分的病例無法歸因於攝取菸酒檳 榔等不良習慣而導致癌症，尤其是女性以及年輕人 (Hashibe et al. 2009; Llewellyn et al.
2001)。許多研究顯示HNSCC中含有HPV的DNA，尤其在口咽癌之中。OSCC在有大 量性伴侶以及較年輕就擁有性行為的人之中發生率也會增高。另外在子宮頸癌的女性 患者以及其性伴侶，OSCC的發生率也會增加 (Scully 2002; Scully 2005)。口腔衛生不 良也可能會使OSCC的發生率增高，牙周疾病以及牙齒缺失可能會使OSCC的機率增 加，口腔中的細菌如streptococci以及neisseria也可能會從酒精中合成乙醛。在接受器 官移植、Fanconi 貧血症、先天性角化不全症(dyskeratosis congenital)、糖尿病以及硬 皮症(scleroderma)等會影響個體免疫能力的疾病，OSCC的發生率也會增加 (Dikshit et al. 2006)
1.1.3 口腔鱗狀上皮細胞癌的治療及預後
手術治療仍然是大多數口腔癌症的主要方式，僅接受手術切除能有有效的控制 80%以上患者的原發腫瘤 (Ichimiya et al. 2005; Makitie et al. 2007)。但在AJCC分期較 高，如第三、第四期的患者，或是有高度復發可能的患者通常需接受放射治療或放射 治療合併化學治療。然而期別越高的患者其預後越差，在口腔癌患者中的五年存活
13
率，第一期為72-90%、第二期為39-85%、第三期為27-70%、第四期為12-50% (Ko et al.
1995; Liao et al. 2008; Liao et al. 2007)。
1.2 第二節 免疫與癌症 (Immunity and cancer)
1.2.1 腫瘤的微環境 (tumor microenvironment)
癌症是一種漸進性的疾病，通常都需要細胞的突變來啟始，然而，僅是細胞的突 變並不足以造成惡性腫瘤的形成 (Hanahan and Weinberg 2000)。惡性腫瘤的組成需要 許多不同的細胞，其中包括：基因變異的癌細胞，以及在腫瘤微環境中被活化或是召 集來的基質細胞；其中有纖維母細胞(fibroblast)、內皮細胞(endothelial cell)以及壁內細 胞(mural cell)來形成血管以及淋巴的通路；以及先天性免疫細胞(innate immune cell) 與適應性免疫細胞(adaptive immune cell)，這些細胞都存在胞外基質(extracellular matrix, ECM)之中，並共同調控惡性腫瘤的發展 (Bissell and Radisky 2001; Coussens and Werb 2002; Kiaris et al. 2004; Mueller and Fusenig 2004; Tlsty 2001)。
在健康的組織中，ECM中的各種細胞會存在於平衡的狀態。但是一旦開始進行癌 化的過程，基質的功能以及結構會產生戲劇性的變化(Mueller et al, 2004)。纖維母細胞 會有更高的增殖率，並且基質中會有許多的免疫細胞浸潤以及活化 (Benitez-Bribiesca et al. 2001; Duncan et al. 1998; Imada et al. 2000; Takanami et al. 2000; Tomita et al. 2000;
Toth-Jakatics et al. 2000)。更進一步，基質內會產生許多沒有組織性的血管，組織間質 液壓(interstitial fluid pressure, IFP)會上升，淋巴通路的結構也會改變 (Achen et al. 2005;
Bergers and Benjamin 2003; Hashizume et al. 2000; Heldin et al. 2004; McDonald and Baluk 2002)。腫瘤細胞、活化的纖維母細胞以及炎症細胞接著開始製造生長因子與蛋 白酶，重塑ECM的結構蛋白以及基底膜，導致組織的平衡受到破壞，使得細胞遷移並 且侵入其他部位的組織 (Egeblad and Werb 2002)。
1.2.2 腫瘤微環境中的免疫細胞
腫瘤微環境中會有許多免疫細胞的浸潤，其中包括了適應性免疫系統的T淋巴 球、樹突細胞(dendritic cell, DC)，偶而會有少量的B細胞；先天性免疫系統的巨噬細 胞(macrophage)、多型核白血球(polymorphonuclear leukocyte)以及很少的自然殺手細胞 (natural killer cell, NK cell) (Whiteside 2006b)。
腫瘤浸潤的淋巴球(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)，包括了CD3+CD4+ T細胞以
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及CD3+CD8+T細胞，通常是腫瘤微環境中的主要成分，這之中許多T細胞都對腫瘤相 關抗原(tumor-associated antigen)有特異性(Miescher et al. 1987)。然而TIL之中卻有一部 分的T細胞為CD4+CD25highFoxp3+細胞，這些細胞稱為調節性T細胞(Regulatory T cell, Treg cell)。Treg細胞能夠分泌IL-10、TGF-β，並經由直接接觸來抑制腫瘤微環境中其 他T細胞的生長 (Strauss et al. 2007)。另外一種CD4+ T細胞的子類型，Th17細胞也可能 會表現在腫瘤的微環境中，雖然目前還沒有明確的證據，但是Th17細胞可能在不同的 環境下會表現抗腫瘤的反應或是促進腫瘤生長的能力 (Zou and Restifo 2010)。
腫瘤微環境中的巨噬細胞稱作腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)，這些細胞會釋放一些抑制性的細胞激素如IL-10、前列腺素(prostaglandin)或活 性氧化物質(reactive oxygen species, ROS)來抑制T淋巴球的功能(Mantovani et al. 2002;
Martinez et al. 2008)。另外腫瘤中聚積的骨髓抑制細胞(myeloid suppressor cell, MSC) 會增進腫瘤的生長以及抑制免疫細胞的功能 (Ochoa et al. 2007)。此外，腫瘤也會分泌 許多因子，包括IL-10、VEGF、GM-CSF來召集MSC聚集到腫瘤處，以抑制DC的成熟 以及抑制淋巴球的功能 (Serafini et al. 2006)。
1.2.3 發炎與癌症
在人體以及實驗性的惡性病灶上的通常都有白血球的浸潤，而這些免疫細胞的增 加不只是因為癌症進展時組織變化的結果，而是在致癌過程的調控機轉中扮演著重要 的角色。臨床的觀察免疫反應在腫瘤的生長以及發展中扮演著雙重的角色；若免疫反 應較傾向抗腫瘤T淋巴球反應(anti-tumor T lymphocytes response)，則與較佳的疾病預 後有關；然而若腫瘤微環境中的免疫反應傾向於慢性活化先天性免疫細胞，則通常與 較差的預後有關 (Abe et al. 2003; Chiba et al. 2004; Funada et al. 2003; Nakakubo et al.
2003; Oshikiri et al. 2003; Wakabayashi et al. 2003; Zhang et al. 2003)。
既然基因改變的細胞是能夠被適應性免疫系統辨認的目標，有許多研究嘗試使用 一 些 疫 苗 來 引 起 有 腫 瘤 特 異 性 的CD8+ T 細 胞 反 應 (tumor-specific CD8+ T cell response)，然而只有少數的病例能夠成功的產生抗腫瘤的適應性免疫反應來控制以及 使腫瘤縮小 (Rosenberg et al. 2004)。這可能是因為腫瘤會將免疫的環境轉換成適合腫 瘤生長的環境 (Balkwill et al. 2005)。腫瘤微環境中出現的先天性免疫細胞；如MSC，
以及Treg細胞會進一步的抑制系統性或局部性的抗腫瘤適應性免疫反應 (Bronte et al.
15
2000; Curiel et al. 2004; Kusmartsev and Gabrilovich 2002; Sakaguchi 2005; Serafini et al.
2004)。而腫瘤中的腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophage, TAM)以及Th17 細胞則會促進微環境中的發炎反應 (Zou and Restifo 2010)。流行病學的研究也指出許 多慢性發炎障礙(chronic inflammatory disorder)、慢性發炎以及慢性的機械及化學性刺 激會使癌症較容易產生 (Ness and Cottreau 1999; Shacter and Weitzman 2002; Thun et al. 2004; Weitzman and Gordon 1990)。也有證據顯示長期使用非固醇類抗發炎藥物 (Non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID) 的 患 者 ， 產 生 癌 症 的 機 率 較 低 (Cotterchio et al. 2001; Garcia-Rodriguez and Huerta-Alvarez 2001; Sharpe et al. 2000)。而 在台灣的OSCC患者中，腫瘤內巨噬細胞浸潤的數目與腫瘤的大小、淋巴的轉移、臨 床期數、復發以及死亡率都有顯著的相關性，且可以用作OSCC預後的一個指標 (Lu et al. 2010)。
1.2.4 腫瘤逃逸(Tumor escape)的機制
腫瘤的微環境一旦建立，就表示腫瘤擁有了一層有效對抗免疫反應的屏障。因為 腫瘤並不是被動的成為宿主免疫力的目標，相反的，腫瘤會主動的藉由各種不同的策 略以及機制來調控抗腫瘤的免疫能力 (Whiteside 2008)。有些機制是直接由腫瘤製造 的一些因子來調控，有些則是因為癌症的產生而改變正常組織的homeostasis造成。
Genetic instability以及molecular changes是所有惡性腫瘤的特色，這些改變也增加了腫 瘤細胞對於免疫監測(immune surveillance)的抵抗力。此外，大多數腫瘤都能介入免疫 細胞的發育、分化、遷移、細胞毒性等一或多個階段來調控免疫細胞的生長及功能 (Whiteside 2006a)。
1.3 第三節 調節性T細胞 (Regulatory T cell, Treg cell)
早期的研究指出，在colorectal cancer的患者中，如果腫瘤浸潤的淋巴球有較高的 CD8+/CD4+ T cell ratio，則有較好的預後 (Diederichsen et al. 2003)。這表示了若CD4+ T 細胞的比例越高，則抗腫瘤的能力會較差。而CD4+ T細胞中的一種subtype，Treg細胞，
引起了大家的注意。Treg細胞表現了高量的CD25，當小鼠中的CD25+細胞被移除，會 造成自體免疫疾病 (Sakaguchi et al. 1995)。而在癌症患者中，若在peripheral blood、
tumor microenvironment以及tumor-draining lymph node中CD4+CD25high Treg濃度較高
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的 患 者 ， 這 些 被 萃 取 出 來 的Treg 細 胞 在 in vitro 研 究 中 都 具 有 免 疫 抑 制 的 能 力 (Fattorossi et al. 2004; Liyanage et al. 2002; Woo et al. 2001)。因此Treg可能藉由提供腫 瘤一種免疫逃逸的機制，使腫瘤能夠躲過免疫細胞的監測和破壞 (Knutson et al.
2007)。
1.3.1 Treg細胞調控免疫的機制
在In vitro study中，human CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞能夠藉由直接接觸來阻斷 許多先天性及適應性的免疫細胞，包括了DC、NK cell以及活化的T細胞 (Maggi et al.
2005)。Treg會用細胞上的CTLA-4以及TGF-β1與作用性T細胞(effector T cell)上的B7和 TGF-β接受器結合，導致作用性T細胞上高親和性IL-2接受器(high affinity IL-2 receptor) 的向上調控(upregulation)被阻斷 (Annunziato et al. 2002)。此外，CD4+CD25- T細胞與 CD4+CD25+ T細胞在一起的時候，會啟動TGF-β的信息傳遞路徑(signaling pathway)以 及TGF-β-inducible gene的向上調控 (Nakamura et al. 2004)。除了經由B7以及TGFβR的 訊息傳遞之外，Treg也可能經由granzyme B或是perforin來誘導T cell的凋亡(apoptosis) 或是壞死(necrosis) (Grossman et al. 2004)。
Human CD4+CD25+Foxp3+ T cell不只調控T細胞的作用，也會影響其他的作用性免 疫細胞(immune effector)。Treg能夠抑制myeloid dendritic cell的成熟以及細胞激素的製 造 (Houot et al. 2006)。NK細胞在癌症患者中的細胞活性則與Treg的數量呈現負相關 的 關 係 ， 表 示Treg也能抑制NK細胞的活性。在in vitro study中，Treg能夠阻斷 NK-mediated cytolysis以及IFN-γ的製造，也會向下調控NK-activating receptor NKG2D (Ghiringhelli et al. 2005a)。
1.3.2 Treg細胞與癌症
腫瘤可能會製造一些因子或細胞激素來增加CD4+ Treg細胞在淋巴以及周邊血液 的產生，藉此阻斷對腫瘤抗原具有特異性的免疫反應產生。在頭頸癌、肝癌、胃癌、
乳癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤(melanoma)、腎細胞癌以及胰臟癌中，周邊血液的CD4+ Treg細胞的濃度都會增加 (Li et al. 2005; Liyanage et al. 2002; Okita et al. 2005;
Schaefer et al. 2005)。有研究顯示，癌症患者中CD4+CD25+ T細胞的量大約佔了所有 CD4+ T細胞的13-52% (Wolf et al. 2003)。其中CD25high或是Foxp3+的細胞，約佔所有 CD4+ T細胞的4-10%，這比正常人的1-2%高出許多 (Cesana et al. 2006; Ormandy et al.
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2005)。此外，在子宮頸癌、子宮內膜癌、胃癌以及黑色素瘤的患者中，腫瘤引流淋 巴結(tumor draining lymph node)中的Treg細胞會增多 (Fattorossi et al. 2004; Kawaida et al. 2005; Matsuura et al. 2006)。有研究指出，在胃癌患者中，Treg在越靠近腫瘤的引流 淋巴結中濃度會越高。在黑色素瘤中，在靠近腫瘤的淋巴結中，即使沒有腫瘤的侵犯，
其Treg的濃度也會上升 (Viguier et al. 2004)。在許多癌症中，包括乳癌、卵巢癌、肺 癌、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、肝癌以及黑色素瘤中，腫瘤中都會 產生CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞的浸潤 (Chen et al. 2005b; Leong et al. 2006; Unitt et al. 2006; Unitt et al. 2005; Woo et al. 2001)。而在卵巢癌中，不管腫瘤的分級為何，腫 瘤中CD4+CD25+ T細胞的數量越多，則臨床預後越差 (Curiel et al. 2004)。也有其他研 究指出卵巢癌中，腫瘤內Foxp3濃度的增加與存活率的降低有高度的相關 (Wolf et al.
2005)。然而在某些腫瘤的研究當中，卻無法確定Foxp3+ T細胞與存活率的關係 (Alvaro et al. 2005; Badoual et al. 2006)。
1.3.3 Treg細胞與口腔鱗狀上皮細胞癌
在HNSCC的患者中，其周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的CD4+以及CD8+ T細胞的比例與健康的人的PBMC相比是低很多的，然而 CD4+/CD8+細胞比是沒有太大差異的，此外NK細胞的比例也比健康族群低很多。然 而，HNSCC患者PBMC中的CD4+CD25+Foxp3+ T細胞的比例卻比健康族群的人高出許 多。這顯示了HNSCC患者的確有受到免疫抑制的現象，而這可能受到Treg細胞的調節 (Bose et al. 2008)。Th1細胞分泌的細胞激素：IL-12、tumor necrosis factor-α(TNF-α)以 及interferon-γ(IFN-γ)在HNSCC的患者中也會被向下調控；而Th2細胞分泌的細胞激 素：IL-4、IL-6、IL-10則會增加 (Lathers et al. 2003)。OSCC的腫瘤組織中也被發現會 表現Treg細胞，且表現量比正常組織來的要高 (Schwarz et al. 2008)。雖然在許多腫瘤 的研究當中提出Treg細胞的增加可能會使患者的預後變差，卻有研究發現在HNSCC 中卻發現腫瘤組織中Treg細胞數量越多，腫瘤的局部區域控制(locoregional control)會 越好，而這可能有助於患者的預後 (Badoual et al. 2006)。
1.4 第四節 細胞激素的調控
慢性發炎能促進癌症的發展，其中TAM、Treg以及MSC對於促進腫瘤的生長以及
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腫瘤對免疫反應的逃逸機制扮演了重要的角色，然而免疫細胞之間的連結則是經由各 種細胞激素的調控，而腫瘤細胞本身也會分泌細胞激素與這些免疫細胞相互作用。藉 由細胞激素的調控能夠抑制或是增加抗腫瘤的免疫反應，並使腫瘤的微環境偏向有利 於生長的狀態或是抑制腫瘤的生長。IL-1β以及IL-6是促進發炎反應的重要細胞激素，
而Treg以及TGF-β則是在調控抗發炎反應上扮演著重要的角色。因此在OSCC中，IL-1β 以及IL-6調控的促發炎反應，與Treg以及TGF-β調控的免疫抑制反應兩者之間的關係 以及對於OSCC的影響，是很值得探討的。
1.4.1 介白素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)
IL-1是一種多效性(pleiotropic)的細胞激素，與許多急性或慢性發炎疾病，如敗血 症或風濕性關節炎，以及惡性腫瘤的致病原因有關 (Apte and Voronov 2008)。IL-1能 夠由很多種類的細胞製造並分泌，包括了基質細胞、單核球(mononuclear cell)、TAM 以及惡性腫瘤細胞。IL-1與TNFα被稱作alarm cytoline，經常由巨噬細胞分泌以起始發 炎反應。IL-1與TNFα會刺激自己或是彼此的分泌產生正向的回饋 (Apte et al. 2006a;
Apte et al. 2006b; Apte and Voronov 2002) 。 IL-1 的 成 員 包 括 了 IL-1α 、 IL-1β 、 IL-1Ra(interleukin-1 receptor antagonist)以及IL-18與IL-33 (Dunn et al. 2001; Pizarro and Cominelli 2007; Sims et al. 2001)。而其中IL-1β在腫瘤的發展中，有著重要的影響。IL-1β 的前驅物，pro-IL-1β在細胞中製造出來後，需要經由IL-1β轉換脢(IL-1β converting enzyme, ICE)的切割，才會被活化成IL-1β (Dinarello 2002)。IL-1β分泌出來後，在局部 的低劑量會造成有限的發炎反應，接著啟動特定的免疫機制來對抗腫瘤，然而在高劑 量下，廣泛性的發炎會造成周圍組織的破壞，使的腫瘤容易侵入深層的組織 (Song et al. 2005; Song et al. 2003)。
1.4.1.1 IL-1β對免疫反應的影響
Th2細胞需要APC以及IL-1β才能產生IL-4 receptor，之後才能藉由自泌(autocrine) 的方式來刺激Th2細胞的生長 (McArthur and Raulet 1993; Weaver et al. 1988)。阻斷 IL-1β也會使卵巢癌患者游離出來的APC所誘導產生的Th17減少 (Kryczek et al.
2009)，而Th17所製造的IL-17，又能誘導IL-1的產生，形成一個正向回饋 (Koenders et al. 2005)。另外也有研究顯示，在缺少其他adjuvant的時候，recombinant IL-1β能夠提 供T細胞足夠的信號對抗原反應 (Apte and Voronov 2002; Li et al. 2007)。在實驗性系統
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性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythromatosus, SLE)中，能作為adjuvant，造成對抗自體 抗體的免疫反應，進而傷害受影響器官的組織 (Voronov et al. 2006)。而在植入IL-1β secreting tumor的小鼠身上，MSC在周邊以及脾臟和腫瘤本身的堆積都會增加。進而 抑制T細胞的功能。
1.4.1.2 IL-1β對細胞癌化的影響
在in vivo study中，使用3-methylcholantrene(3-MCA)，在小鼠身上誘導細胞癌化。
發現IL-1β-/-的小鼠，產生腫瘤的時間要很久，而且不是每隻小鼠都產生。但是在 IL-1Ra-/-以及IL-1α-/-的小鼠全部都在短時間內就產生腫瘤，尤其是IL-1Ra-/-小鼠產生 的速度最快。因此，IL-1β在促進化學誘導的癌化反應(chemical-induced carcinogenesis) 是 很 重 要 的 (Apte and Voronov 2008) 。 在 受 放 射 線 誘 導 之 急 性 骨 髓 白 血 病 (radiation-induced myelogenous leukemia)的小鼠身上，發現其IL-1β的基因會受到受到 改變，這可能是起始白血病發生原因之一 (Silver et al. 1989)。
1.4.1.3 IL-1β對腫瘤侵入性的影響
在in vivo study的動物以及癌症患者身上，局部IL-1濃度的增加通常與腫瘤的侵入 性以及較差的預後有關。外生性的IL-1能夠誘導腫瘤微環境中的基質細胞、白血球以 及腫瘤細胞產生如MMP、VEGF、纖維母細胞生長因子以及CXC chemokine等因子來 促進腫瘤的生長及侵犯性。雖然沒有比較性的研究，但是由於IL-1β會大量分泌出細胞 之外，而IL-1α主要是在存在細胞內，因此這些作用可能都是由IL-1β來誘導 (Apte et al.
2006a; Apte et al. 2006b; Apte and Voronov 2002)。另外在murine B16 model中，注入 recombinant IL-1β，或是注入Lipopolysaccharide(LPS)來誘導IL-1的產生，會增加腫瘤 產生肝臟轉移的機率 (Vidal-Vanaclocha et al. 1996; Vidal-Vanaclocha et al. 1994)。但是 在IL-1β-/-或ICE-/-的小鼠，肝臟轉移的機率會下降 (Vidal-Vanaclocha et al. 2000)。因 為IL-1β會使肝竇狀隙內皮細胞(hepatic sinusoidal endothelial cell, HSE)上vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) 以 及 very late antigen-4(VLA-4) 的 表 現 增 加 。 這 些 adhesion molecule的增加使得腫瘤細胞容易附著在HSE上，因此增加了肝臟轉移的機 會。IL-1β不但能促進發炎反應，也能增加血管新生。在一個 in vivo study中，IL-1β 能增加小鼠角膜中的血管新生 (Nakao et al. 2005)。另一個 in vitro study中，IL-1β能 增加人類腫瘤細胞株之中hypoxia inducible factor-1(HIF-1)的表現，而使腫瘤細胞分泌
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VEGF (Jung et al. 2003)。
將IL-1β的cDNA轉送到纖維母細胞細胞株(fibrosarcoma cell line)中，發現IL-1β transfected fibrosarcoma tumor會比原本的母細胞株更具侵犯性。當將此腫瘤細胞植入 小鼠體內，腫瘤的生長速度會變快，而小鼠也較早死亡。且腫瘤的侵犯性與IL-1β的表 現量相關。且腫瘤細胞分泌VEGF的量也會增加，腫瘤中血管新生也會增加 (Song et al.
2003; Werman et al. 2004)。在Breast carcinoma中，IL-1β的表現與其他breast cancer的指 標都有相關 (Miller et al. 2000)。
1.4.1.4 IL-1β與口腔鱗狀上皮細胞癌
許多研究觀察到HNSCC的腫瘤組織內有高濃度IL-1，且在in vitro研究中發現SCC 的細胞株有製造以及分泌IL-1β的能力 (Ahn et al. 1993; Woods et al. 1998a)。然而在 HNSCC患者的周邊血液單核球與健康的人相比，IL-1β的分泌量並沒有顯著差異 (Gallo et al. 1993)。另外，雖然有研究指出IL-1β基因的變異會增加胃癌的發生率，然 而卻與OSCC的發生沒有關係 (Vairaktaris et al. 2008)。
1.4.2 Interleukin 6(IL-6)
IL-6是一種強效的多效性發炎細胞激素，並且被認為是一種重要的生長促進因子 (growth-promoting factor)以及抗凋亡因子(anti-apoptotic factor) (Ishihara and Hirano 2002)。IL-6的接受器是由IL-6 receptorα以及glycoprotein 130(gp130)組成。活化gp130 會啟動Janus kinase 1(JAK1)，造成signal transducers and activator of transcription protein 1(STAT1)、STAT2以及STAT3 protein的磷酸化。STAT3蛋白的訊息傳導與惡性腫瘤細 胞的生長以及存活有關，而STAT1的訊息則會抑制腫瘤的生長 (Osborne et al. 1999)。
JAK-mediated STAT tyrosine phosphorylation具有改變某些特定基因的能力，而這些基 因通常與細胞的apoptosis的進行或抑制有關，這也強調了IL-6在癌化過程的重要性 (Haura et al. 2005; O'Shea et al. 2002)。JAK-mediated STAT tyrosine phosphorylation能夠 使特定的目標基因產生雙聚合作用(dimerization)、核轉移(nuclear translocation)或是活 化，而這些目標基因通常都與細胞周期的進展或是細胞凋亡的抑制有關 (Haura et al.
2005; O'Shea et al. 2002)。
IL-6 被 認 為 在 卡 波 西 氏 肉 瘤 (Kaposi’s sarcoma) 以 及 多 發 性 骨 髓 瘤 (Multiple myeloma)的致病過程中扮演了重要的角色 (Bommert et al. 2006; Osborne et al. 1999)。
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血液循 環 中的IL-6也可能增加何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)的發生機率 (Cozen et al. 2004)。此外，在breast cancer的患者中，IL-6基因的promotor region的變異 會使細胞製造大量的IL-6，與較差的預後有關 (Berger 2004)。在多發性骨髓瘤中，IL-6 是由骨髓中的基質細胞製造的，這些IL-6會與惡性變化的漿細胞(plasma cell)反應，促 進惡性細胞的生長，腫瘤細胞本身也會製造IL-6，並藉由autocrine的方式促進生長 (Chauhan et al. 1996; Jego et al. 2006)。抑制IL-6的信號，能夠減緩chemical-induced colitis-associated colon cancer(CAC)的生長 (Greten et al. 2004)。
1.4.2.1 IL-6與口腔鱗狀上皮細胞癌
在in vitro研究中，SCC細胞株會分泌IL-6，並且當p53基因突變的時候，IL-6分泌 的量會大幅增加。此外，IL-1也會大幅度的增加IL-6的分泌 (Woods et al. 1998a)。
HNSCC的腫瘤組織中也會表現大量的IL-6，且與組織型態的分級無關 (Woods et al.
1998b)。此外許多研究也指出OSCC患者的唾液或血清中，IL-6的濃度會提高(Rhodus et al. 2005)。在HNSCC患者的周邊血液單核球與健康族群相比，也會製造大量的IL-6 (Gallo et al. 1993)。另外在OSCC患者的DNA中，檢測出與IL-6基因的變異有高度相 關，因此OSCC的發生或許與IL-6的製造有很大的關係 (Vairaktaris et al. 2008)。
1.4.3 變形生長因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β)
TGF-β不僅是一種強效的免疫抑制以及抗發炎的細胞激素，也是調控Treg細胞生 長以及功能的主要角色 (Becker et al. 2006; Chen and Wahl 2003; Ghiringhelli et al.
2005b)。TGF-β的訊號主要是經由啟動SMAD transcription factor來傳遞。TGF-β在腫瘤 的微環境中會由腫瘤細胞、基質細胞以及浸潤的免疫細胞分泌 (Moutsopoulos et al.
2008)。TGF-β有抑制colon epithelial cel生長的能力，如果type II TGF-β receptor(TβRII) 的突變造成TGF-β訊號傳遞有缺陷，則會提高結腸癌(colon cancer)的發生率 (Kim et al.
2000; Parsons et al. 1995)。這似乎顯示了TGF-β在癌化時作為腫瘤抑制者的重要性。
有研究指出，TGF-β的訊號在晚期的Colitis associated colon cancer中可以抑制IL-6 的分泌，進而控制腫瘤的生長。而IL-6活化的STAT3訊號則會抵消TGF-β調控的細胞抑 制作用 (Becker et al. 2004; Jenkins et al. 2005)。因此TGF-β與IL-6在某些癌症中可能有 互相拮抗的功能。
盡管TGF-β有顯著的抗發炎能力以及抑制初期腫瘤生長的能力，在某些腫瘤
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TGF-β也能促進腫瘤的生長。有研究指出Carcinoma常常分泌大量的TGF-β，並且能幫 助腫瘤的侵入和轉移 (Derynck et al. 2001)。此外，TGF-β也能誘導微環境改變，增加 血管新生，抑制CD8+ T cell，進而促進了腫瘤的生長 (Chen et al. 2005a)。因此TGF-β 在腫瘤中扮演了促進或是抑制的角色，可能與腫瘤的期別以及類型有關。
1.4.3.1 TGF-β對免疫系統的調控
在腫瘤微環境中，TGF-β是一種發炎細胞的強效recruitment factor，TGF-β不只扮 演免疫監測(immune surveillance)的角色，卻也能夠建立一個使腫瘤逃逸免疫監測的環 境。TGF-β與Treg細胞的分化以及功能有很重要的關連性，並且能夠誘導Foxp3的表現 (Chen et al. 2003; Wahl et al. 2006)。Treg能夠經由TGF-β的調控來抑制作用性T細胞的 功用 (Strauss et al. 2007)。TGF-β也具有誘導Treg聚集到到腫瘤微環境中的功能 (Chen et al. 2003)。
TGF-β與IL-6以及IL-21是Th17細胞的分化因子(differentiation factor)，藉由活化 STAT3會誘導retinoic-acid-related orphan receptor(RORγt)產生，RORγt能進一步控制 Th17分化 (Ivanov et al. 2006; Korn et al. 2007)。Th17細胞會分泌IL-17，在腫瘤處過度 表現的IL-17與召集吞噬細胞到腫瘤有關，並且增加腫瘤內的血管新生 (Numasaki et al.
2005)。局部堆積的IL-17會使腫瘤容易生長，而系統循環的IL-17則會使遠端轉移的機 會增加 (Kryczek et al. 2007; Stockinger et al. 2007)。TGF-β也能誘導CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞的聚集以及生成使其進行免疫抑制的作用，使tumor-specific CD8+ response受 到影響 (Chen et al. 2003; Chen and Wahl 2003; Strauss et al. 2007; Wahl et al. 2006)。
腫瘤產生的TGF-β會干擾DC的移動以及DC將抗原傳送到淋巴系統的功能，此外 也會使DC逐漸的apoptosis，以減少DC的數量，並且會抑制MHC class II molecule以及 costimulatory molecule的表現 (Ito et al. 2006; Khazaie and von Boehmer 2006)。TGF-β 也能刺激VEGF以及其他angiogenic factor的表現，其中VEGFR-3以及VEGF-C的表現會 與HNSCC的delay neck metastasis有關，而VEGF-A則會增加HNSCC患者的微血管密 度、疾病的進展速度，以及減少成熟的DC，在會在周邊產生許多不成熟的DC，當T 細胞受到不成熟的DC表現的訊號，會表現與Treg細胞一樣的marker，並進一步分泌 TGF-β、IL-10、VEGF-A (Strauss et al. 2005; Warburton et al. 2007)。
1.4.3.2 TGF-β與口腔鱗狀上皮細胞癌
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HNSCC的患者中，與正常的黏膜相比，TGF-β在腫瘤旁的癌前病變中，有大量的 表現，因此TGF-β在HNSCC的發展早期可能就有影響 (Lu et al. 2004)。在HNSCC中，
有研究指出TGF-β是一種強效的腫瘤抑制劑 (Xie et al. 2003)。然而也有研究指出 TGF-β1，TGF-β的三種同種異構物(isoform)之一，會藉由活化gelatinase以及MMP-2來 增加OSCC的侵入性 (Takayama et al. 2009)。這可能是因為TGF-β在不同階段或是不同 濃度下所活化的路徑不同，因此造成這樣的差異。In vitro研究的HNSCC小鼠模型中，
在TGF-β正常的訊號傳遞時，TGF-β是一種主要的腫瘤抑制劑，然而當TGF-β的訊號傳 遞出現問題的時候，會啟動PI3K/AKT路徑，促進細胞的癌化 (Bian et al. 2009)。
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第二章 材料和方法
2.1 第一節 實驗樣本
本實驗之樣本從 1998 到 2004 年間，71 例於臺大醫院牙科部口腔顎面外科求診之 口腔鱗狀上皮細胞癌病患，其診斷均經常規之組織病理學臨床切片確認。其中包括男 性65 例，女性 6 例，平均年齡 53 歲，其腫瘤位置、TNM 狀況及病理分期與口腔習 慣等之詳細分布，可參閱附表。所有標本之取得及使用均經病人同意並簽署同意書。
2.2 第二節 標本之固定與包埋
新鮮的標本在切取後，立即浸泡於足量的 10﹪中性福馬林(formalin)溶液中，固 定至少24 小時以上，再經例行性的脫水程序後，以石蠟 (paraffin)包埋，包埋之組織 切成4μm 厚的切片，經酸洗過程及 0.001% poly-L-lysine (PLL)塗覆於載玻片上後，放
置於56℃烘箱中熱處理 4 小時，以作進一步的免疫組織化學染色。
2.3 第三節 免疫組織化學染色 (immunohistochemical stain)
2.3.1 反應藥劑
免疫組織化學染色法是採取二次抗體結合技術，即利用初級抗體(primary antibody) 與細胞中抗原 (antigen)結合後，加入生物素化的次級抗體 (biotinylated secondary antibody) 與 初 級 抗 體 結 合 ， 再 藉 由 鏈 黴 菌 卵 白 素 - 過 氧 化 氫 酶 複 合 物 (streptavidin-peroxidase conjugate)與生物素之間的強結合力，使之與次級抗體結合，最 後加入呈色劑 (chromogen)來偵測抗原所在位置。
本實驗亦採取實驗樣本之切片，滴入不加任何初級抗體之抗體稀釋液 (antibody dilutor)，並進行一整套的免疫組織化學染色程序，作為陰性對照組，結果顯示無任何 反應。
2.3.2 初級抗體的選擇
本實驗所採用的初級抗體為anti-IL-1β、anti-IL-6、anti-TGF-β 與 anti-Foxp3 四種 抗體。本實驗將四種抗體，以抗體稀釋液（antibody dilutor,Ventana Medical Systems) 分 別稀釋成 1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:500 等梯次濃度進行試驗性染色，觀
察呈色效果，四種抗體皆以1:100 的稀釋濃度所表現之染色鑑別力最佳，且反應時間
恰當，故皆以1:100 之稀釋濃度進行實驗。
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2.3.3 實驗步驟
1. 脫蠟及復水（deparaffinization & rehydration）
(1) 將切片次第浸泡於三缸純二甲苯（xylene）溶液中脫蠟，每缸分別浸泡 10 分鐘。
(2) 脫蠟後依序浸泡於濃度遞減之酒精溶液中復水：100%無水酒精兩缸，95%、85%、
75%、50%酒精各一缸，每缸分別浸泡三分鐘。再置於流動自來水（running water）中 沖洗10 分鐘。
2. 組織抗原性恢復處理（antigen retrieval）
採用微波爐加熱法，將組織標本玻片浸入0.01 M 檸檬酸水溶液加熱至沸騰，於 850W
功率下，持續加熱直至溶液再沸騰10 分鐘，之後以流動之自來水冷卻 10 分鐘。
3. 阻斷內生性過氧化氫酶（blocking endogenous hydrogen peroxidase）
將組織切片浸漬於3%過氧化氫-甲醇溶液（methanolic H2O2 solution）10 分鐘，用以
阻斷內生性過氧化氫酶，防止偽陽性反應，之後置於一缸的蒸餾水及三缸的PBS 中各
潤洗5 分鐘。
4. 阻斷非特異性抗原（non-specific antigen）的結合
欲 加 入 antibody 的 切 片 上 分 別 滴 上 10% 山 羊 血 清 （ non-immune goat serum ， Histostain®-Plus，Invitrogen, Camarillo, CA），混合均勻後靜置 10 分鐘，用以阻斷非 特異性的背景染色。
5. 初級抗體作用
切片上加上足量（約 100μl）稀釋好的抗體溶液(Anti-IL-β 1:100; Anti-IL-6 1:100;
Anti-TGF-β 1:100; Anti-Foxp3 1:100)，在 4℃下隔夜作用。於次日早晨，再以 PBS 潤 洗三次，每次分別為5 分鐘。
6. 偵測抗原抗體結合系統
滴上生物素化二級抗體(biotinylated secondary antibody, Histostain®-Plus，Invitrogen, Camarillo, CA)，在室溫下作用 30 分鐘，使之與初級抗體結合，接著再以 PBS 潤洗三
次，每次 5 分鐘，以洗去多餘的生物素化次級抗體。再滴加滴加鏈黴菌卵白素-過氧
化氫酶複合物(Streptavidin peroxidase conjugate, Histostain®-Plus，Invitrogen, Camarillo, CA))，置於室溫下作用 30 分鐘，使與生物素化次級抗體結合，再以 PBS 潤洗三次，
每次各5 分鐘以洗去多餘之卵白素-過氧化氫酶複合物。
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7. 呈色
使用DAB Kit (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA)進行呈色，於組織切片上各滴 加兩滴，置於室溫下作用，同時並於光學顯微鏡下偵測呈色反應之效果，呈色時間依 初級抗體反應效率而異，相同抗體的呈色時間均控制在同樣時間，待褐棕色反應產物
出現至適當呈色強度時，將玻片置入蒸餾水中，終止呈色反應並洗去多餘之DAB。
8. 背景染色
將切片置於Mayer’s 蘇木紫（hematoxylin）染色液中 1 分鐘後，以流動之自來水沖洗 10 分鐘。
9. 脫水
接著將玻片浸泡於濃度遞增的酒精溶液中脫水，依序浸漬於 50%、75%、85%、95%
四缸不同濃度酒精溶液中，以及100%酒精三缸，每缸各浸泡 3 分鐘，最後置入 75%
二甲苯-25%酒精混合液中 3 分鐘，再次第置入二甲苯三缸，每缸各浸泡 3 分鐘，完成 脫水步驟。
10. 封片（mounting）
切片經脫水後，以組織封片膠（histomount Entelan）進行封片，乾燥後即告完成免疫 組織染色，並以顯微鏡觀察。
2.4 第四節 免疫組織化學染色後之觀察與紀錄
（一） 觀察：
以光學顯微鏡觀察各染色標記於組織切片上之呈色。
（二） 染色程度的定量
記錄IL-1β、IL-6 與 TGF-β 於腫瘤細胞巢(tumor nest)，及周邊基質細胞與浸潤免疫細
胞之染色反應程度，每一樣本於100 倍放大倍率下，選擇染色性最強之 5 個區域，觀
察陽性染色細胞佔所有癌細胞與基質細胞及浸潤免疫細胞之比例，分別得到陽性癌細 胞標記指數(cancer labeling index, CLI)，以及陽性基質細胞與浸潤免疫細胞標記指數 (stromal and infiltrating immune cell labeling index, SILI)。並將等級定義為 0(無陽性染 色細胞)；1(0~10%陽性染色細胞)；2(10~50%陽性染色細胞)；3(50~80%陽性染色細 胞)；4(80~100%陽性染色細胞)。並觀察陽性染色細胞於癌細胞中的強度(intensity score,
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IS)，並將等級分為 0(無陽性染色)；1(輕微陽性染色)；2(中度陽性染色)；3(重度陽性 染色)。並將標記指數及強度相乘後得到陽性癌細胞標計分數(cancer cell labeling score, CLS)。Foxp3 的標記指數(Labeling index, LI)則以 500 倍放大倍率下，選擇染色性最強
的5 個區域，計算其中陽性染色細胞於腫瘤浸潤的淋巴球中的比例來記錄。
（三）臨床變數之記錄
複查口腔鱗狀細胞癌患者臨床紀錄之文件來源包括：病歷正本、病歷縮影、與 癌症登記室的追蹤資料。記錄的項目包括有：病人的性別、年齡、TNM 臨床分期、
癌症發生部位、術後是否復發、復發或死亡時間、口腔鱗狀細胞癌細胞分化程度等。
評估病人的 TNM 臨床分期是採用是美國癌症聯合委員會 TNM 分期系統第六版
(American Joint Committee on Cancer (AJCC)6th edition TNM staging system)。主要依據
術後的病理報告、臨床斷層掃描及核磁共振攝影的結果，決定TNM 臨床分期。評估
參數包括原發腫瘤大小，腫瘤有無侵犯鄰近組織，局部淋巴結轉移，及遠處器官轉移 等。
（四）、統計分析
本研究之資料以IBM SPSS statistics 17(SPSS inc., IBM, Chicago) 統計套裝軟體進 行分析。
1. 利用 Pearson 積差相關係數(Pearson product-moment correlation coefficient)來評估 IL-β、IL-6、TGFβ 及 Foxp3 於 OSCC 中表現的相關性。
2. 利用 Student’s t 檢定、Kruskal-Wallis H 檢定以及 Mann-Whitney U 檢定分析 IL-β、
IL-6、TGF-β 及 Foxp3 於 OSCC 的表現與臨床參數間的差異性。
3. 利用 Kaplan-Meier survival analysis 分析 IL-1β、IL-6、TGFβ 及 Foxp3 表現與存活 率之關係。再利用Log-rank test 進一步推論 IL-1β、IL-6、TGFβ 及 Foxp3 於 OSCC 之 表現是否與OSCC 患者的存活時間有統計上相關性。各項統計分析均以 p <0.05 判定 為有意義。
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第三章 結果
3.1 第一節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β 以及 Foxp3 於口腔鱗狀上皮細胞癌之表現
本研究使用 IL-1β、IL-6、TGF-β 及 Foxp3 之多株抗體，以免疫組織化學染色方 法來檢測IL-1β、IL-6、TGF-β 及 Foxp3 於 OSCC 之表現。結果顯示 IL-6 於所有 OSCC 病例之癌細胞中皆有表現(71/71, 100%)，而 IL-1β 及 TGF-β 則各有一個病例沒有表現 (70/71, 98%)。IL-1β、IL-6 以及 TGF-β 皆會表現於腫瘤細胞之細胞質中及細胞膜上，
IL-1β 及 IL-6 的陽性染色在基底細胞通常較深且表現於細胞質中，而基底上細胞則較 常表現於細胞膜上且染色較淺。TGF-β 則於基底上細胞上呈現較強的表現，且主要皆 表現於細胞質中。IL-1β 的 CLI 為 5.6 ± 3.9，IL-6 為 5.9 ± 3.9，TGF-β 為 6.8 ± 3.7。
所有病例之基質細胞及浸潤之免疫細胞皆表現IL-6 陽性染色(71/71, 100%)，IL-1β 有5 例未表現(66/71, 70%)，TGF-β 則有 1 例未表現(70/71, 98%)。IL-1β 的 SILI 為 2.8
± 1.3，IL-6 為 2.6 ± 1.1，TGF-β 為 2.9 ± 0.9。Foxp3 則皆表現於免疫細胞之上，且主 要集中於腫瘤周圍。Foxp3 陽性細胞於腫瘤浸潤免疫細胞表現的平均標記指數為 6.3 ± 4.0(%)。 (表 1、表 2)(圖 1、圖 2、圖 3、圖 4)
3.2 第二節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果之間的相關性
IL-1β、IL-6 及 TGF-β 於腫瘤細胞中的表現(CLI)分別與其強度(IS)以及基質與浸 潤免疫細胞中的表現(SILI)呈正相關。此外 IL-1β 於腫瘤細胞中的表現也與 IL-6 於腫 瘤細胞以及基質與浸潤之免疫細胞中的表現呈正相關，IL-1β 於基質以及浸潤之免疫
細胞中的表現也與IL-6 於基質以及浸潤之免疫細胞中的表現呈正相關。IL-1β 於腫瘤
細胞中的表現也與 TGF-β 於腫瘤細胞以及基質與浸潤之免疫細胞中的表現呈正相
關。IL-6 於腫瘤細胞之標記分數(CLS)則與 TGF-β 於腫瘤細胞以及基質與浸潤之免疫 細胞中的表現呈正相關。TGF-β 於腫瘤細胞中的表現則與 Foxp3 的表現呈顯著相關。
(表 3)
3.3 第三節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β
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以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果與各項臨床變數間及組織病理學參數 的關係
(1) 患者年齡
本研究共有 71 位口腔鱗狀上皮細胞癌患者樣本，年齡介於 36 至 81 歲之間，平 均年齡為53 歲，主要年齡層為 40 至 60 歲之間，佔整體 70%。患者年齡小於 50 歲者 有30 人，大於等於 50 歲者有 41 人。利用 Student’s t test 檢測，兩組於各項免疫組織 染色結果皆無統計上的顯著相關性。(表 4)
(2) 患者性別
本研究 71 位患者中，男性 65 位，女性 6 位。男女比為 10.8：1。使用 Mann-Whitney U test 檢測，男性於 IL-1β、IL-6、TGF-β 的各項表現上較女性為高，而女性患者的 Foxp3 表現量較男性患者為高，然而皆無統計上的顯著相關性。(表 5)
(3) 腫瘤位置
本研究 71 位患者中，頰黏膜癌 34 例(48%)，舌癌 28 例(39%)，齒齦與腭部癌症 共9 例(13%)。使用 Kruskal-Wallis H test 檢測，發現各部位於各項免疫組織染色結果 上皆無統計上的顯著相關性。(表 6)
(4) 腫瘤大小
依據 AJCC TNM 分期系統，T1 有 20 例(28%)，T2 有 20 例，T3 有 11 例(16%)，
T4 有 20 例。將腫瘤大小分組為 T1 與 T2 以及 T3 與 T4 兩組，使用 Student’s t test 檢 測，發現Foxp3 的表現在兩組之間有統計上的顯著差異，且 T1 與 T2 組較高。IL-1β 於腫瘤細胞之標記指數(CLI)以及強度(IS)於兩組間也存在統計上的顯著差異，且 T3 與T4 組較高。(表 7)
(5) 淋巴結轉移
依據 AJCC TNM 分期系統，N0 有 46 例(65%)，N1 有 8 例(11%)，N2 有 17 例(24%)。
使用Kruskal-Wallis H test 檢測，發現各組間於各項免疫組織染色結果上皆無統計上的 顯著相關性。此外，若將淋巴結轉移分為無轉移(N0)以及有轉移之組別(N1+N2)，經 Mann-Whitney U test 檢測，兩組間於各項免疫組織染色結果上亦皆無統計上的顯著相 關性。(表 8)
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(6) 分期期數
依據 AJCC TNM 分期系統，本研究 S1 有 15 例(21%)，S2 有 12 例(17%)，S3 有 13 例(18%)，S4 有 31 例(44%)。將所有病人分組為早期(S1 與 S2)以及晚期(S3 與 S4) 兩組，使用Mann-Whitney U test 檢測，發現 Foxp3 於兩組間存在統計上的顯著差異，
且早期Foxp3 的表現量較高。IL-1β 的腫瘤細胞標記分數(CLS)於兩組間也存在統計上 的顯著差異，且於晚期時IL-1β 的表現量較高。(表 9)
(7) 腫瘤細胞分化程度
本研究腫瘤分化良好者佔 57 例(80%) ，分化中等者佔 14 例(20%)。使用 Mann-Whitney U test 檢測，發現 TGF-β 腫瘤細胞之標記指數於腫瘤分化良好組的表現 量較高，並存在統計上的顯著差異。(表 10)
(8) 淋巴管或血管侵犯(Lymphovascular permeation, LVP)
術後病理檢查，有淋巴管或血管侵犯者有 18 例(25%)，沒有淋巴管或血管侵犯者 有53 例(75%)。經 Mann-Whitney U test 檢測，發現是否有淋巴管或血管侵犯，於各項 免疫組織化學染色結果皆無統計上的顯著差異。(表 11)
(9) 轉移之淋巴結有膜外擴散(Extracapsular spreading, ECS)
術後病理檢查顯示轉移之淋巴結有膜外擴散者有 12 例(17%)，無膜外擴散者有 59 例(83%)，經 Mann-Whitney U test 檢測，發現是否有膜外擴散，於各項免疫組織化學 染色結果皆無統計上的顯著差異。(表 12)
(10) 腫瘤復發
在原發腫瘤部位經由手術切除後，若於頭頸部還有腫瘤的生成則視為有復發的情 況。在71 位病患手術後，有 19 位(27%)有復發的情況。使用 Mann-Whitney U test 檢 測，發現腫瘤復發與否，於各項免疫組織化學染色結果皆無統計上的顯著差異。(表 13)
3.4 第四節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果與各項風險因子的關係
(1) 酒精攝取
本研究 71 位患者中，沒有喝酒習慣的有 10 位(14%)，有喝酒習慣的有 61 位。經
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Mann-Whitney U test 檢測，發現 IL-6 於基質以及免疫細胞之標記指數(SILI)於有喝酒 習慣的患者所表現的量較高，且有統計上的顯著差異。(表 14)
(2) 嚼食檳榔
71 位患者中，沒有嚼食檳榔習慣的患者有 7 位(10%)，有嚼食檳榔習慣的有 64 位。經Mann-Whitney U test 檢測，發現 Foxp3 於無嚼食檳榔習慣的患者表現量較高，
且有統計上的差異。(表 15) (3) 抽菸
71 位患者中，沒有抽菸習慣者有 8 位(11%)，有抽菸習慣者有 63 位。經 Mann-Whitney U test 檢測，發現有抽菸者的 IL-1β 的於腫瘤細胞中之表現(CLI, CLS) 較未抽菸者高，且有統計上的顯著差異。(表 16)
3.5 第五節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果與存活時間的關係
追蹤本研究期間，於術後因腫瘤死亡的患者共有 24 例(34%)，47 例則維持存活。
追蹤的期間以患者接受治療開始至患者死亡或是最後一次追蹤時間為準。使用 Kaplan-Meier survival analysis 來分析 IL-1β、IL-6、TGF-β 以及 Foxp3 於腫瘤細胞以及
基質中表現量與存活率的關係。結果發現當 TGF-β 於腫瘤細胞之表現比例高於 50%
時，其累積存活率較高，且有統計上的顯著差異(Log-Rank test, p= 0.024)(圖 9)。IL-1β
於腫瘤細胞之表現高於50%時，其累積存活率有較低的趨勢，然而並未達到統計上的
顯著差異。 (圖 5、圖 6、圖 7、圖 8、圖 10、圖 11)
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第四章 討論
OSCC 的患者已經被證實對抗腫瘤的免疫能力是被抑制的，而且腫瘤的生長以及 復發與嚴重的免疫功能失調有關 (Whiteside 2004)。這其中可能有許多機制牽涉其 中，包括許多腫瘤製造的抑制因子，如prostagladin E2(PGE2)；或是免疫抑制的細胞 激素，如interleukin-10(IL-10)；或是過多的免疫抑制巨噬細胞；以及腫瘤中出現的 Treg 細胞 (Reichert et al. 2002)。在 HNSCC 腫瘤中 CD4+ T 細胞以及 CD8+的細胞是比正常 人來的少的。而Foxp3+ Treg 細胞則比正常的組織多很多 (Bose et al. 2008)。而 Treg 對於其他免疫細胞的抑制是已經被證實的 (Curotto de Lafaille and Lafaille 2009)。因此 HNSCC 中免疫細胞的減少，或許是 Treg 細胞的調控所造成的結果。
已經有研究證實，Foxp3+ Treg 細胞以及 TGF-β 在 OSCC 組織中的表現會比正常 組織來的高 (Schwarz et al. 2008)。而 Foxp3+ Treg 細胞能夠製造 TGF-β，而 TGF-β 也 能抑制CD4+細胞分化成Th1 以及 Th2 細胞，並藉由誘導 Foxp3 的表現使其能夠分化 為CD4+CD25+Foxp3+ T 細胞 (Chen et al. 2007)。此外在周邊血液的 Foxp3+細胞越多，
則TGF-β 的表現也會增加 (Gasparoto et al. 2010)。Gasparoto 等人的研究也指出，OSCC 組織中的 Treg 細胞能夠誘導 TGF-β 的產生。本研究中 Foxp3 的表現約佔淋巴球的 2-15%，且與 TGF-β 的表現成正相關，這表示在 OSCC 中 Foxp3 及 TGF-β 有互相刺激 及誘導彼此製造的能力。
IL-1β 在腫瘤的微環境中能夠誘導巨噬細胞的堆積以及向上調控巨噬細胞分泌 IL-6 (Apte et al. 2006a; Gallo et al. 1993)。此外 IL-1β 也能誘導 Th17 細胞的產生，Th17 細胞會進一步分泌IL-6 及 IL17 (Sutton et al. 2006)。In vitro 研究中，IL-1β 在 AML 以 及OSCC 中也會刺激腫瘤以及基質細胞產生 IL-6 (Beauchemin et al. 1991; Woods et al.
1998a)。我們的結果發現 IL-1β 於腫瘤細胞以及基質中的表現，與 IL-6 於腫瘤細胞以
及基質中的表現是呈正相關的，這顯示了IL-1β 表現量多的腫瘤，IL-6 的表現量也會
較高，因此在活體OSCC 組織中，IL-1β 可能也能向上調控 IL-6 的表現。
IL-1β 在大腸腫瘤中，會向上調控 MMP、VEGF 以及 TGF-β 的表現 (Lewis et al.
2006)。IL-6 會與 TGF-β 共同調控及誘導 Th17 細胞的分化，然而 TGF-β 在大腸癌中 會調控Stat3 的訊號使 IL-6 的表現下降 (Chen et al. 2007)，但是在神經膠質母細胞瘤
33
(glioblastoma)中，TGF-β 能夠誘導 IL-6 的產生，使其刺激癌細胞的生長及分化(Seoane 2009)。然而在本研究的結果當中，IL-1β 及 IL-6 於癌細胞中的表現量皆與 TGF-β 癌
細胞及基質中的表現量呈正相關。這顯示了IL-1β 在 OSCC 中，可能會與大腸腫瘤一
樣的向上調控TGF-β。而 TGF-β 也可能會誘導 IL-6 的產生。
在腫瘤的微環境中，IL-1β 可能藉由自泌(autocrine)或旁泌(paracrine)的方式來刺激 周圍腫瘤或基質及免疫細胞的增生或堆積 (Apte and Voronov 2008)，而產生的腫瘤細 胞或是基質中的纖維母細胞、巨噬細胞等等，又會進一步產生IL-1β。IL-6 以及 TGF-β 在腫瘤的微環境中也觀察到類似的現象 (Jakowlew 2006; Jego et al. 2006)。本研究中，
IL-1β、IL-6 以及 TGF-β 在腫瘤細胞中的表現，分別與其表現強度、以及基質中細胞 與浸潤免疫細胞的表現成正比。這個結果指出，當腫瘤細胞中的IL-1β、IL-6 以及 TGF-β
表現量越多，則在基質以及浸潤免疫細胞中的表現也會越多。顯示了 IL-1β、IL-6 以
及 TGF-β 在 OSCC 中，可能也會藉由自泌或旁泌的方式來刺激細胞的增生或堆積，
進而分泌出更多的細胞激素。
在我們的結果中，將腫瘤的大小以及期別分為兩組，發現 Foxp3+在腫瘤較小以
及較早期的時候表現量較高，而 IL-1β 則在晚期以及較大的腫瘤表現量較高。IL-1β
能夠向上調控許多促發炎反應細胞激素(proinflammatory cytokine)，並且與腫瘤的生長 以及侵入性有相關 (Cheng and Tsai 1999; St John et al. 2009)。因此在較晚期且體積較 大的腫瘤中，IL-1β 之高度表現是可以預期的。然而在 Distell 等人的研究當中，在期 數較高的腫瘤中表現的Treg 細胞較早期的腫瘤為多 (Distel et al. 2009)。Distell 等人的 研究，呈現與我們相反的結果，這樣的差異可能是計算上的誤差所造成。我們計算 Treg 細胞的數量是以 Foxp3+細胞在高倍視野下佔總淋巴球的數量，而 Distell 則是以 在100 個癌細胞的視野下 Foxp3+細胞的數量作為依據。
尼古丁以及檳榔鹼(arecoline)能夠誘導口腔腫瘤以及巨噬細胞表現 IL-1β 以及 IL-6 (Cheng and Tsai 1999; Seyedroudbari and Khan 1998)。我們的結果顯示在抽菸的患者 IL-1β 在腫瘤細胞以及基質中的表現高出不抽菸的患者許多，且具有統計上的顯著差 異，這顯示抽菸的確會提高IL-1β 在 OSCC 中表現的量。IL-6 在抽菸的患者組織表現 量是較不抽菸的患者高，然而並未達到統計上的顯著意義。
許多研究顯示酒精性肝炎以及肝硬化等情況，會造成血清中 IL-6 的表現增加
