反應藥劑

免疫組織化學染色法是採取二次抗體結合技術，即利用初級抗體(primary antibody) 與細胞中抗原 (antigen)結合後，加入生物素化的次級抗體 (biotinylated secondary antibody) 與 初 級 抗 體 結 合 ， 再 藉 由 鏈 黴 菌 卵 白 素 - 過 氧 化 氫 酶 複 合 物 (streptavidin-peroxidase conjugate)與生物素之間的強結合力，使之與次級抗體結合，最 後加入呈色劑 (chromogen)來偵測抗原所在位置。

本實驗亦採取實驗樣本之切片，滴入不加任何初級抗體之抗體稀釋液 (antibody dilutor)，並進行一整套的免疫組織化學染色程序，作為陰性對照組，結果顯示無任何 反應。

2.3.2 初級抗體的選擇

本實驗所採用的初級抗體為anti-IL-1β、anti-IL-6、anti-TGF-β 與 anti-Foxp3 四種 抗體。本實驗將四種抗體，以抗體稀釋液（antibody dilutor,Ventana Medical Systems) 分 別稀釋成 1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:500 等梯次濃度進行試驗性染色，觀

察呈色效果，四種抗體皆以1:100 的稀釋濃度所表現之染色鑑別力最佳，且反應時間

恰當，故皆以1:100 之稀釋濃度進行實驗。

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2.3.3 實驗步驟

1. 脫蠟及復水（deparaffinization & rehydration）

(1) 將切片次第浸泡於三缸純二甲苯（xylene）溶液中脫蠟，每缸分別浸泡 10 分鐘。

(2) 脫蠟後依序浸泡於濃度遞減之酒精溶液中復水：100%無水酒精兩缸，95%、85%、

75%、50%酒精各一缸，每缸分別浸泡三分鐘。再置於流動自來水（running water）中 沖洗10 分鐘。

2. 組織抗原性恢復處理（antigen retrieval）

採用微波爐加熱法，將組織標本玻片浸入0.01 M 檸檬酸水溶液加熱至沸騰，於 850W

功率下，持續加熱直至溶液再沸騰10 分鐘，之後以流動之自來水冷卻 10 分鐘。

3. 阻斷內生性過氧化氫酶（blocking endogenous hydrogen peroxidase）

將組織切片浸漬於3%過氧化氫-甲醇溶液（methanolic H2O2 solution）10 分鐘，用以

阻斷內生性過氧化氫酶，防止偽陽性反應，之後置於一缸的蒸餾水及三缸的PBS 中各

潤洗5 分鐘。

4. 阻斷非特異性抗原（non-specific antigen）的結合

欲 加 入 antibody 的 切 片 上 分 別 滴 上 10% 山 羊 血 清 （ non-immune goat serum ， Histostain®-Plus，Invitrogen, Camarillo, CA），混合均勻後靜置 10 分鐘，用以阻斷非 特異性的背景染色。

5. 初級抗體作用

切片上加上足量（約 100μl）稀釋好的抗體溶液(Anti-IL-β 1:100; Anti-IL-6 1:100;

Anti-TGF-β 1:100; Anti-Foxp3 1:100)，在 4℃下隔夜作用。於次日早晨，再以 PBS 潤 洗三次，每次分別為5 分鐘。

6. 偵測抗原抗體結合系統

滴上生物素化二級抗體(biotinylated secondary antibody, Histostain®-Plus，Invitrogen, Camarillo, CA)，在室溫下作用 30 分鐘，使之與初級抗體結合，接著再以 PBS 潤洗三

次，每次 5 分鐘，以洗去多餘的生物素化次級抗體。再滴加滴加鏈黴菌卵白素-過氧

化氫酶複合物(Streptavidin peroxidase conjugate, Histostain®-Plus，Invitrogen, Camarillo, CA))，置於室溫下作用 30 分鐘，使與生物素化次級抗體結合，再以 PBS 潤洗三次，

每次各5 分鐘以洗去多餘之卵白素-過氧化氫酶複合物。

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7. 呈色

使用DAB Kit (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA)進行呈色，於組織切片上各滴 加兩滴，置於室溫下作用，同時並於光學顯微鏡下偵測呈色反應之效果，呈色時間依 初級抗體反應效率而異，相同抗體的呈色時間均控制在同樣時間，待褐棕色反應產物

出現至適當呈色強度時，將玻片置入蒸餾水中，終止呈色反應並洗去多餘之DAB。

8. 背景染色

將切片置於Mayer’s 蘇木紫（hematoxylin）染色液中 1 分鐘後，以流動之自來水沖洗 10 分鐘。

9. 脫水

接著將玻片浸泡於濃度遞增的酒精溶液中脫水，依序浸漬於 50%、75%、85%、95%

四缸不同濃度酒精溶液中，以及100%酒精三缸，每缸各浸泡 3 分鐘，最後置入 75%

二甲苯-25%酒精混合液中 3 分鐘，再次第置入二甲苯三缸，每缸各浸泡 3 分鐘，完成 脫水步驟。

10. 封片（mounting）

切片經脫水後，以組織封片膠（histomount Entelan）進行封片，乾燥後即告完成免疫 組織染色，並以顯微鏡觀察。

2.4 第四節 免疫組織化學染色後之觀察與紀錄

（一） 觀察：

以光學顯微鏡觀察各染色標記於組織切片上之呈色。

（二） 染色程度的定量

記錄IL-1β、IL-6 與 TGF-β 於腫瘤細胞巢(tumor nest)，及周邊基質細胞與浸潤免疫細

胞之染色反應程度，每一樣本於100 倍放大倍率下，選擇染色性最強之 5 個區域，觀

察陽性染色細胞佔所有癌細胞與基質細胞及浸潤免疫細胞之比例，分別得到陽性癌細 胞標記指數(cancer labeling index, CLI)，以及陽性基質細胞與浸潤免疫細胞標記指數 (stromal and infiltrating immune cell labeling index, SILI)。並將等級定義為 0(無陽性染 色細胞)；1(0~10%陽性染色細胞)；2(10~50%陽性染色細胞)；3(50~80%陽性染色細 胞)；4(80~100%陽性染色細胞)。並觀察陽性染色細胞於癌細胞中的強度(intensity score,

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IS)，並將等級分為 0(無陽性染色)；1(輕微陽性染色)；2(中度陽性染色)；3(重度陽性 染色)。並將標記指數及強度相乘後得到陽性癌細胞標計分數(cancer cell labeling score, CLS)。Foxp3 的標記指數(Labeling index, LI)則以 500 倍放大倍率下，選擇染色性最強

的5 個區域，計算其中陽性染色細胞於腫瘤浸潤的淋巴球中的比例來記錄。

（三）臨床變數之記錄

複查口腔鱗狀細胞癌患者臨床紀錄之文件來源包括：病歷正本、病歷縮影、與 癌症登記室的追蹤資料。記錄的項目包括有：病人的性別、年齡、TNM 臨床分期、

癌症發生部位、術後是否復發、復發或死亡時間、口腔鱗狀細胞癌細胞分化程度等。

評估病人的 TNM 臨床分期是採用是美國癌症聯合委員會 TNM 分期系統第六版

(American Joint Committee on Cancer (AJCC)6th edition TNM staging system)。主要依據

術後的病理報告、臨床斷層掃描及核磁共振攝影的結果，決定TNM 臨床分期。評估

參數包括原發腫瘤大小，腫瘤有無侵犯鄰近組織，局部淋巴結轉移，及遠處器官轉移 等。

（四）、統計分析

本研究之資料以IBM SPSS statistics 17(SPSS inc., IBM, Chicago) 統計套裝軟體進 行分析。

1. 利用 Pearson 積差相關係數(Pearson product-moment correlation coefficient)來評估 IL-β、IL-6、TGFβ 及 Foxp3 於 OSCC 中表現的相關性。

2. 利用 Student’s t 檢定、Kruskal-Wallis H 檢定以及 Mann-Whitney U 檢定分析 IL-β、

IL-6、TGF-β 及 Foxp3 於 OSCC 的表現與臨床參數間的差異性。

3. 利用 Kaplan-Meier survival analysis 分析 IL-1β、IL-6、TGFβ 及 Foxp3 表現與存活 率之關係。再利用Log-rank test 進一步推論 IL-1β、IL-6、TGFβ 及 Foxp3 於 OSCC 之 表現是否與OSCC 患者的存活時間有統計上相關性。各項統計分析均以 p <0.05 判定 為有意義。

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第三章 結果

3.1 第一節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β 以及 Foxp3 於口腔鱗狀上皮細胞癌之表現

本研究使用 IL-1β、IL-6、TGF-β 及 Foxp3 之多株抗體，以免疫組織化學染色方 法來檢測IL-1β、IL-6、TGF-β 及 Foxp3 於 OSCC 之表現。結果顯示 IL-6 於所有 OSCC 病例之癌細胞中皆有表現(71/71, 100%)，而 IL-1β 及 TGF-β 則各有一個病例沒有表現 (70/71, 98%)。IL-1β、IL-6 以及 TGF-β 皆會表現於腫瘤細胞之細胞質中及細胞膜上，

IL-1β 及 IL-6 的陽性染色在基底細胞通常較深且表現於細胞質中，而基底上細胞則較 常表現於細胞膜上且染色較淺。TGF-β 則於基底上細胞上呈現較強的表現，且主要皆 表現於細胞質中。IL-1β 的 CLI 為 5.6 ± 3.9，IL-6 為 5.9 ± 3.9，TGF-β 為 6.8 ± 3.7。

所有病例之基質細胞及浸潤之免疫細胞皆表現IL-6 陽性染色(71/71, 100%)，IL-1β 有5 例未表現(66/71, 70%)，TGF-β 則有 1 例未表現(70/71, 98%)。IL-1β 的 SILI 為 2.8

± 1.3，IL-6 為 2.6 ± 1.1，TGF-β 為 2.9 ± 0.9。Foxp3 則皆表現於免疫細胞之上，且主 要集中於腫瘤周圍。Foxp3 陽性細胞於腫瘤浸潤免疫細胞表現的平均標記指數為 6.3 ± 4.0(%)。 (表 1、表 2)(圖 1、圖 2、圖 3、圖 4)

3.2 第二節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β 以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果之間的相關性

IL-1β、IL-6 及 TGF-β 於腫瘤細胞中的表現(CLI)分別與其強度(IS)以及基質與浸 潤免疫細胞中的表現(SILI)呈正相關。此外 IL-1β 於腫瘤細胞中的表現也與 IL-6 於腫 瘤細胞以及基質與浸潤之免疫細胞中的表現呈正相關，IL-1β 於基質以及浸潤之免疫

細胞中的表現也與IL-6 於基質以及浸潤之免疫細胞中的表現呈正相關。IL-1β 於腫瘤

細胞中的表現也與 TGF-β 於腫瘤細胞以及基質與浸潤之免疫細胞中的表現呈正相

關。IL-6 於腫瘤細胞之標記分數(CLS)則與 TGF-β 於腫瘤細胞以及基質與浸潤之免疫 細胞中的表現呈正相關。TGF-β 於腫瘤細胞中的表現則與 Foxp3 的表現呈顯著相關。

(表 3)

3.3 第三節 Interleukin-1β、Interleukin-6、Transforming Growth Factor-β

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以及 Foxp3 免疫組織化學染色結果與各項臨床變數間及組織病理學參數 的關係

(1) 患者年齡

本研究共有 71 位口腔鱗狀上皮細胞癌患者樣本，年齡介於 36 至 81 歲之間，平 均年齡為53 歲，主要年齡層為 40 至 60 歲之間，佔整體 70%。患者年齡小於 50 歲者 有30 人，大於等於 50 歲者有 41 人。利用 Student’s t test 檢測，兩組於各項免疫組織 染色結果皆無統計上的顯著相關性。(表 4)

(2) 患者性別

本研究 71 位患者中，男性 65 位，女性 6 位。男女比為 10.8：1。使用 Mann-Whitney U test 檢測，男性於 IL-1β、IL-6、TGF-β 的各項表現上較女性為高，而女性患者的 Foxp3 表現量較男性患者為高，然而皆無統計上的顯著相關性。(表 5)

(3) 腫瘤位置

本研究 71 位患者中，頰黏膜癌 34 例(48%)，舌癌 28 例(39%)，齒齦與腭部癌症 共9 例(13%)。使用 Kruskal-Wallis H test 檢測，發現各部位於各項免疫組織染色結果 上皆無統計上的顯著相關性。(表 6)

(4) 腫瘤大小

依據 AJCC TNM 分期系統，T1 有 20 例(28%)，T2 有 20 例，T3 有 11 例(16%)，

T4 有 20 例。將腫瘤大小分組為 T1 與 T2 以及 T3 與 T4 兩組，使用 Student’s t test 檢 測，發現Foxp3 的表現在兩組之間有統計上的顯著差異，且 T1 與 T2 組較高。IL-1β 於腫瘤細胞之標記指數(CLI)以及強度(IS)於兩組間也存在統計上的顯著差異，且 T3 與T4 組較高。(表 7)

(5) 淋巴結轉移

依據 AJCC TNM 分期系統，N0 有 46 例(65%)，N1 有 8 例(11%)，N2 有 17 例(24%)。

使用Kruskal-Wallis H test 檢測，發現各組間於各項免疫組織染色結果上皆無統計上的 顯著相關性。此外，若將淋巴結轉移分為無轉移(N0)以及有轉移之組別(N1+N2)，經 Mann-Whitney U test 檢測，兩組間於各項免疫組織染色結果上亦皆無統計上的顯著相 關性。(表 8)

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(6) 分期期數

依據 AJCC TNM 分期系統，本研究 S1 有 15 例(21%)，S2 有 12 例(17%)，S3 有 13 例(18%)，S4 有 31 例(44%)。將所有病人分組為早期(S1 與 S2)以及晚期(S3 與 S4) 兩組，使用Mann-Whitney U test 檢測，發現 Foxp3 於兩組間存在統計上的顯著差異，

且早期Foxp3 的表現量較高。IL-1β 的腫瘤細胞標記分數(CLS)於兩組間也存在統計上 的顯著差異，且於晚期時IL-1β 的表現量較高。(表 9)

(7) 腫瘤細胞分化程度

本研究腫瘤分化良好者佔 57 例(80%) ，分化中等者佔 14 例(20%)。使用 Mann-Whitney U test 檢測，發現 TGF-β 腫瘤細胞之標記指數於腫瘤分化良好組的表現 量較高，並存在統計上的顯著差異。(表 10)

(8) 淋巴管或血管侵犯(Lymphovascular permeation, LVP)

術後病理檢查，有淋巴管或血管侵犯者有 18 例(25%)，沒有淋巴管或血管侵犯者 有53 例(75%)。經 Mann-Whitney U test 檢測，發現是否有淋巴管或血管侵犯，於各項 免疫組織化學染色結果皆無統計上的顯著差異。(表 11)

(9) 轉移之淋巴結有膜外擴散(Extracapsular spreading, ECS)

術後病理檢查顯示轉移之淋巴結有膜外擴散者有 12 例(17%)，無膜外擴散者有 59 例(83%)，經 Mann-Whitney U test 檢測，發現是否有膜外擴散，於各項免疫組織化學 染色結果皆無統計上的顯著差異。(表 12)

(10) 腫瘤復發

在原發腫瘤部位經由手術切除後，若於頭頸部還有腫瘤的生成則視為有復發的情 況。在71 位病患手術後，有 19 位(27%)有復發的情況。使用 Mann-Whitney U test 檢 測，發現腫瘤復發與否，於各項免疫組織化學染色結果皆無統計上的顯著差異。(表

在原發腫瘤部位經由手術切除後，若於頭頸部還有腫瘤的生成則視為有復發的情 況。在71 位病患手術後，有 19 位(27%)有復發的情況。使用 Mann-Whitney U test 檢 測，發現腫瘤復發與否，於各項免疫組織化學染色結果皆無統計上的顯著差異。(表