中華大學碩士論文

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中華大學碩士論文

題目：材料表面微結構對E. coli K-12 細胞貼附的影響

系所別：機械與航太工程研究所學號姓名：M09208039 余柏青

指導教授：馬廣仁博士共同指導教授：簡錫新博士

中華民國九十四年七月

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中文摘要

本實驗在於研究材料表面化學性質與材料表面奈微米結構對 E. coli K-12 細胞貼附成長行為所造成的影響。實驗中以 PMMA 與

e-PTFE 為主要基材，藉著 RF 電漿系統來進行材料表面改質，並藉由熱壓轉印技術與電漿表面蝕刻來製作材料表面奈微米結構。

研究結果可得，材料奈微米結構表面對於 E. coli K-12 細胞貼 附的影響遠大於表面化學性質所造成的影響。當材料 PMMA 表面 具較小深寬比凹槽，材料表面有利於 E. coli K-12 細胞貼附。材料 PMMA 經氮電漿處理，於材料表面沉積一層胺基官能基，雖有利 於 E. coli K-12 細胞的貼附效果，但藉著深寬比較大的凹槽有著引 導 E. coli K-12 細胞成線性排列的效應，明顯降低 E. coli K-12 細胞 聚集貼附於材料表面的機會。e-PTFE 材料表面經氧電漿蝕刻處理後，材料表面產生奈微米針狀組織，使材料表面具有超疏水效應，

因此無論表面是否具有親水性官能基，材料表面皆能有效抑制 E.

coli K-12 細胞聚集貼附於材料表面。

關鍵字：E. coli K-12、奈微米結構表面、貼附

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Abstract

This study aims to investigate the effects of surface chemistry and nano-structured surface of materials on the adhesion and growth of E.

coli K-12 cell. PMMA and e-PTFE were used as the substrate materials. Surface modification was carried out by RF plasma system and nano-structured surface was produced by hot embossing and plasma etching process.

The results indicated that nanostructured surface dominates the adhesion behaviour of of E. coli K-12 cells, rather than surface chemical properties of materials. In the case of PMMA materials, the nano-grooved surface with a lower aspect ratio favors the attachment of E. coli K-12 cells on the surface. A thin layer of amino groups deposited on the nano-grooved surface of PMMA substrates can further improve the adhesion and growth of E. coli K-12 cells on the surface.

However, E. coli K-12 cells was found to be aligned along the nano-grooved surface with a higher aspect ratio, which is not benefit for the further aggregation and growth of E. coli K-12 cells due to the 1-D confinement effect.

The e-PTFE materials demonstrate super-hydrophobic characteristics after O2 plasma etching treatment due to the existence of needle-like structure on the surface, which obviously prevents the adhesion and growth of E. coli K-12 cells on e-PTFE materials, even with hydrophilic functional groups on the surface.

Keywords: E. coli K-12, nanostructured surface, adhesion

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致謝

首先要由衷地感謝吾師馬廣仁博士以及共同指導教授簡錫新博士，在我兩年的求學期間不辭辛勞的悉心教導與細心的照顧與教誨，使得學業能夠順利完成，在此致上我最誠摯的敬意與謝意。

在此學生也特別感謝，口試期間淡江大學趙崇禮博士以及中正理工學院陳大同博士對本文的悉心指正並惠賜與多寶貴意見，使本文架構及內容更趨完好。

同時我也要感謝葉雲鵬學長與林志曄學長在課業上的提點與幫助，還要感謝廖偉達、吳泓均、楊勝程、楊渝翔、曾兆弘、沈和勳等同學與學弟王信富、郭建煌、李文斌、曹雄程、王信偉等學弟在實驗上與生活上給予相當多的幫助。最後要感謝我的家人與我的女友，給我永遠的支持與最大的鼓勵，使我能順利完成學業。

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目錄

中文摘要---Ⅰ 目錄---Ⅱ 表錄---Ⅴ 圖錄---Ⅵ

ㄧ、前言---1

二、文獻回顧---3

2-1 細胞貼附特性---3

2-1-1 細胞外間質（Extracellular Matrix）---4

2-1-2 細胞骨架系統(Cell Cytoskeleton System)---6

2-2 細胞在基板上的黏附作用(Cell Adhesion)---13

2-2-1 整粘蛋白（Integrin）---13

2-2-2 Focal Adhesions (FAs)---15

2-2-3 Integrin與訊息的傳導---16

2-3 影響細胞行為的方法---19

2-3-1 電漿表面改質---19

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2-3-2 利用離子專一性---21

2-3-3 表面結構對細胞的影響---22

2-3-4 e-PTFE 表面對 E. coli K-12 細胞的貼附影響---26

三、實驗設備與步驟---27

3-1 實驗設備---27

3-1-1 改變表面性質與表面微結構設備---27

3-1-2 觀察材料表面細菌細胞狀況---28

3-2 細胞與細菌細胞的培養---29

3-2-1 細菌菌種繁殖---32

3-3 實驗流程圖---35

3-3-1 試片材料選擇---36

3-3-2 試片前置處理---37

3-3-3 製作試片之方式---39

3-4 進行細菌細胞培養---41

3-5 表面觀察---41

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四、結果與討論---42

4-1 PMMA 材料表面濕潤特性對 E. coli K-12 細胞的貼附影響 ---42

4-1-1 對 PMMA 平板進行氮電漿表面改質---43

4-1-2 PMMA 表面具微奈米結構對 E. coli K-12 細胞的貼 附影響---43

4-1-3 表面潤濕角與表面結構對 E. coli K-12 細胞的貼附影 響---45

4-2 e-PTFE 材料進行電漿表面改質對 E. coli K-12 細胞貼附的影響 ---47

4-2-1 e-PTFE 材料表面化學與結構對細菌細胞的影響---47

五、結論---67

六、第六章參考文獻---70

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表錄

表2-1 細胞外間質成份與其功能---5

表2-2 不同激脢的功能---14

表2-3 Integrin-binding protein---15

表3-1 氧電漿對 e-PTFE 處理實驗參數---40

表3-2 氮電漿對 PMMA 處理實驗參數---40

表3-3 氮電漿對 e-PTFE 處理實驗參數---40

表3-4 氧電漿與氮電漿對 e-PTFE 處理實驗參數---41

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圖錄

圖2-1 纖維粘連蛋白結構與組成物質---7

圖2-2 細胞骨架系統三維結構---7

圖2-3 運動素---9

圖2-4 肌動蛋白結構---10

圖2-5 Minus End 和 Plus End---11

圖2-6 中間絲以及 Plectin 蛋白---12

圖2-7 中間絲形成步驟---12

圖2-8 整粘蛋白結構---14

圖2-9 FAK 和激脢互相連結結構---17

圖2-10 FAK 活化 Integrin 與 ECM 連結形成 FA---18

圖2-11 藉 RTK 或 Integrin 與外界接觸---18

圖2-12 細胞與外界接觸促使細胞各種行為---19

圖2-13 PS 表面經 IPA 電漿處理 600 秒---21

圖2-14 利用表面工程技術讓表面圖案化---22

圖2-15 用 Microcontact Printing 技術讓表面圖案化---22

圖2-16 不規則表面粗糙度---23

圖2-17 微米凹/凸槽結構---24

圖2-18 等方向溝槽結構---26

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圖2-19 角度 α 判別---26

圖2-20 E. coli K-12 細胞增生步驟---4

圖3-1 電漿輔助化學氣相沉積( PECVD )設備---27

圖3-2 熱壓機---28

圖3-3 掃描式電子顯微鏡(SEM)---28

圖3-4 光學顯微鏡---29

圖3-5 倒立式光學顯微鏡型---29

圖3-6 水浴槽---30

圖3-7 培養箱---30

圖3-8 無菌操作台---31

圖3-9 酒精燈---31

圖3-10 接種環---32

圖3-11 高溫滅菌鍋---33

圖3-12 培養細菌時接種步驟---34

圖3-13 PMMA 平板---38

圖3-14 小塊狀鐵氟龍---38

圖4-1 材料 PMMA 表面未經任何處理其表面潤濕角 66∘---50

圖4-2 材料載玻片表面未經任何處理其表面潤濕角 32∘---50

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圖4-3 材料載玻片經 E. coli K-12 細胞培養後的 SEM 照片---51 圖4-4 材料 PMMA 經 E. coli K-12 細胞培養後 7 天的 SEM 照片----51 圖4-5 材料 PMMA 表面經氮電漿表面處理後，其表面變的超親水---52 圖4-6 材料 PMMA 表面經氮電漿表面處理後，培養 E. coli K-12 細胞，由SEM 照片可以觀察到細胞呈現樹枝狀排列---52 圖4-7 材料表面經氮電漿表面處理後，培養 E. coli K-12 細胞，

由SEM 照片可以觀察到其表面貼附許多菌落，有增加細胞貼附效果---53 圖4-8 具有 V 字型結構的 PMMA 表面，經 E. coli K-12 細胞培 養後的SEM 照片---53 圖4-9 具有凹槽結構的 PMMA 表面，經 E. coli K-12 細胞培養 後的SEM 照片---54 圖4-10 具有凹槽結構的 PMMA 表面，經 E. coli K-12 細胞培養 後省略清洗步驟的SEM 照片---54 圖4-11 哺乳類細胞貼附於凹槽結構時的機制---55 圖4-12 材料 PMMA 表面具 V 字型結構並經氮電漿處理後，其表面變超親水---55 圖4-13 材料 PMMA 表面具凹槽結構並經氮電漿處理，後其表

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面變超親水---56 圖4-14 材料 PMMA 表面具 V 字型結構，經氮電漿處理後培養 E. coli K-12 細胞的 SEM 照片---56

圖4-15 材料 PMMA 表面具凹槽結構，經氮電漿處理後培養

E. coli K-12 細胞的 SEM 照片---57

圖4-16 材料 e-PTFE 未經處理的表面潤濕角 121∘---57 圖4-17 材料 e-PTFE 經氧電漿 300W，10sccm 處理 5 分鐘後的溼潤角為79∘---58 圖4-18 材料 e-PTFE 經氧電漿 300W，10sccm 處理 20 分鐘後的溼潤角104∘---58 圖4-19 材料 e-PTFE 經氧電漿 500W，20sccm 處理 2 分鐘後的溼潤角135∘---59 圖4-20 材料 e-PTFE 經氧電漿 500W，20sccm 處理 3 分鐘後的溼潤角137∘---59 圖4-21 材料 e-PTFE 經氧電漿 500W，20sccm 處理 15 分鐘後的溼潤角151∘---60 圖4-22 材料 e-PTFE 經氮電漿 400W，20sccm 處理 20 分鐘後的溼潤角 28∘---60 圖4-23 材料 e-PTFE 先經過氧電漿 500W，10sccm，15 分鐘後

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，再以氮電漿400W，20sccm，20 分鐘處理試片表面的潤濕

角75∘---61 圖4-24 未經處理的材料 e-PTFE 其潤濕角為 121∘，經

E. coli K-12 細胞培養後的 SEM 照片---61

圖4-25 材料 e-PTFE 表面潤濕角為 79∘，經

圖4-30 材料 e-PTFE 表面經氮電漿改質後表面具潤濕角∘，經 E. coli K-12 細胞培養後的 SEM 照片---64

圖4-31 材料 e-PTFE 先經過氧電漿處理後，再以氮電漿處理，

試片表面具∘潤濕角，經 E. coli K-12 細胞培養後的 SEM 照片---65 圖4-32 表面具 U 型凹槽結構的鎳材母模基板 AFM 圖形---65

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圖4-33 材料 PMMA 表面具較小深寬比 U 型凹槽結構，經氮電漿處 理後培養 E. coli K-12 細胞的 SEM 照片---66

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第一章前言

早期由於美國學者 Langer 和 Vacanti[1]提出了組織工程的再生醫學新概念。藉由生命科學與工程科學的結合，希望能夠發展出具有修復和取代人體組織或器官的植入物。近十年來已經有大量的植入物，經由設計與改良使用在人體。因此，研究各種材料運用於生醫方面的可能性，也隨之興起。早期外科手術常因為感染而導致失敗，直到Lister[2]開始研究無菌外科手術，生醫材料（Biomaterials）

才獲得真正的實際用途。

傳統的概念是希望生醫材料呈非常的惰性（Inert），植入人體時，不會與體內的化學物質產生任何作用。由於人體免疫系統的反應與排斥作用，使得這項概念幾乎不可能實現。因此，近幾年來期望植入材料，可讓細胞吸附於材料上，進而產生遷移與增生行為，

並且材料能夠慢慢被人體所吸收或分解，藉由自體細胞與組織的再生與重建取代原來病變部位，解決免疫系統排斥外來物的問題。

因此，有許多研究都著重於體內各種細胞對不同材料、不同表面化學特性，所表現出來的各種現象，來探討材料在有機體時所發揮的功效及生物相容性（Biocompatibility），使得材料能更符合體內血液相容性、組織相容性、力學相容性，減少併發症的產生。

藉著了解材料表面化學性質與結構，對於哺乳類細胞的貼附與

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排列的影響，希望藉此探討表面化學性質與結構是否對於細菌細胞有相同的影響效果；因此實驗藉著電漿表面改質與熱壓轉印技術，

改變材料表面化學特性與結構，探討 E. coli K-12 細胞所表現的行 為，希望使材料表面能夠達到完全抗菌效果。

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第二章文獻回顧

2-1 細胞貼附特性

大多數哺乳類動物細胞呈貼附生長的特性[3]，細胞只能藉由貼附才能生長，這種細胞稱之為貼附性細胞（Anchorage-dependent Cells），例如纖維母細胞（Fibroblast）、上皮細胞（Epithelium）…

等[4]。培養時，細胞藉著培養基（Medium）內的細胞貼附分子貼附於基質（Substrate）表面，如纖維粘連蛋白（Fibronectin）或基質表面具有讓細胞膜表面受體（Receptors ）辨識的縮氨酸

（Peptide）、碳氫化合物（Carbonhydrate）提供細胞進行貼附[3]。

而 E. coli K-12 的細菌細胞，貼附於材料表面可以分為五個階 段，第一階段為細菌細胞利用培養液的流動或靠著鞭毛移動至材料表面的可逆吸附，第二階段為吸附性質由可逆轉為不可逆吸附，第三階段為細菌細胞會共同分泌由蛋白質組成的柱狀細胞生物膜，第四階段為這些柱狀生物膜會形成特定圖案的排列方式，利於水道的形成並有效的獵取液體中的養分，第五階段為釋放增生的細菌細胞

（如圖 2-20 所示）[66]。

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圖2-20 E. coli K-12 細胞增生步驟[66]。

2-1-1 細胞外間質（Extracellular Matrix）

在人體內，細胞外間質成分相當複雜（主要成份由表 2-1 所示），可提供細胞貼附與支撐並得到各方面的訊息，讓細胞產生展開、遷徙、分化、增生…等生長訊息[5]。細胞外間質蛋白質，大多數由細胞自體分泌至細胞膜外，並且組合而成的聚合物分子，以提供細胞組織工作及機械性質。因此細胞外間質的主要功能可細分為下列幾項[6]：

（1）提供細胞支撐力

（2）決定細胞的排列

（3）控制細胞的生長

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（4）在細胞分化時有重要的決定性

（5）提供一個三維的立體結構，讓組織生長

（6）建立起細胞的微環境

（7）可以接收、儲藏並提供各種體內調節分子

表2-1 細胞外間質成份與其功能[7]

1、纖維粘連蛋白（Fibronectin)

纖維粘連蛋白是細胞外間質以及引導細胞貼附、伸展、遷徙與細胞骨架系統的主要成分，可和排列在細胞間隙中的胞外基質 (ECM)連結，並且規律地排列附著在可貼附的材質或表面結構上，

(23)

作為細胞貼附的依據[8]。纖維粘連蛋白是由纖維母細胞、內皮細胞、血管肌肉平滑細胞…等，分泌的大分子糖蛋白 (400,000 m.w.) 所組成，兩條長鏈之間的 C-端藉著雙硫鍵鍵結成二聚體（圖 2-1）

[7,9]。在血液內也可以發現其蹤跡，此時呈現為溶解態不具任何連接位子（Bonding Sites）不會與任何受體(Recepter)作用，位於細胞外間質時呈現非溶解態，此時可和有專一性質的受體快速作用連結 [10]。纖維粘連蛋白的每一個長鏈皆為異質性，包含了 12 種 Type I 組成物質、2 種 Type II 組成物質、15 至 17 種 Type III 組成物質和包含各種樣式的組成物質區塊所構成[10]（圖 2-1）。因此，其具有各種連接位子可讓各種物質連接，包括纖維蛋白（Fibrin）、肝素

（Heparin）、膠原蛋白（Collagen）和整粘蛋白（Integrin）[9,10]。

2-1-2 細胞骨架系統（Cell Cytoskeleton System）[11,12]

細胞骨架為提供細胞支撐力與決定細胞外在形狀的絲狀組織，細胞跟環境的接觸會使細胞骨架受到機械性質的外力，藉由細胞骨架的變動與重新排列傳導訊息讓細胞表現出各種形狀。

組成細胞骨架的兩種主要組成蛋白為肌動蛋白（Actin）和微管蛋白（Tubulin）；肌動蛋白主要是構成細絲（Thin Filament），包含微絲（Microfilament）與中間絲（Intermediate Filament），而微管蛋白主要是組成微管（Microtubules），細胞骨架系統由微絲、微管

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與中間絲構成網狀網絡（圖2-2）。

圖 2-1 纖維粘連蛋白結構與組成物質[10]

圖2-2 細胞骨架系統三維結構[13]

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三種主要蛋白質結構與特性有：

1、微管（Microtubules）[14,15,16]

微管通常存在於真核細胞內，是由 α 微管蛋白以及 β 微管蛋白所組成的緊密管狀結構，具有直徑24nm 以及 5nm 的壁厚，由中心體（Centrosome）向外呈放射狀射出，形成密集的網絡系統；最長的微管甚至可到達整個細胞寬度，是細胞骨架中最具剛性的纖維蛋白；由於，具有良好剛性能避免纖維被壓縮或彎曲因此能夠提供細胞維持一定的形狀，功能類似建築大樓的鋼樑。

細胞胞器，大部分隨著微管網絡系統分布，不同的微管將影響胞器的分布位置。於 1985 年，在烏賊的神經巨軸突，發現一種由兩條Heavy Chain 蛋白和兩條 Light Chain 蛋白盤旋而成，具有運動的運動蛋白(Motor Protein)，稱之為運動素（Kinesin）（圖2-3）；運動素會沿著微管運送小泡（Vesicle）到細胞各處，最遠可到達突觸末梢；小泡內含有細胞所需的養分、蛋白質、生長訊息和胞器，維持細胞細胞生長；除此之外，還能形成鞭毛或纖毛的主體結構。

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圖2-3 運動素[14]

2、微絲（Microfilaments）[14,15,16]

微絲是由蛋白質機動蛋白（Protein Actin）組成的細小纖維，

直徑約為8nm。在 Cross-linking Proteins 作用下，機動蛋白之間互相鍵結，形成兩條相互纏繞並具有剛性的雙股螺旋長鏈蛋白，散佈於細胞質（Cytoplasm）內，是細胞骨架主要的成份。肌動蛋白由 Heads（為 Actin-ATP 組成）和 Tail 所組成（圖 2-4），攜帶 ATP 的肌動蛋白會促使微絲的形成，依形成的先後可以分為 Minus End 和 Plus End（圖 2-5），形成微絲蛋白後 ATP 會轉換成 ADP，肌動蛋白會從 Minus End 開始脫離，並由其他肌動蛋白在 Plus End 端補上，形成一個交替狀態維持長度不變。然而，在細胞內不同的蛋白

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質激素，將會影響肌動蛋白的聚集（Assembly）或拆散（Disassembly）

速率；當形成速率大於拆散速率時，細胞形成偽足並藉著整粘蛋白固定於細胞外間質或基板上；聚集速率等於拆散速率時，細胞不會改變外型，因此細胞呈現靜止不動；聚集速率小於拆散速率時細胞偽足收回，藉由這三種狀態的調節產生類似變形蟲的移動方式，並且控制細胞質流動，讓胞器能設置於適當位子。

圖 2-4 肌動蛋白結構[14]

(28)

圖2-5 Minus End 和 Plus End[14]

3、中間絲（Intermediate Filament）[14,15]

中間絲是一種實心、表面平滑並且沒有任何分支的纖維，通常直徑大約為10nm，位於微管與微絲之間；中間絲藉 Plectin 蛋白與其他纖維連結（圖2-6），只有在特定的動物細胞中才有其蹤跡。中間絲的形成與膠原蛋白非常相似，胜肽長鏈至少由 50 種不同基因解讀合成，類似的胜肽長鏈可以相互聚集形成 N-端及 C-端相同方向排列的α 螺旋（α-Helix）二聚體（Dimer）；這些二聚體之間會互相吸引形成 N-端及 C-端相反排列的四聚體；最後四聚體再互相聚集形成中間絲結構（圖 2-7），中間絲主要是提供細胞機械性質的應力，維持細胞的外貌。

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圖 2-6 中間絲以及 Plectin 蛋白[16,17]

圖2-7 中間絲形成步驟[18,19]

細胞骨架複雜的網狀結構，提供細胞下列幾種功能[15]：

一、提供細胞能夠維持一定的細胞外貌二、各種纖維之間的協調可以促使細胞移動三、可以讓養分或胞器到達所需要的位子

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2-2 細胞在基板上的黏附作用 (Cell Adhesion)

細胞膜含有Intergrin、Cadherin、Selectin…等橫跨於細胞膜的蛋白質，細胞藉著這些蛋白質連結於細胞外間質與細胞骨架[20]。

每種蛋白對於基材表面性質如親疏水性、表面官能基、表面粗糙度、表面微結構及正負電荷性質，都有不一樣的反應；因此表面性質與結構的差異，將直接影響到細胞貼附與生長的情況[3,8]。

2-2-1整粘蛋白（Integrin）

Integrin是由α-family以及β-family次單元膜蛋白藉著非共價鍵所連結在一起的二聚體（圖2-8），因此Integrin至少可以有100種以上的型態，每種的專一性皆不相同，其藉著Talin、Vinculin、α-actinin 結構分子與Paxillin、P130cas、c-Src訊息傳遞分子聚集成複雜的結構與訊息傳遞途徑[21]。在FAKs內有許多蛋白質可以調解其專一性質，例如R-Ras可以調解Integrin和補體之間互相的作用強度[22]，

而Rho、Rac和Cdc42可以調節Integrin的聚集與拆散，可以控制細胞的展開或遷徙的行為[23]，除此之外尚有其他調節激脢可調節細胞各種行為（表2-2），對於不同的α與β次單元也有著不同的連接蛋白質調節Integrin功能（表2-3）。

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圖2-8 整粘蛋白結構[24,25]

表2-2 不同激脢的功能[26]

Integrin Avidity FA Turnover Cell Migration Proliferation FAK + / - + + +

Src + / - + + + P130Cas + / - + +

Crk + / - +

Paxillin + / -

Talin + ? Vinculin ? +

+,已知道其有正面的作用；-,已知道其有負面的作用；+/-,同時具有正反面作用；

?,有相關但尚不知其確定功能

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表2-3 Integrin-binding Protein[20]

Binding Taget Binding Protein Characteristics Function β2 Cytohesin-1 PH- and SEC7 Domain Enhances αLβ2

Binding to ICAM-1 β3 Endonexin Small Cytoplasmic

protein

Affinity Modulation β4 P27BBP Intermediate Filament

Association

?

Β ILK-1 Serine-threonine Kinaes Negatively Modulates

Integrin-cytoskeleton Interactions ?

Β CD98 Transmembrane Protein Affinity Modulation Multiple αs Calerticulin Calcium Regulatory

Protein

Modulates

Integrin-triggered Ca2﹢ Influx and Ca2﹢- Dependent Cytoskeletal

Events ? αllb CIB Similarities to

Calmodulin and Calcineurin

Affinity Modulation

Transmembrane domain

TM4 Proteins Four

Membrane-spanning Helices

Signal

Transduction ?

2-2-2 Focal Adhesions (FAs)

FAs是細胞吸附於基底時顯著斑點，是由至少50種以上拉長的蛋白質在機動蛋白纖維末端聚集而成[27]，細胞與基底接觸1到2小

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時之後開始產生吸附作用，因此FAs也開始產生聚集。當細胞吸附於基底初期時Focal Complexes開始在細胞展開末梢或細胞遷徙的主導邊緣形成，之後Focal Complexes會互相連結形成FAs讓細胞能夠穩定的吸附於基底，並且在這些吸附位子產生張力的表現，使細胞停止展開或遷徙的行為[21]。

2-2-3 Integrin與訊息的傳導

Integrin與補體連結時能夠活化細胞質內的酪氨酸蛋白激酶

（Tyrosine Kinases）和絲氨酸蛋白激酶（Serine Kinase），引起離子的壓差和促進脂質得新陳代謝[20]。當細胞吸附於基底時FAK

（Focal Adhesion Kinase）可以當成一個標記，表示Integrin吸附於補體[28]。FAK是一個非受體的酪氨酸蛋白激酶，主要由1052個氨基酸組成，當FAK與Tail結合時會在第397個氨基酸上（Y397）產生自我磷酸化反應，產生一個對SH2有很好專一性質的位置，提供 Src連接。當Src與FAK連接後，Src會在Y576與Y577等位置進行磷酸化反應，提供其他具有SH2 Domain的蛋白質連接例如Grb2，並且對P130Cas與Paxillin進行磷酸化，產生SH3 Domain的連結位置與 FAK分子上具Proline區域進行連接（圖2-9）。FAK、P130Cas、

Paxillinc和Src會互相在特定的位子連結成四聚體，這些連結有助於 Focal Adhesion的形成（圖2-10）、活化細胞外信號調節激酶（ERK）

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與分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的訊息傳遞路徑。但有些研究指出ERK/MAPK等訊息傳遞途徑的活化不需要經由FAK的作用，藉著受體酪氨酸激素（RTK）與環境中的生長因子（GF）結合活化訊息傳遞途徑為其中一種例子[20,26,28-33]（圖2-11）。

由此可知細胞能夠藉著各種蛋白質之間作用，對不同環境產生不同的行為（圖2-12）。因此，許多的實驗藉著改變基材表面的形貌（Topography）、潤濕性、官能基…等，希望藉此觀察細胞發生的各種現象，以運用於生物科技的領域。

圖2-9 FAK和激脢互相連結結構[34]

(35)

圖2-10 FAK活化Integrin與ECM連結形成FA[33]

圖2-11 藉RTK或Integrin與外界接觸[32]

(36)

圖2-12 細胞與外界接觸促使細胞各種行為[35]

2-3 影響細胞行為的方法

過去許多研究指出，基材表面會影響細胞行為的主要原因包括：

表面化學性質與表面物理性質[36]。表面化學處理包括：電漿（Plasma）

表面改質處理、自我組裝排列（Self-assembly）…等；而物理處理則包含：表面奈微米結構、表面粗糙度…等。希望藉此改善細胞貼附行為，增加材料表面生物相容性質。

2-3-1 電漿表面改質

使用電漿來清潔與改質生醫材料表面特性，主要是因為下列幾種特性[37]：

1. 它能夠在不改變材料主體的狀況下，只改變材料表面化學特性或形

(37)

貌。

2. 其本身亦具有殺菌效果。

3. 能夠處理比較細小或狹窄的材料。

由於現今 e-PTFE 已被廣泛地應用在、食品包裝、中口徑的人工血管(內徑約 4~10 mm)、人工韌帶、人工心包膜與胸腔或腹腔手術的補綴片(Patch)等生醫材料(Biomaterial)上，雖然具有 121∘的潤濕角表面特性對於哺乳類細胞與體液有著良好的抗沾黏的功效，但是對細菌細胞效果卻不彰顯，容易造成細菌細胞的孳生，造成食物腐敗以及體內細菌感染。因此，藉著氧電漿處理，讓材料表面具有微結構組織，增加抗沾黏效果，使材料有利於食物的保存與生醫植入物（Implant），植入體內時更加安全；並利用所需的光罩可以在 PTFE 表面做奈微米圖案表面處理，控制 E. coliK-12 細菌細胞的貼 附區域，可用於檢測細菌細胞的細胞晶片，由於表面具有超疏水效應，對於訊號傳遞與處理比較沒有互相干擾的效果。

也能夠運用在微小的晶片上，更加精巧的控制表面親疏水性的區域，以利於控制細胞貼附區域（圖 2-13），運用於生物晶片 [38,39]。

(38)

圖2-13 PS表面經IPA電漿處理600秒[39]

2-3-2 利用離子專一性

自我組裝（Self-assembly）是利用分子與基底具有專一性的特性，並自我產生排列的行為，例如，表面鍍金的底材，浸泡於一端含有S原子另一端為Functional Groups的長鏈分子，S原子會依著固定的角度與Au原子連結排列，並把Functional Groups顯露在表面，

以達到改變表面特性[3,40]的目的。利用表面工程技術（圖2-14）

[41]，控制表面異質區域或利用Microcontact Printing技術使表面圖案化（圖2-15）[3]，操控細胞、抗體或抗原的貼附位置。

(39)

圖2-14 利用表面工程技術讓表面圖案化[41]

圖2-15 用Microcontact Printing技術讓表面圖案化[3]

2-3-3 表面結構對細胞的影響

材料表面型態是影響細胞反應的主要因素之ㄧ[43,44]，目前表面型態影響細胞行為的有：表面的幾何形狀 (Surface Geometry)、

表面曲率 (Curvature)、表面結構方向性 (Orientation)、凹槽表面

(40)

(Cavity)、表面粗糙度(Roughness)、尖銳表面(Edges)…等；藉著不同結構的改變，影響組織與植入物質表面的免疫反應、纖維母細胞貼附、血管新生（Angiogenesis）…等[45]，改善表面生物相容性。

1.表面粗糙度（圖2-16）

早期的資料指出不同的表面粗糙度將會響纖維母細胞的增生

（Proliferation）、分化（Differentiation）和基質的合成（Matrix Synthesis）[46,47]。因此，許多研究利用砂紙研磨、拋光或電漿處理等方法，得到不同的表面粗糙度[48-53]，藉此觀察於不同表面形貌，各種細胞的貼附（Adhesion）、展開（Spreading）、增生、細胞骨架分佈狀態…等行為[51,52]。

圖2-16 不規則表面粗糙度[49]

(41)

2. 微米凹/凸槽（圖2-17）

表面奈微米凹/凸槽處理，最主要是希望藉著不同孔徑，在表面上產生不同的粗糙度，在這分開來談主要是因為其結構相對於表面粗糙度還是具有一定規則。Sang Jin et al. [54]發現，在0.2-1.0µm 時細胞容易貼附在材料表面並開始伸展，當孔徑為3.0-8.0µm細胞呈現球的形狀（圖2-18）。Yuqing wan et al.[55]發現孔徑大小對 OCT-1 osteoblast-like cell貼附於表面影響較大，對細胞增生卻沒太大影響，然而Cherine c. Berry et al.[56]卻指出孔徑大小明顯影響了 Fibroblast的增生，由此可知不同細胞對表面粗糙度皆有不一樣的表現。現在更有許多研究把微米孔徑以及奈米孔徑結合，在一個表面下直接觀察細胞對不同結構產生的各種情況[57,58]。

圖2-17 微米凹/凸槽結構[55]

(42)

3.等方向溝槽結構（圖2-18）

於1912年，Harrison[59]發現表面具有特定方向的微結構，影響了細胞的移動方向與排列方向；Green et al.[60]使用纖維母細胞，培養在具有1-10µm的微柱狀結構矽晶圓基板，發現2µm和5µm 的微柱狀結構可誘發細胞增生率的增加；W O´jciak-Stothard et al.[61]利用30-282nm深度的微米溝槽結構，測量不同深度對Murine

Macrophages的影響，發現其對具有30-70nm深度的凹槽，有較高的敏感度並隨其引導生長；Den Braber et al.[62]則固定溝槽深度 0.5µm，只探討溝槽寬度2.0-10µm的對細胞影響，發現貼附在溝槽為2µm和5µm的細胞有比較好的貼附強度，並發現所有的排列方向角度平均小於10°（圖2-19 角度判別），有著良好的引導作用；但 Walboomers et al.[63]於深度1µm和寬度分別為1µm與10µm的溝 槽，進行纖維母細胞對體外培養，卻發現排列方向角度分別為12.1°

和17.9°，並發現當寬度為10µm時細胞能夠長入溝槽內部，而且有些細胞並不會呈現方向性生長；這些數據相對於Den Braber et al.

是乎有些差異，但我們可以看到其材料製作方式、溝槽深度差異，

導致結果不同；由此得知表面溝槽結構其深度、寬度、製造過程與培養細胞種類，將會得到不同的結果。

(43)

圖2-18 等方向溝槽結構[64]

圖2-19 角度α判別[65]

2-3-4 PTFE 表面對細菌細胞的貼附影響

細菌細胞在於可逆貼附階段時，會利用液體的流動與鞭毛運動克服相斥性材料表面，進而接近固體表面進行貼附作用[66]。因為平坦的 PTFE 材料表面未具足以抗吸附與抗菌的表面特性，並且 PTFE 表面具有裂縫的粗糙表面能促進細菌細胞貼附。由於其表面有利於血清蛋白與Clotting Protein 的貼附，因此增加了細菌細胞貼附於PTFE 材料表面[69]。

(44)

第三章實驗設備與步驟

本實驗是藉著熱壓轉印技術和 PECVD 電漿處理試片，改變材料表面微結構與表面性質，製作細菌細胞培養所需之試片，來培養細菌細胞，藉此探討表面結構與性質對細菌細胞所產生的影響。

3-1 實驗設備

本實驗藉著電漿與熱壓機改變材料表面化學性質與奈微米結構，並藉著SEM 與 OM 做材料表面觀察與分析。

3-1-1 改變表面性質與表面微結構設備

（一）電漿輔助化學氣相沉積( PECVD )

藉著淋浴方式所產生的電漿在不改變材料主體的狀況下，能均勻的改變材料表面化學特性或形貌，進行表面官能基接枝或表面蝕刻來改變材料表面親疏水性的表面性質。如圖 3-1 所示。

圖3-1 電漿輔助化學氣相沉積( PECVD )設備

(45)

（二）熱壓機（Hot Embossing）

本實驗使用的熱壓機來熱壓具有微結構奈米圖案模具於材料表面，藉此改變材料表面形貌。如圖3-2所示。

圖3-2 熱壓機

3-1-2 觀察材料表面細菌細胞狀況 (一) 掃描式電子顯微鏡(SEM)

用以觀察微材料表面結構尺寸大小和細菌生長於材料表面凹槽結構的情況。如圖3-3 所示。

圖3-3 掃描式電子顯微鏡(SEM)

(46)

(二) 顯微鏡(OM)

光學顯微鏡（圖 3-4）與倒立式光學顯微鏡型（圖 3-5），用以初步觀察試片表面形貌與深度，並用來初步觀察經由熱壓改變表面結構的 PMMA 表面巨觀型態。如圖 3-6,3-7 所示。

圖 3-4 光學顯微鏡圖 3-5 倒立式光學顯微鏡型

3-2 細胞與細菌細胞的培養

（一）水浴槽(Water Bath)

在進行細菌培養前，將冷凍的培養液加熱，讓溶液溫度調節至 37℃以適合細胞的生長條件。如圖 3-6 所示。

(47)

圖3-6 水浴槽 (二) 培養箱 (Incubator)

培養箱內溫度、濕度與 CO2 含量可由微電腦程式控制，來調節細菌所生長環境，讓細菌細胞生長於 37℃的恆溫環境，以及藉著CO2含量來控制生長液的PH 值。如圖 3-7 所示。

圖3-7 培養箱

(48)

(三) 無菌操作台

為了避免細菌分盤或種植細菌時有別種細菌或微粒進入培養液內，導致細胞死亡或菌種不純。如圖3-8 所示。

圖3-8 無菌操作台

（四）酒精燈（Alcohol burner ）

任何器具使用前都要經由本生燈的烘烤，以達到消毒殺菌的效果，避免細胞受到感染死亡或外來細菌進入導致菌種不純。如圖 3-9 所示。

圖3-9 酒精燈

(49)

（五）接種環（Inoculation loop）

接種環必須在酒精燈火燄上燒紅，將生長有細菌之培養皿蓋子拿起，將接種環在培養基空白處輕戳數次以使冷卻用於刮下菌落，

進行分植(如圖 3-10 所示)。

圖3-10 接種環

3-2-1 細菌菌種繁殖

（一）LB 培養液

在瓶中加入10 g tryptone 、 5 g yeast extract 、 10 g NaCl，加水至一公升並用攪拌器混勻，待滅菌後降溫再旋緊瓶口。之後把溶液放置高溫滅菌鍋（圖 3-11）約 40 分鐘，高壓滅菌後必須等它慢慢排氣，只有當氣體完全排除後，才能安全地打開滅菌鍋，戴耐熱手套取出材料。

(50)

圖3-11 高溫滅菌鍋

（二）LB 固體培養基

在 LB 培養液中加入 1.5%Agar 再高溫滅菌鍋消毒，在置放於抽風櫃讓溫度降至50℃，在培養基凝固前，倒入微生物用的培養皿（petri dish），等待完全凝固後，放在室溫或 4 °C 中。

（三）大腸桿菌的培養

自冷凍櫃取出儲存的菌種（E. coli K-12），培養在 LB 培養液 中並放置於 37 °C 恆溫培養箱中培養。取 1 個具有固體培養基的 LB plate，將接種環放置酒精燈上燒紅，將接種環在固體培養基空白處輕戳數次使其冷卻。將接種環浸入培養菌種的培養液一下，打開空白 LB plate，將沾有菌種的接種環在其上輕輕畫數條橫線，再轉一個角度，再將沾有菌種的接種環在其上輕輕畫數條橫線，一直重複這些步驟（圖3-12），放置於 37℃培養箱培養 12 小時。

(51)

圖3-12 培養細菌時接種步驟

（四）菌種保存

接種環於酒精燈火燄上燒紅，在有生長細菌之 LB plate 空白處輕戳數次使其冷卻在刮下菌落，於具有LB 培養液的培養試管內攪拌使菌種散至培養液內，並把培養液儲存於-70 ℃冰櫃中保存，菌種保存於-70 °C 培養液中，可保存數月甚至數年。

(52)

3-3 實驗流程

試片材料選擇

1.聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 2.鐵氟龍(e-PTFE)

試片前置處理

熱壓機

電漿處理

表面觀察細菌培養

(53)

3-3-1 試片材料選擇

（一）聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate PMMA)

是由甲基丙烯酸甲酯單體(MMA)所聚合而成的高分子聚合物，分子量約為 50~100 萬。甲基丙烯酸甲酯(PMMA)是目前對細胞具良好生物相容性材料之ㄧ，對於培養液的酸鹼性有著一定的穩定性、材料的玻璃換溫度低具有良好的可塑性質、材料便宜、材料透光性良好，因此 PMMA 被廣泛應用於微流道製作、光纖抽製、

鏡片、隱形眼鏡、人工關節、人工水晶體、骨水泥…等。

（二）四氟化聚乙烯(Expanded Polytetrafluorethylene e-PTFE) 在自然界中有許多動植物，其表面具有疏水性的化合物與微結構。例如蝴蝶的翅膀表面具有疏水性的化學化合物質，並藉著表面微結構的輔助導致其有超疏水的特性，因此具有自潔與抗菌的功效 [68]；因此本實驗以由 C-F 鍵結而成的疏水化合物 e-PTFE 為試片，

經電漿處理觀察表面型態與潤濕角，對細菌細胞的貼附影響。

四氟化聚乙烯(e-PTFE) ，是一種含氟的高分子聚合材料，主要特性包括耐高低溫(-70℃~260℃)、相當惰性的化學性質、傑出的抗化學性與抗析出性、表面摩擦係數為 0.05-0.1，介電常數小、電絕緣性良好、抗 UV 紫外線和能抗各種天氣變化、理想的抗腐蝕性、良好的表面疏水性、低易燃性…等，現已被廣泛地應用於、食

(54)

品、醫療、才表面塗佈、絕緣套件…等各個不同的領域。

由於四氟化聚乙烯(e-PTFE)其性質相當惰性，植入體內其化學性質相當穩定，並具有相當好的耐磨性、表面疏水性與低摩擦係數係數，所以常常應用於口徑約 4~10 mm 的人工血管、人工韌帶與手術補綴片(Patch)等生醫材料上。

因此，本實驗藉著改變材料表面結構以及表面官能基，用來研究細菌細胞貼附性質，希望可以達到良好的抗菌與抗沾黏效果。

3-3-2 試片前置處理

1.聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)

選購長 15 ㎝、寬 7 ㎜、高 3 ㎜的平板狀 PMMA（圖 3-13），

以刀具裁切為15 段長 1 ㎝的 PMMA 小平板，以此當成熱壓底才。

利用乙醇清潔 PMMA 表面的灰塵與汙漬，之後以去離子水清洗並用吹風機吹乾放置於乾燥箱中保存，預防大氣中的顆粒依附其表面。

(55)

圖3-13 PMMA 平板 2. 鐵氟龍(e-PTFE)

把多孔性鐵氟龍切成大小約為 5mm×7mm 見方的小塊狀（圖

3-14），利用噴有乙醇的無塵紙，清潔材料表面，放置乾燥箱中保存，

以供電漿表面改質的底材。

圖 3-14 小塊狀鐵氟龍

(56)

3-3-3 製作試片之方式

本實驗試片製作可分為兩種：

1.利用熱壓轉印技術，把母模上具有的奈米圖案轉印製 PMMA 表面，讓表面具有奈米溝槽結構，討論其對細菌的影響。

2.利用電漿對表面改質處理，以 Plasma Etching 及化學沉積的方法在PMMA 與 e-PTFE 材料表面上進行改質，藉此改變面結構與表面親疏水性。

（1）熱壓轉印技術

本實驗室熱壓機可分為上下兩個壓縮台（SP1,SP2），為向上壓縮方式。設定機台 SP1 溫度升至 150℃、SP2 不加溫、壓力 300kg、

壓縮時間 90 秒，當 SP1 升溫至 150℃時放置母模，之後放置已裁切的 PMMA 於母模表面上之後 SP1 像上壓縮，經 30 秒壓力驟增至 300kg 歷經 90 秒壓縮時間，取出試片於室溫，母模冷卻至室溫時自然脫模。

（2）電漿對表面改質

利用電漿改質 e-PTFE 與 PMMA 表面結構與親疏水性，藉此探討影響細菌生長條件因素。

(57)

1. e-PTFE 經氧電漿改質條件如下表 3-1 所示：

表 3-1 氧電漿對 e-PTFE 處理實驗參數

處理時間 RF 功率氣体流量腔體壓力

2 分鐘 500W 20sccm

腔體壓力抽至65 mtorr，打開 POWER 壓力變至100mtorr

腔體壓力抽至65 mtorr，打開 POWER 壓力變至80mtorr

2. PMMA 經氮電漿改質條件如下表 3-2 所示：

表3-2 氮電漿對 PMMA 處理實驗參數

處理時間 RF 功率氣體流量

3. e-PTFE 經氮電漿改質條件如下 3-3 表所示：

表3-3 氮電漿對 e-PTFE 處理實驗參數

處理時間 RF 功率氣體流量

(58)

4. e-PTFE 先經氧電漿再以氮電漿改質條件如下 3-4 表所示：

表3-4 氧電漿與氮電漿對 e-PTFE 處理實驗參數 Step 氣体處理時間 RF 功率氣體流量

Step1 氧氣 15 分鐘 500W 20sccm Step2 氮氣 20 分鐘 400W 20sccm

3-4 進行細菌細胞培養

1. 使用前把儲存於-70 ℃冰櫃中含有菌種培養液的試管取出，並置於37 °C 水浴槽中振盪培養過夜。

2. 打開試管蓋前，先於酒精燈上烘烤管口與蓋子接縫處，打開蓋子並烘烤蓋子與瓶口，之後把事先準備好的試片放置培養液內，再將管口與蓋子再次在酒精燈上過火後蓋上蓋子，並登記日期。

3. 將試管置於 37℃ 培養箱內震盪培養一周。

4.取出以培養試片經去離子水沖洗後放置 37℃ 培養箱內乾燥。

3-5 表面觀察

使用掃描式電子顯微鏡，觀察處理過的試片表面型態與細菌生長情況與行為。

(59)

第四章結果與討論

因此，本實驗主要的目的在於改變材料表面化學與表面微結構，利用培養細菌細胞的培養技術把細菌細胞培養於材料表面，用此探討細菌細胞所表現出的行為與對其吸附的影響，希望得到抗菌的效果。

4-1 PMMA 材料表面潤濕特性對 E. coli K-12 細胞的貼附影響 本實驗使用 PMMA 與載玻片兩種表面型貌較為平坦，但具有 不同潤濕角的材料表面，來進行 E. coli K-12 細胞培養；在培養前 先做表面潤濕角度測量，發現 PMMA 在未經過任何改質時，其表面具有 66∘的潤濕角（如圖 4-1 所示），而未經任何改質的載玻片表面具有32∘（如圖 4-2 所示）的潤濕角。

在培養 E. coli K-12 細胞 7 天後拿出，以去離子水清洗並放入 培養箱內進行乾燥，之後再利用 SEM 觀察材料表面可看到載玻片 表面貼附了大量的 E. coli K-12 細胞（如圖 4-3 所示），而 PMMA 在其表面只有少數 E. coli K-12 貼附（如圖 4-4 所示），雖然材料表面性質不同，但這兩種材料對於哺乳類細胞皆具有良好的生物相容 性，並不會對細胞產生任何毒害效果，因此更不會對 E. coli K-12 細胞有任何影響，所以本實驗認為最大的影響因素為表面潤濕角的

(60)

差異。

4-1-1 對 PMMA 平板進行氮電漿表面改質

爲了更明確知道材料表面潤濕角對於 E. coli K-12 細胞貼附的 影響，本實驗利用氮電漿對 PMMA 材料進行表面改質，讓材料表面產生電漿蝕刻與胺基化合物聚合反應，使得 PMMA 試片表面被活化，產生親水性的官能基團；材料表面在輸入功率為 100W，氣體流量 20sccm 的環境條件下，進行材料表面改質 10 分鐘，材料表面變的相當親水（如圖 4-5 所示），於相同培養環境下進行 E. coli K-12 細胞培養 7 天取出，以去離子水清洗並放入培養箱內進行乾燥，之後再利用 SEM 觀察材料表面。

經由 SEM 觀察可明確得知，E. coli K-12 細胞對經由氮電漿處 理的PMMA 材料表面有著非常良好的貼附效果，E. coli K-12 細胞 呈樹枝狀圖案排列（如圖 4-6 所示），並產生許多菌落（如圖 4-7 所示），由此可知 E. coli K-12 細胞對於材料表面的貼附特性，材料 表面沉積的胺基基團與潤濕性改善為主要影響因素。

4-1-2 PMMA 表面具奈微米結構對 E. coli K-12 細胞的貼附影響 由於熱壓轉印技術（Hot Embossing ）跟矽晶微細加工技術

（Silicon Micromachining Technology ）相互比較下，其成本較為

(61)

低廉，並可以使用於壓印有機材料及可做大面積且三維結構的表面處理[67]，因此本實驗藉著熱壓轉印技術，進行 PMMA 材料表面奈微米結構圖案轉印。

本實驗所使用的母模基板可分為兩種，一種為表面具凹槽的奈微米結構，凹槽與凹槽之間的間距約為 400nm，U 型凹槽深度

（Depth）約為 200 nm（如圖 4-32）；另一種為表面具有 V 型凹槽奈米結構，每一個V 字型頂尖相隔約為 400 nm，深度約為 50 nm 的鎳材基板，利用熱壓機於 150℃，施力 300kg，把具奈米圖案的鎳材基板壓印於 PMMA 表面上 90 秒，之後把試片放置室溫待母模冷卻後自動脫落，如材料表面有 U 型凹槽或 V 型凹槽產生，可以發現材料表面光線都有干涉的現象產生。

把具有奈微米結構的 PMMA 試片清洗後放置培養皿內，做為 培養 E. coli K-12 細胞的底材，放置培養箱內震盪培養 7 天，取出 後利用離子水清洗並放入培養箱內進行乾燥，之後再利用 SEM 觀 察貼附於材料表面的 E. coli K-12 細胞貼附情況。

經由 SEM 觀察可以得到，具有 V 型凹槽的材料表面，因為凹 槽深度較淺，並沒辦法有效的影響 E. coli K-12 細胞的移動行為，

也沒有辦法有效的影響 E. coli K-12 細胞的排列方向，就貼附於材 料表面的 E. coli K-12 細胞數量而言，具有 V 型凹槽的 PMMA 材

(62)

料表面其細胞貼附數量遠比平板PMMA 還多（如圖 4-8 所示），由此可知 V 型凹槽，可以增加材料表面的表面積，讓 E. coli K-12 細 胞與其分泌的蛋白質生物膜有更多的貼附表面可以連結，讓 E. coli K-12 細胞更有效的吸附於材料表面。

而具有 U 型凹槽的奈微米結構的材料表面，可發現 E. coli K-12 細胞貼附於材料表面數量比平板的 PMMA 材料表面還要少，並喜歡貼附於凹槽邊緣，並對凹槽呈等方向性排列（如圖 4-9 所示），

為了更明確的觀察凹槽結構對細胞的引導效應，把另一個試片取出後不經過清洗步驟，限制細胞的活動區域，可看見大量細胞呈等方向性排列（如圖4-10 所示）。由此發現，E. coli K-12 細胞與哺乳類 細胞行為相似，皆喜歡貼附於凹槽邊緣（如圖 4-11 所示）並呈等方向性的排列[44]。

由此可知，具 U 型凹槽的表面微結構其凹槽深寬比夠大才能 夠有效的影響 E. coli K-12 細胞的排列方向，使 E. coli K-12 細胞沒 辦法形成樹枝狀圖案排列，影響細胞獵取養分，所以細胞並不喜愛貼附於具有深寬比較大的 U 型凹槽的材料表面；由此可知，材料的表面結構不只影響了細胞的貼附生長方向，並且影響了細胞對材料表面的貼附喜好。

(63)

4-1-3 表面潤濕角與表面結構對 E. coli K-12 細胞的貼附影響

為了更加確定材料表面結構與潤濕角，對 E. coli K-12 細胞的 貼附影響，本實驗針對具 U 型凹槽與 V 型凹槽的奈微米結構材料表面，進行氮電漿表面改質，改質條件為：輸入功率 100W，流量 20sccm，並對材料表面處理 10 分鐘，材料表面變的相當親水（如圖4-12，4-13 所示），把試片進行 E. coli K-12 細胞培養 7 天後取出，

以去離子水清洗後放入培養箱內乾燥，再利用 SEM 觀察材料表面 的 E. coli K-12 細胞貼附情況。

具 V 型凹槽微結構的材料表面，由於其非但不能影響 E. coli K-12 細胞排列方向性，並且增加了材料表面的貼附面積，再經過氮電漿處理過後，於材料表面沉積具胺基的親水基團，更增加了細胞對材料表面的貼附特性（如圖4-14 所示）。

就材料表面 E. coli K-12 細胞貼附的數量而言，材料表面皆沉 積一層胺基親水基團的 U 型凹槽結構，表面明顯的比具 V 型凹槽結構的材料表面還要來的少（如圖 4-15 所示），由於經過氮電漿改 質材料表面後，其表面具有的胺基對 E. coli K-12 細胞有良好的貼 附效果，因此兩種材料表面的相異性質為表面結構的不同，凹槽深 度較深時對於 E. coli K-12 細胞生長的方向與排列有很大的影響；

材料表面親水官能基雖會影響 E. coli K-12 細胞貼附於材料表面的

(64)

行為，但其效應遠不如表面微結構效應所造成的影響來的明顯。

為了更明確知道凹槽的深寬比對 E. coli K-12 細胞的貼附影 響，本實驗以 U 型凹槽母模基板為主，於製作過程中僅改變壓印壓力由原本的 300kg 降至 250g，以得到深寬比較小的 U 型凹槽並經氮電漿表面處理，於培養 7 天後取出清洗並觀察材料表面，由 SEM 照片可得材料表面聚集大量 E. coli K-12 細胞（如圖 4-33 所 示），由此可知深寬比較小時雖然材料表面微結構為 U 型凹槽，但卻沒辦法達到材料表面具較大深寬比 U 型凹槽（由壓力 300kg 轉 印奈米圖案）的抗菌效果，凹槽深寬比大小明顯影響了 E. coli K-12 細胞的生長行為。因此更加確定當深寬比較小時，材料表面微結構 沒辦法影響 E. coli K-12 細胞的生長方向，並且增加材料表面積提 高 E. coli K-12 細胞聚集貼附效果，當凹槽深寬比較大時，表面 U 型凹槽會影響細胞的生長方向，降低 E. coli K-12 細胞的聚集貼附 效果，提高材料表面抗菌功效。

4-2 e-PTFE 材料進行電漿表面改質對 E. coli K-12 細胞貼附的影響 e-PTFE 在未處理時，表面潤濕角呈現 121∘（如圖 4-16 所示），經由氧電漿處理，條件分別為：輸入功率300W，通入氧氣流量為 10sccm，處理時間達 5 分鐘時，可得到 e-PTFE 表面的潤濕角呈現為79∘（如圖 4-17 所示），延長處理時間為 20 分鐘，表面潤濕角

(65)

可達到 104∘（如圖 4-18 所示）；而輸入功率 500W，通入氧氣流量變為 20sccm，處理時間為 2 分鐘可得到 135∘的潤濕角（如圖 4-19 所示），在輸入功率與流量條件相同之環境下，只延長處理時間為3 分鐘與 15 分鐘，分別得到大約 137∘（如圖 4-20 所示）與 151∘（如圖 4-21 所示）的潤濕角度。

爲了改變表面潤濕角使其更為親水，因此使用氮電漿處理材料表面，條件分別為：輸入功率400W，通入氮氣流量 20sccm，處理時間20 分鐘，可得到潤濕角 28∘（如圖 4-22 所示）與先經過氧電漿500W，10sccm，15 分鐘後，再以氮電漿 400W，20sccm，20 分鐘處理試片表面，可得潤濕角75∘（如圖 4-23 所示）。

4-2-1 e-PTFE 材料表面化學與結構對細菌細胞的影響

在此實驗中可以發現，e-PTFE 在尚未改質之前，其表面對於 E. coliK-12 細胞並沒辦法有效抗菌，於結點處纖維與纖維間，因為

有細小孔隙能讓培養液通過，讓細菌細胞得到所需養分所以大多數 細菌細胞集中於此處，至於纖維間距較大區域 E. coli K-12 細胞比 較不喜歡貼附（如圖 4-24 所示）；由此可知，材料表面疏水性質抗 E. coli K-12 細胞的效果不彰，主要是因為 E. coli K-12 細胞會利用 鞭毛運動慢慢克服材料表面疏水效果[66]，並於一段時間後移動至材料表面。經氧電漿處理的表面具有 79∘潤濕角，其表面上只有

(66)

極少數的 E. coli K-12 細胞的貼附（如圖 4-25 所示），這是由於經 氧電漿處理過後的材料表面已有相當程度的 Etching 效果，材料表 面結構已經足夠影響 E. coli K-12 細胞的生長排列；而材料表面具 104∘、135∘、137∘與 151∘的潤濕角，皆對 E. coli K-12 細胞具 有良好的抗沾黏效果（如圖 4-26，4-27，4-28，4-29 所示），由此可知，經氧電漿處理具柱狀纖維的材料表面，不僅增加材料表面的 疏水效應，也影響了 E. coli K-12 細胞對其的貼附性質。

經由氮電漿表面處理的 PMMA 及 e-PTFE 試片，材料表面皆沉積具有胺基的親水性基團，由經氮電漿處理過的 PMMA 平板可 知，其對 E. coli K-12 細胞的貼附有良好的效果，但在 e-PTFE 材料 表面的 SEM 圖顯示並沒有任何 E. coli K-12 細胞的貼附（如圖 4-30，4-31 所示），由此可知其表面奈微米結構對 E. coli K-12 細胞 的貼附影響遠大於材料表面化學性質的影響。

(67)

圖 4-1 材料 PMMA 表面未經任何處理其表面潤濕角 66∘

圖 4-2 材料載玻片表面未經任何處理其表面潤濕角 32∘

(68)

圖4-3 材料載玻片經 E. coli K-12 細胞培養後的 SEM 照片

圖4-4 材料 PMMA 經 E. coli K-12 細胞培養後 7 天的 SEM 照片

(69)

圖4-5 材料 PMMA 表面經氮電漿表面處理後，其表面變的超親水

圖4-6 材料 PMMA 表面經氮電漿表面處理後，培養 E. coli K-12 細 胞，由 SEM 照片可以觀察到細胞呈現樹枝狀排列

(70)

圖4-7 材料表面經氮電漿表面處理後，培養 E. coli K-12 細胞，由 SEM 照片可以觀察到其表面貼附許多菌落，有增加細胞貼附效果

圖4-8 具有 V 型凹槽結構的 PMMA 表面，經 E. coli K-12 細胞培養 後的SEM 照片

(71)

圖4-9 具有 U 型凹槽結構的 PMMA 表面，經 E. coli K-12 細胞培養 後的SEM 照片

圖4-10 具有 U 型凹槽結構的 PMMA 表面，經 E. coli K-12 細胞培 養後省略清洗步驟的SEM 照片

(72)

圖 4-11 哺乳類細胞貼附於 U 型凹槽結構時的機制[44]

圖4-12 材料 PMMA 表面具 V 型凹槽結構並經氮電漿處理後，其表面變超親水

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圖4-13 材料 PMMA 表面具 U 型凹槽結構並經氮電漿處理後其表面變超親水

圖4-14 材料 PMMA 表面具 V 型凹槽結構，經氮電漿處理後培養 E. coli K-12 細胞的 SEM 照片

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圖4-15 材料 PMMA 表面具較大深寬比 U 型凹槽結構，經氮電漿處 理後培養 E. coli K-12 細胞的 SEM 照片

圖4-16 材料 e-PTFE 未經處理的表面潤濕角 121∘

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圖4-17 材料 e-PTFE 經氧電漿 300W，10sccm 處理 5 分鐘後的溼潤角為79∘

圖4-18 材料 e-PTFE 經氧電漿 300W，10sccm 處理 20 分鐘後的溼潤角104∘

(76)

(77)

圖4-22 材料 e-PTFE 經氮電漿 400W，20sccm 處理 20 分鐘後的溼潤角28∘

(78)

圖4-23 材料 e-PTFE 先經過氧電漿 500W，10sccm，15 分鐘後，再以氮電漿400W，20sccm，20 分鐘處理試片表面的潤濕角 75∘

圖4-24 未經處理的材料 e-PTFE 其潤濕角為 121∘，經 E. coli K-12 細胞培養後的SEM 照片

(79)

圖4-25 材料 e-PTFE 表面潤濕角為 79∘，經 E. coli K-12 細胞培養 後的SEM 照片

(80)

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圖4-30 材料 e-PTFE 表面經氮電漿改質後表面具潤濕角 28∘，經 E. coli K-12 細胞培養後的 SEM 照片

(82)

圖4-31 材料 e-PTFE 先經過氧電漿處理後，再以氮電漿處理，試片表面具潤濕角75∘，經 E. coli K-12 細胞培養後的 SEM 照片

圖4-32 表面具 U 型凹槽結構的鎳材母模基板 AFM 圖形

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圖4-33 材料 PMMA 表面具較小深寬比 U 型凹槽結構，經氮電漿處 理後培養 E. coli K-12 細胞的 SEM 照片

(84)

第五章結論

本研究藉著電漿表面改質來改變材料表面性質，並藉著熱壓轉 印技術改變材料表面奈微米結構，其對 E. coli K-12 細胞貼附行為 的影響結論整理如下：

1. PMMA 平板材料表面經氮電漿改質，表面沉積一層胺基官能 基，不僅改善材料表面親水效果，更加提供了 E. coli K-12 細胞 與生物膜連結的位置，增加了 E. coli K-12 細胞對 PMMA 表面 的貼附效應。

2. E. coli K-12 細胞貼附於材料固體表面時，細胞之間會相互連結 成樹枝狀排列的菌落，並且為了控制生長的密度，菌落與菌落之間相距一定的距離；由實驗中可以得知，PMMA 表面凹槽深 度較淺時，其對 E. coli K-12 細胞的排列方向沒有任何影響；反 而因為增加材料表面的表面積，提供更多的連結位置，讓 E. coli K-12 細胞與生物膜貼附更容易貼附於材料表面。但是，凹槽深度較深時，能明顯看出細胞成等方向性排列，並與哺乳類細胞有相同行為，喜歡貼附於凹槽邊緣，改變了細胞成樹枝狀的成長方向行為。

3. 具有奈微米結構並經氮電漿表面改質的 PMMA 材料表面，當表 面凹槽深寬比較小時，不僅已提高 E. coli K-12 細胞貼附於表面

(85)

的效果，其表面所沉積的胺基基團，更提供 E. coli K-12 細胞良 好的連結位置，因此細胞貼附於材料表面的數量大幅增加。但當凹槽深寬比較大時，已經能夠影響到細胞的貼附方向，阻止細胞成樹枝狀排列，影響了細胞獵取養分，因此，雖然材料表 面已沉積能增加 E. coli K-12 細胞貼附的氨基，但由於材料表面 結構的影響，只有幾許 E. coli K-12 細胞貼附於材料表面，能有 效的抑制 E. coli K-12 細胞聚集於材料表面；由實驗中可得，材 料表面結構對於細胞貼附的影響遠大於材料表面性質的改變。

4. e-PTFE 未經改質，發現 E. coli K-12 細胞大都貼附於結點附近，

由於結點由纖維構成，因此，E. coli K-12 細胞大多數貼附於纖 維與纖維之間。由於結點仍可供養分通過，因此 E. coli K-12 細 胞不需要形成樹枝狀菌落，也可以獵取培養液中養分。但是當 纖維間距過大或深度太深的區域 E. coli K-12 細胞並不喜歡貼附 其上。

5. 藉著氧氣對 e-PTFE 做電漿表面改質，材料表面因 Etching 導致材料出現明顯的針狀組織，具超疏水特性，可使材料表面有良好的抗菌效果。

6. 藉著氮氣對 e-PTFE 做電漿表面改質，材料表面因 Etching 導致材料出現明顯的微結構改變，即使表面沉積胺基基團仍有效抑

(86)

制 E. coli K-12 細胞貼附。

(87)

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中 華 大 學 碩 士 論 文