鼠尾草酸對人類神經母細胞瘤 IMR-32 細胞株細胞週期之影響 林家媛1 蔡佳文1*
Effect of Carnosic Acid on the Induction of Cell Cycle Arrest in Human Neuroblastoma IMR-32 Cells
Chia-Yuan Lin1, Chia-Wen Tsai1*
1 Department of Nutrition, China Medical University, Taiwan, ROC
*Corresponding author: Chia-Wen Tsai, Department of Nutrition, China Medical University, Taiwan, ROC. Tel: 886-4-22053366 ext.7521; Fax: 886-4-22062891; E-mail: [email protected]
Running title: carnosic acid induces cell cycle arrest in neuroblastoma cells Figure: 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
摘要 鼠尾草酸(carnosic acid, CA)為迷迭香中的二萜類(diterpene)，由於我們先 前的研究發現 CA 會透過增加活性氧化物質(reactive oxygen species, ROS)而活化 p38 蛋白，以促進人類神經母細胞瘤(neuroblastoma) IMR-32 細胞發生凋亡。因此 本研究欲探討 CA 減少 IMR-32 細胞生長是否與 ROS 和 p38 路徑影響其細胞週 期有關。IMR-32 細胞以 30 μM 的 CA 處理 12-60 小時，流式細胞儀結果顯示在 CA 處理 24 小時後，細胞滯留在 G0/G1 期的比例顯著地增加，而且 CA 隨處理
濃度的增加而降低週期素(cyclins)中的 cyclin D1和 cyclin D3以及週期素激酶
(cyclin-dependent kinases, CDKs)中的 CDK4 和 CDK6 蛋白表現，然而 CA 對於細 胞週期抑制性蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors, CDKIs)中 p21 蛋白的表現卻
隨著濃度的增加而增加。另外，細胞若先處理抗氧化劑 N-
乙醯基半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)或進行 p38 siRNA 實驗，則會抑制 CA 增加 p21 蛋白的能力， 並回復 CA 抑制 CDK4 蛋白的能力。結論：CA 可能透過調節 p21 和 CDK4 蛋白 表現，使 IMR-32 細胞停滯在 G0/G1 期，且此路徑可能與 ROS 和 p38 路徑有關， 因此，CA 未來可能可發展為抵抗神經母細胞瘤的化學預防治療策略。 關鍵字：鼠尾草酸、活性氧化物質、細胞週期、p38 激酶、人類神經母細胞瘤 IMR-32 細胞株 *蔡佳文 通訊地址：中國醫藥大學營養系，台中市學士路91 號 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
ABSTRACT Carnosic acid (CA) is a phenolic diterpene obtained from rosemary (Rosmarinus officinalis). Our previous study indicated that CA induced apoptotic cell death though reactive oxygen species (ROS)-mediated phosphorylation of p38 in human neuroblastoma IMR-32 cells. In this study, we explored whether CA reduced cell viability was associated with cell cycle arrest through ROS generation and p38 pathway. IMR-32 cells were treated with 30 μM CA for 12-60 h. In flow cytometric analysis indicated that cells were significantly arrested in G0/G1 phase when the cells were treated with CA for 24 h (p<0.05). Immunoblotting suggested that CA decreased the levels of cell cycle regulatory proteins such as cyclin D1, cyclin D3, CDK4, and
CDK6 proteins, while increased the level of p21 protein. Pretreatment with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) or p38 siRNA inhibited CA-induced p21 expression, whereas reversed CA-decreased CDK4 expression. In conclusion, CA induced ROS generation and p38 activation, which in turn modulated the protein expression of p21 and CDK4, and induced G0/G1 cell cycle arrest in IMR-32 cells. Therefore, CA may be developed as a therapeutic agent against neuroblastoma.
Key words: carnosic acid, reactive oxygen species,cell cycle, p38 kinase, human neuroblastoma IMR-32 cells
32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
前言 神經母細胞瘤(neuroblastoma, NB)是由神經外胚層(neuroectoderm)細胞發展的 胎兒腫瘤，也是兒童時期常見的惡性固體腫瘤(solid tumor)1，位居兒童癌症發生 率第四。至今NB 的病理機制尚未明瞭，目前臨床上 NB 的化療用藥(包括： cyclophoshamide、doxorubicin 和 cisplatin)，由於 NB 本身具有高度的侵略性和藥 物的抗藥性，約有20-50%病童會出現腫瘤再生(refrcctory)的問題，而降低存活 率。近年來已有許多食材中的植化素(phytochemicals)具有預防腫瘤的作用。乾燥 的迷迭香葉子中，大約含有5%的鼠尾草酸(carnosic acid, CA)和鼠尾草苦內酯 (carnosol, CS)，其化學結構式屬於二萜類(diterpene)2，其生理活性，包括抗氧化、 抗發炎、抗細菌、抗癌以及抗細胞增生等作用。研究指出迷迭香多酚類化合物也 具有誘發細胞週期停滯(cell cycle arrest)的能力，比如 CA 能夠誘發細胞 G0/G1 期停滯而抑制血癌細胞的生長5；CA 抑制細胞週期素 A (cyclin A)蛋白表現，導 致人類大腸癌Caco-2 細胞停滯於 G2/M 期6；而CS 促進人類攝護腺癌 PC3 細胞 G2/M 期停滯則與抑制 cyclin A、D1、D2以及週期素激酶(cyclin-dependent kinase,
CDK) 2 和 6 蛋白表現有關3。然而，CA 是否會透過調控細胞週期來影響人類神 經母細胞瘤的生長仍未釐清，值得進一步探討。 細胞週期可分為四個時期，包含 G1、S、G2 和 M 時期，在真核細胞中，細胞 週期的進行需要透過一系列的cyclins 和 CDKs 彼此協調，才能使細胞週期完整 的進行7。當G1 期的 cyclin D 與 CDK4 結合形成 cyclinD/CDK4 複合物時，此複 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67
合物會活化視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, Rb)，而高度磷酸化的 Rb 能將轉錄因子(early gene 2 factor, E2F)從 Rb-histone acetyltransferase (Rb-HDAC)複合物釋出，驅使細胞週期由 G1 期進入到 S 期8。但是，cyclins/CDKs 大
量的形成複合物，則會使細胞週期過度進行，而導致細胞不正常增生9。為了避
免此現象，就需要細胞週期抑制性蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors,
CDKIs)如：p21，其會直接與 cyclin D/CDK4 複合物結合因而抑制複合物的活性， 使細胞週期無法進入下一個時期，而造成G1 期停滯(G1 phase arrest)10。已有文 獻指出咖啡因能夠抑制cyclin D1/CDK4 複合物的形成，進而導致 G0/G1 期停滯， 並且抑制小鼠皮膚JB6 細胞的生長11；薑辣素([6]-gingerol)增加 p21 蛋白表現與 胰臟癌BxPC-3 細胞 G0/G1 期停滯有關12。 文獻指出植化素能夠抑制癌細胞的生長也與活性氧化物質(reactive oxygen species, ROS)有密切的關係13-15。當植化素促進胞內ROS 形成時，細胞中的 DNA 會遭到破壞，此時細胞週期中的G1/S 或是 G2/M 期檢查點(cell cycle
checkpoints)會被啟動，以檢測損傷的 DNA，等待損傷的 DNA 修復完成後，再
進行DNA 合成，此時細胞週期才能順利的進到下一個時期，然而檢測受損的
DNA 過程中會阻礙細胞週期的往前，而導致細胞週期的停滯16。另外，植化素也
可能透過增加胞內ROS 的生成，促進下游的蛋白質激酶和轉錄因子的活化，而
影響細胞週期的進行17。Mitogen-activated protein kinases (MAPKs)屬於 serine-threonine 的蛋白激酶，其家族成員包括：extracellular signal-regulated kinase 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86
(ERK1/2)、c-Jun N-terminal kinase (JNK)和 p38，其中 ERK 主要參與細胞增生作 用；JNK 和 p38 則與細胞生存、凋亡、分化和發炎反應有關18。已知在十字花科蔬 菜衍生物(Benzyl isothiocyanate, BITC)會藉由誘發 ROS 的生成而活化 ERK 路徑， 以促進人類胰臟癌細胞發生G2/M 期停滯13；大蒜含硫化合物(diallyl trisulfide, DATS)誘發人類攝護腺癌細胞的細胞週期停滯，與促進 ROS 產生，進而上調 JNK 磷酸化有關14；在人類肺腺癌A549 細胞中，釩酸銨(vanadate)處理則會刺激 胞內ROS 的增加，並且誘發 ERK 和 p38 的活化，而促進細胞停留在 G2/M 期15。 在我們最近的研究也發現 CA 可能透過誘發人類神經母細胞瘤 IMR-32 細胞株 的細胞凋亡，而抑制細胞的生長，其調控的機轉與胞內ROS 增加而促進 p38 蛋 白的磷酸化有關19。然而，CA 減少 IMR-32 細胞的生長是否與細胞週期停滯有關 仍未清楚，且ROS 和 p38 路徑對於其細胞週期的進行之角色仍有待釐清，因此， 本研究欲探討CA 是否有可能透過 ROS 和 p38 路徑，影響人類神經母細胞瘤 IMR-32 細胞株的細胞週期進行。 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99
材料與方法
一、細胞培養與處理
IMR-32 細胞為人類神經母細胞瘤細胞株，購自台灣生物資源保存與研究中心 (Bioresources Collection and Research Center, BCRC)。IMR-32 細胞培養在含有 10 % 胎牛血清的 MEM 培養液(2 mmol/L L-glutamine、1.5 g/L sodium
bicarbonate 、0.1 mmol/L non-essential amino acid、1.0 mmol/L sodium
pyruvate 、1105 unit /L penicillin 和 100 mg /L streptomycin)，並將細胞培養在
37℃且含有 5 % CO2培養箱，每兩天更換一次新鮮的MEM 培養液。除此之外，
細胞於加藥處理前12 小時先將培養液更換成含有 2.5% 胎牛血清的培養液，之 後再依不同時間點處理30 μΜ CA 或是加入不同濃度的 CA 培養 24 小時，而控 制組只給予0.1% DMSO 處理。
二、細胞週期分析 (cell cycle analysis)
當 IMR-32 細胞達到七分滿，將細胞液換成無血清的 MEM 培養液，細胞在無 血清的培養液中培養12 小時後，再更換含有 30 μM CA 的 2.5%胎牛血清培養液， 處理12、24、36、48 和 60 小時。細胞處理後，加入 trypsin/EDTA，將細胞從培養 皿上切離，並且收集於離心管，接著以2,000 ×g 離心 5 分鐘，移除上清液，並 且用冰的磷酸鹽緩衝溶液沖散細胞，再進行離心，隨後以冰的70%酒精進行細 胞固定，並且將樣品放置-20℃冰箱。隔天取出樣品，離心去除酒精，用冰的磷 酸鹽緩衝液沖洗細胞，然後將細胞懸浮於propidium (PI)溶液(40 μg/mL PI、0.5% 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119
triton X-100 和 2 mg/mL RNase A)，放置室溫暗反應 30 分鐘，離心移除 PI 溶液， 然後加入冰的磷酸鹽緩衝液製成細胞懸浮液並且過濾，最後利用流式細胞儀 (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)收集 10,000 顆細胞進行分析，所得到的 數據，再以Modfit LT 軟體計算細胞週期各時期的百分率。
三、RNA 干擾現象 (RNA interference)
當 IMR-32 細胞達到八分滿，以 DharmaFECT® siRNA (Thermo Fisher
Scientific, Lafayette, CO)轉染試劑進行 p38 siRNA (100 nmol/L)或是 nontargeting control siRNA 轉染，序列包含 1) GGACCUCCUUAUAGACGAA-3’； 2) 5’-GCACACUGAUGACGAAAUG-3’； 3) 5’-ACACUCGGCUGACAUAAUC-3’以 及 4) 5’-GAAUGUGAUUGGUCUGUUG-3’。細胞轉染 12 小時後，將培養液換成 含有30 μM CA 的 2.5%胎牛血清培養液處理 12 和 24 小時，收取其細胞液以進 行西方墨點法分析。 四、西方墨點法 (Western blotting) 細胞處理後，移除培養液，以冰的磷酸鹽緩衝液清洗，加入 lysis buffer 破細 胞(25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.5 % Triton X-100, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 1mM PMSF, 1 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL aprotinin, and phosphatase inhibitor)，收集細胞液，再以超音波震盪機(Micro Ultrasonic Cell Disrupter, KONTES, Vinelan, NJ)震破細胞，細胞液於 4℃以 14,000 ×g 進行離心 20 分鐘， 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139
所得上清液即為細胞蛋白質液。之後利用Coomassie plus protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL)進行蛋白質定量，取相同量蛋白質的樣品注入 10% SDS-PAGE 進行電泳，並將蛋白質轉漬到 polyvinylidene fluoridemembranes
(Millipore, Bedford, MA)。隨後，將膜放置到 5% 脫脂牛奶的 buffer B (25 mM Tris、150 mM NaCl , pH 7.4)中，於 4℃下進行 blocking。隔天接著與 cyclin D1 、cyclin D3、CDK4 和 CDK6 或是 p15、p21 和 p27 (購自 Cell Signaling
Technology, Beverly, MA)以及 β-tubulin (購自 Sigma Chemical Company, Louis, MO)一級抗體於 4℃反應到隔天。然後，膜再與二級抗體(goat anti-rabbit IgG 或 是goat anti-mouse IgG)反應 1 小時。最後以 Enhanced Chemiluminescence Reagent 呈色，並且使用冷光螢光數位分析儀(LAS-4000, FUJIFILM, Japan)照相分析蛋白 質表現。
五、統計分析
各組實驗分析所得之數據以平均值加減一個標準差(means ± SD)表示，採用 SAS 統計套裝軟體中單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)及 配合 Tukey's test 進行統計分析，當 p 值＜0.05 代表各組之間有顯著差異。 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155
結果 一、鼠尾草酸對人類神經母細胞瘤IMR-32 細胞株細胞週期的影響 CA 的化學結構式如圖一所示。先前研究已發現 CA 能夠顯著地降低 IMR-32 細 胞的存活率，部分可能與細胞凋亡有關，為了探討CA 是否也會影響細胞週期 的進行，因此將IMR-32 細胞在 30 μM CA 處理下，於不同時間點觀察細胞週期 中G0/G1 期、S 期和 G2/M 期的分布。流式細胞儀結果顯示與控制組相比較，細 胞在CA 處理 24 小時後，G0/G1 期細胞的比例顯著的增多，相反地，細胞進到 S 期的比例則顯著的減少，造成大量的細胞堆積在 G0/G1 期。細胞在 CA 處理 24 小時下，其G0/G1 期細胞的比例比控制組相對地增加了 23%，在 60 小時則相對 地增加了34% (p＜0.05)(如圖二)。因此，CA 誘發 IMR-32 細胞中 G0/G1 期的停滯
二、鼠尾草酸對IMR-32 細胞中 cyclins 和 CDKs 以及 CDKIs 的影響
細胞週期中負責調節 G0/G1 期的 cyclins 和 CDKs，包括：cyclin D1和cyclin D3
以及CDK4 和 CDK6 蛋白，為了確認 CA 是否透過調節這些 G0/G1 期的 cyclins 和CDKs 表現，在西方墨點法的結果顯示隨著處理 CA 濃度的增加，cyclin D1和 cyclin D3以及CDK4 和 CDK6 蛋白的蛋白表現則逐漸減少(如圖三)。另外，由於 G0/G1 期的 CDKIs (p15、p21 和 p27)能夠負向調控 cyclin /CDK 複合物的結合， 進而阻斷細胞週期的進行，所以利用西方墨點法分析CA 是否也會影響 CDKIs 的表現。如圖四結果顯示，CA 能夠隨濃度增加而促進 p21 蛋白的表現，但是對 於p15 和 p27 蛋白的表現則不受影響。因此，CA 可能透過上調 p21 蛋白進而抑 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175
制cyclin D1、cyclin D3、CDK4 以及 CDK6 的結合，促進 G0/G1 期停滯。
三、N-乙醯基半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)對鼠尾草酸調節 IMR-32 細胞中 CDK4 和 p21 蛋白的影響 在我們先前的研究已指出細胞預處理抗氧化劑 NAC 能夠阻斷 CA 誘發胞內 ROS 的生成和 p38 蛋白的磷酸化，以達到抑制細胞凋亡的作用。目前我們則繼 續探討CA 調節 G0/G1 期相關調節蛋白的表現是否與胞內 ROS 的生成有關。結 果與單獨處理CA 相比較，預處理 NAC 能夠回復 CA 抑制 CDK4 蛋白的表現和 降低CA 誘發 p21 蛋白的效果(如圖五)。因此，CA 誘發胞內 ROS 的生成與細胞 停滯於G0/G1 期有密切關係。 四、p38 蛋白對 CA 誘發 G0/G1 期停滯扮演的影響 為了近一步確認p38 路徑是否也參與細胞週期的進行，我們利用 p38 siRNA 基因轉殖技術將p38 基因功能喪失，再加入含有 CA 的培養液分別處理 12 和 24 小時，以分析p38 和 CDK4 或 p21 蛋白表現。結果如圖六所示，p38 siRNA 抑制 CA 所誘發的 p38 蛋白磷酸化以及減少 p38 蛋白的表現，表示 p38 siRNA 對 p38 蛋白表現具有專一性的抑制。另外，在轉殖nontargeting control siRNA (si-control)的細胞中，CA 會減少 CDK4 蛋白，並誘發 p21 蛋白，相反地，細胞若 轉殖p38 siRNA (si-p38)，其 CDK4 蛋白表現則部分被回復，而 p21 蛋白則被抑 制。以上結果可知， CA 誘發 IMR-32 細胞發生 G0/G1 期的停滯可能也與 p38 路 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195
徑有關。 196
討論 傳統上抑癌藥物的開發可分為兩種類型，一類是誘發癌細胞的凋亡；另一類 則是干擾癌細胞的細胞週期和細胞分裂，以降低癌細胞的存活率或是增生20，但 是這些抑癌的藥物常伴隨副作用的發生，且影響病患的生活福祉。文獻指示植化 素中的水飛薊素(silibinin)、兒茶素(epigallocatechin 3-gallate，EGCG)和榭皮素能 夠降低cyclin D 和 CDK4 蛋白表現，而促進人類皮膚癌 A431 細胞生長停滯21； 異硫氫酸鹽(isothiocyanates)以及蜂膠素 C (propolin C)阻斷皮膚癌和乳癌細胞中 細胞週期G2/M 期之進行22,23；另外，薑的化合物(diarylheptanoids)誘發 S 期停 滯而延緩SH-SY5Y 和 SK-N-SH 神經母細胞瘤的生長24。除此之外，迷迭香也被 發現具有調控細胞週期的作用，以達到抑制癌細胞增生的效果，比如：CA 和 CS 抑制 cyclin A 蛋白表現，促進大腸癌和攝護腺癌細胞 G2/M 期停滯；CA 阻 斷G0/G1 期的進行而抑制血癌細胞的增生5。而在我們的結果則發現CA 透過增 加胞內ROS 生成19，並活化p38 路徑以抑制 G0/G1 期中 cyclin D 1、cyclin D3、CDK4 以及 CDK6 蛋白的表現，造成 IMR-32 細胞株 G0/G1 期停滯，而降低 細胞生長。 當調節細胞週期的相關蛋白表現異常時，細胞週期的運作則會受到影響，就 可能導致細胞不正常的增生。大部分的癌細胞可能會透過過度地增加cyclins D 或是CDK4 的表現，以至於 cyclin D/CDK4 複合物大量形成並且過度活化，造 成細胞週期中的G1 期不斷地進入到 S 期，而促進癌細胞的生長。許多文章即顯 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215
示植化素可能透過降低cyclin D 或是 CDKs 的表現，而阻礙 cyclin D/CDKs 複合
物的形成，導致G1 期無法進入到 S 期，以阻斷細胞週期。比如：薑辣素會降低
胰臟癌BxPC-3 細胞的 cyclin A、CDK2、CDK4 和 CDK6 蛋白表現12；芹菜素 (apigenin)則會抑制 CDK4 以及 cyclin D1和A 的蛋白量26；另外，白樺榵萃取物
(chaga mushroom)造成 HepG2 肝癌細胞生長停滯則與下調 cyclin D1和CDK4 蛋
白表現有關27。而在本篇研究，CA 的處理能夠下調 IMR-32 細胞的 cyclin D
1和 cyclin D3以及CDK4 和 CDK6 的蛋白表現(圖三)，因此，導致細胞停滯於 G0/G1 期。 除了調節 cyclin D 或是 CDKs 的表現之外，CDKIs 也能夠抑制 CDKs 的活性， 並且阻斷細胞週期的進行。調控G1 期的 CDKIs 有兩大家族：一類為 INK4 家族 (如：p15 和 p16)28；另一類為Cip/Kip 家族(如：p21 和 p27)29。已知，INK4 家族 會與D 型 cyclins 競爭結合到 CDK subunit 的機會，相反地，Cip/Kip 家族則會直 接與cyclin/CDK 複合物結合而造成 G1 期停滯30。文獻指出綠茶中的EGCG 阻斷 細胞週期的進行與促進p21 蛋白表現有關31；雪蓮(saussurea involucrate)能夠誘 發p21 和 p27 表現與抑制 cyclin D1 和 CDK4 蛋白，而導致攝護腺癌 PC-3 細胞 G1 期生長停滯32；而水飛薊素能夠增加p21 表現，而促進前列腺癌 DU145 和 22Rvl 細胞 G1 期停滯，然而，利用 p21 siRNA 基因轉殖則發現水飛薊素誘發 G1 期的停滯被抑制33。在我們結果發現CA 不影響 p15 和 p27 蛋白的表現，卻呈 濃度關係增加p21 的蛋白(圖四)。Long 等人研究則與我們的結果具有一致性，神 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234
經毒素( tri-ortho-cresyl phosphoate)能夠上調 p21 與下調 cyclin D1的RNA 和蛋白 質表現，但是不影響p27 表現，以促進 G1 期停滯，而促進 SH-SY5Y 細胞 G1 期停滯34。同樣地，咖啡因也不會影響p27 蛋白表現，卻增加 p21 表現，以達到 抑制cyclin D1/CDK4 複合物的活性，使小鼠皮膚 JB6 細胞滯留在 G0/G1 期11。因 此，CA 可能藉由增加 p21 蛋白表現與向下調節 cyclin D 和 CDK4 或 CDK6 蛋白， 造成IMR-32 細胞 G0/G1 期停滯。 已有文獻指出 ROS 干擾細胞週期進行的機轉，可能與 MAPKs 路徑的活化有 關，並且進一步增加細胞內p21 表現，p21 再抑制 CDK4 或是 CDK 的活性，造 成Rb 蛋白處於低度磷酸(hypophosphorylated)，而失去磷酸化的 Rb 蛋白則與轉 錄因子E2F 緊密接合，因而抑制下游 DNA 複製相關基因的活化，阻斷細胞週 期由G1 期進入到 S 期，誘發 G0/G1 停滯35。研究發現厚朴酚(honokiol)能夠刺激 人類攝護腺癌PC-3 和 LNCaP 細胞中胞內 ROS 的形成，而降低 cyclin D1 與 CDK4 複合物形成，以抑制 Rb 蛋白磷酸化和 E2F 轉錄活性，導致細胞滯留在 G0/G1 期，但是若細胞預處理 NAC 則會回復細胞週期的進行36。我們先前研究也 發現CA 誘發 IMR-32 細胞 ROS 的產生，並上調 p38 磷酸化，導致細胞凋亡19。 而本研究則發現IMR-32 細胞預處理 NAC 則會減少 CA 對 p21 蛋白的誘發以及 CDK4 蛋白的抑制(圖五)。另外，細胞受到氧化壓力或是環境壓力(如：紫外線或 輻射)會引起 JNK 與 p38 的活化，而上調 p21 表現，以阻斷細胞週期。人參的代 謝產物(compound K)則透過 JNK 路徑，促進 p21 以及抑制 cyclin D 和 CDK4 的 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253
蛋白，而導致人類血癌U937 細胞停留在 G1 期37。釩酸銨誘發ROS 形成並且活 化p38 蛋白，而增加 p21 蛋白，導致 A549 細胞生長停滯15。在我們的實驗中， p38 siRNA 會降低 CA 上調 p21 蛋白表現，且部分地抑制 CA 降低 CDK4 蛋白的 能力(圖六)。因此，這些結果都指出 ROS 與 p38 路徑，可能在 CA 調節 p21 與 CDK4 蛋白表現，而促進 IMR-32 細胞生長停滯於 G1 期，扮演重要的調節角色。 254 255 256 257 258
結論 綜合以上結果得知，CA 抑制 IMR-32 細胞的生長部分可能與 G0/G1 期停滯有 關，其機轉可能與透過ROS 和 p38 路徑，誘發 p21 蛋白以及降低 CDK4 蛋白表 現，而促進細胞停滯於G0/G1 期，以達到抑癌作用，期盼 CA 未來能夠用在人 類神經母細胞瘤的化學預防上。 259 260 261 262 263
致謝 本研究承蒙中國醫藥大學校內計畫(CMU-98-N1-04)經費補助方能如期完成， 特此致謝。 264 265 266
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380 381 382 383
圖表
圖一、鼠尾草酸化學結構式
Fig. 1. Chemical structure of carnosic acid. 384 385 386 387 388 389
圖二、鼠尾草酸對人類神經母細胞瘤IMR-32 細胞株細胞週期的影響
Fig. 2. Effect of carnosic acid on cell cycle progression in neuroblastoma IMR-32 cells. Cells were incubated in serum-free medium for 12 h before CA treatment. Cells then treated with 0.1% dimethylsulfoxide (DMSO) alone (control, －) or with 30 μM of CA for 12, 24, 36, 48, or 60 h. Cell cycle distribution was determined by flow cytometry. Percentage of cells in G1, S, and G2/M phases were calculated using Modfit LT software. Values are shown as the means±SD, n=3. abTreatments at the same phase not sharing a common letter differ significantly, p<0.05.
390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405
圖三、鼠尾草酸對IMR-32 細胞中 cyclins 和 CDKs 蛋白的影響
Fig. 3. Effect of carnosic acid on the protein levels of cyclin and CDK in IMR-32 cells. Cells were exposed with 0.1% dimethylsulfoxide (DMSO) alone (control, －) or with 10, 20, 30, or 40 μMCA for 24 h. The protein expression of cyclin D1, cyclin D3,
CDK4, and CDK6 were examined by Western blotting. One representative immunoblot out of four independent experiments is shown.
406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416
圖四、鼠尾草酸對於IMR-32 細胞中細胞週期抑制性蛋白的影響
Fig. 4. Effect of carnosic acid on the protein levels of cyclin dependent kinase inhibitors proteins in IMR-32 cells. Cells were exposed with 0.1%
dimethylsulfoxide (DMSO) alone (control, －) or with 10, 20, 30, or 40 μMCA for 24 h to determine the protein levels. The protein expression of p15, p21, and p27 were determined by Western blotting. One representative immunoblot out of four
independent experiments is shown. 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430
圖五、N-乙醯基半胱氨酸對鼠尾草酸調節 IMR-32 細胞中 CDK4 和 p21 蛋白的影 響
Fig. 5. Effect of N-acetylcysteine on the protein expression of CDK4 and p21 by carnosic acid in IMR-32 cells. Carnosic acid (CA) caused G0/G1 arrest is associated with the generation of reactive oxygen species (ROS) in IMR-32 cells. Cells were pre-treated with 2 mM antioxidant NAC for 1h followed by treatment with 0.1%
dimethylsulfoxide (DMSO) alone (control, －) or with 30 μMCA for 24 h. The protein expression of CDK4 and p21 were determined by Western blotting. One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446
圖六、基因轉殖 p38-siRNA 對鼠尾草酸調節 IMR-32 細胞中 p38、CDK4 和 p21 蛋白的影響
Fig. 6. Effect of p38-siRNA on the protein expression of p38, CDK4 and p21 by carnosic acid in IMR-32 cells. Cells were transfected with nontargeting control siRNA (si-control) or p38-siRNA (si-p38) for 12 h, and then treated with 30 μMCA for 12 or 24 h. The protein expression of p38, CDK4 and p21 were determined by Western blotting. One representative immunoblot out of three independent
experiments is shown. 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457
