散血草降低四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化; Ajuga bracteosa Reduces Liver Fibrosis Induced by Carbon Tetrachloride in Mice
105
0
0
全文
(2) 致謝辭 這兩年的研究所生涯，感謝恩師林文川教授的細心照顧及指導， 當學生遇到實驗困難時，給予諸多幫助及指引，並給予正向鼓勵，培 養學生閱讀文獻及邏輯思考能力，以利學生實驗及論文的進行，在您 細心指導下學生受益良多，在此致上由衷的謝意。此外，也特別感謝 台灣大學食品科技所沈立言教授以及藥理學科譚思濰副教授，對本篇 論文的審閱及指正，使本論文更加完善。 感謝實驗室焄蓮學姊、麗嬋學姊、佳慈學姊、岳文學長、宏柏學 長、柏齡、思穎、惠詒、瑞琪，對實驗上的協助及關心。感謝藥理學 科譚思濰副教授、湯智昕助理教授、陳玉芳副教授、楊家欣助理教授 及謝文聰副教授在實驗上的協助及指導，技佐柯毅文先生的實驗課堂 上的諸多協助。 感謝基礎醫學所導師馬明琪教授及謝佳宏助理教授的指導及關 心，所辦陳麗如小姐的幫助及鼓勵。感謝基醫所同學們：欣珊、慕恩、 娟秀、松源、承寯，及癌生所聖傑同學在課業及實驗上的幫忙，還要 特別感謝張文鑫同學於求學期間的互相扶持及真情相待，感激不盡。 最後感謝我的父母，給我很多的支持及鼓勵，還有在我求學時， 一直陪伴我的嘉豪，謝謝你的關心及鼓勵，使我順利完成學業。.
(3) 目錄 圖表目錄………………………………………………………………Ⅲ 中文摘要……………………………………………………………Ⅵ 英文摘要………………………………………………………………Ⅷ 第一章. 緒論…………………………………………………………1. 第一節. 研究背景及目的……………………………………………1. 第二節. 散血草相關文獻考察. 一、散血草植物型態………………………………………………4. 二、筋骨草屬化學成分研究………………………………………4. 三、藥理作用………………………………………………………7. 第三節. 肝臟纖維化形成之機制. 一、 肝臟構造……………………………………………………9 二、 肝細胞…………………………………………………………9 三、 庫氏細胞……………………………………………………11 四、 星狀細胞……………………………………………………15 五、 四氯化碳氧化傷害…………………………………………17 第四節 肝臟損傷與發炎相關因子 一、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis α; TNF-α)………………………20 I.
(4) 二、介白素-6 (interleukin-6; IL-6)…………………………………20 三、介白素-10 (interleukin-10; IL-10)……………………………21 四、干擾素-γ (Interferon-γ; INF-γ)………………………………21 五、一氧化氮 (NO)…………………………………………………21. 第二章 散血草對四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化之影響 前言…………………………………………………………………23 材料方法……………………………………………………………23 結果…………………………………………………………………35 討論…………………………………………………………………38. 第三章. 散血草抑制脂多醣誘發小鼠巨噬細胞株活化. 前言…………………………………………………………………58 材料方法……………………………………………………………58 結果………………………………………………………...……….67 討論…………………………………………………………………70 第四章. 結論…………………………………………………………87. 第五章. 參考文獻……………………………………………………88. II.
(5) 圖表目錄 Table 1. Oligonuleotide sequences used in RT-PCR……….…...…...….42 Table 2. Effect of ABEE on LPS-induced cytotoxicity and production of NO in mouse RAW 264.7cells………………….76 Table 3. Effect of ABBE and ABB-AQE on LPS-induced cytotoxicity and production of NO in mouse RAW 264.7 cells…………….77 Table 4. Effect of ABCE and ABC-AQE on LPS-induced cytotoxicity and production of NO in mouse RAW 264.7 cells.................... 78 Fig.1. Effect of ABEE on the activity of plasma ALT in CCl4-treated mice………………...………………………………43 Fig.2. Effect of ABEE on hepatic hydroxyproline in CCl4-treated mice………………………………………………...44 Fig.3. Effect of ABEE on hepatic lipid peroxidation in CCl4-treated mice………………………………………………...45 Fig.4. Effect of ABEE on hepatic content of IL-10 in CCl4-treated mice………………………………………………...46 Fig.5. Effect of ABEE on hepatic content of INFγ in CCl4-treated mice……………………………………………..….47 Fig.6. Histologic analysis of liver fibrosis (Sirius red staining).………..48 Fig.7. Histologic analysis of liver setion (hematoxylin-eosin statin)…...49 Fig.8. Immunostaining of CD14 in the liver section. ……………..…....50 Fig.9. Immunostaining of CD68 in the liver section.………...………....51 Fig.10. Immunostaining of α-SMA in the liver section.……….…….…52 Fig.11. Effect of ABEE on hepatic mRNA expression of LBP, CD14, TNF-α and CD68 in CCl4-treatd mice.……..……..53 III.
(6) Fig.12. Effect of ABEE on hepatic mRNA expression of collagen (α1)(I),and α-SMA in CCl4-treatd mice.…………...….54 Fig.13. Effect of ABEE-induced cytotoxicity in rat Kupffer cells treated with LPS…………………………………………...55 Fig.14. Effect of ABEE on LPS-induced production of NO in rat Kupffer cells. ………………………………………...56 Fig.15. Effect of ABEE on LPS-induced production of TNF-α in rat Kupffer cells.……………………………………..57 Fig.16. Effect of LPS-induced cytotoxicity in mouse RAW 264.7 macrophages…………………………………………………….74 Fig.17. The production of nitric oxide (NO) induced by LPS in mouse RAW 264.7 macrophages.…………………….…………75 Fig.18. Effect of ABCE on LPS-induced production of NO in rat Kupffer cells…........................................................................79 Fig.19. Effect of ABCE on LPS-induced production of IL-6 in mouse RAW 264.7 macrophages………………………………. 80 Fig.20. Effect of ABCE on LPS-induced production of TNF-α in mouse RAW 264.7 macrophages……………………………….81 Fig.21. Effect of ABCE on LPS-induced production of TNF-α in rat Kupffer cell.………………………………………………….82 Fig.22. Effect of ABCE on LPS-induced iNOS protein expressions in RAW264.7 macrophages.……………………………………..83 Fig.23. Effect of ABCE on LPS-induced IκBα and IκBα phosphorylation protein expressions in RAW264.7 macrophages.…...…………..84 Fig.24. Effect of ABCE on LPS-induced NF-κB nuclear translocation in RAW264.7 macrophages.…………………………………..85 IV.
(7) Fig.25. Effect of ABCE on LPS-induced MAPK and MAPK phosphorylation protein expressions in RAW264.7 macrophages.………………………………………………...….86. V.
(8) 散血草降低四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化 摘要. 散血草為民間用藥應用於護肝。本研究主要探討散血草50%酒精 萃取物對四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化的抑制效果。肝臟纖維化之誘 導，小鼠每週以管灌餵食兩次四氯化碳 (10％ 0.1ml/10g BW) 連續八 週。實驗分為正常對照組及四氯化碳三組。四氯化碳三組每日一次經 口投予散血草酒精萃出物(300 mg/kg、1000 mg/kg)或去離子水。四氯 化碳誘導肝纖維化組顯著增加血液中丙氨酸轉移酶活性 (Alanine aminotransferase, ALT)，肝臟脂質過氧化程度及羥基脯胺酸含量，和 四氯化碳組比較，高劑量散血草酒精萃物能降低血液中丙氨酸轉移酶 活性，肝臟脂質過氧化程度及羥基脯胺酸含量。散血草可顯著降低四 氯化碳誘導之肝臟之IL-10、INF-γ的增高。組織染色之分析發現散血 草酒精萃取物能顯著緩解四氯化碳誘導肝臟纖維化、壞死，及減少 CD14及CD68的表現。RT-PCR的分析也顯示散血草酒精萃取物能明 顯降低肝臟 lipopolysaccharide-binding protein(LBP), CD14 , CD68, α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen (α1)(I), tumor necrosis factor-α (TNF-α) mRNA的表現。另外，在大鼠肝臟庫氏細胞以LPS誘導NO模. VI.
(9) 式中，發現散血草酒精萃取物可顯著降低LPS所誘導NO的產生量。 在 RAW264.7 巨噬細胞株研究發現，散血草不同分層萃取物皆有 抑制 LPS 所誘導之 NO 的產生，其中以 CHCl3 萃取物(ABCE)最為顯 著。LPS 可誘導 iNOS、p-IκBα、NF-κB p65、p50 及 MAPK (p-ERK、 p-JNK、pp38)的表現，而 ABCE 能顯著抑制 LPS 所誘導之 NF-κB 及 MAPK 的磷酸化，在 LPS 誘發 24 小時急性發炎後，其細胞上清液中 也發現其 TNF-α、IL-6 的表現量顯著增加，ABCE 可顯著降低此發炎 反應。 ABCE能抑制NF-κB及MAPK的活化，進而影響其下游相關發炎 因子如NO、TNF-α等。因此推測口服散血草酒精萃取物能明顯緩解 四氯化碳誘導的肝臟纖維化，可能是經由抗發炎作用。. VII.
(10) Ajuga bracteosa Reduces Liver Fibrosis Induced by Carbon Tetrachloride in Mice. Abstract Ajuga bracteosa (Labiatae) has been used in traditional folk medicine for its hepatoprotective agent. The purpose of this study was to investigate the effect of 50% ethanol A. bracteosa extract (ABEE) on liver fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl4) in mice. Hepatic fibrosis was produced by CCl4 (10%; 0.1 ml/10 g body weight, p.o.) twice a week for 8 weeks in mice. Mice in the three CCl4 group were treated daily with distilled water and ABEE (300 or 1000 mg/kg) via gastrogavage throughout the experimental period. CCl4 caused liver fibrosis, featuring increase in plasma transaminase, hepatic malondialdehyde (MDA) and hydroxyproline (HP) contents. Compared with CCl4 group, ABEE (1000 mg/kg) treatment significantly decreased the activities of transaminase, hepatic MDA and HP contents. CCl4 treated mice significantly increased the hepatic contents of interferon-γ、 interleukin-10, while ABEE suppressed these mediators of inflammation in liver damage. Histological evaluations showed that ABEE could attenuate the liver fibrosis, necrosis, and expressions of CD14 and CD68 that were induced by CCl4. In addition, RT-PCR analysis also showed that ABEE treatment decreased hepatic mRNA expressions of lipopolysaccharide-binding protein, α-smooth muscle actin, collagen (α1)(I), CD14, CD68 and tumor necrosis factor-α. In addition, ABEE was found to inhibit LPS-induced NO production in rat Kupffer cell. Various fractions of A. bracteosa, especially chloform fraction, were found to inhibit LPS-induced NO production in RAW 264.7 macrophage. A. bracteosa chloroform fraction (ABCE) inhibited the protein expression of iNOS. ABCE reduced phosphorylation of IκBα, NF-κB p65 and p50 protein expressions. In addition, ABCE inhibited phosphorylation mitogen activated protein kinase (MAPKs) protein expressions, including ERK1/2, JNK, and p38. ABCE suppressed the activation of NF-κB and MAPKs, then regulated downstream inflammatory factors such as NO and TNF-α. It is reasonable to suggest that oral administration of ABEE significantly reduced CCl4-induced hepatic fibrosis in mice probably through the anti-inflammatory action.. VIII.
(11) 第一章 緒論 第一節. 研究背景及目的. 肝病在台灣是相當普遍的疾病，號稱「國病」。所有慢性肝炎皆 會轉變成肝臟纖維化，甚至變為肝硬化。根據 97 年行政院衛生署統 計，在十大死因中，慢性肝炎及肝硬化居第八位，台灣每年約有五千 人因慢性肝病及肝硬化死亡。另外，在十大死因中，癌症居第一位， 肝癌在癌症死亡率中佔第 2 位，慢性肝炎如 B 及 C 型肝炎是引起肝 癌的主要危險因子。因此，慢性肝炎的預防與治療在台灣是很重要的 課題。目前肝硬化被認為是不可逆的，現代的藥物對於肝硬化尚沒有 很好的治療效果，僅能針對肝硬化產生的併發症處理，因此研發保肝 的產品，來預防肝炎變為肝硬化是極為重要。 造成肝臟纖維化原因很複雜包括化學性傷害如毒物、藥物濫用， 病毒性肝炎，非酒精性肝炎或酒精性肝炎引起的脂肪肝，這些原因都 可能造成肝臟纖維化的發生，甚至惡化為肝硬化 (Gines et al., 2004)。 庫氏細胞是存在於肝臟的巨噬細胞，長久以來被認為是主要的清 除細胞，負責清除門脈循環來的特殊物質。然而很多的動物實驗結果 顯示庫氏細胞參與很多肝臟疾病如病毒性肝炎、脂肪肝炎、酒精性肝 疾病、膽汁鬱滯、肝臟移殖的排斥及肝纖維化等。很多證據指出，庫 氏細胞是一個影響細胞(effect cell)能放出有害性的媒介物質來對肝細. 1.
(12) 胞造成損傷，在病毒感染的肝臟也拌演著抗原呈現細胞的角色(Kolios et al., 2006)。 肝臟纖維化主要是細胞外基質如膠原蛋白等的沉積，這些細胞外 基質主要由星狀細胞(stellate cell)所產生。在肝臟纖維化的過程首先 要使星狀細胞活化成纖維母細胞來產生膠原蛋白等。其次要抑制分解 細胞外基質的蛋白質分解酵素(matrix metalloproteinases；MMPs) 及 增加 MMP 的抑制劑(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase， TIMP)的產生。TGF-β1 (transforming growth factor β1) 是促使星狀細 胞活化最主要的細胞激素，已知庫氏細胞是 TGF-β1 的主要來源。在 細胞實驗也發現庫氏細胞可以誘發星狀細胞 platelet-derived growth factor (PDGF) 接受體的表現，PDGF 可以促使星狀細胞增生。TGF-β1 也可以影響到 MMP 及 TIMP 的 mRNA 表現 (Kolios et al., 2006)。 四氯化碳誘發小鼠產生肝臟纖維化是常用的動物模式，四氯化碳 受到肝臟的代謝產生自由基造成肝細胞的損傷會活化庫氏細胞 (Luckey and Petersen, 2001)。另外，動物口服投與四氯化碳腸道也會 產生脂多糖(lipopolysaccharide；LPS)，LPS 經門脈進入肝臟活化庫 氏細胞 (Lorenzo-Zuniga, 2006)。已有不少文獻指出抑制庫氏細胞可以 改善肝臟的纖維化(Muriel et al., 2003; Rivera et al., 2001)。 散血草(Ajuga bracteosa)在民間被用於治療咽喉炎、肝炎、跌打. 2.
(13) 損傷、止血、解毒等功效 (邱與張，1992)，也有文獻報導同屬植物 在四氯化碳誘導肝損傷模式中，可抑制其血清 ALT 表現，具有保肝 作用 (馬與黃，2002)。 推測散血草具有抗發炎的效果，也可能經由抑制肝臟發炎而產生 有保肝作用。因此，本研究分成兩個部分，第一部分探討散血草對四 氯化碳誘發小鼠肝纖維的保護功效，並分析肝組織中庫氏細胞活化相 關的基因表現。第二部分以小鼠性巨噬細胞珠RAW 264.7來闡明散血 草抑制巨噬細胞活化所經由的訊息傳遞途徑。這些結果可用為以後開 發保肝健康食品或藥品之依據。. 3.
(14) 第二節 散血草相關文獻考察 一、散血草植物型態 散血草為唇形花科(Lamiaceae)，筋骨草屬(Ajuga)植物，其學名為 Ajuga bracteosa Wall.，別名：有苞筋骨草、筋骨草、石灰菜、八正草、 百症草、白尾蜈蚣(台灣)、九味一枝蒿，分布： 中國大陸、喜馬拉 雅、馬來西亞、非洲，產地：台灣全島平野至中低海拔山區之林緣、 路旁。常有零星藥用栽培。 型態－莖：多年生草本，株高 5~20 公分。葉：葉叢生狀，葉片 匙形至倒披針形，長 5~15 公分，寬 2~5 公分，基部漸狹尖，先端 鈍形或微突尖，波狀緣或略呈疏鋸齒緣，兩面被短毛。花：輪繖花序， 腋生，排列成總狀花序，小花梗長 0.2~0.5 公分，萼筒 2 唇裂，上 唇 3 齒裂，下唇 2 齒裂。花冠管狀，長 0.6~0.8 公分，花冠淡紫色 或白色，上部 2 唇裂，下部較上唇長。雄蕊 4 枚，2 強，花葯 2 室， 柱頭 2 歧。果實：小堅果橢圓形，長 0.12~0.15 公分，表面被網紋， 具臍痕。(邱與張，1992)。. 二、筋骨草屬化學成分研究 筋骨草屬有 40 多種植物，其中 20 多種植物的化學成分已被報 導，此屬含有 80 多種二萜類化合物、30 多種固醇類化合物、20 多. 4.
(15) 種皂苷類化合物、少量黃酮類化合物及其他成分 (李等，2009)。以 下介紹重要的筋骨草屬植物的化學成分，不限於 A. bracteosa Wall。 已 有 文 獻 報 導 散 血 草 (A. bracteos) 含 有 抑 制 lipoxygenase 及 cholinesterase enzymes 的化學成分。抑制 cholinesterase enzyme 的成 分如下 (Riaz et al., 2004)： (一) bracteosin A: (22R)-5β,6β :22,26-diepoxy-4β,28-dihydroxy-3β-methoxyergost-24-e ne-1,26-dione (二) bracteosin B: (22R)-5β,6ββ:22,26-diepoxy-4β,28-dihydroxy-3β-methoxy-1,26-diox oergost-24-en-19-oic acid (三) bracteosin C: (22R)-22,26-epoxy-4β,6β,27-trihydroxy-3β-methoxyergost- 24ene-1,26-dione. 抑制 lipoxygenase enzyme 的成分如下(Riaz et al., 2007)：. 5.
(16) (一) bractin A: (2S,3S,4R,5E)-2-{[(2R)-2-hydroxydodecanoyl]amino}triacont-5-ene1,3,4-triol (二) bractin B: (2S,3S,4R,5E,8E)-2-{[(2R)-2-hydroxyhexacosanoyl]amino}pentadec a-5,8-diene-3,4,15-triol1-O-β-D-glucopyranoside (三) bractic acid: (5Z,10Z,15Z)-2-decyl-4,7,8,12,13,17,18-heptahydroxy-20,23-dioxop entacosa-5,10,15-trienoic acid. 6.
(17) 白毛夏枯草(A. decumbens Thumb)，又稱為筋骨草。全草含新克 羅烷雙萜類. (neoclerodane diterpenes) 化 合 物 ： 金 瘡 小 草 素. (ajugacumbin) A、B、C、D、E、F，筋骨草素 (ajugamarin) 及筋骨 草素 A2、B2、G1、H1、F4。亦含環烯醚萜類 (iridoid) 化合物：白 毛夏枯草甙 (decumbeside) A、B、C、D，雷補妥甙 (reptoside)，8乙酰基哈帕甙 (8-acetyl harpa-gide)。另含固醇類 (sterols)化合物：杯 莧固醇酮 (cyasterone)、蛻皮固醇酮 (ecdysterone)、筋骨草固醇酮 (ajugasterone) B、C，筋骨草內酯 (ajugalactone)。黃酮類化合物：木 犀草 (luteo-lin)。根含筋骨草多糖 (kiransin) (江蘇新醫學院， 1992)。. 三、藥理作用 白毛夏枯草(A. decumbens Thumb.)具有如下作用： (一) 降血壓效果：白毛夏枯草二萜類化合物，在大鼠動物實驗中發 現可降低高血壓大鼠的血壓 (王等， 1996)。 (二) 護肝效果：白毛夏枯草黃酮類化合物，可降低四氯化碳誘導小 鼠肝損傷，其血清 ALT 值可顯著降低 (馬與黃，2002)。 (三) 抑制腫瘤：白毛夏枯草水提液對小鼠腫瘤移植模式，有明顯的 抑制作用 (曾等，2003)，萃取成分中的 iridoid glycoside 及 8-acetylharpagide 對 Epstein-Barr virus 早期抗原有顯著抑制效. 7.
(18) 果，具有抗腫瘤之作用。 (四) 抗骨質疏鬆、抗關節炎：白毛夏枯草能夠降低 NO 合成，達到 抗發炎效果，因而減緩骨質疏鬆和關節炎的情況 (Ono et al., 2008)。 (五) 降血糖：A. iva 水萃物能夠降低糖尿病大鼠的血糖表現 (Hilaly and Lyoussi, 2002)。 (六) 抗菌(黴菌、分枝桿菌)：A. remota 分離之 petroleum ether fraction 有抗黴菌效果 (Kariba, 2001)、ergosterol-5,8-endoperoxide 成份 具有抗分枝桿菌的效果 (Cantrell et al., 1999)。對高血壓大鼠也 有降血壓之功效 (Odek-Ogunde et al., 1993)。 (七) 利膽作用：該屬(Ajuga)植物中的蛻皮固醇酮化合物，具有促進 膽汁分泌作用，且可增加膽汁中膽酸及膽紅素含量，可降低膽 固醇 (劉等，2001；楊，1989)。. 8.
(19) 第三節 肝臟纖維化形成之機制 一、肝臟構造 肝臟是人體最大的器官。其位於右側橫隔膜下腔，成人肝臟重 約1,200 至 1,500 公克，肝臟呈楔形，表現平滑呈暗紅色，由鐮狀韌 帶分左右葉，其結構分為四葉。肝臟從肝動脈和肝門靜脈的雙重供應 血流，肝動脈為細胞供應氧氣及營養，由肝門靜脈的血液獲取大量的 營養物質。肝臟也可透過膽道系統與腸道相連，將肝內代謝產物、毒 素、廢物等可隨膽汁的分泌，經由腸道排出體外。 肝 臟 細 胞 分 為 實 質 細 胞 (parenchymal cells) 及 非 實 質 細 胞 (non-parenchymal cells)。實質細胞主要為肝細胞，佔總數目約 80％， 外觀為不規則多面體，有數個細胞核，非實質細胞主要有兩種，分別 為星狀細胞(hepatic stellate cell)及庫氏細胞(kupffer cell)，另外還包括 膽管細胞(cholangiocyte)、內皮細胞(endothelial cell)等。. 二、肝細胞 人體有許多重要的生理反應皆在肝細胞進行，包括醣類(葡萄 糖)、脂質(脂蛋白、膽固醇、膽汁)、蛋白質(胺基酸、氨)、鐵等營養 的代謝、分泌、儲存及合成等，另外，還有藥物毒物的代謝等 (Ramadori. and Saile., 2005)。 肝細胞功能如下：(1)分泌膽汁：膽汁還包括膽汁酸、磷脂質、膽 9.
(20) 固醇和膽紅素，可促進脂類消化吸收；(2)促進蛋白質的代謝：身體 合成蛋白質的能力，以肝細胞為最強，並且會合成大部分血漿蛋白， 包括白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原、凝血酶原等，促進氨基酸分解及 合成，合成尿素促進毒素代謝等；(3)醣類代謝：調節血中葡萄糖濃 度； (4) 脂肪的代謝：促進脂類的消化吸收，合成膽固醇的重要場 所之一，磷脂、脂蛋白的合成；協助脂溶性維生素的吸收：肝臟有儲 存維生素 A、D、E、K 及 B12 的功能；(5)解毒功能：內源性或外源 性有毒物質，大部分經肝細胞的脫氨作用、羥基化、氧化還原等作用 後失去活性，部分物質經由結合作用後，轉化為可溶物質，以利尿液 或糞便排出等等 (詹，2003；陳，2003)。 肝臟細胞進行許多重要的代謝合成反應，需要多酶來輔助進行， 如丙氨酸轉換酶(Alanine aminotransferase, ALT)、天門冬胺酸轉換酶 (Aspartate aminotransferase, AST)，進行胺基酸代謝產生氨。ALT 即是 GPT (Glutamyl pyrubic transaminase)，主要存在肝臟中，較具肝臟專 一性；AST 即是 GOT (Glutamyl oxaloacetic transaminase)，存在於肝 臟、心臟、骨骼肌中。當肝細胞受損時，AST 和 ALT 會被釋放到血 液中，因此測定其酵素活性，可推測肝臟損傷程度，而此兩項生化檢 驗值被認為是偵測肝損傷之功能重要指標 (Sturgill and Lambert, 1997)。. 10.
(21) 三、庫氏細胞 (一) 庫氏細胞 巨噬細胞依其所在部位的不同，而得到不同的特定名稱，如在 結 締 組 織 稱 為 組 織 細 胞 (histiocytes) ， 在 骨 骼 稱 為 破 骨 細 胞 (osteoclast)，在肺部稱為肺巨噬細胞(alveolar macrophage)，在神經組 織稱為神經膠質細胞(microglia)，在肝臟稱為庫氏細胞(kupffer cell)， 在脾臟稱為竇內襯細胞(Sinusoidal lining cells)，在腎臟稱為系膜細胞 (mesangial cells)。 庫氏細胞，屬於肝臟的巨噬細胞，於 1876 年由 Kupffer 先生首 度在肝臟的竇狀隙發現這些特化的內皮細胞，當時命名為 sternzellen (star cells)，但其他學者為區別庫氏細胞和星狀細胞，改稱呼為庫氏 細胞(kupffer cell) (Haubrich, 2004)。 庫氏細胞大小約 15-20 μm 的不規則型態，細胞上有 70 nm 厚的 茸毛外殼，有 15 nm 的莢膜，貼附於肝臟竇狀隙的內皮細胞上，約佔 肝臟非實質細胞總數的 35％，以門脈區數量最多 (Gregory and Wing , 2002)。庫氏細胞能吞噬廢棄血球細胞，如紅血球和白血球，或細菌 碎片、細菌內毒素等 (Muriel et al., 2001；Muriel and Escobar, 2003； Luckey and Petersen, 2001)。庫氏細胞與慢性肝臟疾病的發炎過程息息 相關，包括外來毒素、酒精等引起之免疫反應、由 B、C 型肝炎病毒. 11.
(22) 引起的免疫反應、肝臟的自體免疫反應等 (Gregory et al., 2002)。 巨噬細胞能清除血液中的一些氧化或醣化蛋白與脂蛋白，其不規 則 細 胞 表 面 大 部 分 與 與 竇 狀 隙 的 血 液 相 接 觸 (Koo, Chaudry and Wang ,1999)。巨噬細胞為身體內具吞噬功能之單核細胞，由骨髓中的 前單核血球（promonocytes）分化而成，當單核球由血液移行進入組 織後，再分化為成熟的巨噬細胞。巨噬細胞只存在於組織並不出現於 血液中，其體積比單核球大，約 25-50μm，外觀卵圓形。巨噬細胞在 免疫及發炎反應上扮演了一個很重要的角色，會分泌製造前發炎 （pro-inflammotory）物質，而在正常生理條件下，巨噬細胞若受到 特定刺激如 LPS 或細胞激素（如 interferon-γ）刺激下，才會被活化 (Schwacha, 2003)。. (二) 庫氏細胞活化 庫氏細胞面對外來毒物如四氯化碳、酒精或內毒素等傷害，會釋 出 細 胞 激 素 或 發 炎 因 子 如 ： Tumor necrosis factor-α (TNF-α) 、 interleukin-6 (IL-6)、interleukin-10 (IL-10)等，促使細胞損傷 (Su, 2002)。當巨噬細胞被刺激活化後，會增加其吞噬能力及大量增殖， 其型態會有改變，實驗上，CD68 經常被用來標定巨噬細胞活化的表 徵 (Roberts et al., 2007；Mandrekar and Dolganiuc, 2007)。 LPS 是格蘭氏陰性菌莢膜產生的毒素，化學結構包含三個部分 12.
(23) (1) O-antigen (2) core (3) lipid A ，其中 lipid A 是 LPS 主要的活性部 位。大鼠給予四氯化碳誘導肝纖維化模式中，發現其血清中有大量 LPS 存在，且會透過 LPS 途徑活化庫氏細胞(Qiu et al. 2005)。LPS 會 透過腸道進入肝臟血流中，引起肝臟損傷，LPS 會與 LPS-binding protein (LBP)在血漿中結合，其中 LBP 由肝臟細胞所生成，與 LPS 形成 LPS/LBP 複合體，可催化 LPS 與庫氏細胞膜上的 CD14 結合， 進而轉移並結合到 Toll-like receptor-4 (TLR-4)，最後才將訊息傳入細 胞內，刺激發炎因子如 superoxide radicals、TNF-α 的產生，導致肝臟 的傷害 (Wheeler, 2003)。許多研究已證實 LPS 可活化許多訊息的傳 遞途徑，主要有 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB )及 Mitogen-activated protein (MAP) kinases( MAPK ) 兩 種途徑 (Mi Jeong et al., 2009；Kim et al., 2007b； Kim et al., 2007a)。 NF-κB 在發炎反應中扮演的角色：目前在哺乳動物中，NF-κB 可 分為五種不同型態：Rel (c-Rel)、Rel A (p65＆NF-κB3)、Rel B、NF-κB1 (p50) 、 NF-κB2 (p52) 。 NF-κB 由 不 同 次 單 元 體 組 成 為 同 二 聚 體 (homodimers)或是異二聚體 (heterodimers)，以 p65/p50 異二聚體形式 存在最為常見，並具有強力的轉錄活性(Teng et al., 2006)。細胞在未 受刺激下，細胞質中的 p65/p50 會和抑制其活性的 Inhibitor of kappa B (IκB)結合。而 IκB 會阻擋 NF-κB 的 nuclear localization signal (NLS)，. 13.
(24) 使其無法進入核內，而停留在細胞質中。IκB 家族分為 IκBα、 IκBβ、 IκBγ、IκBε 及 Bcl-3，其中主要的蛋白為 IκBα。NF-κB 在非活化狀態 時是和 inhibitor of kappa B (IκB)結合為複合體，並存在細胞質中，若 受到刺激活化後，IκBα 會被 IκB kinase (IKK)磷酸化，接著 IκBα 被 26S proteasome 進行 Ubiquination 作用而分解，使 NF-κB 與 IκB 結合 分開，進而活化 NF-κB 異二聚體進入核內，影響下游基因的發炎或 免疫反應(Makarov, 2000；Moynagh, 2005)。目前已知可活化 NF-κB 因子包括：細胞激素或生長因子如 IL-1、TNF-α 及 TNF-β 等；細菌 產物如：LPS；病毒產物如：EBV；壞死性刺激如：H2O2 等(Teng et al., 2006)。 Mitogen-activated protein kinase (MAPK)是 serine/threonine 的 protein kinases，可調控細胞增殖、分化、凋亡或細胞間質堆積等， MAPK pathway 包括 MAP kinase kinase kinase (MKKK or MAP3K)、 MAPK kinase kinase (MKK, MEKK, or MAP2K),、MAP kinase (MAPK) 等三類主要傳遞細胞內訊息之蛋白質。MAPK 活化之路徑主要先經由 MKKK 磷酸化 MKK，而 MKK 再磷酸化 MAPK，MAPK 再繼續活化 細胞質或細胞核的下游蛋白使其磷酸化，最後再與 DNA 結合進行傳 訊。在 MAPKs 家族中大致可分為三大類，extracellular responsive kinase (ERK1 and ERK2；p44/42)、C-Jun N-terminal kinase (p46/54；. 14.
(25) JNK 1/2 and 3；JNKs)、 p38 Kinases。MAPKs 會參與不同的細胞反 應：ERK 主要是參與細胞的增殖、分化及調控細胞週期進行等；JNKs 主要是參與細胞凋亡、壓力及發炎反應等，而 p38 MAPK 其主要調控 免疫、發炎反應及對細胞激素的影響等作用(Johnson and Lapadat, 2002)。此三條路徑，皆可調控發炎相關因子(Herlaar and Brown, 1999)。研究顯示 MAPK 可調控發炎相關蛋白免疫反應或是刺激細胞 激素的分泌如：TNF-α、IL-1β、IL-6 等(Hommes, Peppelenbosch and van ,2003)，LPS 誘導 MAPK 活化的模式中，MAPK 被活化後，可調 控下游 inducible nitric oxide synthase (iNOS)表現(Kim et al., 2007b)。. 四、 星狀細胞 肝臟星狀細胞 (Hepatic Stellate Cell)， 1951 年 Ito 學者在人類肝 臟細胞切片中發現有儲存脂肪滴的細胞(Willcox, 1952)，Suzuki 氏在 迪氏腔發現外型似星狀的細胞，故而得名(Wake, 1980)。星狀細胞約 佔肝細胞總數之 5-8％，與肝細胞比例約 13：100，可儲存維生素 A， 故又稱作 fat-storting cell、vitamine A rich cell 等(Geerts, 2001)。 在正常情況下，星狀細胞處於靜止期，負責細胞外間質的維持， 當肝臟受到傷害，則星狀細胞會受到生長因子或發炎激素的刺激，開 始增生和製造膠原蛋白，會導致發炎細胞和活化態的星狀細胞聚集， 而促使星狀細胞成為活化狀態，其主要分泌的細胞外間質為膠原蛋白 15.
(26) 第一及第三型，並以第一型的量為最多(Geerts et al., 1991)，而組成膠 原蛋白的主要特殊成分為羥基脯胺酸(hydroxyproline)，可反應纖維化 的程度(Dang et al., 2007；Fang, Lai and Lin ,2008)，當肝臟受到損傷， 星狀細胞會被活化來進行修復，是造成肝臟纖維化形成的重要細胞 (Friedman, 2000)。 活化態的星狀細胞骨架蛋白，主要是 desmin、α-smoth muscle actin(α-SMA)，其中 α-SMA 是所有活化態星狀細胞都會表現，視為星 狀細胞活化程度的重要指標(Geerts et al., 1991)，其為肝臟纖維化的主 要原因之一。 肝臟纖維化主要是肝臟的慢性損傷合併細胞外間質的過度堆 積。造成肝臟纖維化原因包括化學性傷害如毒物、藥物濫用，病毒性 肝炎，非酒精性肝炎或酒精性肝炎引起的脂肪肝，這些原因都可能造 成肝臟纖維化的發生。而肝臟纖維化後，細胞外間質的堆積會破壞肝 細胞的架構，且傷害一直持續，會進一步轉為肝硬化。肝硬化嚴重時 會造成門脈高壓和肝功能衰竭甚至死亡(Gines et al., 2004)。 當肝臟受損時，這些竇狀隙週遭的細胞會產生變化 (圖一.)，內 皮細胞受損，肝細胞表面的微絨毛減少，而庫氏細胞活化後分泌促發 炎細胞激素，促使發炎細胞聚集，且肝臟星狀細胞被活化產生疤痕組 織，內皮細胞間的孔隙消失，造成細胞外基質堆積這些改變造成肝臟. 16.
(27) 損傷及纖維化 (Friedman, 2000)。. 圖一.Sinusoidal events during fibrosing liver injury (Friedman, 2000).. 五、 四氯化碳氧化傷害 四氯化碳誘導肝臟損傷的方法，被廣泛使用在動物模式中。四氯 化碳導致肝損傷的機轉主要是藉由肝臟內質網上的 cytochrome P450 系統中的代謝酵素，主要為 CYP2E1，其次為 CYP2B1 及 CYP2B2 將四氯化碳代謝為三氯甲烷自由基 (trichloromethyl) CCl3· 及更具活 性之 CCl 3 OO·(trichloromethylperoxy)，進而造成脂質過氧化 或導致蛋白質合成受阻，並引起肝損傷 (McGregor and Lang ,1996) (圖二.)。其中三氯甲烷自由基還會經由鹵烷化作用，使得核酸突變、 蛋白質減少甲基化、脂質堆積，進而造成肝臟損傷，除了使粒線體膜 17.
(28) 的脂質氧化，影響粒線體的結構及功能外，也會造成肝細胞中鈣離子 的失衡、生物膜的破壞等等，最後導致肝細胞纖維化、壞死(Weber, Boll and Stampfl, 2003)。四氯化碳會促使組織損傷，造成庫氏細胞活化， 釋出細胞激素或氧化物質等，因此，庫氏細胞活化被認為是四氯化碳 誘導肝損傷過程中的主要因素(Luckey and Petersen, 2001；Muriel et al., 2001；Muriel and Escobar, 2003；Fang et al., 2008)。 四氯化碳在工業上作為脫脂劑及有機溶劑。有人提出四氯化碳會 誘導大鼠肝硬化的形成 (Cameron, 1936)。經由口服的給藥方式，應 用於慢性肝損傷誘導模式，在組織學可觀察到組織會出現肝細胞壞 死、變性，合併嚴重纖維化。. 18.
(29) 圖二、四氯化碳代謝途徑 (McGregor and Lang, 1996). 19.
(30) 第四節 肝臟損傷與發炎相關因子 一、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis α; TNF-α) TNF-α 主要由單核球細胞和巨噬細胞所分泌出來，TNF-α 是一 種具有多種功效的細胞激素，包括抗腫瘤和病毒、調節免疫和發炎等 反應。TNF-α 在低濃度的情況下，扮演細胞保護的角色，但是分泌過 多反而會導致細胞的損傷，而 TNF-α 在肝損傷過程中扮演一重要的 角色，TNF-α 與肝臟的壞死有直接的關聯性且也會使血清轉胺酶升高 (Bruccoleri et al., 1997)。之前研究指出四氯化碳誘導肝臟損傷會代謝 為三氯甲烷自由基，造成活化庫氏細胞並釋出 TNF-α，在肝臟或血清 中都可發現 TNF-α 升高 (DeCicco et al., 1998)。TNF-α 也會藉由活化 庫氏細胞，因而刺激細胞激素及 iNOS 的生成 (Morio et al., 2001)。. 二、介白素-6 (interleukin-6; IL-6) IL-6 是一種多效能的細胞激素，由巨噬細胞、T 細胞或內皮細胞等 所分泌(Gregory et al., 1998)。其功能包括參與急性期反應、細胞分 化、免疫反應、肝細胞再生等。肝臟中主要是由星狀細胞及巨噬細胞 分泌，當 IL-6 過度表現可能導致肝纖維化的發生 (Heinrich, Castell and Andus, 1990)。研究發現在肝損傷情況下，TNF-α 及 IL-6 會顯著 增加，並促使 NF-κB 基因的轉錄作用(Kovalovich et al., 2000； Elsharkawy and Mann, 2007)。 20.
(31) 三、介白素-10 (interleukin-10; IL-10) IL-10 主要由巨噬細胞、第二型輔助型 T 細胞 (T helper 2) 、巨 細胞(mast cells)、肝細胞及肝臟星狀細胞產生 (Moore et al., 1990)。 IL-10 可抑制發炎反應 NF-κB 的活化，降低吞噬細胞產生促發炎 激素如 TNF-α、IL-6、IL-12；具有抑制第一型輔助型 T 細胞之活化作 用(Williams et al. 2004)。IL-10 抗發炎機轉主要藉由抑制 Th1 細胞產 生干擾素-γ，達到抗發炎作用 (Wang et al., 1998)。研究指出以四氯化 碳誘發肝損傷模式中，在 IL-10 基因悌除 小鼠中，其肝臟損傷、發 炎及纖維化情況比正常小鼠更為嚴重，因此可推斷 IL-10 存在下，可 調控肝纖維化程度(Louis et al., 1998)。. 四、 干擾素-γ (Interferon-γ; INF-γ) INF-γ 主要由 CD4+ Th1 細胞、CD8+細胞、NK 細胞產生，扮演活 化淋巴球的角色，有抗微生物和抗腫瘤的作用。在肝臟纖維化中， INF-γ 是很重要的細胞激素，在動物實驗模式中，許多研究顯示 INF-γ 可抑制星狀細胞活化及細胞外基質的產生(Rockey et al., 1992；Rockey and Chung, 1994；Baroni et al., 1996)。. 五、 一氧化氮 (NO) NO 具有多種活性的自由基，由 NO 合成性酵素合成，依 NO 合. 21.
(32) 成性酵素之不同，可分為三種亞型，分別為 eNOS (endothelial NOS)、 nNOS (neuronal NOS)、 iNOS (inducible NOS)。而 iNOS 只有在發炎 刺激情況下才會被誘發，其負責產生大量 NO，毒殺標地細胞，因此 iNOS 的表現與免疫保護與防衛功能密切關連。許多血管細胞，例如 巨噬細胞、平滑肌細胞、纖維母細胞等，皆會受到發炎激素刺激誘導 iNOS 產生 (Luoma and Yla-Herttuala, 1999)。NO 在低濃度情況下，具 有保護功效，但大量產生會造成傷害。在 LPS 誘導巨噬細胞活化的 模式中， LPS 可促使多種的發炎媒介物如 TNF-α、interleukins 及 NO (Harris et al., 2006) 分泌。. 22.
(33) 第二章. 散血草對四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化之影響. 前言. 四氯化碳誘導肝臟脂質過氧化，與慢性肝損傷、肝臟纖維化 有很密切的關係 (Poli, 2000)，當損傷持續存在，肝臟纖維化可能 惡化為肝硬化，甚至成為肝癌，因此，要抑制肝臟纖維化的程度， 必須阻斷肝臟發炎的反應。 在之前研究已知同屬植物(Ajuga decumbens Thumb.)有護肝 效果，可降低四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷 (馬與黃，2002)，但 其作用機轉並不清楚。本研究目的在於釐清散血草是否可減緩四 氯化碳誘導之慢性肝炎，產生肝纖維化，並瞭解其相關作用機轉。. 材料與方法 一、 散血草的製備 散血草購自台中市漢強青草藥行，經本校中藥資源學系郭昭麟副 教授鑑定。散血草乾品 1.6 公斤以 50%酒精溫浸(80℃) 24 小時，兩次， 濾液經減壓濃縮至乾後，以去離子水複溶適當濃度(570 mg/ml, 800 ml)，萃出物重 456 公克，萃取率為 28.5%。投予小鼠時，以去離子. 23.
(34) 水稀釋成濃度 100 mg/ml 、30 mg/ml，小鼠每 10 公克體重投予 0.1ml， 即投予劑量為 1000 mg/kg 和 300 mg/kg，以下簡稱為 ABEE。. 二、 藥品試劑 編 名稱. 廠牌. 1.. Carbon Tetrachloride. OSAKA. 2.. Olive oil. Wako. 3.. ALT kit（GPT 分析套組）. Roche. 4.. HCl. Sigma-Aldrich. 5.. NaOH. Sigma-Aldrich. 6.. CuSO4. Sigma-Aldrich. 7.. H2O2. Roche. 8.. p-dimethylaminobenzaldehyde. Sigma-Aldrich. 9.. Sodium dodecyl sulfate (SDS). Sigma-Aldrich. 10.. Acetic acid. Sigma-Aldrich. 11.. Thiobarbituric acid. Sigma-Aldrich. 12.. n-butanol. Sigma-Aldrich. 13.. Pyridine. Sigma-Aldrich. 14.. Coomassie Blue. Sigma-Aldrich. 15.. H2SO4. Fluka. 16.. Enzyme-link immunosorbent assay kit (IL-10). BioScience. 17.. Enzyme-link immunosorbent assay kit. BioScience. 號. 24.
(35) (INF-γ) 18.. KCl. Wako. 19.. CD14 antibody. Santa cruz. 20.. CD68 antibody. Abbiotec. 21.. Alcohol. Panreac. 22.. Diamiobenzidine (DAB). Sigma-Aldrich. 23.. Xylene. Scharlau chemie. 24.. Trizol. Invitrogen. 25.. Chloroform. Showa. 26.. Isopropanol. Scharlau Chemie S.A.. 27.. DEPC water. Biotecx. 28.. dNTP Mix. GeneMark. 29.. MMLV RT. GeneMark. 30.. Oligo dT primer. GeneMark. 31.. PCR master Mix Kit. GeneMark. 32.. 6 × DNA Loading Dye. GeneMark. 33.. Gen-50 DNA Ladder. GeneMark. 34.. Agarose Ι. Amresco. 35.. TBE buffer. Amresco. 36.. Ethidium Bromide (EtBr). Fermentas. 37.. Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM). HyClone. 38.. MTS. Promega. 39.. Lipopolysaccharides. Sigma-Aldrich. 40.. Griess Reagent. Sigma-Aldrich 25.
(36) 41.. Pentobarbital. Sigma-Aldrich. 42.. Collagenase type IV. Sigma-Aldrich. Percoll 50%： 43.. 44.. 45.. 46.. Dissolve 0.35 g NaHCO3 (4 mM final) in 400 ml water and add 500 ml of 100% Percoll and 100 ml of 10× HBSS pH to 7.4 Heparin. GE Healthcare. Sigma-Aldrich. HBSS (Hanks’ balanced salt solution): 8 g NaCl (138 mM final) 0.4 g KCl (5.4 mM final) 0.091 g Na2HPO4·7H2O (0.3 mM final) 0.06 g KH2PO4 (0.4 mM final) 1 g dextrose (5.6 mM final) 0.2 g MgSO4·7H2O (0.8 mM final) 0.185 g CaCl2·7H2O (1.26 mM final) 0.35 g NaHCO3 (4 mM final) Add H2O to 1 liter Adjust pH to 7.4. Amresco Merck J.T. Baker Wako Katayama chemical Wako Merck Merck. CMF-HBSS (Ca2+and Mg2+free Hanks’ balanced salt solution ). 三、 設備器材 編 名稱. 廠牌. 1.. Spectrophotometer. Hitachi. 2.. PCR system 9700. A＆B（Applied. 號. 26.
(37) Biosystems） AlphaDigDocTM（影像擷取與分析系 3. 統）. Alpha Innotech Coporation. 4.. CoBAS MIRA PLUS （生化儀）. Roche. 5.. KUBOTA 3500 （離心機）. KUBOTA. 6.. TOA pH meter HM-5S. TOA Electronics. 7.. Microplate Reader Model 550. Bio-RAD. 8.. Electronic balance AB104. Mettler toledo. 四、 動物 實驗動物選用 ICR 小鼠，體重 25-30g，購買自樂斯科生物科技 公司。餵養環境維持 22 ± 2℃，相對溼度 55 ± 5%，半日照環境，採 自由飲水及攝食。. 五、 四氯化碳誘導之慢性肝毒性 小鼠每週兩次經口服給予四氯化碳 10%(溶於橄欖油)，為期八 週，投予體積為每 10 克體重給予 0.1 ml。將小鼠分成控制組(n = 6) 及四氯化碳組。四氯化碳組又分成三組，每組 8 隻，三組以四氯化碳 誘導肝臟纖維化，每天分別經口給予一次水或 ABEE (300、1000 mg/kg body weight) ，每週秤體重一次。四氯化碳與實驗藥物的投予時間， 27.
(38) 需相隔 5 小時以上。投藥滿八週後犧牲動物時，快速取下肝臟，浸泡 在冰冷生理食鹽水中，洗淨擦乾水分後，將肝臟分成五個部分，第一 部份浸泡在 10%中性福馬林中，以供病理切片用；第二部份測定羥基 脯胺酸；第三部份存於液態氮，供蛋白質或 RNA 之分析；第四及第 五部分冰凍於–80℃，以供後續實驗使用。. 六、 肝功能測試 動物投藥滿八週後，小鼠以乙醚麻醉，用 1 ml 針筒由下腔靜脈 採血，將全血收集至含有 heparin 潤滑的微量離心管中，在室溫下， 4700 rpm 離心 10 分鐘分離出血漿。使用 ALT 試劑，以自動分析儀 器檢測 ALT 活性。. 七、 肝臟羥基脯胺酸含量測定 參考 Neuman 和 Logan (1950)的方法，測定肝臟羥基脯胺酸含量。 秤取肝臟約 0.3 克，於 100℃隔夜烘乾，將乾燥的肝臟組織秤重後， 放入玻璃試管中，加入 3 ml 的 6N HCl 置於 100℃烘箱中，加以完全 水解。待冷卻後，取樣品 1ml 至微量離心管， 10000 rpm 離心 30 分 鐘。取 0.1 ml 的上清液，以 1N NaOH 中和水解產物，每管分別加入 1 ml CuSO4 (0.01M)、NaOH (2.5N)、H2O2 (6%) 震盪後靜置反應 5 分 鐘，促進氧化還原反應。之後以 80℃加熱 5 分鐘，去除多餘過氧化. 28.
(39) 物。冷卻至室溫，再加入 2 ml 5﹪P-dimethylaminobenzaldehyde 及 4 ml 3 N H2SO4，劇烈震盪均勻後，再放入 70℃水浴 16 分鐘反應呈色， 以分光光度計於 540 nm 測量吸光值。表示單位為 μg hydroxypoline/g 肝臟重。. 八、 肝臟脂質過氧化(Lipid peroxidation)產物檢測 肝臟脂質過氧化測定參考(Ohkawa, et al., 1979)等人的方法。秤取 肝臟組織約 0.3 克，加入 3 ml 的 1.15% KCl 溶液，以均質機均質化後， 取 0.2 ml 之上清液，分別加入 0.2 ml sodium dodecyl sulfate (8.1%)、 1.5 ml acetic acid (20%)、1.5 ml 2-Thiobarbituric acid (0.8%`)，並加入 一次水使最終體積為 4ml，以 99℃水浴 1 小時，待冷卻後，加入 4 ml N-butanol/pyridine 混合液(15：1，v/v)，劇烈震盪數十秒後，以 4℃ 4000g 離心 10 分鐘，取有機層以分光光度計 532nm 測量吸光值。組織同時 依照 Congdon 等人(1993)之 Coomassie Blue 蛋白質定量法，測定肝 臟組織蛋白質含量，以胎牛血清(Bovine derum akbumin)蛋白為標準 品。脂質過氧化單位以 nmol malondialdehyde (MDA)/mg protein 表示。. 九、 肝臟組織之細胞激素 IL-10、INF-γ 之測定 細 胞 激 素 測 定 採 用 Enzyme-link immunosorbent assay kit (BioScience) 分析。將肝臟組織秤取約 0.3 克，加入 3 ml 1.15% KCl ，. 29.
(40) 以均質機均質後，取 1 ml 於微量離心管，以 3000 rpm 4℃離心 5 分 鐘，之後取上清液及細胞激素標準液，加入預先 coating 及 blocking 的 96 孔盤中，置於室溫 2 小時，再以 Phosphate Buffered Saline Tween 20 (PBS-T)清洗 3-5 次，再加入 detection antibody ，置於室溫 1 小時， 接著以 PBS-T 清洗 3-5 次，加入 Horse Radish peroxidase ，室溫作用 30 分鐘，再以 PBS-T 清洗後，加入 Subatrate，置於室溫 15 分鐘，使 其呈色，最後加入 H2SO4 ，終止反應，呈現黃色，再以 ELISA reader 偵測 OD 450 nm 吸光值。濃度以標準曲線求得之。. 十、肝臟病理檢驗 取肝臟最大葉 1/3 浸泡 10% 福馬林固定後，脫水後，進行石臘 包埋及切片，再以蘇木青與伊紅染色法(Hematoxylin and Eosin stain) 和天狼猩紅(Sirius red)染色，供評估肝臟組織病變及纖維化程度分 析，纖維化程度之百分比以影像分析軟體(Image-pro plus)分析。 將肝臟切片進行 CD14、CD68 及 α-SMA 之免疫組織化學染色。 其方法是將切片烘乾後，進行復水步驟，以 5％脫脂奶粉阻斷非特異 性反應 30 分鐘，之後加入一級抗體(1:200)在 4℃反應 16 小時，以 PBS-T 清洗後，加入 3％H2O2 去除內源性過氧化酶，反應 10 分鐘後， 以 PBS-T 清洗，而後加入二級抗體室溫反應 30 分鐘，再利用免疫偵 測套組及 diaminobenidine 呈色，再以蘇木紫染色，脫水、封片後， 30.
(41) 以光學顯微鏡觀察即可。. 十一、RT-PCR 分析 (一) 肝臟組織 RNA 的萃取 取 0.1 g 的肝組織加入 1 ml trizol 試劑，使組織粉碎均質化，於 4℃、6400 rpm 條件下離心 10 分鐘。取上清液加入 0.2 ml chloroform 萃取 RNA，劇烈震盪 15 秒後，靜置冰上 3 分鐘，於 4℃、12700 rpm 離心 15 分鐘，取上清液加入 0.5 ml isopropanol 使 RNA 沉澱， 上下搖晃後，靜置冰上 10 分鐘，於 4℃、12700 rpm 離心 10 分鐘。 移除上清液，留下沉澱物，再加入 75％酒精後，靜置於-30℃冰箱 30 分鐘。於 4℃、10000 rpm 離心 5 分鐘，再倒掉上清液，加入適量 Diethyl pyrocarbonate (DEPC)溶解。於波長 260 nm / 280 nm 測定吸光值，換 算其濃度。 (二) 合成 cDNA cDNA 的製備主要採用 MMLV Reverse Transcriptase (first-strand cDNA synthesis） 。取 1 μg mRNA 加入 2.5μl 10×MMLV RT buffer、0.6 μl MMLV RT、5 μl dNTP、2.5 μl 0.1M DTT、1 μl oligo dT primer，混 合後於 37℃反應 60 分鐘，之後立即置於冰上。 (三) 聚合酵素反應(Polymerase Chain Reaction,PCR） 利用 PCR Master Mix 套組，將特定 cDNA 量化。取去離子水 9.5 31.
(42) μl、PCR Master Mix 12.5 μl、10mM primer 各 1 μl、cDNA 1 μl 。 (四) DNA 電泳分析 取 PCR 產物 5 μl，加入 1μl 6X DNA loading dye，以 2％洋菜膠 及混合 Ethidium Bromide，以 100 伏特電泳進行分離，在暗箱以紫外 光照射，再用影像分析軟體(AlphaDigi Doc 1201)分析。採用的 primer 序列如 Table 1。. 十二、分離大鼠肝臟庫氏細胞測定 NO 及細胞存活率 依據 Froh, Konno and Thurman (2002)的方法分離，步驟如下： 實驗步驟: (一) 分離庫氏細胞 1. 取老鼠，將老鼠稱重。 2. 將老鼠用 pentobarbital (50 mg/kg )進行麻醉，利用腹腔注射的方式。 3. 待老鼠麻醉完全，從尾巴靜脈的位置進行注射 heparin，適量即可。 4. 將老鼠全身以 95%酒精進行消毒，用剪刀進行剖腹並將導管插入 肝門靜脈，用止血夾子固定。 5. 用 Ca2+ and Mg2+ free Hanks’ balanced salt solution (CMF-HBSS；詳 細配方見藥品試劑) 進行灌流 (溫度保持在 37 度，並適時的攪拌)， 流速保持在 20 ml/min，將下腔靜脈遠端的位置剪斷，使血液能夠 流出。 32.
(43) 6. 將下腔靜脈固定，使灌流液能夠充分灌流，並反覆按摩，接著開 胸腔剪破心臟，等待肝臟充分灌流。 7. 更換灌流液體 HBSS 進行灌流，並加入 0.02%的 collagenase type IV。 8. 待肝臟消化完全後，將肝臟剪下放到培養盤上面，用 HBSS 進行 沖洗，並用剪刀輕柔剪碎。 9. 利用 nylon gauze 來過濾沒有消化完全的部份和結締組織。 10. 將過瀘之後的細胞液，加入 Hanks’ balanced salt solution ( HBSS 詳細配方見藥品試劑) 至 50 ml 進行離心。 11. 70 g, 4℃ 離心 3 分鐘 (離心完的細胞液，須至於冰上)。 12. 將上清液取出至另一個新的離心管，加 HBSS 至 50 ml，並與另一 管的 pellets 也加 HBSS 至 50 ml， 進行 70×g, 4℃離心 3 分鐘。 13. 將離心後的細胞液，取出上清液至新的離心管，補 HBSS 至 50 ml 再於 650×g, 4℃離心 7 分鐘。 14. 去除不要的上清液，再將 pellets 重新 suspension 加入 HBSS 10 ml。 15. 加 10 ml 的 pellets 加到 50% 25%的 percoll 離心管 (最下層為 50% percoll 20 ml，接著緩慢的加入 25% percoll 20 ml 避免 50% 25% percoll 混合，之後再加入 10 ml 的細胞液) 最後要有分層的出現。 16.在 1800×g , 4℃離心 15 分鐘 (不可減速，避免梯度混淆)。. 33.
(44) 17. 小心吸除出最上層的上清液(此層為碎片、死細胞)，將第二層和第 三層的上清液(多屬非實質細胞)，分別的集中至新的離心管，加入 HBSS 至 50 ml，在 650×g, 4℃ 離心 7 分鐘。 18. 移除上清液，留下 pellets，加入 HBSS 至 5-10 ml 進行沖洗，將多 餘的 percoll 清洗乾淨，300×g, 4℃離心 5 分鐘 (最大減速)，移除上 清液，再重新加入 5 ml-10 ml 的 HBSS 之後進行細胞計數。 19. 接著將取出的庫氏細胞計數，細胞種於 96 孔盤中，每 well 種度 3×105 細胞， 20~30 分鐘後，讓庫氏細胞貼附後，再洗掉其他細胞。 20. 庫氏細胞貼附 24 小時後才可進行實驗。 (過程當中須完全無菌的狀態下，所有器具須先經過滅菌). (二) 細胞實驗步驟 將細胞種於 96 孔盤中，每孔 100 μl 培養液控制細胞數目 3×105， 加入不同濃度的 ABEE (600-1000 μg/ml)培養 1 小時後，加入刺激物 LPS (0.1 μg/ml)，於 37℃，5% CO2 培養箱中培養 48 小時後，取出上 清液 50 μl 加入 Griess reagent 等體積溶液呈色後，以 540 nm 測吸光 值，定量亞硝酸根離子(Nitrite)濃度。 將每孔上清液吸乾後，加入 100 μl 培養液，再加入 20 μl/well [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophe nyl)-2H-Tetrazolium] (MTS) 試劑， 靜置 1-2 小時。以波長 490 nm 測. 34.
(45) 定吸光值，計算細胞的存活率(Cell viability)。存活率 (%)= (試驗組吸 光值/對照組吸光值) x 100％。 另外，將細胞上清液保存，測定 TNF-α 含量，採用 ELISA kit 分析。將細胞上清液 5 倍稀釋，均勻震盪後取出 100 μl 加入預先 coating 及 blocking 的 96 孔盤中，置於室溫 2 小時，再以 PBS-T 清洗 3-5 次， 再加入 detection antibody ，置於室溫 1 小時，接著以 PBS-T 清洗 3-5 次，加入 HRP，室溫作用 30 分鐘，再以 PBS-T 清洗後，加入 Subatrate， 置於室溫 15 分鐘，使其呈色，最後加入 H2SO4 終止反應，呈現黃色， 再以 ELISA reader 偵測 OD 450 nm 吸光值。濃度以標準曲線求得之。. 十三、統計方法 數據結果以平均值(mean) ± 標準差(Standard deviation, SD)表 示，各組與對照組間的數據，以單因子變異數分析(One-way ANOVA) 方法分析，並進行 Dunnett 測試，以 P 值小於 0.05 表示在統計學上 具有顯著差異。 結果. 一、對血清 ALT 影響 投藥滿八週後，犧牲小鼠採血，血漿部份測定 ALT 活性。四氯 化碳組的 ALT 值與控制組比較有顯著增加，ABEE 低劑量 300 mg/kg. 35.
(46) 和高劑量 1000 mg/kg 組別，皆能顯著降低四氯化碳誘導的 ALT 上升 (Fig.1)。 二、羥基脯胺酸含量 四氯化碳誘導八週後，肝臟羥基脯胺酸含量與控制組比較有顯著 增加，而投予 ABEE 低劑量 300mg/kg 和高劑量 1000 mg/kg 組別，其 肝臟羥基脯胺酸含量與四氯化碳組比較有顯著的降低 (Fig. 2)。 三、脂質過氧化產物分析 四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化，結果顯示四氯化碳組脂質過氧化 產物含量比控制組高。ABEE 低劑量 300 mg/kg 和高劑量 1000 mg/kg 組別能夠顯著降低四氯化碳誘導的脂質過氧化 (Fig. 3)。 四、細胞激素含量 四氯化碳誘導八週後，犧牲取肝臟均漿測試 IL-10 及 INF-γ 濃度。 四氯化碳組肝臟的 IL-10 及 INF-γ 表現和控制組比較是明顯升高。 ABEE 組別皆能降低四氯化碳所誘導的 IL-10 及 INF-γ 濃度(Fig. 4、 5)。 五、肝臟組織切片染色及免疫化學染色分析 肝臟病理切片的觀察顯示，經由天狼星紅染色分析肝臟纖維化分 佈佔肝組織的百分比，發現四氯化碳組引發的肝臟纖維化程度較為嚴 重，而投予 ABEE 高劑量的纖維化程度和四氯化碳組比較有顯著的降. 36.
(47) 低 (Fig. 6)。 肝臟的損傷程度及型態觀察，經由蘇木精和伊紅染色得以判讀， 投與四氯化碳八週之小鼠，其組織細胞有廣泛浸潤、壞死的現象，投 予高劑量的 ABEE 則可明顯改善肝臟受損情況(Fig. 7)。 經由 CD14 及 CD68 免疫組織化學染色分析肝臟庫氏細胞活化的 情況，結果顯示四氯化碳組會誘導 CD14 及 CD68 之表現，而 ABEE 高劑量組的 CD14 及 CD68 表現顯著低於四氯化碳組(Fig. 8、9 )。另 外，由 α-SMA 免疫組織化學染色分析肝臟星狀細胞活化情況，結果 顯示四氯化碳會誘導 α-SMA 之表現，而 ABEE 組的 α-SMA 表現顯著 低於四氯化碳組(Fig. 10) 六、RT-PCR 結果 結果如 Fig. 11-12 所示，肝臟 LBP、CD14、CD68、TNF-α、 collagen(α1)(I)及 α-SMA 的量化結果，顯示四氯化碳組肝臟之 LBP、 CD14、CD68、TNF-α、collagen(α1)(I)、α-SMA 的表現較控制組皆顯 著提高。ABEE 高劑量的 mRNA 表現，與四氯化碳組比較皆有顯著 的降低。 七、大鼠肝臟庫氏細胞之 NO、細胞存活率及 TNF-α 細胞激素含量之 測定 將大鼠庫氏細胞，96 孔盤分別加入 LPS 0.1 μg/ml 或前處理 1 小. 37.
(48) 時 ABEE，待 48 小時後，結果顯示 LPS 可誘發 NO 的增加，ABEE 具濃度(200-1000 μg/ml)依存性抑制 NO 的釋出，且對於細胞存活率並 無影響(Fig. 13、14)。另外，在 TNF-α 細胞激素含量測定，結果顯示 ABEE 具濃度 (200-1000 μg/ml) 依存性抑制 TNF-α 的釋出 (Fig. 15)。. 討論. 在本實驗中，主要是探討 ABEE 對四氯化碳慢性肝炎誘導小鼠肝 纖維化的保護效果。結果顯示 ABEE 能降低四氯化碳所誘導的小鼠肝 纖維化，其作用機轉之一是藉由抑制發炎作用，而達到抑制纖維化的 效果。 ALT 主要存在肝臟中，當肝細胞受損時，會被釋放到血液中，因 此測定其酵素活性，可推測肝臟損傷程度，為是偵測肝損傷之功能重 要指標 (Sturgill and Lambert, 1997)。在小鼠給予四氯化碳八週的實驗 中，結果顯示四氯化碳組 ALT 顯著增高，而 ABEE 低劑量或是高劑 量的組別皆有顯著降低 ALT 的表現，另外，在蘇木精和伊紅組織染 色分析可發現四氯化碳組別肝臟有廣泛壞死、發炎、浸潤的情況，反 之，給予 ABEE 高劑量的組別，可發現肝臟發炎、壞死的區域有顯著 降低(Fig.7)，這些結果可證實 ABEE 可降低肝臟的損傷程度。 肝臟纖維化是細胞外間質不正常的堆積，尤其是膠原蛋白增生，. 38.
(49) 膠原蛋白主要的特別成分為羥基脯胺酸，常被用來表示纖維化程度的 分析 (Dang et al., 2007；Fang et al., 2008)。本實驗，ABEE 能夠降低 四氯化碳誘導羥基脯胺酸的增加，在組織 Sirius red 染色，也可發現 ABEE 能夠降低肝臟纖維化程度(Fig. 6)，因此，可推斷 ABEE 能夠降 低肝臟纖維化的程度。 四氯化碳會產生自由基攻擊細胞膜，使肝臟產生脂質過氧化，脂 質過氧化有多種產物，其中以 malondialdehyde (MDA)最容易定量 (McGregor and Lang, 1996)，在實驗中發現，ABEE 能夠降低四氯化 碳所誘導的脂質過氧化程度 (Fig. 3)，顯示 ABEE 能降低自由基的傷 害。 過去研究發現，大鼠給予四氯化碳誘導肝纖維化模式中，其血清 中有大量 LPS 存在，能經由 LPS 途徑活化庫氏細胞(Qiu et al., 2005)。 LPS 會透過腸道進入肝臟血流中，與 LBP 在血漿中結合，形成 LPS/LBP 複合體，進一步與庫氏細胞膜上的 CD14 結合，進而轉移並 結合到 Toll-like receptor-4 (TLR-4)，最後才將訊息傳入細胞內，刺激 發炎因子如 superoxide radicals、TNF-α，導致肝臟的傷害 (Wheeler, 2003)。之前研究指出四氯化碳會活化庫氏細胞並釋出 TNF-α，在肝 臟或血清中都可發現 TNF-α 升高 (DeCicco et al., 1998)。庫氏細胞被 外來物刺激活化後，其型態會有改變，實驗上，CD68 經常被用來標. 39.
(50) 定巨噬細胞活化的表徵 (Roberts et al., 2007；Szabo et al., 2007)。本實 驗發現 ABEE 能降低 LBP、CD14、CD68、TNF-α 的 mRNA 的表現 量(Fig. 11)，免疫組織染色也證實 ABEE 能夠降低四氯化碳所誘導 CD14 及 CD68 的表現(Fig. 8、9)，這些結果證實 ABEE 能夠降低四氯 化碳誘導巨噬細胞的活化，降低發炎的反應。 庫氏細胞面對外來毒物會釋出 TNF-α、IL-10 等細胞激素，造成 細胞損傷 (Su, 2002)。而 TNF-α 也會藉由活化庫氏細胞，因而刺激細 胞激素及 iNOS 的生成 (Morio et al., 2001)。在四氯化碳誘導肝臟損傷 模式中，INF-γ 會上升。在 INF-γ 基因惕除小鼠也發現，對由四氯化 碳誘導的肝損傷情況有減緩的效果 (Horn et al., 2000；Neubauer et al., 2008)。IL-10 為抗發炎因子，抗發炎機轉主要藉由抑制 Th1 細胞產生 INF-γ，達到抗發炎作用 (Wang et al., 1998)，有文獻指出，在四氯化 碳誘導下，大鼠肝臟的 IL-10 表現顯著增加 (Yu et al., 2004)。本實驗 結果顯示四氯化碳誘導八週模式中，四氯化碳會誘導 IL-10、INF-γ 的增加，ABEE 能夠降低四氯化碳誘導肝臟的 IL-10、INF-γ 含量的增 加(Fig. 4、5)，在大鼠分離的巨噬細胞實驗中，也發現 ABEE 能夠降 低 LPS 所誘發 NO 及 TNF-α 的釋出(Fig. 14、15 )。根據這些結果可推 論，四氯化碳誘導小鼠肝炎模式中，ABEE 能夠降低發炎反應， 四氯化碳誘發肝臟發炎，進而活化星狀細胞，促使細胞外基質堆. 40.
(51) 積，造成膠原纖維的增生，以第一型的量為最多，而活化態的星狀細 胞骨架蛋白，主要是 α-SMA，α-SMA 是所有活化態星狀細胞都會表 現，視為星狀細胞活化程度的重要指標 (Geerts et al., 1991；Geesin et al., 1991)。在本實驗，ABEE 能夠降低 α-SMA 及第一型膠原蛋白的 mRNA 表現(Fig. 12)，且在免疫組織染色的結果也顯示 ABEE 能夠降 低四氯化碳誘導 α-SMA 之表現 (Fig. 10)，證實 ABEE 能夠抑制星狀 細胞活化因而減緩纖維化的堆積。 由大鼠肝臟分離出初代庫氏細胞，ABEE 明顯抑制 LPS 誘發初代 庫氏細胞 NO 的產生。另外，在小鼠的實驗，ABEE 能降低肝臟 LBP 的 mRNA 表現。這些結果說明了 ABEE 能抑制四氯化碳誘發小鼠肝 炎的機轉，部分是直接抑制庫氏細胞活化。除此之外，也能經由降低 腸道 LPS 進入肝臟，減輕肝臟發炎。. 41.
(52) Table 1. Oligonuleotide sequences used in RT-PCR mRNA. Sequence. Product Annealing Cycle size temperature (bp) (℃). LBP. F:ACCCTTGACCTGGACTTGAC R:ACAGTGCCCGCTCTTAAAGT CD14 F:CCTAGTCGGATTCTATTCGGAGCC R:AACTTGGAGGGTCGGGAACTTG CD68 F:ATGGACAGCTTACCTTTGGATTCA R: TGCCTGTGGGAAGGACACAT TNF-α F:CTCAGCGAGGACAGCAAGG R:AGGGACAGAACCTGCCTGG Collagen F:GGTCCCAAAGGTGCTGATGG I(α1) R:GACCAGCCTCACCACGGTCT α-SMA F:CTGCTCTGCCTCTAGCACAC R:TTAAGGGTAGCACATGTCTG GAPDH F: TGTGTCCGTCGTGGATCTGA R: CCTGCTTCACCACCTTCTTGA. 42. 127 bp. 56. 35. 375 bp. 58. 38. 98 bp. 54. 40. 108 bp. 57. 40. 174 bp. 64. 35. 138 bp. 56. 40. 76 bp.
(53) ALT. 2000. ###. ALT(U/dL). 1800 1600 1400. **. 1200. **. 1000 800 600 400 200 0. Control. H2O. ABEE 300 mg/kg. ABEE 1000 mg/kg. CCl4. Fig. 1. Effect of ABEE on the activity of plasma ALT in CCl4-treated mice. All values are means ± S.D. (n=6-8).. ###. P < 0.001 compared with control. group. **P < 0.01 compared with CCl4 + H2O group.. 43.
(54) Hydroxyproline (μg/g tissue). 700. ### 600. ***. 500. ***. 400. 300. 200. 100. 0. Control. ABEE 300 mg/kg. H2O. ABEE 1000 mg/kg. CCl4. Fig. 2. Effect of ABEE on hepatic hydroxyproline in CCl4-treated mice. All values are means ± S.D. (n= 6-8).. ###. P < 0.001 compared with control. group. ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group. 44.
(55) Malondialdehyde (nmol/mg protein). 4. ### 3 **. **. 2. 1. 0. Control. ABEE 300 mg/kg. H2O. ABEE 1000 mg/kg. CCl4. Fig. 3. Effect of ABEE on hepatic lipid peroxidation in CCl4-treated mice. ###. All values are means ± S.D. (n= 6-8). P < 0.001 compared with control group. **P < 0.01 compared with CCl4 + H2O group. 45.
(56) IL-10. IL-10 (pg/mg protein). 700. # 600. 500. 400. ** 300. 200. 100. 0. Control. H2O. ABEE 300 mg/kg CCl4. ABEE 1000 mg/kg. Fig. 4. Effect of ABEE on hepatic content of IL-10 in CCl4-treated mice. #. All values are means ± S.D. (n= 6-8). P < 0.05 compared with control group. **P < 0.01compared with CCl4 + H2O group.. 46.
(57) INF-γ. INF-γ (pg/mg protein). 18. #. 16 14 12. *. *. 10 8 6 4 2 0. Control. ABEE 300 mg/kg. H2O. ABEE 1000 mg/kg. CCl4. Fig. 5. Effect of ABEE on hepatic content of INFγ in CCl4-treated mice. #. All values are means ± S.D. (n= 6-8). P < 0.05 compared with control group. *P < 0.05 compared with CCl4+ H2O group.. 47.
(58) A. B. C. D. liver fibrosis (%). 16. Sirius red stainig. E. ###. 14 12 10. ***. ***. 8 6 4 2 0. Control. H2O. ABEE ABEE 300 mg/kg 1000 mg/kg CCl4. Fig. 6. Histologic analysis of liver fibrosis (Sirius red staining). (A) control group; (B) CCl4+ H2O group, showing micronodular formation and complete interconnection of septa with each other; (C) CCl4+ABEE 300 mg/kg group; (D) CCl4+ABEE 1000 mg/kg group.(100X); (E) Histogram representing image-quantitation of the mean percentage collagen fibers/totalslide area. All values are means ± S.D. (n= 6-8). ###P < 0.001 compared with control group. ***P < 0.001 compared with CCl4 + H2O group.. 48.
(59) A. B. C. D. Fig. 7. Histologic analysis of liver setion (hematoxylin-eosin statin). (A) control group; (B) CCl4 + H2O group, showing inflammatory cell infiltration and necrosis; (C) CCl4+ABEE 300 mg/kg group; (D) CCl4+ABEE 1000 mg/kg group. (100X). 49.
(60) A. B. C. D. Fig. 8. Immunostaining of CD14 in the liver section. (A) control group; (B) CCl4 + H2O group, CD14 positive cells expressing; (C) CCl4+ABEE 300 mg/kg group; (D) CCl4+ABEE 1000 mg/kg group.(100X). 50.
(61) A. B. C. D. Fig. 9. Immunostaining of CD68 in the liver section. (A) control group; (B) CCl4 + H2O group, CD68 positive cells expressing; (C) CCl4+ABEE 300 mg/kg group; (D) CCl4+ABEE 1000 mg/kg group.(100X). 51.
(62) A. B. C. D. Fig. 10. Immunostaining of α-SMA in the liver section. (A) control group; (B) CCl4 + H2O group, α-SMA positive cells expressing; (C) CCl4 + ABEE 300 mg/kg group; (D) CCl4+ABEE 1000 mg/kg group.(100X). 52.
(63) LBP/GAPDH. CD14/GAPDH. 800. ##. #. Relative mRNA level(%). Relative mRNA level(%). 250. 200. 600. 150. *. 400. 100. *. 200. 50. 0. 0. Control. H2O. ABEE 300 mg/kg. ABEE 1000mg/kg. Control. H 2O. CCl4. CD68/GAPDH. TNF-α/GAPDH. 400. ##. 1000. ABEE 1000mg/kg. CCl4. Relative mRNA level(%). Relative mRNA level(%). 1200. ABEE 300mg/kg. 800. 600. 400. ** 200. 0. ## 300. 200. **. **. ABEE 300 mg/kg. ABEE 1000 mg/kg. 100. 0. Control. H2O. ABEE 300 mg/kg. ABEE 1000 mg/kg. Control. H 2O. CCl4. CCl4. Fig. 11. Effect of ABEE on hepatic mRNA expression of LBP, CD14, TNF-α and CD68 in CCl4-treatd mice. All values are means ± S.D. (n = 6-8). ### P< 0.001, #P< 0.05 compared with control group.**P< 0.01, * P< 0.05 compared with CCl4+H2O group.. 53.
(64) Collagen-1/GAPDH. Relative mRNA level(%). 1600. ### 1400 1200 1000 800 600. ***. 400 200 0. Control. H 2O. ABEE 300 mg/kg. ABEE 1000 mg/kg. CCl4. αSMA/GAPDH. Relative mRNA level (%). 300. ### 250. 200. 150. ***. ***. 100. 50. 0. Control. H2O. ABEE 300 mg/kg. ABEE 1000 mg/kg. CCl4. Fig. 12. Effect of ABEE on hepatic mRNA expression of collagen (α1)(I),and α-SMA in CCl4-treatd mice. All values are means ± S.D. (n = 6-8). ### P< 0.001 compared with control group.***P< 0.001compared with CCl4+H2O group.. 54.
(65) 160 140. viability(%). 120 100 80 60 40 20 0. Control. LPS. ABEE ABEE ABEE 1000 μg/ml 600 μg/ml 200 μg/ml LPS (0.1 μg/ml). Fig.13. Effect of ABEE-induced cytotoxicity in rat Kupffer cells treated with LPS. All values are means ± S.D. (n = 3). 55.
(66) 25. ###. Nitrite (μM). 20. 15. *** ***. 10. 5. 0. Control. LPS. ABEE ABEE ABEE 200 μg/ml 600 μg/ml 1000 μg/ml LPS (0.1μg/ml). Fig.14. Effect of ABEE on LPS-induced production of NO in rat Kupffer cells. All values are means ± S.D. (n = 3).. ###. P < 0.001 compared with control. group. ***P < 0.001 compared with LPS group.. 56.
(67) TNFα 300. ##. TNF-α (pg). 250. 200. 150. **. 100. 50. 0. Control. LPS. ABEE ABEE ABEE 200 μg/ml 600 μg/ml 1000 μg/ml LPS (0.1μg/ml). Fig.15. Effect of ABEE on LPS-induced production of TNF-α in rat Kupffer cells. ##. All values are means ± S.D. (n=3). P < 0.01 compared with control group. **P < 0.01compared with LPS group.. 57.
(68) 第三章. 散血草抑制脂多醣誘發小鼠巨噬細胞株活化. 前言. 在第二章實驗中，顯示散血草能夠經由抑制庫氏細胞活化， 降低發炎反應，進而減緩星狀細胞所導致的肝臟纖維化。因此，進一 步使用小鼠巨噬細胞株 RAW264.7，探討散血草抑制 LPS 誘發發炎反 應所經由的途徑。許多研究已證實 LPS 可活化許多訊息的傳遞主要 有 NF-κB pathway 及 MAPK pathway (Mi Jeong et al. 2009, Kim et al. 2007b, Kim et al. 2007a)，因此，本章研究目的主要探討此兩條路徑之 作用機轉。. 材料與方法. 一、散血草分層萃出物的製備 萃出物之順序如圖三所示，將前章製備的散血草水萃液 700 ml (400 公克) 以下簡稱為 ABEE，以適量正丁醇(butanol)分層兩次，正 丁醇層及水層分別減壓濃縮，得正丁醇層 87 公克，水層 305 公克， 以下簡稱為 ABBE 及 ABB-AQE。取正丁醇萃出物 50 公克複溶於水， 以氯仿(chloroform) 進行分層兩次，氯仿層及水層分別減壓濃縮，得 氯仿層 13.5 公克(ABCE)，水層 35 公克，以下簡稱為 ABCE 及 58.
(69) ABC-AQE 。 於 實 驗 時 ， 不 同 分 層 的 萃 出 物 溶 於 適 量 的 dimethyl sulfoxide (DMSO). Ajuga bracteosa 50% EtOH (ethanol) EtOH layer (ABEE) BuOH (butanol) H20 layer BuOH layer (ABB-AQE) (ABBE) CHCl3 (Chloroform) CHCl3 layer (ABCE). H20 layer (ABC-AQE). 圖三、散血草分層製備流程. 二、藥品試劑 編 名稱. 廠牌. 1.. Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM). HyClone. 2.. MTS. Promega. 3.. Lipopolysaccharides (Escherichia coli serotype 0128-B12). Sigma-Aldrich. 4.. Griess Reagent. Sigma-Aldrich. 5.. Coomassie blue dye. Sigma-Aldrich. 號. 59.
(70) 6.. SDS. Amresco. 7.. 40% Acrylamide. Amresco. 8.. Tris base. Sigma-Aldrich. 9.. APS(ammonium persulfate). Amresco. 10.. TEMED. Amresco. 11.. Tween 20. Sigma-Aldrich. 12.. ECL reagent. Invitrogen. 13.. Sodium chlodide. Amresco. 14.. iNOS. Abcam. 15.. p-IκB. Cell signaling. 16.. IκB. Cell signaling. 17.. NF-κB p65. Cell signaling. 18.. NF-κB p50. Santa cruz. 19.. PCNA. Santa cruz. 20.. pp38. Abcam. 21.. p38. Abcam. 22.. p-ERK. Santa cruz. 23.. ERK. Abcam. 24.. p-JNK. Abcam. 25.. JNK. Abcam. 26.. α-tubulin. Abcam. 27.. Anti-rabbit. Santa cruz. 28.. Anti-goat. Santa cruz. 29.. Anti-mouse. Santa cruz. 60.
(71) PD98059 (ERK)、SB203580(JNK)、 30.. Sigma-Aldrich. SP600125 (P38) (MAPK inhibitor). 三、儀器設備 編 名稱. 廠牌. Spectrophotometer. Hitachi. 號 1.. AlphaDigDocTM（影像擷取與分析系 2 統）. Alpha Innotech Coporation. 3.. CoBAS MIRA PLUS （生化儀）. Roche. 4.. KUBOTA 3500 （離心機）. KUBOTA. 5.. TOA pH meter HM-5S. TOA Electronics. 6.. Microplate Reader Model 550. Bio-RAD. 7.. Electronic balance AB104. Mettler toledo. 四、細胞培養與繼代培養 將 RAW 264.7 培 養 於 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 培養液中，內含 10％ 胎牛血清、100 U/ml penicillin、100 μg/ml streptomycin 和 0.25 μg/ml amphotericin。培養環境以 37℃，5% CO2 培養。細胞約 2-3 天繼代一次，將培養皿中舊的培養液吸掉，以 61.
數據
+7
Outline
相關文件
To proceed, we construct a t-motive M S for this purpose, so that it has the GP property and its “periods”Ψ S (θ) from rigid analytic trivialization generate also the field K S ,
The nanostructure with anisotropic transmission characteristics on ITO films induced by fs laser can be used for the alignment layer , polarizer and conducting layer in LCD cell.
Myers effect condensation of mean field D(-1) Chern Simons term is induced. Fuzzy sphere is
• QCSE and band-bending are induced by polarization field in C-plane InGaN/GaN and create triangular energy barrier in active region, which favors electron overflow. •
Optim. Humes, The symmetric eigenvalue complementarity problem, Math. Rohn, An algorithm for solving the absolute value equation, Eletron. Seeger and Torki, On eigenvalues induced by
The significant and positive abnormal returns are found on all sample in BCG Matrix quadrants.The cumulative abnormal returns of problem and cow quadrants are higher than dog and
A revolution: Probability propagation in networks with cycles, Jordan, Kearns and Solla (eds), Advances in Neural Information Processing Systems 10, MIT Press.
Unless prior permission in writing is given by the Commissioner of Police, you may not use the materials other than for your personal learning and in the course of your official
