前言
在第二章實驗中，顯示散血草能夠經由抑制庫氏細胞活化，
降低發炎反應，進而減緩星狀細胞所導致的肝臟纖維化。因此，進一 步使用小鼠巨噬細胞株RAW264.7，探討散血草抑制 LPS 誘發發炎反 應所經由的途徑。許多研究已證實LPS 可活化許多訊息的傳遞主要 有NF-κB pathway 及 MAPK pathway (Mi Jeong et al. 2009, Kim et al.
2007b, Kim et al. 2007a)，因此，本章研究目的主要探討此兩條路徑之 作用機轉。
材料與方法
一、散血草分層萃出物的製備
萃出物之順序如圖三所示，將前章製備的散血草水萃液 700 ml (400 公克) 以下簡稱為 ABEE，以適量正丁醇(butanol)分層兩次，正 丁醇層及水層分別減壓濃縮，得正丁醇層 87 公克，水層 305 公克，
以下簡稱為ABBE 及 ABB-AQE。取正丁醇萃出物 50 公克複溶於水，
以氯仿(chloroform) 進行分層兩次，氯仿層及水層分別減壓濃縮，得
ABC-AQE。於實驗時，不同分層的萃出物溶於適量的 dimethyl sulfoxide (DMSO)
圖三、散血草分層製備流程
二、藥品試劑
編 號
名稱 廠牌
1. Dulbecco’s modified eagle’s medium
(DMEM) HyClone
2. MTS Promega
3. Lipopolysaccharides (Escherichia coli
serotype 0128-B12) Sigma-Aldrich 4. Griess Reagent Sigma-Aldrich 5. Coomassie blue dye Sigma-Aldrich
Ajuga bracteosa
50% EtOH (ethanol)
EtOH layer (ABEE)
BuOH (butanol)
H20 layer(ABB-AQE)
BuOH layer (ABBE)
CHCl3 layer (ABCE)
CHCl
3(Chloroform)
H20 layer(ABC-AQE)
6. SDS Amresco 7. 40% Acrylamide Amresco
8. Tris base Sigma-Aldrich
9. APS(ammonium persulfate) Amresco
10. TEMED Amresco
11. Tween 20 Sigma-Aldrich
12. ECL reagent Invitrogen 13. Sodium chlodide Amresco
14. iNOS Abcam
15. p-IκB Cell signaling
16. IκB Cell signaling
17. NF-κB p65 Cell signaling
18. NF-κB p50 Santa cruz
19. PCNA Santa cruz
20. pp38 Abcam
21. p38 Abcam
22. p-ERK Santa cruz
23. ERK Abcam
24. p-JNK Abcam
25. JNK Abcam
26. α-tubulin Abcam 27. Anti-rabbit Santa cruz
28. Anti-goat Santa cruz
29. Anti-mouse Santa cruz
30.
PD98059 (ERK)、SB203580(JNK)、
SP600125 (P38) (MAPK inhibitor)
Sigma-Aldrich
三、儀器設備
編 號
名稱 廠牌
1. Spectrophotometer Hitachi
2
AlphaDigDocTM（影像擷取與分析系 統）
Alpha Innotech Coporation
3. CoBAS MIRA PLUS （生化儀） Roche 4. KUBOTA 3500 （離心機） KUBOTA 5. TOA pH meter HM-5S TOA Electronics 6. Microplate Reader Model 550 Bio-RAD
7. Electronic balance AB104 Mettler toledo
四、細胞培養與繼代培養
將 RAW 264.7 培 養 於 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 培養液中，內含 10％ 胎牛血清、100 U/ml penicillin、100 μg/ml streptomycin 和 0.25 μg/ml amphotericin。培養環境以 37℃，5%
CO2 培養。細胞約 2-3 天繼代一次，將培養皿中舊的培養液吸掉，以
PBS 清洗一次，再用培養液將細胞沖洗下來，置於 15 ml 離心管中，
於室溫下300g 離心 5 分鐘，留下沉澱物，加入適量培養液將細胞均 勻打散，細胞計數後，將1 × 106細胞加入新鮮的培養液於10 公分培 養皿中，置於37℃，5% CO2 培養。
五、一氧化氮測定(Nitric Oxide Assay) (一) 原理
一氧化氮(NO)是一種滲透性的氣體，由精胺酸 (L-arginine) 受到 NOs作用所產生。當不穩定的NO產生時，迅速的在組織中會氧化成 穩定的產物亞硝酸 (nitrite) 或硝酸 (nitrate)，可利用 Griess reagent
進 行 呈 色 反 應 反 應 ， 其 原 理 是N i t r i t e 會 和 A r o m a t i c A m i n e Sufanilamide 在 Acid form 下 形 成 Diazonium Salt ， 再 與 3-Hydroxy-1.2.3.4-Tetrahydro-7.8-Benzoquinoline 形 成 紅 色 的 AZO Dye。
(二) 實驗步驟
將 RAW 264.7 細胞種於 96 孔盤中，每孔 100 μl 控制細胞濃度 1×104，加入散血草不同分層萃取物 30 分鐘後，再加入刺激劑 LPS (1μg/ml)，於 37℃，5% CO2培養箱中培養24 小時後，取出上清液 50 μl 加入 Griess reagent 等體積溶液呈色後，以 540 nm 測吸光值，定
另外，將庫氏細胞種於 96 孔盤中，每孔 100 μl 培養液控制細胞 數目3×105，加入不同濃度的ABCE (25-100 μg/ml)培養 1 小時後，加 入刺激物LPS (0.1 μg/ml)，於 37℃，5% CO2培養箱中培養 48 小時後，
取出上清液50 μl 加入 Griess reagent 等體積溶液呈色後，以 540 nm 測吸光值，定量亞硝酸根離子，並計算濃度。
六、MTS 分析 (Cell viability assay)：
(一) 原理
MTS 分 析 是 一 種 檢 測 細 胞 存 活 和 生 長 的 方 法 ， 化 學 名 為 [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulfop henyl)-2H-Tetrazolium]。 是 依 據 活 細 胞 粒 線 體 內 的 琥 珀 酸 脫 氫 酶 ( succinate dehydrogenase)會與 MTS 反應，將 MTS 中的 tetrazolium salt 還原為暗紫色 formazan，顏色會由淡黃色變成暗紫;而死細胞的粒 線體不具此功能 。利用此特性，以酵素免疫自動分析儀(ELISA reader)
於波長492 nm 讀取吸光值，細胞的存活率與吸光值成正比。
(二) 實驗步驟
將每孔上清液吸乾後，加入 100 μl 培養液，再加入 20 μl/well [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulfop henyl)-2H-Tetrazolium] (MTS) 試劑，靜置 1-2 小時。以波長 490 nm 測 定吸光值，計算細胞的存活率(Cell viability)。存活率 (%)= (試驗組吸 光值/對照組吸光值) x 100％。
七、細胞激素測定
(一) RAW 264.7 細胞激素測定
將 RAW 264.7 細胞種於 96 孔盤中，每孔 100 μl 控制細胞濃度 1×104，加入ABCE 30 分鐘後，再加入刺激劑 LPS ( 1 μg/ml )，於 37℃，
5% CO2培養箱中培養24 小時後，取出細胞上清液，將其 10 倍稀釋，
均勻震盪後取出 100 μl 加入預先 coating 及 blocking 的 96 孔盤中，
置於室溫2 小時，再以 PBS-T 清洗 3-5 次，再加入 detection antibody ， 置於室溫 1 小時，接著以 PBS-T 清洗 3-5 次，加入 HRP，室溫作用 30 分鐘，再以 PBS-T 清洗後，加入 Subatrate，置於室溫 15 分鐘，使 其呈色，最後加入H2SO4 終止反應，呈現黃色，再以 ELISA reader 偵 測OD 450 nm 吸光值。濃度以標準曲線求得之。
(二) 大鼠庫氏細胞胞激素測定
將 Kupffer 細胞種於 96 孔盤中，每孔 100 μl 培養液控制細胞數 目3×105，加入不同濃度的ABCE (25-100 μg/ml)培養 1 小時後，加入 刺激物LPS (0.1 μg/ml)，於 37℃，5% CO2培養箱中培養48 小時後，
將細胞上清液保存，將其稀釋5 倍測定 TNF-α 含量，採用 ELISA kit 分析，步驟如前所述。
八、西方墨點法(Western blotting)
將RAW 264.7 巨噬細胞株以1× 106 細胞種於6公分培養皿培 養，放置隔夜後，加入不同濃度的氯仿層散血草萃取液或已知的抑制 劑 (curcumin,PD98059,SB203580,SP600125)，處理30分鐘後，加入LPS (1 μg/ml)，依據蛋白表現的時間不同，予以不同時間的培養。培養時 間終止時，吸除培養液，並用PBS洗滌，接著加入適量的冰PBS在 dish，將細胞刮下，置於微量離心管中，在300×g 4℃離心10分鐘，移 除上清液，沉澱物加入200 μl 低張緩衝液(Hypotonic Buffer，配方如 表二所示)，均勻打散後，置於冰上15分鐘，期間反覆搖晃數次，接 著在加入10 μl 10％ NP-40均勻混合，以6000×g 4℃離心10分鐘，上
清液留於微量離心試管保存，此部分為細胞質萃取液，而沉澱物即為 細胞核，沉澱物加入適量萃取緩衝液(Extraction Buffer，配方如表二 所示)，使其均勻分散，並劇烈震盪15秒，置於冰上15分鐘，此步驟 反覆四次，再於12000×g 4℃離心10分鐘，其上清液即為核內萃取液。
表二、蛋白萃取緩衝液配方
Hypotonic buffer Extraction buffer 10 mM HEPES pH 7.9 20 mM HEPES pH 7.9
10 mM KCl 400mM NaCl
0.1 mM EDTA 1 mM EDTA 0.1 mM EGTA 1 mM EGTA
1 mM dithiothreitol 1 mM dithiothreitol
1 mM PMSF 1 mM PMSF
1 mM NaF 1 mM NaF
1 mM Na3VO4 1 mM Na3VO4
(二) 蛋白質定量
以 albumin 作為蛋白質標準品，依序稀釋，將 Bradford 試劑加入 100 μl，以波長 595nm 測定吸光值，求出標準曲線，而蛋白質樣本即 以此曲線進行濃度定量。
(三) 蛋白質電泳 (SDS-PAGE)
下膠採用10％ separating gel，上膠採用 3％ stacking gel，蛋白質 樣本以100℃加熱 5-10 分鐘後，置於冰上，隨後將樣本和 maker 分別 注入以樣本槽中，以125 伏特進行電泳約 1 小時。
(四) 轉印(transfer)
以50 伏特電壓轉印 1 小時後，將凝膠片蛋白質以濕式法 transfer 至PVDF 膜，將轉印完成之 PVDF 膜浸泡於 5％脫脂奶，於室溫下 1 小 時 或 放 置 隔 夜 ， 以 阻 斷 非 特 異 性 反 應 ， 之 後 以 Tris-buffered
saline-Tween 20 (TBS-T)清洗數次，之後以一級抗體於室溫下反應 2 小時或 4℃放置隔夜，以 TBS-T 清洗數次，再加入相對應之二級抗 體，於室溫下反應 1 小時，以 TBS-T 清洗後，進行壓片。將 PVDF 膜浸泡於冷光試劑中，以底片進行感光，感光時間依蛋白樣本而定，
之後放於顯影劑中顯影約1-2 分鐘，清水沖洗後，再放入定影劑中 3 分鐘，清水洗淨後即可。底片待乾後，以影像分析軟體分析，評估 組間的差距。
九、統計方法
數據結果以平均值(mean)±標準差(Standard deviation, SD)表示，
各組與對照組間的數據，以單因子變異數分析(One-way ANOVA)方法
分析，並進行 Dunnett 測試，以 P 值小於 0.05 表示在統計學上具有 顯著差異。
結果
一、LPS 對細胞的毒性測試
RAW 264.7 巨噬細胞珠，加入不同濃度的 LPS (0.1-1μg/ml)，分 別培養不同的時間(12、24、48、72 小時)，結果顯示 LPS 不會影響細 胞的存活(Fig. 16)。
二、LPS 誘導 NO 生成之影響
Ajuga bracteosa
將大鼠庫氏細胞，96 孔盤分別加入 LPS 0.1 μg/ml 或前處理 1 小
時ABEE，待 48 小時後，結果顯示 LPS 可誘發 NO 的增加，ABCE 具濃度(25-100 μg/ml)依存性抑制 NO 的釋出(Fig. 18)。
四、細胞激素含量
RAW 264.7 巨噬細胞加入 LPS 1μg/ml 經 24 小時後，取細胞上清 液測試IL-6 及 TNF-α 濃度。LPS 組別 IL-6 及 TNF-α 表現和控制組比 較是顯著升高。給予 ABCE 之組別，能降低 LPS 所誘導 IL-6 及 TNF-α 的釋出量 (Fig. 19、20)。另外，在庫氏細胞培養的 TNF-α 含量測定，
結果顯示ABCE 具濃度 (25-100 μg/ml) 依存性抑制 TNF-α 的釋出 (Fig. 21)。
五、ABCE 對 LPS 誘導 iNOS 蛋白表現之影響
RAW 264.7 巨噬細胞株，加入 LPS 1μg/ml 培養 24 小時後，iNOS 蛋白表現量顯著增加，而加入不同濃度之ABCE (25-100μg/ml) 前處 理30 分鐘後，可顯著抑制 iNOS 蛋白的表現量(Fig. 22)。
六、ABCE 對 LPS 誘導 IκBα 蛋白表現之影響
RAW 264.7 巨噬細胞株，加入 LPS 1 μg/ml 培養 15 分鐘後，磷酸
化IκBα 蛋白表現量顯著增加，而加入 ABCE(25-100 μg/ml) 前處理 30 分鐘後，可顯著抑制 LPS 誘導磷酸化 IκBα 蛋白的表現量，而非磷 酸化 IκBα 蛋白的表現量組別間無顯著差異，表示其磷酸化的降低，
並非IκBα 降解所導致(Fig. 23)。
七、ABCE 散血草對 LPS 誘導 NF-κB 蛋白表現之影響
RAW 264.7 巨噬細胞株，加入 LPS 1 μg/ml 培養 1 小時後，核內 NF-κB p65/p50 蛋白表現量顯著增加，而加入不同濃度之 ABCE 具有
抑制IκBα 降解的功能，進而抑制 NF-κB 轉移到核內。ABCE (25-100 μg/ml) 前處理後，可顯著抑制 LPS 誘導磷酸化 NF-κB p65/p50 蛋白 的表現量 (Fig. 24 )。
八、散血草對LPS 誘導 MAPK 蛋白表現之影響
RAW 264.7 巨噬細胞株，加入 LPS 1 μg/ml 培養 15 分鐘後，磷酸
化ERK 1/2、JNK、P38 的蛋白表現量顯著增加，而加入不同濃度之 ABCE (25-100μg/ml)前處理 30 分鐘後，可顯著抑制 LPS 誘導磷酸化 IκBα 蛋白的表現量，而非磷酸化 ERK、JNK、p38 蛋白的表現量組別
間無顯著差異，表示其磷酸化的降低，並非非磷酸化 ERK、JNK、p38 蛋白降解所導致(Fig. 25)。總結來說，ABCE 具有抑制 MAPK 蛋白磷 酸化的功能。
討論
本實驗主要是探討 ABCE 抑制 LPS 誘導 RAW264.7 巨噬細胞株 產生NO 的作用機轉。ABEE、ABBE、ABCE 及 ABC-AQE 抑制 LPS
誘發RAW264.7 細胞產生 NO 的 IC50 分別約為 1000、400、50 及 600 μg/ml 。以 ABCE 抑制效果顯著，因此後續實驗，作用機轉的探討使
用ABCE。
LPS 誘發 RAW 264.7 細胞株發炎反應中，細胞上清液中發炎有 關的細胞激素 IL-6 及 TNF-α 的濃度有顯著增加情形，ABCE 的前處 理可顯著降低LPS 所誘發之細胞激素發炎反應(Fig.19、20)，且在 LPS
誘發大鼠庫氏細胞發炎反應，其上清液結果亦顯示 ABCE 具濃度
(25-100 μg/ml) 依存性抑制 NO 及 TNF-α 的釋出 (Fig.18、21)。證實 ABCE 能夠減緩 LPS 誘發之發炎反應。
許多研究指出LPS 可活化 NF-κB pathway 及 MAPK pathway 的 訊息傳遞促使下游發炎細胞激素如 IL-6 及 TNF-α 及 NOS 的釋出(Mi Jeong et al., 2009；Kim et al., 2007a；Kim et al., 2007b)。
NF-κB 由不同次單元體組成，以 p65/p50 異二聚體形式最為常 見，並具有強力的轉錄活性(Teng et al., 2006)。細胞在未受刺激下，
細胞質中的p65/p50 會和抑制其活性的 IκB 結合存在細胞質中。而 IκB 會阻擋NF-κB 使其無法進入核內。若受到刺激活化後，IκBα 會被 IKK 磷酸化，接著IκBα 被 26S proteasome 進行 Ubiquination 作用而分解，
使 NF-κB 與 IκB 結合分開，進而活化 NF-κB 異二聚體進入核內，影 響下游基因的發炎或免疫反應(Makarov, 2000；Moynagh, 2005)。在本
實驗，ABCE 降低 LPS 所誘發的核內 p65/p50 表現，且 ABCE 能抑制
實驗，ABCE 降低 LPS 所誘發的核內 p65/p50 表現，且 ABCE 能抑制