國立臺灣大學臨床醫學研究所 碩士論文
Graduate Institute of Clinical Medicine College of Medicine
National Taiwan University Master Thesis
RBMY基因的表現在人類肝細胞癌之預後所扮演的角色 The role of RNA binding motif on Y Chromosome (RBMY) expression in the outcome of human hepatocellular carcinoma
高佩琪 Pei-Chi Kao
指導教授﹕張美惠 教授
Advisor: Professor Mei-Hwei Chang
中華民國 一零三 年 八 月
August 2014
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誌謝
感謝指導教授張美惠老師的指導，吳嘉峯醫師以及蔡慧慧博士在旁協助，李伯皇教授及 鄭永銘教授的幫忙，還有感謝臺大公共衛生學院流行病學與預防醫學研究所李文宗教授及 廖淑芬老師。感謝家人的支持。
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中文摘要
〔研究背景及目的〕
肝臟惡性腫瘤是人類最好發的癌症之一，其中肝細胞癌與肝母細胞癌是最主 要的兩種類型。研究顯示B型肝炎帶原是導致肝細胞癌的重要危險因子之一，台灣 的研究顯示大約百分之八十的成人肝細胞癌和幾乎百分之百的孩童肝細胞癌與B 型肝炎帶原有密切的關係。肝母細胞癌佔了小於五歲的孩童之原發肝腫瘤的百分 之九十。肝癌好發於男性，在青春期之前的男童亦然，尤其是B型肝炎相關之肝癌 男女比例特高，男女比介於二比一與七比一之間；而肝母細胞癌發生於男性的比 例也是較高，其原因仍待研究。
RBMY基因位於所有哺乳類動物的Ｙ染色體上，與男性精子發育有關。過去 的研究發現，在一位患有肝細胞癌的孩童基因體中，RBMY基因被B型肝炎DNA所 嵌入。後續研究也顯示利用基因反轉錄方法，在九十名罹患肝細胞癌的男性病患 中，有三十二名(36%)患者的肝癌細胞組織，以及在六名罹患肝母細胞癌的男孩童 中，有四名(67%)孩童的肝母細胞癌內，偵測到RBMY轉錄體的表現，但在同一病 人的非癌性肝組織中則無。另外，也在活體小鼠的實驗中，發現到RBMY基因具 有癌前病變及致癌性。本研究目的在於釐清RBMY基因的表現與人類肝細胞癌之 預後，是否有相關聯存在。
〔研究方法〕
本研究收案197 個患有肝細胞癌且在台大醫院接受開刀之男性病患當作基本 研究組，他們的肝組織會藉由手術中而取得，並以冷凍方式包埋切片。另外也找 來75 位患有肝細胞癌且在台大醫院開刀之男性病患當作驗證組，他們的肝組織檢 體是以福馬林固定的方式。所有個案的病歷記載皆詳細回顧並整理，包括病人的 臨床表徵，腫瘤的美國癌症聯合委員會分期、病理組織分級，與病人存活情況。
再利用免疫組織化學染色法的方法來偵測病人肝腫瘤細胞中，RBMY 蛋白質的表 現情況，並且與他們的臨床及存活情況相互比較。
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〔結果〕
共計有143 位基本研究組的病人，藉由免疫組織化學染色法，可以在肝細胞 癌細胞內檢測出RBMY 的表現(72.6%)，包含了 RBMY 蛋白質表現在細胞核與細 胞質兩個地方。RBMY 的表現與美國癌症聯合委員會分期 (AJCC) 較高，有顯著 相關性(p= 0.034)，且有較低的存活率，尤其是細胞質內帶有 RBMY 表現的病人，
其五年存活率較其他病患為最差(p= 0.0027)。而在驗證組也同樣證實了這樣的結 果。
〔結論〕
肝細胞癌病人身上RBMY 的表現，與美國癌症聯合委員會腫瘤分期較高有顯 著的相關聯。另外，RBMY 也是個肝細胞癌的重要預後因子。
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Abstract Background and aim:
Liver cancer remains one of the commonest cancers worldwide. Hepatocellular carcinoma (HCC) and hepatoblastoma (HB) are two major types of human liver cancer.
Chronic infection with hepatitis B virus (HBV) has been closely associated with the development of HCC, which was found in around 80% of adult HCC and nearly 100%
of childhood HCC. HB accounted for 90% of primary malignant liver tumor in children less than 5 years of age in Taiwan. Male predominance had been observed in both adult and childhood HCC, especially HBV-related HCC, with man to woman sex ratio ranging from 2:1 to 7:1. HB occurs in males significantly more frequently than it does in females and the reason remains obscure.
The RNA-binding motif gene on Y chromosome ( RBMY gene), encoding a male germ cell-specific RNA binding protein associated with spermatogenesis, was found integrated by HBV DNA in a childhood HCC tissue. The RBMY transcripts, expressed exclusively in the testis of normal people, were detected by reverse transcription – polymerase chain reaction in 32 (36%) out of 90 male HCCs and in 4 (67%) of 6 male HB in a previous study. Nontumor liver counter parts were all negative for RBMY transcripts. Besides, previous study also revealed liver-specific RBMY transgenic mice developed hepatic pre-cancerous lesions, adenoma, and HCC. This study was aimed to evaluate the expression of RBMY in HCC patients to determine if a correlation between RBMY expression and the survival outcome existed.
Methods:
We enrolled total 197 male patients of hepatocellular carcinoma, from National Taiwan University Hospital as the baseline-study group. The HCC liver tissues were collected from the surgery and they were dealt with frozen embedded. To elaborate our
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model further, an additional cohort of 75 male patients of hepatocellular carcinoma, from the same hospital was enrolled as the validation group. Their liver tissues were collected from the surgery and dealt with paraffin embedded. Clinical data and pathologic findings were obtained from the medical records, including clinical presentation, American joint committee on cancer (AJCC) pathologic staging system, tumor grading, and survival condition. We checked the RBMY protein expression status by immunohistochemistry assessment. We evaluated the correlation between the clinical presentation and survival condition with RBMY protein expression.
Results:
RBMY protein was expressed in 143 (72.6%) of baseline-study group, including two patterns of RBMY protein distribution within HCC hepatocytes, including nucleus and cytoplasm. RBMY protein expression correlated with high grade AJCC staging (p=
0.034) and also contributed to poor prognosis trend, especially those with RBMY protein expression within the cytoplasm of hepatocytes (p= 0.0027). We confirmed the similar results in the validation group.
Conclusions:
RBMY protein expression correlated with higher AJCC tumor stage and was a significant prognostic factor for human hepatocellular carcinoma.
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目錄
口試委員會審定書... 0
誌謝... i
中文摘要... ii
英文摘要... iv
緒論 ... 1
研究方法與材料... 4
結果... 7
討論... 10
展望... 12
參考文獻... 13
表格... 19
圖片... 24
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〔緒論〕
肝臟的惡性腫瘤在現今的社會仍然相當普遍，不論是台灣、東南亞、甚至歐 洲國家或是北美 (El-Serag HB, 2002; Bosch et al., 2004; Nordenstedt et al., 2010)，
其中以肝細胞癌與肝母細胞癌為最主要的兩種惡性腫瘤。已經明確知道肝細胞癌 的危險因子為 B 型肝炎病毒(HBV)感染、C 型肝炎病毒(HCV)感染、黃麴毒素、
過量酒精的攝取，以及男性性別 (Montesano et al., 1997; El-Serag and Rudolph, 2007)等。慢性 B 型肝炎感染已經被證實會造成肝細胞癌的產生 (Beasley RP, 1982)，它會引起大約台灣百分之八十的成人肝細胞癌以及幾乎百分之百的孩童肝 細胞癌 (Chen et al., 1986; Chang et al., 1989)。病例對照研究法也顯示出，慢性 B 型肝炎帶原者比起一般民眾有高達一百倍的風險可能形成肝細胞癌 (Beasley RP and Hwang LY, 1984; Beasley RP, 1988)。基因遺傳學的研究也發現，在肝細胞癌 的染色體上，B 型肝炎病毒的遺傳物質 DNA 會嵌入肝癌細胞的遺傳物質 DNA，
而造成肝癌細胞的DNA 突變、減少、複製以及易位，種種複雜的關係存在 (Brechot et al. 2000; Buendia MA, 2000)。
肝細胞癌的發生率，不論年齡，性別的差異情形如下所述:男比女的比例約為
二到四比一；尤其在B 型肝炎感染引起之肝細胞癌更是明顯，其男比女的比例上
升甚至可高到七比一 (Parkin et al., 2001; Kao et al., 2010; Yang et al., 2010)。另外 也有研究指出，雄性激素的上升與受到B 型肝炎病毒感染之男性病人得到肝細胞 癌有很大的相關性 (Yu et al., 2000)。然而，罹患肝細胞癌，不分年齡，即使是在 青春期之前，男女比例仍約為四到五比一，這點很難單單用雄性激素的升高來解 釋 (Ni et al., 1991; Chang et al., 2000)。近年來，分子醫學逐漸蓬勃發展中，已經 有研究發現，雄性激素的受體表現與否和肝細胞癌的發生有密切的關係存在 (Ma WL and Hsu CL, 2008)。猜測性別的差異也許可以就三個部份來解釋: 第一、男性 比較容易暴露在肝癌的危險因子中，例如喝酒、較易受病毒性肝炎的感染；第二、
雌性激素可以抑制某些細胞激素引發的發炎反應；第三、雄性激素會作用在雄性
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激素的受體上，進而造成肝細胞的增生( Naugler et al., 2007; Yang et al., 2010)。
肝母細胞癌佔了小於五歲的孩童，原發肝細胞惡性腫瘤的百分之九十以上，
算是孩童原發惡性肝腫瘤中的第一名 (Darbari et al., 2003)。目前認為肝母細胞癌 的癌細胞是源自於肝內幹細胞，具有分化能力，因此在肝母細胞癌的組織內仍可 發現肝臟細胞或是膽管上皮細胞的特徵 (Schnater et al., 2003)。也曾經有研究發現，
低出生體重兒 (Oue et al., 2003; McLaughlin et al., 2006)、Beckwith-Wiedemann 過 度生長症候群 (Tan et al., 2006)、Gardner's syndrome 以及家族性的腺瘤息肉增生 症 (Krush et al., 1988; Hirschman et al., 2005; Aretz et al, 2006)，這些因素都與肝母 細胞癌發生率增加有關係。肝母細胞癌在男童的發生率也確實比女童還要來的高，
目前對於這部分的機轉仍是尚未清楚 (Weinberg et al., 1983; Stiller et al., 2006)。
RBMY (RNA-binding motif (RRM) gene on Y chromosome) 基因，在所有哺乳 類的Y 染色體上可以找到。RBMY 蛋白質在 N 端有一段可與核醣核酸結合的結 構區域(RNA recognition motifs, RRMs)，C 端則具有由四個胺基酸(serine, arginine, glycine and tyrosine)組成的高度重覆片段，稱為 SRGY box (Ma et al., 1993)。RBMY 有一個同源體位於 X 染色體上，稱做 RBMX。一般情況下，RBMX 是廣泛性的 表現與作用，而RBMY 基因的轉錄體只會在男性的睪丸中生殖細胞核內(即精原 細胞、精母細胞、及圓形精子細胞)有所表現，並不會在男性睪丸以外的組織，例 如大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、前列腺體，或是骨骼肌中表現出來 (Ma et al., 1993;Elliott et al., 1997; Delbridge et al., 1999)。具有表現型的 RBMY 基因主要是位 在Y 染色體長臂上 AZFb (azoospermia factor) 區塊，如果 AZFb 區塊有微小的缺 失，就會影響到 RBMY 的表現，進而會造成男性的不孕症 (Elliott et al., 1997;
Foresta et al.,2001)。目前已知 RBMY 藉由和 SR 蛋白質或是 STAR (signal transduction and activation of RNA family) 蛋白質相互作用，進而調節生殖細胞內 核醣核酸選擇性剪接、或是轉錄前的處理過程，但確切的機制仍尚在研究中 (Venables et al., 2000; Elliott DJ., 2004)。
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之前的研究發現，B型肝炎病毒感染所引起的肝細胞癌，百分之八十的細胞內
可偵測到B型肝炎病毒的去氧核醣核酸嵌入宿主的染色體 (Chen et al., 1986)。在一 位罹患肝細胞癌男童的肝癌細胞內發現到，B型肝炎病毒的去氧核醣核酸嵌入 RBMY基因的intron 6。接著利用反轉錄聚合酶鏈式反應，驗證了B型肝炎病毒去氧 核醣核酸的嵌入，造成RBMY基因在肝癌細胞中有所表現，而同一位病人的非肝 癌細胞內就檢測不到RBMY基因的轉錄體。接著，又在其他八位肝細胞癌病童的 肝組織也進行一樣的反轉錄聚合酶鏈式反應，發現約有三位(37.5%)男性病童，其 肝癌細胞內可檢測出RBMY基因的轉錄體。至於在膽道閉鎖造成的肝硬化組織內，
完全不會偵測到RBMY基因轉錄體的表現 (Tsuei et al., 2002)。
後續研究也發現，利用反轉錄聚合酶鏈式反應，可以在九十位罹患肝細胞癌 男性病人中，其中有三十二名病人(36%)的肝細胞癌檢體帶有RBMY基因的轉錄體；
同時也在六位罹患肝母細胞癌的男童中，發現四名病人(67%)的肝母細胞癌檢體檢 測出RBMY基因的轉錄體。罹患肝細胞癌的女性病患、以及其他種癌症組織，包 括膽道癌、大腸癌、胃癌、肺癌、攝護腺癌、以及腎臟惡性腫瘤，都沒有檢測出 RBMY基因轉錄體的表現 (Tsuei et al., 2004)。有研究證實，在B型肝炎轉殖小鼠身 上，雄性激素受體會促進肝細胞癌的生成 (Wu et al., 2010)。後來，在肝癌細胞株 或是人類肝細胞癌組織內皆驗證了，RBMY的表現會抑制雄性激素受體的拮抗體 表現，進而增加雄性激素的受體表現 (Tsuei et al., 2011)。這也許暗示著RBMY與 肝臟惡性腫瘤男性病患較多有相關性。另外，在裸鼠活體身上轉殖RBMY基因，
會造成肝臟腫塊及惡性腫瘤的產生，這些結果顯現出RBMY擁有使肝臟細胞致癌 的能力 (Tsuei et al., 2011)。在肝臟惡性腫瘤男性病患身上，已發現到RBMY基因 的相關表現，但其對於臨床表現的影響甚至病人的預後，目前尚未清楚。希望藉 由這次的研究能找出RBMY蛋白質的表現情況與肝臟惡性腫瘤病人的臨床、病理 表徵及存活預後，是否有相關性的存在。
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〔研究方法與材料〕
(1) 病人與組織來源及分類
從西元2005年到西元2007年，共有197位在台灣大學附設醫院進行肝細胞癌開 刀的男性病患當作基本研究組，他們開刀時的平均年齡為57.0歲。肝臟檢體的取得 都是經由手術中獲得，並以冷凍方式包埋切片。術後這群病人都是在台灣大學附 設醫院進行追蹤。病人臨床資料的取得是藉由醫療病歷的記載回顧而加以整理，
包括開刀時的年齡、手術前胎兒蛋白指數(alpha-fetoprotein, AFP)、開刀前B型肝炎 感染(B型肝炎表面抗原陽性, HBsAg (+))及C型肝炎感染(C型肝炎抗體陽性, anti-HCV Ab (+))的情況，其中139人為B型肝炎感染病患，44人為C型肝炎感染者，
有五位是共同感染到B型及C型肝炎。也根據臨床資料與病理報告，依據美國癌症 聯合委員會分期(American Joint Committee on Cancer, AJCC ) (Edge et al., 2010)，將 病人分成四期，第一期的AJCC為低期別，沒有血管的侵犯，第二期為單顆腫瘤帶 有血管侵犯或是多顆小腫瘤(皆小於五公分)，第三期為多顆大腫瘤或是有腫瘤侵犯 到門靜脈或是肝靜脈的大分支，甚至直接侵襲到周邊組織，而第四期為周邊淋巴 結的轉移。第二期以上我們認定為高期別。另外，還依據Edmondson and Steiner提 出的分級方式(Edmondson and Steiner, 1954)，將肝癌細胞病理組織分為四級，第一 級為分化良好的組織，第二級為分化中等的組織，第三級為分化不良的組織，而 第四級為未分化的組織。病人術後有無早期復發，以及術後五年內的存活情況也 都會詳細記載。若是在術後追蹤的一年內，被臨床醫師偵測到肝癌腫瘤再度在肝 臟內存在，定義為早期復發 (early tumor recurrence, ETR) (Poon et al., 2000; Yuan et al., 2005)。術後五年內的存活情況，起點為接受肝臟手術當日，研究終點為術後追 蹤至少滿五年或是在五年內死亡或失聯，其中只有16位病患於追蹤時，中途失聯。
另外從西元1982年到西元1994年，找來75位曾在台灣大學附設醫院進行肝細 胞癌開刀的男性病患當作驗證組，用來確認基本研究組中所得到的RBMY的表現 與存活的關係。他們開刀時的平均年齡為56.5歲。他們的肝組織檢體藉由手術中取
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得，以福馬林固定。術後在同一家醫院追蹤。病人臨床資料的取得是藉由醫療病 歷的記載回顧而加以整理，研究起點為接受肝臟手術當日，研究終點為追蹤至少 滿五年或是死亡或失聯。本研究已取得台灣大學附設醫院研究倫理委員會之許 可。
(2)免疫組織化學染色法分析 RBMY 蛋白質的表現
基本研究組病人手術中取來的肝細胞癌組織檢體，我們會先使用OCT複合物 於液態氮中作用五分鐘，再儲存於負八十度C的冰庫內。使用時，把OCT冷凍組織 切成五到八微米的切片，再用磷酸緩衝液(phosphate buffer solution; PBS)浸泡，使 用乙酮固定並作用於負二十度C的環境下，回溫且風乾後，用百分之一濃度的triton X-100浸泡五分鐘。
免疫組織化學染色法的操作主要是採用“UltraVision Quanto Detection System”
(Thermo Scientific, Fremount, CA)試劑套組，並依據賣方所提供的建議執行: 首先，
在室溫中，用百分之三的雙氧水浸泡十分鐘，以便消除細胞內生性過氧小體的活 性。之後用PBS緩衝液徹底沖洗三次，每次五分鐘，再使用試劑套組中所提供的ultra V block於室溫下處理五分鐘以阻斷組織中的雜訊，不須沖洗，直接加入本實驗室 自製的抗人類RBMY單株抗體(anti-human RBMY monoclonal antibody)。抗體先以 PBS緩衝液稀釋，比例為一比五，靜置於四度C的冰箱內作用二十四小時。接著，
以PBS緩衝液沖洗五分鐘，重複三次，加入“Primary Antibody Amplifier Quanto” 放 置在室溫下十分鐘。再用PBS緩衝液以上述方式沖洗。再者，加入“HRP Polymer Quanto”繼續在室溫下作用一小時。在三次PBS緩衝液沖洗後，加入“DAB Quanto Chromogen” 和“DAB Quanto Substrate”之混合液。最後用hematoxylin染色，再用 micromount(Surgipath, Richmond, IL)封片。
驗證組的肝細胞癌組織檢體，主要是經由福馬林固定，再以石蠟包埋處理。
因此在進行免疫組織化學法之前，須將檢體浸泡於TrilogyTM reagent(Cell Marque, Rocklin, CA)，並微波加熱十分鐘，以便同時去除福馬林(deparaffinization)，再水化
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(rehydration)，及修復抗原(antigen unmasking)。為了更全面修復因石蠟包埋而造成 檢體中的抗原被破壞，Trilogy處理後的檢體需再浸泡於AR-10 antigen retrieval solution pH 10 (BioGenix, San Ramon, CA)，微波十分鐘，放在室溫下冷卻三十分鐘，
使用無離子水清洗兩次，最後用PBS緩衝液浸泡，接著進行上述的免疫組織化學染 色法。
為了驗證本實驗室自製的抗人類RBMY單株抗體染色結果的正確性，我們以 人類睪丸組織的免疫組織化學染色作為正控制 (positive control)，其結果與過去已 發表的現象雷同 (Elliott et al., 1997)，即在睪丸組織的細胞內，RBMY只在細胞核 中被染出，細胞質內完全沒有表現。而在人類肝細胞癌細胞內進行同樣的免疫組 織化學染色法，發現不論是基本研究組還是驗證組的檢體，RBMY的表現不只在 細胞核內，更在細胞質內有所表現。這點是與睪丸組織的細胞內RBMY的表現，
有所不同。
(3) 統計分析
本研究中，資料的處理是使用STATA(StataCorp LP, Texas, USA)以及 Statistical Analysis System(SAS institute Inc.)統計軟體來進行統計分析。X2 test 用來進行臨床、
病理各項特徵與RBMY 表現的單變項分析。存活分析是以 Kaplan-Meier 圖表來 表達，而存活曲線差異的評估是使用log-rank test。存活曲線的起點為手術日，終 點為術後滿五年或是五年內死亡或失聯。存活情況與臨床、病理表徵及RBMY 的 表現之單變項及多變項分析則是利用 Cox proportional hazards model 及 Wald chi-square test。P 值小於 0.05，表示具有統計上的顯著意義，若 P 值介於 0.1 至 0.05 間，認為具有差異的趨勢存在。
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〔結果〕
1) RBMY 蛋白質在基本研究組肝細胞癌的組織之表現
利用免疫組織化學染色法，我們發現到RBMY 蛋白質在肝細胞癌組織的表現 具有三種不同的情況: 單純在細胞核中表現，單純在細胞質內表現，或是細胞核 和細胞質內都有表現(圖 1)。共計在 197 位肝癌病人中，有 143 位病人肝癌細胞內，
藉由免疫組織化學染色法，不論是在細胞核或是細胞質內，可以在肝癌細胞內檢 測出RBMY 蛋白質(72.6%)。在這其中，有 25 位只在細胞質內表現 RBMY 蛋白 質(12.7%)，43 位只有在細胞核內表現 RBMY 蛋白質(21.8%)，75 位在細胞質和細 胞核內都有表現RBMY 蛋白質(38.1%)，剩下的 54 位病人則是都不表現(27.4%)。
2) 基本研究組 RBMY 蛋白質的表現與臨床、病理表徵的關係
分析臨床、病理表徵與肝癌組織RBMY 蛋白質表現的關係，發現與無 RBMY 蛋白質表現者相比，肝癌病患之肝組織具有RBMY 蛋白質的表現者其美國癌症聯 合委員會分期(AJCC)期別較高，此具統計學上有意義的差別(p=0.034)。RBMY 蛋 白質的表現與病人開刀時的年紀、手術前的胎兒蛋白指數高低、B 型肝炎感染情 況、C 型肝炎感染情況、肝臟惡性腫瘤細胞的病理分級程度、以及早期復發，都 無明顯的相關性(表 1)。
3) 基本研究組 RBMY 蛋白質在細胞質內的表現與否，是病人五年存活機率的預 測因子
我們發現RBMY 蛋白質的表現與否和病人五年存活機率具有相關的趨勢，肝 癌組織內具有RBMY 蛋白質表現的病人，五年存活機率較差(p=0.06) (圖 2A)。倘 若把RBMY 蛋白質在肝癌組織內的表現分成前述的三種類型:單純在細胞核中表 現，單純在細胞質內表現，細胞核和細胞質內都有表現，再與病人的五年存活機 率來加以分析，發現在細胞核、質均表現RBMY 者五年存活率比 RBMY 不表現 者或RBMY 只表現於細胞核者較差，而僅在細胞質內表現 RBMY 蛋白質的病人，
其五年存活率為最差(p=0.0027) (圖 2B)。
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為了更加地釐清RBMY 蛋白質的表現與病人存活的關係，我們把各臨床與病 理表徵、RBMY 蛋白質表現的各種情況，與病人五年存活機率進行了單變項分析 (表 2)。RBMY 蛋白質在細胞質內的表現(p=0.0032)、手術前的胎兒蛋白指數較高 (p=0.0001)、美國癌症聯合委員會分期較高(AJCC) (p< 0.0001)，以及早期肝癌復 發(p< 0.0001)，這些因子都和病人五年存活機率有顯著相關性。RBMY 蛋白質在 細胞核內表現有無，其五年存活情況在統計上則無顯著的差異。
接著在Cox 比例風險模式中，進行影響存活率的因子之多變項分析。排除美 國癌症聯合委員會分期(AJCC)，手術前的胎兒蛋白指數，以及早期肝癌復發這些 因素的影響力之後，帶有RBMY 蛋白質在細胞質內的表現，對於病人的存活分析 仍具有統計上顯著的意義(p =0.026; HR 1.71) (表 2)。
4) 驗證組的相關結果
在75 位驗證組的病人當中，共計有 28 位病人肝細胞癌組織內，藉由免疫組 織化學染色法，可以在肝癌細胞內檢測出RBMY 蛋白質的表現，不論是在細胞核 或是細胞質內(37.3%)。在這其中，有 11 位只在細胞質內表現 RBMY 蛋白質(14.7%)，
17 位在細胞質和細胞核內都有表現 RBMY 蛋白質(22.7%)，剩下的 47 位病人則是 都不表現(62.7%)。驗證組中，肝癌組織 RBMY 蛋白質表現者與無 RBMY 蛋白質 表現者相比，肝癌病患之肝組織具有RBMY 蛋白質的表現者與美國癌症聯合委員 會分期(AJCC)期別較高，有明顯相關(p=0.002)。
RBMY 蛋白質的表現與否和病人五年存活機率在驗證組仍具有相關的趨勢。
肝癌組織內具有RBMY 蛋白質表現的病人，其五年存活機率較差(p=0.003)(圖 3A)。
倘若把RBMY 蛋白質在肝癌組織內的表現分成前述的三種類型，再與病人的五年 存活機率加以分析，仍然是僅在細胞質內表現RBMY 蛋白質的病人，表現出最差 的五年存活機率(p=0.002) (圖 3B)。
RBMY 蛋白質在細胞質內的表現(p=0.0038)、美國癌症聯合委員會分期(AJCC) 較高(p=0.0029)，與早期肝癌復發(p<0.0001)，這些因子在單變項分析中也展現與 存活情況有顯著相關性(表 3)。接著，進行存活機率的因子之多變項分析後，發現
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美國癌症聯合委員會分期(AJCC)較高(p=0.0083)，和早期肝癌復發(p<0.0001)，這 些因素對於病人的存活分析具有統計上顯著的意義，而RBMY 蛋白質在細胞質內 的表現與否，和病人存活機率無明顯相關，但仍帶有風險存在(HR 1.26) (表 3)。
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〔討論〕
男性患者在肝細胞癌比女性高的發生率，一直在許多的研究中都有發表，在 台灣也是如此，不只是成人，甚至罹患肝細胞癌的孩童，男女的比例也高達四到 五比一 (Ni et al., 1991; Chang et al., 2000)。對於肝細胞癌存活率，性別也是存在 著極大的差異 ( Parkin et al., 2001) 。RBMY 位在哺乳動物的 Y 染色體上，主要 作用是影響生殖能力(Elliott et al., 1997; Foresta et al., 2001)。正常的情況下，RBMY 基因只會在男性睪丸的生殖細胞核內表現，並不會在其他組織中有所展現。近幾 年來開始有研究發現，RBMY 可以在人類肝臟惡性腫瘤細胞內有所表現，而且僅 限在肝臟惡性腫瘤細胞，若是其他的肝臟非惡性腫瘤細胞或是其他組織細胞腫瘤，
則檢測不到RBMY 的表現(Tsuei et al., 2002)。另外，不論是在生物體外或是活體 實驗，都已經證實 RBMY 基因確實有致癌性 (Tsuei et al., 2004; Tsuei et al., 2011)。
本研究是第一篇探討肝細胞癌內RBMY 的表現與病人之臨床、病理表徵與存 活率的相關性。在本研究中，利用免疫組織化學染色法，在肝細胞癌的病患身上，
不論是基本研究組或是驗證組，約有三分之一以上的病患其肝細胞癌腫瘤細胞中 帶有 RBMY 的表現。特別的是，RBMY 在肝細胞癌腫瘤細胞內不僅僅在細胞核 中有所表現，在細胞質內也有所顯現，這點，與生殖細胞內RBMY 只活躍在細胞 核內，是大不相同的。而驗證組的免疫組織化學染色法的結果，並沒有發現到 RBMY 單獨在肝癌細胞核中有所表現，與基本研究組有些微不同，猜測可能與驗 證組的肝組織檢體年代較為久遠，保存狀況不一，有所關聯。
在基本研究組或是驗證組中，探索RBMY 的表現與臨床、病理表徵的關聯，
皆發現 RBMY 的表現與美國癌症聯合委員會分期(AJCC) 較高，有顯著相關 (p=0.034)，而 AJCC 分期較高，就暗示著腫瘤細胞已經有血管的侵犯，這一點和 病人較差的預後息息相關(Pan et al., 2003)。因此我們猜測，肝細胞癌腫瘤細胞內 RBMY 的表現也許與血管新生及腫瘤之侵襲與轉移等相關因子有相互作用存在，
進而能造成腫瘤細胞持續惡化或是復發。然而這部分仍尚待後續相關研究。
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本研究中也發現到，肝癌組織內帶有RBMY 表現的病人，其五年存活率有較 低的趨勢(p=0.06)，準確一點地說，細胞質內帶有 RBMY 的表現的病人，其五年 存活率較其他病患為差(p=0.0027)。這部分同樣地在驗證組中也證實了(p=0.002)。
另外，排除了美國癌症聯合委員會分期(AJCC)較高，手術前的胎兒蛋白指數，以 及早期肝癌復發機率較高等因子的影響後，細胞質內帶有RBMY 的表現與存活率 的相關性，仍具有統計上顯著的意義(p=0.026)或是高風險存在。因此我們推測，
肝癌細胞細胞質內 RBMY 的表現對於五年存活率是個預後因子。而在驗證組中 進行存活率之多變項分析，僅發現到RBMY 蛋白質在細胞質內的表現似乎有降低 存活率的風險(HR1.26)，但未到達統計上的意義，猜測可能與驗證組的樣本數較 小、肝組織檢體保存年代久遠，有所相關，且多變項分析因子之一，早期肝癌復 發，有12 筆資料的遺失，會造成多變項分析的樣本數更加地減少(n=63)，而樣本 數小容易造成顯著性的消失，這些都可能把RBMY 蛋白質在細胞質內的表現與存 活率相關的顯著性掩蓋住。
生殖細胞內，RBMY 的表現僅在細胞核內，且主要是與 SR 蛋白質，STAR (signal transduction and activation of RNA family) 蛋白質，或 Tra2ß 蛋白質相互作 用，進而調節生殖細胞內核醣核酸選擇性剪接、或是轉錄前的處理過程，接著影 響後續相關反應。在肝癌細胞內，我們發現到RBMY 在細胞質與細胞核中皆有所 表現，但單獨是細胞質中的RBMY 表現與肝癌病人五年存活機率高度相關，這暗 示著在細胞質內活躍的RBMY 是經由某種的核定位訊號 NLS (nuclear localization signal ) 及 NES ( nuclear export signal )，才能在細胞核、質游走而進行作用，來影 響肝癌病人的預後情況。由於肝癌細胞RBMY 在細胞質內的表現，與 RBMY 在 生殖細胞核內的作用點位完全不同，猜測兩者機轉大相逕庭。即使目前我們的研 究團隊初步的研究結果顯示，RBMY 在肝癌細胞質內可能是透過 WNT 訊息傳遞 系統而有所作用，但RBMY 經過怎樣的途徑，來影響肝癌病人的預後，其詳細的 機轉尚未明朗，仍需更多的研究來探討。
- 12 -
〔展望〕
藉由本研究，我們發現RBMY 在肝細胞癌腫瘤細胞內的表現與在生殖細胞內 的表現大不相同，RBMY 在肝細胞癌腫瘤細胞質內是有所表現的，推測可能與 RBMY 在肝細胞癌的致癌機轉，扮演息息相關之角色，尚待未來更多的研究來探 討。另外也發現對於肝細胞癌腫瘤細胞，RBMY 蛋白質的表現，特別是在細胞質 內表現，對於病人的臨床病理腫瘤分期，及存活的情況是個重要的預後因子，儘 管詳細的機制仍未明朗，仍期許RBMY 在未來對於肝細胞癌預後的評估以及病人 後續的追蹤或是輔助性治療的選擇上，能有所助益。
- 13 -
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- 19 -
表1. 基本研究組RBMY 表現與臨床、病理表徵的單變項分析
變項
RBMY 蛋白質的表現
P 值 總人數,
n=197
陽性, n (%)
OP Age (yr) 0.697
< 60
≥ 60
105 92
75 (71) 68 (74) HBsAg
(-) (+)
58 139
46 (79) 97 (70)
0.172
Anti-HCV Ab (-) (+)
153 44
107 (70) 36 (82)
0.119
AFP (ng/ml) (8 missing data)
<200
≥200
135 54
97 (72) 40 (74)
0.942
AJCC staging I II-IV
111 86
74 (67) 69 (80)
0.034*
Histology grading (5 missing data)
Grade 1-2 Grade 3-4
ETR (4 missing data)
(-) (+)
136 56
142 51
94 (69) 46 (82)
102 (72) 37 (73)
0.15
0.46
縮寫: AJCC, American Joint Committee on Cancer 美國癌症聯合委員會分期; (+), present; (-) absent; AFP, alpha-fetoprotein, 胎 兒 蛋 白 指 數; ETR, early tumor recurrence, 早期復發
* p <0.05 by X2 test
- 20 -
表2 基本研究組病人存活情況與臨床、病理表徵及RMBY蛋白質表現的單變項及 多變項分析
單變項分析 多變項分析
變項 死亡 人數
總人數 (存活人
年數)
死亡率 風險 比值
P值 風險 比值
P值
Age (yr) 0.9877
< 60 43 105 (311.67)
0.14 1.00
≥ 60 38 92 (269.57)
0.14 1.00
RBMY_C 0.0032* 1.71 0.0260*
(-) 29 97
(447.01)
0.06 1.00
(+) 52 100 (385.21)
0.13 1.98
RBMY_N 0.8039
(-) 34 79
(332.24)
0.10 1.00
(+) 47 118 (499.98)
0.09 0.95
HBsAg 0.4301
(-) 21 58
(248.67)
0.08 1.00
(+) 60 139 (583.55)
0.10 1.22
Anti-HCV Ab 0.3951
(-) 67 153
(653.97)
0.10 1.00
(+) 14 44
(178.25)
0.08 0.78 AFP(ng/ml)
(8 missing data)
0.0001* 1.76 0.0189*
<200 45 135 (658.04)
0.07 1.00
≥200 32 54 (177.86)
0.18 2.45
- 21 -
單變項分析 多變項分析
變項 死亡 人數
總人數 (存活人 年數)
死亡率 風險 比值
P值 風險 比值
P值
AJCC staging <0.0001* 2.33 0.0007*
I 30 111 (541.66)
0.06 1.00
II-IV 51 86
(290.56)
0.18 2.97
Histology Grading (5 missing data)
0.316
Grade 1-2 53 136 (611.01)
0.09 1.00
Grade 3-4 24 56 (212.15)
0.11 1.28
ETR
(4 missing data)
<0.0001* 35.87 <0.0001*
(-) 40 142 (556.46)
0.07 1.00
(+) 41 51 (24.77)
1.66 50.55
縮寫: RBMY_C, RBMY蛋白質在肝癌細胞質內染出; RBMY_N, RBMY蛋白質在肝 癌細胞核內染出; AFP, alpha-fetoprotein 胎兒蛋白指數; AJCC, American Joint Committee on Cancer 美國癌症聯合委員會分期; ETR, early tumor recurrence, 早期 復發; (+), present; (-) absent;
* p < 0.05 by Wald chi-square test
- 22 -
表3 驗證組病人存活情況與臨床、病理表徵及RMBY蛋白質表現的單變項及多變 項分析
單變項分析 多變項分析
變項 死亡 人數
總人數 (存活人 年數)
死亡率 風險比 值
P值 風險 比值
P值
Age (yr) 0.8517
< 60 30 38 (202.88)
0.15 1.00
≥ 60 33 37 (182.57)
0.18 1.05
RBMY_C 0.0038* 1.26 0.4617
(-) 36 47
(302.89)
0.12 1.00
(+) 27 28
(82.56)
0.33 2.13
RBMY_N 0.2036
(-) 47 58
(320.89)
0.15 1.00
(+) 16 17
(64.56)
0.25 1.45
HBsAg 0.9413
(-) 20 22
(114.18)
0.18 1.00
(+) 43 53
(271.27)
0.16 1.02
AFP (ng/ml)
0.0561
<200 32 39 (244.85)
0.13 1.00
≥200 31 36 (140.60)
0.22 1.63
AJCC staging 0.0029* 2.50 0.0083*
I 18 24
(199.29)
0.09 1.00
II-IV 45 51
(186.16)
0.24 2.34
- 23 -
單變項分析 多變項分析
變項 死亡 人數
總人數 (存活人 年數)
死亡率 風險比 值
P值 風險 比值
P值
Histology Grading 0.3714
Grade 1-2 38 46 (248.94)
0.15 1.00
Grade 3-4 25 29 (136.51)
0.18 1.26
ETR
(12 missing data)
<0.0001* 7.70 <0.0001*
(-) 22 34
(314.95)
0.07 1.00
(+) 29 29
(57.52)
0.50 7.38
縮寫: RBMY_C, RBMY蛋白質在肝癌細胞質內染出; RBMY_N, RBMY蛋白質在肝 癌細胞核內染出; AFP, alpha-fetoprotein 胎兒蛋白指數; AJCC, American Joint Committee on Cancer 美國癌症聯合委員會分期; ETR, early tumor recurrence, 早期 復發; (+), present; (-) absent;
* p < 0.05 by Wald chi-square test
- 24 -
圖1. RBMY蛋白質在人類睪丸及肝臟惡性腫瘤中的表現
A圖: 基本研究組的免疫組織化學染色法 B圖: 驗證組的免疫組織化學染色法
RBMY N+ C-: 單純在細胞核中表現; RBMY N- C+: 單純在細胞質內表現;
RBMY N+ C+: 細胞核和細胞質內都有表現; RBMY N- C-: 細胞核和細胞質內都 不表現。
放大倍率200倍
- 25 -
圖2A
(基本研究組)罹患肝惡性腫瘤的197位病人之Kaplan-Meier 存活分析:具有RBMY
蛋白質表現者 (143位)，五年存活率有較差的趨勢，p 值為0.06。
- 26 -
圖2B
(基本研究組)罹患肝惡性腫瘤的197位病人之Kaplan-Meier 存活分析:僅在肝臟惡
性腫瘤細胞的細胞質中具有RBMY蛋白質表現者 (25位)，表現出最差的五年存活
率。在細胞核、質均表現RBMY者五年存活率比RBMY不表現者或RBMY只表現於 細胞核者較差。p 值為0.0027。
- 27 -
圖3A
(驗證組)罹患肝惡性腫瘤的75位病人之Kaplan-Meier 存活分析:具有RBMY蛋白
質表現者 (28位)，五年存活率較差，p 值為0.003。
- 28 -
圖3B
(驗證組)罹患肝惡性腫瘤的75位病人之Kaplan-Meier 存活分析:僅在肝臟惡性腫
瘤細胞的細胞質中具有RBMY蛋白質表現者 (11位)，表現出最差的五年存活率，
p 值為0.002。
