抑癌基因 Rb 及 p16 在人類食道癌腫瘤組織及細胞 株中表現度之研究
食道癌在台灣地區的十大癌症死亡原因中為第十位,在台灣地區男性的十 大癌症死亡原因中更為第五位。食道癌在分子生物方面,已有相當多的定 性實驗數據,包括在抑癌基因 p53 、 APC 、 MCC 上,均發現有變異發生。
抑癌基因( tumor suppressor gene )在正常細胞中可經由負面的生長調 控機轉,達到抑制細胞生長的目的。當這些基因發生點突變( point mutation )、重組( rearrangement )、缺失( deletion ),或插入(
insertion ),而導致其蛋白質喪失正常功能,便可能造成細胞不受控制 地生長而逐漸變成癌細胞。 Rb 抑癌基因( Retinoblastoma gene )和 p16 抑 癌基因( p16INK4A/CDKN2/MTS-1 gene )均為目前最被人所熟知的抑癌基 因之一。 Rb 抑癌基因的蛋白質產物被認為具有可限制細胞增殖的能力,因 其可在細胞週期時鐘和轉錄機轉之間,扮演著訊息傳送的角色,控制許多 基因的表現,進而控制細胞進入生長週期的下一個階段與否。 D type Cyclin/ CDK4, 6 complex 具有使 Rb 蛋白質磷酸化,使其失去在細胞週期 的 G1 phase 中限制細胞增殖的活性。 p16 抑癌基因的蛋白質產物則可和 CDK4 及 CDK6 結合,進而抑制 Cyclin/CDK complexes 使 Rb 磷酸化的活性。食 道癌是目前世界上相當普遍的癌症之一,在台灣地區十大癌症死亡原因中 為第十位,在男性十大癌症死亡原因中更為第五位。為了瞭解在食道癌中 Rb 抑癌基因與 p16 抑癌基因變異的情形及彼此間的相互關係,我們搜集了 五個人類食道癌細胞株 -CE48T/VGH 、 CE81T/VGH 、 CE146T/ VGH 、 TE2 、 HCE6 ,及十三位食道癌病人外科手術切除的正常食道黏膜組織及癌組織,
來研究在食道癌中 Rb 基因的轉錄因子結合部位( A / B 口袋區)和 p16 基因 的變化。結果發現,在 Rb 基因部分,以單股結構多形性法( SSCP, Single Strand Conformational Polymorphism )篩檢的結果,發現十三個不同食 道癌病人的組織 cDNA 中,有一個在 cDNA 的 2136 位置的 T 變異成為 A ,造成 stop codon 的 TGA ,和另一個在 cDNA 的 1337 至 1445 位置上有缺失(
deletion );但在五個食道癌細胞株方面則沒有變化。而以西方墨點法(
Western Blotting )偵測其蛋白質表現度,發現在五個細胞株中均有表現 出 Rb 蛋白質,而十個食道癌組織中(有三個組織未取得蛋白質),有七個 表現出 Rb 蛋白質,而另外三個未表現出蛋白質者,則包括了一個在轉錄因 子結合部位有發生變異的組織。在 p16 基因方面,以聚合酵素鏈鎖反應(
PCR, Polymerase Chain Reaction )分析基因組 DNA ( genomic DNA )的表 現和被甲基化( methylation )的狀況,發現在五個細胞株中, CE48T/VGH
、 CE81T/VGH 、 HCE6 有發生變異或有小部分的缺失, CE146T/VGH 被甲基化
, TE2 有同種接合子型缺失( homozygous deletion ),所以,這五株食道 癌細胞株的 p16 基因的基因組 DNA 均已產生變異。而在十三個食道癌組織的 基因組 DNA 中,則發現在四個有發生變異( 30.8 % ),其中包括兩個發生 點突變或小段的缺失,一個被甲基化,一個有同種接合子型缺失。而在 RNA 方面,利用反轉錄反應( Reverse Transcription )及套疊聚合酵素鏈 鎖反應( Nested Polymerase Chain Reactio, NPCR )研究以上各細胞株 及食道癌病人正常及癌組織 RNA 的結果,發現五個細胞株中,除了 HCE6 仍 有完整的 p16 基因的 cDNA 外, 146T/VGH 、 TE2 未表現出 p16 抑癌基因的 cDNA
(在基因組即已被甲基化或同種接合子型缺失), CE48T/VGH 、 CE81T/VGH 細胞株則有異種接合子型缺失( heterozygous deletion );而在食道癌 組織的 cDNA 方面,在十三個組織中,有六個表現出完整的 p16 基因的 cDNA
,有二個未表現出 p16 基因的 cDNA (在基因組 DNA 即已被甲基化或同種接合 子型缺失),三個有異種接合子型缺失;一個有同種接合子型缺失,和一 個有介入子插入( intron insertion )。在 p16 蛋白質的表現方面,利用 免子抗體對抗 p16 蛋白質片段(對抗的區域為 p16 蛋白質上第 4--13 個氨基 酸,第 103--114 個氨基酸,和第 137--156 個氨基酸。)血清進行西方墨點 法分析,結果發現五株食道癌細胞株均無 p16 蛋白質的表現,而十個食道 癌組織中(有三個組織未取得蛋白質),五個有表現出完整 p16 抑癌基因 的 cDNA 亦均有表現出蛋白質,另外一個在 RNA 有異種接合子型缺失的組織 中, p16 蛋白質則有大量表現的現象。總而言之,我們的研究結果顯示 p16 基因的變異在食道癌的演化中扮演了重要的角色;至於 Rb 基因在和轉錄因 子結合區的 DNA 序列變異的機率很低,故其在食道癌中所扮演的角色,尚 待進一步的研究才能證實。
Characterization of Tumor Suppressor Genes Rb a nd p16 in Human