國立臺灣大學醫學院醫學檢驗暨生物技術學系 碩士論文
Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology College of Medicine
National Taiwan University Master Thesis
探討 invariant NKT 細胞的活化對於 過敏性呼吸道發炎反應之影響
The Effect of Activation of Invariant NKT Cells on the Allergic Airway Inflammation
王姿君 Tzu-Chun Wang
指導教授：莊雅惠 博士 Advisor：Ya-Hui Chuang, Ph.D.
中華民國 九十八 年 七 月
July, 2009
致謝
沒想到自己也會有完成碩士論文的這一天，這本論文的完成首先當然要感謝
我的指導老師-莊雅惠老師，謝謝老師這兩年來的指導，身為老師的第一屆學生，
我很感謝老師亦師亦友的指導，在實驗上給予我各種大大小小的指導，也不斷訓 練我的思考邏輯，還有科學寫作上的技巧；在平常生活上，則是常常和我分享有 趣好笑的事情，也會替我分析未來的出路，真的很謝謝老師，沒有您，這本論文
不會完成的如此順利！當然這本論文的完成也要謝謝我的口試委員-臨床所江伯倫
老師與免疫所繆希椿老師，謝謝兩位老師在報告 proposal 時對於我未來實驗方向 所提出寶貴的建議，以及在口試時給予的意見與指導，還有您們最後給予我的肯 定讓我對於自己更有自信，謝謝您們！
另外，我也要感謝江伯倫老師家眾多的學長姐給予我實驗上的教學與幫助，
尤其是心穎學姐，從碩一時教我抓老鼠，眼窩採血，到碩二時還要不停被我問東
問西，但是學姐從來不嫌我煩（還是其實心裡有偷嫌過…XD），還會不時和我
聊天、關心我的實驗進度；真的很謝謝江家所有學長姐給予的幫助和關心！
這兩年碩士生涯當然也要謝謝實驗室學弟妹：曉玉跟 C.J. God.（這是吳希傑的英 文名字），大犧牲的時候因為有你們也進行得更順利了，當然你們也為我苦悶的 研究生涯帶來許多笑聲跟吵鬧聲，尤其是任曉玉，和你在一起的時候根本就像兩 個瘋子，還讓老師為我們實驗室封了「瘋子實驗室」的封號，實驗要做到很晚的 時候也因為有你的陪伴讓時間更的更快；還有新進的學弟妹：阿幹、肇軒跟盈均，
歡迎你們加入「瘋子實驗室」。這兩年也謝謝雅倩老師家：嘉芸學姐、凱欣、彥
君、梓明學長和 henda 學長，謝謝你們常常借我串門子聊天抱怨還有借東西；最
後當然是要感謝我最親愛的高中、大學跟研究所同學，以及我最愛最重要的太太
們：陳佳 mo、鄒雨恬跟阿用，你們為我帶來的歡笑、感動和回憶一直是我研究
所得到最珍貴的東西之一，對你們的感謝真的無法用言語表達，只好用一直當你 們的好朋友來感謝了！
最後的最後，當然要謝謝我們家人，謝謝爸媽給予我後顧無憂的學習環境，
還要容忍我不時的脾氣與任性，謝謝哥哥在假日時總是載我回到溫暖的家，你就
摘要
氣喘是一肺部發炎疾病，其臨床表徵為鳴喘、呼吸急促與呼吸道過度反應，
許多免疫細胞都會參與發炎的過程，例如：T helper 2（Th2）cells 和 eosinophils。
natural killer T cells（NKT cells）是一群特殊的 T cells，它會表現 natural killer cells 和 conventional T cells 兩者的特性，目前在 invariant natural killer cells（iNKT cells ） 的 研 究 最 多 。 當 iNKT cells 辨 識 由 CD1d 所 呈 獻 的 抗 原 如 α- galactosylceramide（α-GalCer）而活化後，可在數小時內快速分泌多種且大量的 細胞激素如 interferon-γ（IFN-γ）和 interleukin-4（IL-4），這獨特的特性使 iNKT cell 在許多疾病中扮演調控的角色。有關 NKT cells 在氣喘中扮演之角色先前研究 的結果並不一致，有團隊證明 NKT cells 會促進氣喘的產生，但另有團隊卻證明 NKT cells 的活化會抑制呼吸道過度反應與呼吸道發炎反應。此外， NKT cells 在 某些疾病不同進程時扮演不同的角色。本研究的目的是探討是否 NKT cells 在氣
喘不同疾病進程中亦扮演不同的角色，我們在氣喘疾病進程中不同時期以 α-
GalCer 活化 iNKT cells 後測量小鼠呼吸道發炎之嚴重程度是否會不同以及其機轉。
我們利用 ovalbumin（OVA）致敏引發氣喘的小鼠模式，在 OVA 致敏前或 OVA 致敏後給予 α-GalCer，之後分析小鼠呼吸道發炎反應的程度。實驗結果顯 示 OVA 致敏前給予 α-GalCer 的小鼠其呼吸道發炎反應高於致敏後才給予 α- GalCer 的小鼠，證實在氣喘疾病不同時期給予 α-GalCer 活化 iNKT cells 確實會使
小鼠產生不同嚴重程度之呼吸道發炎反應。接著我們分析致敏前或致敏後給予 α-
GalCer 兩小時與五天後小鼠的免疫反應之變化，發現在 OVA 致敏前給予 α- GalCer 可活化 iNKT cells 分泌大量的 Th2 cytokines 例如 IL-4、IL-5 與 IL-13，及 使肺部 TSLP 與 eotaxin 濃度升高，導致肺部浸潤細胞增多及 IL-4 的顯著上升。
但若是在 OVA 致敏後才給予 α-GalCer 則造成 Th2 cytokines 與 thymic stromal lymphopoietin （TSLP）的降低，終使小鼠呼吸道發炎反應不如 OVA 致敏前給予 α-GalCer 之小鼠嚴重。
這些結果顯示 naïve 環境下的 iNKT cells 與氣喘病 Th2 為主的環境下的 iNKT cells 其活化後產生的反應不同，最後造成呼吸道發炎反應之嚴重度不同。然而欲 將 α-GalCer 當作呼吸道佐劑或治療性藥物的時候，需注意 eosinophilia 的可能性。
關鍵詞:氣喘、NKT 細胞、呼吸道發炎反應、α-galactosylceramide (α-GalCer)、
支氣管肺泡沖洗液
Abstract
Asthma is an inflammatory lung disease characterized by the expansion of T helper 2 (Th2) cells and eosinophils as well as the production of allergen-specific IgE. Natural killer T (NKT) cell is a unique subset of T cells that coexpresses T cell receptor (TCR) and natural killer (NK) cell markers. The most studied NKT cells are Type 1 NKT cells, which also referred to invariant natural killer T cell (iNKT cells). iNKT cells express semi-invariant CD1d-restricted αβ TCR, therefore they can recognize glycolipid antigens (like α-galactosylceramide (α-GalCer)) presented by CD1d molecules on antigen presenting cells. Once NKT cells are activated, they rapidly produce large amount of cytokines, such as interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4). Due to this unique characteristic, they have been implicated in the regulation of immune responses associated with a broad range of diseases.
In allergic asthma, the roles of iNKT cells are controversial. Some studies demonstrate that NKT cells are important in the development of asthma. However, others demonstrate that NKT cell activation before challenge abolishes the airway hyperresponsiveness and airway inflammation in experimental murine asthma models.
These studies imply that NKT cells may play different roles in different asthma progression. Furthermore, this theory has been proved in some autoimmune diseases and allergic conjunctivitis. The aim of this study is to investigate the effect of activation of iNKT cells on the allergic airway inflammation and its mechanism.
We administered BALB/c mice with α-GalCer, a stimulator for NKT cell activation, before or after ovalbumin (OVA) immunization and measured airway inflammation of those mice after 2 times of intranasal OVA challenge. In our results, the airway inflammation was more serious in mice that administered with α-GalCer before OVA immunization than that of after OVA immunization, suggesting that activation of iNKT cells in different asthma progression could lead to different severity of airway inflammation. Moreover, we analyzed the cell components and cytokines expression in lung after 2 hours and 5 days of α-GalCer administration to study the mechanism. Our data demonstrated that mice administered with α-GalCer before OVA immuniztion could activate iNKT cells to secrete large amount of Th2 cytokines, such as IL-4, IL-5 and IL-13, and increase eotaxin and thymic stromal lymphopoietin (TSLP) expression in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), which recruit cell infiltrate in lung.
In contrast, administration of α-GalCer after OVA immunization decreased Th2 cytokines, TSLP, and airway inflammation when compared to mice administered with a-GalCer before OVA immunization.
Our data demonstrated that different immune response was noted in activation of naïve NKT cells and Th2-dominant environment NKT cells, which led to different outcome of airway inflammation in mice. However, the potential risks of treatment with NKT cell activation in human diseases should be considered.
Keyword: asthma, natural killer T cell (NKT cell), airway inflammation, α- galactosylceramide (α-GalCer), bronchoalveolar lavage fluid (BALF)
縮寫對照表
α-GalCer α-galactosylceramide
AHR airway hyper-responsiveness APC antigen presenting cell BAL bronchoalveolar lavage BALF bronchoalveolar lavage fluid CD cluster of differentiation DC dendritic cell
ELISA enzyme linked immunosorbent assay HBSS Hank’s balanced saline solution Ig immunoglobulin
IFN-γ interferon-γ IL interleukin
iNKT invariant natural killer T L liter
MHC major histocompatibility complex ml milliliter
NK natural killer NKT natural killer T OD optical density OVA ovalbumin
PBS phosphate-buffered saline rpm revolutions per minute SEM standard error of the mean TCR T cell receptor
TSLP thymic stromal lymphopoietin Th T helper
目錄
封面
口試委員審定書 授權書
致謝……….. i
中文摘要……….. ii
英文摘要……….. iv
縮寫對照表……….. vi
目錄……….. vii
圖目錄………..… ix
第一章 研究背景……… 1
1.1 氣喘之背景介紹………...……… 1
1.1.1 發炎反應 (inflammatory response)……….……….… 1
1.1.2 呼吸道過度反應 (airway hyperesponsiveness；AHR)….…….. 5
1.2 NKT cells 之背景介紹………..……… 6
1.2.1 NKT cells 的定義………..………...… 6
1.2.2 iNKT cells 的活化………....……… 6
1.2.3 NKT cells 的生物功能………..…………...… 7
1.3 NKT cells 在氣喘中扮演的角色………..……… 8
1.4 NKT cells 在疾病進程中，會扮演不同的角色..……… 9
1.5 研究目的……… 10
第二章 實驗材料與方法……….………...…… 11
2.1 實驗用小鼠……….………...…… 11
2.2 氣喘動物模式之建立……….………...….... 11
2.3 α-GalCer 之給予……….….………...…...…… 11
2.4 血清樣品的收集……….….………..……. 11 2.5 抽取小鼠支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid；BALF )… 12
2.7 流式細胞儀(flow cytometry)分析細胞表面抗原……….… 12
2.8 利用 ELISA 測量血清中 OVA-specific IgE………..………...… 13
2.9 利用 ELISA 測量 BALF 中細胞激素之濃度………...… 13
2.10小鼠肺臟細胞初代培養………..………... 14
2.11以 α-GalCer 體外刺激肺臟初代細胞………..………...… 14
2.12腹腔注射小鼠 α-GalCer 實驗………..………...… 14
2.13收集小鼠腹腔沖洗液………..………...… 15
2.14繪圖及統計分析………..………...… 15
第三章 結果………..……….………...… 16
3.1 小鼠在 OVA 致敏前與致敏後注射 α-GalCer 對於呼吸道發炎反 應嚴重程度之影響……….……….…...… 16
3.2 探討小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 兩小時後，肺 部的iNKT cells 與細胞激素有何變化….……….…...… 17
3.3 以 OVA 致敏小鼠兩次後，其肺部的 iNKT cells 升高……….…...… 19
3.4 探討小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後，肺部 之細胞組成與細胞激素有何變化.………....……….…...… 20
3.5 研究 α-GalCer 是否可直接影響初代培養之肺臟細胞產生 eotaxin 之能力………....……….……….…..… 22
3.6 探討腹腔注射 α-GalCer 是否吸引 eosinophils 至腹腔中…...….…... 23
第四章 討論…………....……….………….….…..… 24
圖…………....……….………...….…..… 29
參考文獻……….………...….………..… 52
附錄……….………...….………..… 61
圖目錄
圖一． protocol 1。………..……….….... 30
圖二． 在 OVA 致敏之前或之後給予 α-GalCer 皆會使小鼠血清 OVA 專一性 IgE 升高，但以 OVA 致敏之前給予 α-GalCer 的小鼠 升高較多……….………..…….…... 31
圖三． 在 OVA 致敏前給予 α-GalCer 會使小鼠 BAL total cell number 升高……….……….. 32
圖四． 在 OVA 致敏前給予 α-GalCer 會使小鼠 BAL cells 中 eosinohpils 佔 BAL total cells 之百分比與細胞數上升………. 33
圖五． protocol 2……….……….…………. 34
圖六． BAL cells 中 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比…..…….………. 35
圖七． BAL cell 中 iNKT cell 佔 lymphocytes 之百分比及細胞數…..……. 36
圖八． BALF 中 IFN-γ、IL-4、IL-5 和 IL-13 濃度…..……...…..………… 37
圖九． BALF 中 eotaxin 濃度………..………… 38
圖十． BALF 中 TSLP 濃度……..…….………..………….... 39
圖十一． BAL total cell number………..…………. 40
圖十二． BAL cell 中 iNKT cell 佔 lymphocytes 之百分比及細胞數…….….. 41
圖十三． BAL cell 中 eosinohpil 佔 total BAL cells 之百分比及細胞數…….. 42
圖十四． BAL cell 中 conventional CD4+ 和 CD8+ T cell 以及 NK cell 細 胞數……..…….………..…..………….... 43
圖十五． BALF 中 IFN-γ、IL-4、IL-5 和 IL-13 濃度……...…..………….... 44
圖十六． BALF 中 eotaxin 濃度………..…..………..…….... 45
圖十七． BALF 中 TSLP 濃度………..…..………... 46
圖十八． 以 α-GalCer 刺激初代培養之肺臟細胞，其培養基上清液中 eotaxin 濃度………..…..………...….... 47
圖十九． protocol 3………..…..…………... 48
圖二十． 腹腔沖洗液中細胞總數與 eosinophils 百分比和細胞數….……... 49
圖二十一． 在不同氣喘疾病進程時給予 α-GalCer 刺激 iNKT cells 會使
小鼠產生不同嚴重程度之發炎反應的可能機制…..………....….... 50
第一章 研究背景
1.1 氣喘之背景介紹
支氣管氣喘是現今主要的公共健康問題之一，其盛行率在近二十年來有戲劇 性的增加，在已開發國家約每八人就有一人受到影響，而在開發中國家受影響的 人數更多，造成盛行率上升的原因可能是受到人類生活環境的快速改變，例如：
許多感染症的發生率、公共衛生及空氣品質都受到改變(1, 2)。
氣喘是一種免疫方面的疾病，伴隨許多發炎症狀及臨床表徵，例如：鳴喘
（wheezing）、呼吸急促及因為呼吸道過度反應（airway hyper-responsiveness ； AHR）和可逆性呼吸道阻塞（reversible airway obstruction）引起的咳嗽。其中，
過敏性氣喘為最常見的一種氣喘，約佔了70~80%的病人(3)。
1.1.1 發炎反應（inflammatory response）
在正常情況下，發炎為一種對宿主有益的免疫系統反應，它主要是宿主對於 外來、非本身、且可能有害的抗原（例如：微生物）刺激之下所產生的保護作用，
此反應最終目的為消除外來的生物體或某些物質，恢復組織的完整性(4)，當這些 刺激消除後，內源性的停止訊號（stop signals）或是 anti-inflammatory mediators 會停止這些發炎反應(5-7)。
氣喘為一種呼吸道發炎反應的疾病，包含：當受到外來抗原（例如：吸入性 過敏原、花粉或是微生物感染）刺激之下產生的急性發炎，以及在缺少抗原刺激 之下仍一直存在的慢性發炎反應，而這些慢性發炎反應會使病人肺功能下降而導 致呼吸道過度反應(8)。
氣喘的免疫反應可分為早期反應（early-phase reaction）及晚期反應（late- phase response）；早期反應是當氣喘患者吸入之過敏原和肥大細胞（mast cells）
上的IgE作交叉結合（cross-link），導致肥大細胞立即釋放histamine、leukotrienes 和prostaglandin，最後造成黏液大量分泌、血管舒張以及呼吸道阻塞。上述早期 反應通常在一小時內消退，而晚期反應在三到四小時內開始作用，約八小時達到 尖峰，最後在幾天內消退；晚期反應是由於抗原呈獻細胞呈獻過敏原給T cell，使
mast cells分泌之細胞激素及趨化激素（chemokine）會吸引發炎細胞到呼吸道，其 中引發呼吸道上皮細胞受損，造成呼吸道basement membrane增厚；而這些發炎細 胞中以eosinophils最為重要。
持續性氣喘（persistent asthma）在支氣管會有 eosinophils、mast cells 以及 CD4+ T lymphocytes 的發炎性浸潤(9)，其他細胞例如：dendritic cells (DCs)的抗原 呈獻功能；上皮細胞、皮膚纖維母細胞及呼吸道平滑肌分泌的 pro-inflammatory mediators 像是 eicosanoids、細胞激素、趨化激素、生長因子（growth factors）和 蛋白酵素（proteases）也都被認為和持續性氣喘有關(4)。
1.1.1.1 Mast cells
在某些環境因子（如：過敏原）誘發及血漿滲透壓上升之下，它會藉由釋放 許多 bronchoconstrictors，包含 histamine（已先合成並儲存於 graunles）、lipid mediators leukotriene C4、leukotriene D4、leukotriene E4 及 prostaglandin D2（上述 則是 mast cells 活化後才合成）而影響氣喘的過程。另外，mast cells 也會釋放許 多細胞激素和過敏性發炎反應有關，像是 interleukin（IL）-4、IL-5 及 IL-13。也 有研究認為呼吸道平滑肌內存在的mast cells 和呼吸道過度反應有關(10)。
1.1.1.2 Eosinophils
Eosinophils 是一多形核白血球，在骨髓裡由 totipotent stem cell 分化而來；在 T cells 及 T cells 分泌的 IL-3、IL-5 及 GM-CSF（granulocyte-macrophage colony stimulating factor）的調控下會大量產生；IL-9 對於 eosinophils 的產生也同樣重要；
IL-5（也被稱為 eosinophil differentiation factor）則是這些細胞激素中最具特異性 的，其可幫助未成熟 eosinophils 的分化(11)；若利用基因轉殖鼠（transgenic mice）
過量表現IL-5 會使小鼠產生嚴重的 eosinophilia(12)，反之，若小鼠的 IL-5 基因缺 失，再經過抗原之 challenge 後，原應在週邊血及肺臟產生之氣喘性 eosinophilia 則大量下降(13)；研究也發現血液有 eosinophilia 的病人，其血清中 IL-5 也會升高，
且 IL-5 的 升 高 會 發 生 在 eosinophilia 之 前 (14) 。 而 關 於 化 學 趨 化 因 子
（chemoattractants）方面，則是 eotaxin-1 和 eotaxin-2 對 eosinophils 較具特異性，
它們主要由上皮細胞與內皮細胞分泌(15)，經由和 eosinophils 上的 CCR-3 結合後
傳遞訊息(16)，吸引 eosinophils 到作用處；在氣喘疾病中，上述過程對於吸引 eosinophils 到呼吸道也是不可或缺的。
目前關於 eosinophils 的研究多集中在過敏疾病，尤其是氣喘，先前分析氣喘 病人痰液、支氣管肺泡沖洗液（BALF；bronchoalveolar lavage fluid）或肺組織 切片的研究證實：eosinophilia 和氣喘之間確實存在有正相關，在過敏性及非過敏 性氣喘病人中，其BAL eosinophils 比起正常人有顯著升高，此外，更進一步發現 BAL eosinophilia 和呼吸道過度反應、histamine 濃度、脫落之呼吸道上皮細胞，
以及血管通透性都存在著正相關，而和 FEV1（Forced Expiratory Volume in 1 second；一秒內用力呼氣量）則是負相關(14)；類似的研究也發現在氣喘後期反 應時，在BAL eosinophils 升高時 ECP（eosinophil cationic protein）也會提高，證 實在氣喘後期反應時 eosinophils 確實會去顆粒化（degranulate）而釋放 ECP，使 ECP 升高(17)。
因此eosinophils在過敏性氣喘呼吸道發炎扮演一個重要的角色，目前已知機 制為：在氣喘晚期反應中，Th2 cytokines及mast cells分泌之細胞激素及趨化激素 會促進eosinophils生長分化和吸引eosinophils到呼吸道，當eosinophils被吸引到呼 吸道後會釋放各種granule protein、mediator及其他物質，包含major basic protein
（MBP）、eosinophil cationic protein（ECP）、eosinophil peroxidase（EPO）、
oxygen radicals、LTC4（leukotriene C4）、PAF（platelet-activating factor）和細胞 激 素 ， 而 導 致 黏 液 分 泌 、 呼 吸 道 平 滑 肌 收 縮 導 致 呼 吸 道 過 度 反 應 （airway hyperesponsiveness；AHR）、呼吸道上皮細胞損傷、組織重塑（tissue remodeling）
以及使氣喘惡化。雖然產生eosinophilic airway inflmmation的過程非常複雜，但 Th2 cytokines例如IL-4、IL-5及IL-13已被認為在eosinophils的吸引及活化過程中扮 演重要角色(14, 18)。
1.1.1.3 Macrophages
macrophages 的數目在氣喘病人的呼吸道中有上升的現象。macrophages 是源 自於血液中循環的 monocytes，因為化學趨化因子（chemoattractants）像是 CCL2 與 CXCL1 而被吸引到肺(19)。且有越來越多的證據認為肺部的 macrophages 會釋
放趨化激素吸引 neutrophils、monocytes 和 T cells，也會釋放蛋白質酵素尤其是 matrix metallopeptidase 9（MMP9），來調控呼吸道的發炎反應(20)。
1.1.1.4 Th1 cells 及 Th2 cells
在氣喘病人的呼吸道中，CD4+ cells 有上升的現象，特別是 Th2 cells 會有顯 著的上升，相較於正常人在呼吸道是Th1 cells 較為顯著(3)。
Th2 cells 會分泌 Th2 cytokines，例如 IL-4、IL-5 與 IL-13；IL-4 會使 B cells 產 生 IgE(10) ， 也 會 起 始 priming of Th2-effector cells ； 利 用 IL-4 基 因 缺 失
（deficient）的小鼠發現：在抗原刺激之後也無法使小鼠呼吸道產生發炎反應(21)，
證明 IL-4 對於呼吸道發炎扮演一個很重要的角色；IL-5 則可使骨髓的 eosinophils 分化及成熟，並且可以吸引 eosinophils 到發炎的部位(15)；吸引 eosinophils 到呼 吸道是氣喘其中之一的特徵，且eosinophilia 的程度和氣喘嚴重度也有正相關；而 IL-13 和調控 B cells 產生 immunoglobulin E（IgE）、黏液過度分泌、eosinophils 和mononuclear cells 的浸潤、呼吸道過度反應（AHR）等氣喘的疾病特徵有關(22, 23)。
相較於Th2 cells，Th1 cells在氣喘扮演的角色仍未明確，一方面Th1 cells被認 為和抑制氣喘有關，因為Th1 cytokines（例如：IFN-γ和IL-12）和Th2 cytokines有 拮抗作用，且重組（recombinant）之 IFN-γ或是IL-12在氣喘小鼠模式皆被證實可 以抑制呼吸道 eosinophilia及呼吸道過度反應(24)，另外Th1 cells重要的轉錄因子
（transcription factor）T-bet也被發現在氣喘病人的T cells中表現量下降(25)。但是 另外一方面adoptively transfer Th1 cells到小鼠體內，再以過敏原challenge小鼠，發 現BAL中leukocytes數目會增加，其中以neutrophils的上升最為顯著，更進一步發 現adoptively transfer Th1 cells並不能降低Th2 cells引起的呼吸道過度反應，且會引 起嚴重的肺部neutrophils 浸潤(26)，所以也有研究者認為Th1 cells並不一定只會抑 制氣喘，在某些情況下可能會加重氣喘的嚴重程度。
1.1.1.5 B cells
B cells在過敏性氣喘中亦扮演重要的角色。Th2 cytokines IL-4及IL-13會引發 B cells產生免疫球蛋白class switching而產生IgE，所產生的過敏原專一性的IgE會
藉由和mast cells與basophils表現的high-affinity IgE Fc recptors（FcεRI）結合，也 會和其他發炎細胞（包含B cells、macrophages，可能也有eosinophils）表現的 low-affinity IgE Fc recptors（FcεRII）結合，而引起氣喘的發炎反應(27)。
1.1.1.6 Dendritic cells（DCs）
DCs是一專業的抗原呈獻細胞，DCs可呈獻過敏原的peptides給naïve T cells，
使之分化為Th2 cells來調控Th2 cells的反應(28)。研究發現表皮細胞和mast cells所 分泌大量的thymic stromal lymphopoietin（TSLP）可使myeloid DCs成熟(29)。也 有研究發現在過敏性氣喘中TSLP會升高，而TSLP已知可刺激DCs的分化與活化，
包含表現Th2 cell-attracting chemokine CCL17和CCL22，更進一步發現利用經過 TSLP刺激的DCs以primed naïve CD4+ T cells，會使T cells產生IL-4、IL-5與IL- 13(30)。
1.1.2 呼吸道過度反應（airway hyperresponsiveness；AHR）
呼吸道重塑（airway remodeling）和發炎反應會造成呼吸道過度反應以及呼 吸道阻塞（airway obstruction），導致呼吸急促和喘鳴，此也為氣喘的主要特徵 之一。
呼吸道過度反應定義為對非特異性刺激物的刺激產生反應而增加呼吸道的收 縮，呼吸道過度反應可以利用非特異性刺激物導致氣喘病人的呼吸道收縮，一般 會吸入低到高劑量的刺激物，例如：methacholine，並製作dose-response curve。
呼吸道過度反應明確的機制並不清楚，但其強弱和呼吸道發炎的程度相關，而其 他的因子，包含減小呼吸道直徑、增加平滑肌收縮能力、表皮損傷程度、不正常 的神經元調控、增加微血管通透性與許多發炎相關的mediators也都和呼吸道過度 反應有關(31)。
造成持續性氣喘的致病因素為：常見吸入性過敏原造成的過敏原致敏(32, 33)，
而這樣的致敏會造成過敏原專一性的 IgE 與 CD4+ Th2 cells 的產生；在過敏原刺 激之下，mast cells 會藉由 IgE 的 cross link 而活化，並釋放顆粒（degranulation）
與mediators，包含 histammine 及 leukotriene，使呼吸道阻力上升(34, 35)；然而在
素會直接作用在呼吸道平滑肌和表皮細胞而造成呼吸道過度反應(36)，在動物模 式中，去除CD4+ Th2 cells 後則小鼠不產生呼吸道過度反應(3)。
1.2 NKT cells之背景介紹
NKT cells被認為和許多疾病有關，例如移植、腫瘤、自體免疫疾病、動脈硬 化症、過敏與感染(37, 38)。
1.2.1 NKT cell 的定義
NKT cells 會表現 NK cells 和 conventional T cells 兩者的特性，依照其 T cell receptor（TCR）repertoire 的不同，NKT cells 被分為三群：
（1）type 1 NKT cells：也被稱為 iNKT（invariant NKT）cells，其會表現 NK lineage 的 receptor（ 例 如 C57BL/6 小 鼠 的 NK1.1 ） 以 及 semi- invariant CD1d-restricted 的 αβ TCR（T cell receptor），而這些 T cell receptor 在小鼠體內超過 80%為 Vα14-Jα18／Vβ8，Vβ7，Vβ2，在人則 為Vα24-Jα18／Vβ11(37)；這群細胞會辨識由 MHC class I-like CD1d 所 呈 獻 的 抗 原 ， 故 可 以 藉 由 使 用 CD1d tetramers loaded with α- galactosylceramide（α-GalCer；為 marine sponge 的衍生物）去特異性地 鑑別出iNKT cells(3)。
（2）type 2 NKT cells：也會辨識由 MHC class I-like CD1d 所呈獻的抗原，但 是其TCRs repertoire 為多變化的，故無法藉由使用 CD1d tetramers loaded with α-GalCer 去特異性地鑑別出 iNKT cells(3)。
（3）type 3 NKT cells：所辨識的抗原是由 MHC class I 及 class II 呈獻，而非 CD1d(3)。
這三種 NKT cells 在氣喘及呼吸道過度反應的角色以 iNKT cells（type 1 NKT cells）的研究最多(39, 40)。
1.2.2 iNKT cells 的活化
iNKT cells 辨識由 MHC class I-like CD1d 分子所呈獻的醣脂類（glycolipids）
抗原。其中 CD1d 會表現於氣管、支氣管、腸子的黏膜表皮細胞，以及肝細胞、
T cells、B cells、macrophages、dendritic cells 這些細胞表面(3)。
CD1d 所呈現的醣脂類（glycolipids）抗原可以是內源性的（endogenous）或 是外源性的（exogenous）；若抗原呈獻細胞（antigen presenting cell；APC）受到 損 傷 ， 便 有 可 能 會 呈 獻 自 體 的 glycolipids （ 即 內 源 性 抗 原 ） (39) ， 例 如 ： lysosomal glycosphingolipid isoglobotrihexosylceramide（iGb3）(41, 42)。而外源性 抗 原 則 包 含 在 革 蘭 式 陰 性 菌 、 脂 多 醣 陰 性 （lipopolysaccharide-negative ） 的 Sphingomonadaceae 和 Rickettsiaceae families、Borrelia burgdorferi 找到的細菌性 glycosphingolipid(42-44)。
1.2.3 NKT cells 的生物功能
從 resting DCs 呈現抗原例如 α-GalCer 給 NKT cells，之後 NKT cells 和 DCs 會互相活化(45)，而 NKT cells 活化後，其 CD40L、Th1 和 Th2 的細胞激素和趨 化激素表現量會上升；而CD40 cross-linking 會引起 DCs 的 CD40、CD80、CD86 以及IL-12 表現量的上升，進一步加強 NKT cells 的活化和細胞激素的產生(46)，
此反應相當快速，NKT cells 會在刺激後的幾分鐘到幾小時內產生大量的細胞激素，
包含IL-4、IL-13 以及 IFN-γ(47, 48)，顯示其為一種 innate-like immunity。而這個 反應的增殖活化了 NK cell 的 cytolysis 以及 IFN-γ 的產生(49, 50)，也使 DC 的 costimulatory properties、MHC class I-和 MHC class II-mediated antigen presentation 被upregulation(45, 51)。
NKT cells 不同於其他淋巴細胞的地方在於其可短時間大量釋放 IFN-γ 與 IL-4，
除此之外也可分泌其他Th2 cytokines 例如 IL-13(47, 48)。全身性的注射 α-GalCer 會使血清中偵測到早期的IL-4 burst，接著是 NKT cells 和 transactivated NK cells 產生延長較久的 IFN-γ burst，以及 DCs 產生部份的 IL-12(37)。總言之，NKT cells 快速產生的細胞激素可增加 DCs、NK cells 以及 B cells 的功能，去增強並調 控 adaptive immune response(37) 。 然 而 NKT cells 的 TCR 也 會 很 快 的 被 downregulation，反應之後三到四天內會大量的凋亡，導致持續性的 depletion，直 到從胸腺的前驅物（precursors）再度產生新的 NKT cells(52)。
除 此 之 外 ， NKT cells 快 速 產 生 的 細 胞 激 素 也 會 調 控 抗 微 生 物
（antimicrobial）、自體免疫、抗腫瘤（antitumor）以及抗移植（antitransplant）
免疫反應的發展(37, 38, 53)，導致「造成疾病」或是「預防疾病」兩者其中之一 的結果；例如研究認為 NKT cells 在 PBC（primary biliary cirrhosis）中是扮演造 成疾病的角色，在 PBC 病人的肝切片中有較正常人多的 iNKT cells(54)；在 PBC 動物模式中亦證明去除iNKT cells 會降低小鼠 PBC 症狀(55)；此外發現 PBC 病人 的自體抗體會辨識 PDC-E2 酵素的 epitope，此酵素在 Sphingomonas 具有高度保 留性，而Sphingomonas 細胞壁的醣脂類（glycolipids）又發現可活化 NKT cells，
故認為NKT cells 在 PBC（primary biliary cirrhosis）中是扮演造成疾病的角色(37)。
然而有研究發現利用 CD1d 的基因剔除鼠研究發現當小鼠缺少 iNKT cells 時，
IAV（influenza A virus）專一的免疫反應會降低，IAV titer 升高，導致小鼠無法 清除病毒，故認為NKT cells 對於 IVA 的感染症中是扮演疾病預防的角色(56)。
1.3 NKT cells 在氣喘中扮演的角色
由氣喘臨床病人的研究發現病人的痰液或是支氣管肺泡沖洗液中 iNKT cells 所佔的比例較正常人高(57-59)，且 iNKT cells 的數目和氣喘嚴重程度呈正相關 (60)，進一步利用 α-GalCer 刺激氣喘病人的 pulmonary iNKT cells，發現這群 iNKT cells 會分泌 IL-4 和 IL-13，推測 iNKT cells 與其分泌的 IL-4 和 IL-13 在氣 喘疾病中扮演重要的角色(61)。
近年來也有許多團隊利用基因剔除鼠研究 NKT cells 對於氣喘發展的重要性；
2003 年 Lisbonne, M. et al.研究在以 ovalbumin（OVA）致敏 Jα18-/- mice（此小鼠 會缺少invariant Vα14,CD1d-restricted NKT cells），發現並無法使小鼠產生呼吸道 過度反應，其他呼吸道eosinophilia 以及 OVA-specific IgE 等小鼠的氣喘特徵都會 降低，且BALF 內的 IL-4 及 IL-5 減少，因此作者推測 iNKT cells 對於 OVA 引起 小鼠氣喘的產生是非常重要的(62)。同年，Akbari, O. et al.利用 OVA 致敏 Cd1d1-/- mice（此小鼠會因為 NKT cells 缺少了 class I restricting element，而無法產生 NKT cells）或是 Jα281-/- mice（Jα281 也稱作 Jα18 或 Jα15；因為 NKT cells 缺少 invariant TCR，導致此小鼠缺少 NKT cells），在 OVA challenge 後發現無法使此 兩種小鼠產生呼吸道過度反應，且呼吸道eosinophilia 皆會降低，進一步研究發現
adoptive transfer wild type 小鼠的 NKT cells 到 Jα281-/-小鼠體內後，再以OVA 致 敏小鼠後又會使呼吸道過度反應再度產生；但若 adoptive transfer 的是 Il4-/-/Il13-/- 小鼠的NKT cells，則無法回復呼吸道過度反應，故作者推論 NKT cells 所產生的 IL-4 及 IL-13 對於小鼠產生呼吸道過度反應的過程是很重要的(39)。然而，有些 研究團隊以類似的方法進行實驗，卻沒有得到上述的實驗結果(37)。
另外也有研究團隊是利用給予小鼠 α-GalCer 活化 NKT cells 後，研究 NKT cells 對於發展氣喘疾病的影響，但目前的結果並不一致：naïve 小鼠利用鼻腔注 射 α-GalCer 活化 NKT cells，發現可使小鼠的呼吸道過度反應上升，血清中 IgE 及 IgM 升 高 ， 也 會 產 生 eosinophilic 及 lymphocytic peribronchiolar inflammation(63)；然而在 OVA 致敏的小鼠體內，在 OVA challenge 前給予 α- GalCer 以活化 NKT，卻可使小鼠產生的氣喘症狀（例如：呼吸道過度反應、呼 吸道 eosinophilia）下降，及 OVA-specific IgE 及 Th2 cytokines IL-4、IL-5 降低 (64)；由上述所知 NKT cells 在小鼠氣喘中扮演的角色尚無一致結論。
1.4 NKT cells 在疾病進程中，會扮演不同的角色
在某些疾病中，NKT cells 的功能會隨著疾病進程的不同有所改變。在 systemic lupus erythematosus（SLE）的小鼠模式中（（NZB×NZW）F1 mice），
發現小鼠在四周大（young age）時，其 NKT cells 數目和正常 C57BL/6 小鼠並無 統計上差異，但隨著年齡的增加及疾病進程的發展，NKT cells 的數目及分泌細胞 激素的能力也跟著升高(65)。在自體免疫 PBC（primary biliary cirrhosis）的小鼠 模式中，發現隨著年齡的增加及疾病進程的發展，NKT cells 的數目也跟著升高，
但其分泌 IFN-γ 能力則是隨著年齡上升而降低，推測 NKT cells 及其分泌 IFN-γ 的能力對於 PBC 疾病的發展扮演一個角色(55)。除此之外，在實驗性過敏性結膜 炎（experimental allergic conjunctivitis）的小鼠模式中，若在以 ragweed 致敏小鼠 的同時也給予 α-GalCer，則小鼠 Th2 cells 反應會上升，過敏性結膜炎嚴重性也會 升高；但若在以ragweed 致敏小鼠後、antigen challenge 前才給予小鼠 α-GalCer，
則小鼠的疾病會受到抑制(66)。由以上實驗結果顯示 NKT cells 具有調控功能，會 在疾病的不同階段扮演不同的功能。
1.5 研究目的
目前研究 NKT cells 在過敏性氣喘所扮演角色的結果並不一致，有團隊研究 結果認為 NKT cells 對於 naïve 小鼠發展氣喘的過程中扮演一個重要的角色(63)；
但另外一些團隊卻認為在氣喘小鼠模式下 challenge 前才活化 NKT cells 可降低小 鼠呼吸道過度反應及發炎反應(64)。這不一致的結果是否因在小鼠氣喘疾病進程 中的不同時期，NKT cells 對於過敏性氣喘之影響不同，就如同 NKT cells 在某些 自體免疫疾病與過敏性結膜炎的疾病進程中扮演不同的角色一樣(55, 65)。因此本 研究的目的為探討在過敏性氣喘不同疾病進程時活化 NKT cells 對於呼吸道發炎 反應之影響。
首先，我選擇以 OVA 致敏的小鼠氣喘模式當作研究氣喘疾病的工具，並將
小鼠分成三組，分別為鼻腔內注射 PBS（對照組）、在 OVA 致敏前鼻腔內注射
α-GalCer，和在 OVA 致敏後鼻腔內注射 α-GalCer，以研究在 OVA 致敏前及致敏 後兩個不同的疾病進程時，活化 iNKT cells 是否會造成氣喘的發炎反應有所不同。
另外，我們設計分別在給予 PBS 或 α-GalCer 後兩小時及第五天犧牲小鼠，測量 其 BALF 細胞激素及 BAL cells 之變化，以研究造成氣喘呼吸道發炎反應嚴重程 度不同之機轉。
第二章 實驗材料與方法
2.1 實驗用小鼠
BALB/c 雌性小鼠，六週大，購自台灣大學醫學院動物中心或是國家實驗動 物中心，並由台大醫學院動物中心代為飼養。
小鼠飼養於塑膠動物籠中， 舖設厚實墊料，每籠小鼠數目在6隻以下，給予 充足食物及飲水，動物房中溼度60 ± 10%，溫度為 21 ± 2 ℃，並有適當光週期 (日照時間：每日八時至二十時)。動物照護與動物操作流程經國立台灣大學動物 委員會（Animal Committee of National Taiwan University）核定。
2.2 氣喘動物模式之建立
如圖一：小鼠在第 0 天時，利用腹腔注射（intraperitoneally；i.p.）OVA
（ovalbumin，Sigma Chemical Co.，Cat. NO. A5503）50µg 加上佐劑 aluminum hydroxide（alum；Pierce Chemical，Imject®Alum，Cat. NO. 77161） 2mg，在第 14 天及第 28 天時再次腹腔注射 OVA 25µg 及佐劑 alum 2mg，最後在第 38 與 39 連續兩天，以鼻腔注射（intranasal；i.n.）OVA 100µg / 40µl PBS 以 challenge 小鼠。
2.3 α-GalCer 之給予
第一部份實驗（如圖一），將小鼠分成三組，分別為「PBS」組在第 0 天及 第21 天均以鼻腔內注射 40µl PBS；「α-GalCer before」組是在第 0 天 OVA 致敏 前以鼻腔內注射2µg α-GalCer in 40µl PBS，而在第 21 天鼻腔注射 40µl PBS；「α- GalCer after」組是在第 0 天鼻腔注射 40µl PBS，在第 21 天鼻腔注射 2µg α-GalCer in 40µl PBS。
第二部份實驗（如圖五），將小鼠分為四組，分別為「naïve PBS」組是在第 0 天以鼻腔內注射 40µl PBS；「naïve α-GalCer」組是在第 0 天以鼻腔內注射 2µg α-GalCer in 40µl PBS；「OVA PBS」組是在第 21 天以鼻腔內注射 40µl PBS；
「OVA α-GalCer」組是在第 21 天鼻腔注射 2µg α-GalCer in 40µl PBS。
於實驗進行第 0、14、21、28、35天對小鼠進行眼窩採血 （retro-orbital）以 收集小鼠血液。將小鼠以pentobarbital麻醉後，以pasteur pipet自眼窩靜脈竇採血，
約取 100 ~200 µL血液，靜置 1~2 小時後，以6000 rpm 轉速離心 10分 鐘，收集血 清，於 -20℃ 保存。
2.5 抽取小鼠支氣管肺泡沖洗液（bronchoalveolar lavage fluid；BALF）
小鼠犧牲後，剪開頸部皮肉，用鑷子將氣管外側肌肉撕開，使氣管露出，在 靠近頭部之氣管上剪開一小洞，以靜脈置留管插入氣管，將軟管置留於氣管內，
以1ml HBSS buffer（Hank’s balanced salt solution）透過軟管沖洗支氣管肺泡，重 複三次，第一次沖洗液的上清液保存在-20℃，而三次沖洗液的細胞則resuspend到 1ml HBSS buffer，利用counting chamber計數細胞總數，細胞組成則分別利用顯微 鏡計數並分類玻片上400顆細胞，或是經由細胞表面抗原染色後利用流式細胞儀
（flow cytometry）分類。
2.6 製備 BAL cell 玻片
收集小鼠支氣管肺泡沖洗液之細胞後，將調整細胞濃度為 5×105 cells/ml，取 200µl 細胞液並利用 cytospin 機器（Shandon Cytospin 3 Centrifuge）離心 500rpm，
4 分鐘，將細胞固定於玻片上，玻片風乾、經由 Liu’s stain 染色後，利用顯微鏡
計數 400 顆細胞，依據不同型態及染色結果判別細胞，將細胞分類成巨噬細胞
（macrophage）、嗜中性白血球（neutrophil）、嗜酸性白血球（eosinophil）以及 淋巴球（lymphocyte）。
2.7 流式細胞儀（flow cytometry）分析細胞表面抗原
利用螢光標的之抗體結合到細胞上表現的特異分子上，透過流式細胞儀機器，
對細胞表面分子的表現情形加以分析。
將欲分析之細胞分裝成 5×105/ tube，6000 rpm 離心兩分鐘，將細胞團塊拍散 後，加入 50µl 0.2% BSA in PBS 再加入 0.5µl Fc blocker（anti-mouse CD16/32 blocks Fc binding；eBioscience Cat. No. 14-0161-85，clone 93），於 4℃作用 10 分 鐘，再加入 50µl 0.2% BSA in PBS 以及各種欲分析螢光標的的抗體，FITC-
conjugated anti-CD8（Cat. No. 100705，clone 53-6.7）、PE-conjugated anti-CD19
（Cat. No. 115507，clone 6D5）、APC-conjugated anti-CD11c（Cat. No. 117309，
clone N418）、PerCP/cy5.5-conjugated anti-CD4（Cat. No. 100433，clone GK1.5 ）、
APC-conjugated anti-CD3 （ Cat. No. 100311 ， clone 145-2C11 ） ， 以 上 皆 購 於 Biolegend；PE/Cy5-conjugated anti-CD3（Cat. No. 15-0031-82，clone 145-2C11 ）、
FITC-conjugated anti-DX5 （ Cat. No. 11-5971-63 ， clone DX5 ） ， 以 上 皆 購 於 eBioscience；PE-conjugated CD1d:PBS57 tetramer（the Tetramer Core Facility of the National Institutes of Health, USA），加入抗體後，於 4℃作用 30 分鐘，再以 1 ml 0.2% BSA in PBS 沖洗細胞，6000rpm 離心兩分鐘，去除上清液，拍散細胞團塊 後，加入0.5 ml 0.2% BSA in PBS，即可上機分析。
2.8 利 用 enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA） 測 量 血 清 中 OVA- specific IgE
OVA 以 coating buffer 稀釋至 10µg/ml，每個 ELISA 盤的 well 加入 100µl，4
℃靜置過夜，隔天以PBS 沖洗 well 兩次後，每個 well 加入 200µl 3% BSA in PBS 當作 blocking，室溫靜置兩小時，再以 PBS 沖洗 well 四次後，每個 well 加入 200µl sample（檢體稀釋 200 倍），4℃靜置過夜，隔天以 PBS 沖洗 well 六次後，
加入 100µl 1µg/ml 的 biotin-anti-mouse-IgE（BD Bioscience，Cat. NO. 553419，
clone R35-118），室溫靜置四十五分鐘，再以 PBS 沖洗 well 八次後，加入 100µl 1µg/ml 的 avidin-peroxidase（PIERCE，Cat. NO. 29994），避光，室溫靜置三十分 鐘，再以 PBS 沖洗 well 十次後，加入 100µl tetramethylbenzidine substrate（TMB）
（Clinical Science Products，Cat. NO. 01016-1），最後以 ELISA reader（Cisbio Bioassays，SpectraMax M5e）讀取OD450nm減去OD540nm的吸光值。
2.9 利用 ELISA 測量細胞激素之濃度
小鼠的第一次支氣管肺泡沖洗液與體外刺激初代培養肺臟細胞所得到之上清 液，皆利用 R&D DuoSet® ELISA kit 分別定量 IL-4（Cat. NO. DY404）、IFN-γ
（Cat. NO. DY485）、IL-5（Cat. NO. DY405）、IL-13（Cat. NO. DY413）、
eotaxin（Cat. NO. DY420）與 TSLP（Cat. NO. DY555）之濃度；步驟皆遵照產品 所附之說明書。
2.10 小鼠肺臟細胞初代培養
無菌狀態下將小鼠（BALB/c）肺臟取下，以 HBSS buffer 沖洗數次以去除血 液及其餘雜質，將肺臟置於含10% FBS α-MEM modification medium（以下簡稱 為培養基（medium））的培養皿中，將肺臟剪成許多小塊，越小越好，之後以無 菌針筒磨碎小組織塊，將含磨碎小組織塊之所有培養基（medium）取入 15ml 離 心管，4℃離心 1500rpm 五分鐘，此時管內應分為三層（最上層含小組織塊，中 層為液體，最下層為細胞團塊），將最上層之小組織塊取入無菌管子內備用，丟 棄中層液體後將最下層細胞團塊打散，加入1ml ACK lysing buffer 作用一分鐘使 紅血球溶解，加入 9ml 培養基，4℃離心 1500rpm 五分鐘，丟棄上清液，再以 HBSS buffer 重複洗細胞團塊兩次，丟棄上清液打散細胞團塊後，取 15ml 培養基
到離心管內均勻混合細胞，並將全部液體取置 10cm 培養皿中，置於培養箱培養
10~14 天，期間每 2~3 天需更換培養基，待細胞長至約培養皿之八分滿時，以 trypsin 使培養皿上之細胞脫落，即可取細胞進行實驗。
2.11 以 α-GalCer 體外刺激肺臟初代細胞
以 trypsin 使初代肺臟細胞脫落後，將細胞液以培養基調整成 2×105 cells/ml，
將 48-well plate 的每個 well 加入 500µl 調整過之細胞液，培養過夜（overnight）
後，將培養基丟棄，加入各種刺激物：(1) 500µl 培養基，為 cell only 對照組，(2) 250ng α-GalCer in 500µl 培養基，故 α-GalCer 濃度為 125ng/ml，(3) 1000ng α- GalCer in 500µl 培養基，故 α-GalCer 濃度為 500ng/ml，(4) 4000ng α-GalCer in 500µl 培養基，故 α-GalCer 濃度為 2000ng/ml，(5) 600 units IL-4 in 500µl 培養基，
故 IL-4 濃度為 300 units/ml；刺激四十八小時後，收集上清液以 ELISA 測量 eotaxin 濃度。
2.12 腹腔注射小鼠 α-GalCer 實驗
將小鼠（BALB/c）分為兩組，在第 0 天時，一組腹腔注射 200µl PBS，另一 組注射2µg α-GalCer in 200µl PBS，五天後犧牲小鼠，收集其腹腔沖洗液。
2.13 收集小鼠腹腔沖洗液
小鼠犧牲後，將小鼠腹部表面之毛髮及皮膚去除，切記保留完整腹腔外膜，
以5ml 針筒吸取 3ml HBSS buffer，注射入腹腔內，將液體充分均勻沖洗腹腔後，
在以針筒取出所有液體到15ml 離心管，離心 1500 rpm 五分鐘，將上清液取置另 一管子內，保存於-20℃，直至以 ELISA 分析細胞激素濃度；而細胞團塊則以 HBSS buffer 將調整細胞濃度為 5×105 cells/ml，取 200µl 細胞液並利用 cytospin 機 器（SHANDON）離心 500rpm，4 分鐘將細胞固定於玻片上，玻片風乾、經由 Liu’s stain 染色後，即可利用顯微鏡計數 400 顆細胞，依據不同型態及染色結果 判別細胞，將細胞分類成巨噬細胞（macrophage）、嗜中性白血球（neutrophil）、
嗜酸性白血球（eosinophil）以及淋巴球（lymphocyte）。
2.14 繪圖及統計分析
當繪製曲線圖或柱狀圖時，圖形皆以 mean ± SEM 表達。
分析兩組數據生物統計上的差異時，所使用的是 GraphPad Prism 5 軟體中的 Mann-Whitney test，設定 p value<0.05 時達到統計上的顯著差異。
第三章 結果
3.1 小鼠在 OVA 致敏前與致敏後注射 α-GalCer 對於呼吸道發炎反應嚴重程 度之影響
為了探討 OVA 致敏前與致敏後活化 iNKT cells 對於氣喘小鼠發炎反應之影 響，我們將BALB/c 小鼠依據 protocol 1（圖一）來建立氣喘小鼠模式，並將小鼠 分為三組，依據 protocol 1 分別將小鼠鼻腔內注射 PBS（以下簡稱為 PBS，為對 照駔）、OVA 致敏前鼻腔內注射 α-GalCer（以下簡稱為 α-GalCer before）與 OVA 致敏後鼻腔內注射 α-GalCer（以下簡稱為 α-GalCer after），最後在第 40 天 犧牲小鼠。
結果顯示 OVA 致敏前給予 α-GalCer 小鼠血清的 IgE 和對照組（PBS）並無 統計上差異（圖二），然而其 BAL cells 總細胞數比對照組高，同時也是三組中 最高（圖三），表示細胞 migrate 到支氣管或肺的數目升高，導致細胞浸潤；進 一步觀察BAL cell 中各細胞分佈比例，發現 eosinophils 不論是佔 BAL total cells 之百分比（圖四(a)）或是細胞數（圖四(b)）相較於對照組（PBS）都有上升的現 象，同時也是三組中最高，表示此組小鼠肺部有嚴重的 eosinophilia。觀察以上數 據我們推論在OVA 致敏前給予 α-GalCer 活化 iNKT cells 可能會使氣喘小鼠呼吸 道的發炎反應趨向嚴重。
另一方面，OVA 致敏後再給予 α-GalCer 的組別，發現其 IgE 和對照組（PBS）
並無統計上差異（圖二）；BAL cells 總細胞數則些微上升（圖三），eosinophils 細胞數也是些微上升（圖四）。
總論之，我們藉由測量血清中 IgE 和呼吸道總細胞數或是 eosinophils 浸潤的
程度以評估氣喘小鼠呼吸道發炎嚴重程度，發現比起 OVA 致敏之後給予 α-
GalCer 的組別，OVA 致敏之前給予 α-GalCer 小鼠的氣喘發炎反應會更嚴重；推 論在OVA 致敏前活化 iNKT cells 比在 OVA 致敏後活化 iNKT cells 更使肺部發炎 反應趨向嚴重。
接著我們欲探討是什麼原因使得在 OVA 致敏前與致敏後給予 α-GalCer 會導 致小鼠產生不同嚴重程度的呼吸道發炎反應，我們依據 protocol 2 （圖五）將
BALB/c 小鼠 OVA 致敏與給予 α-GalCer，將小鼠分為四組分別為：「naïve PBS」
組是在第0 天以鼻腔內注射 40µl PBS；「naïve α-GalCer」組是在第 0 天以鼻腔內 注射2µg α-GalCer；「OVA PBS」組是在第 0 與 14 天腹腔注射 OVA 致敏小鼠，
並在第21 天以鼻腔內注射 40µl PBS；「OVA α-GalCer」組是在第 0 與 14 天腹腔 注射 OVA 致敏小鼠，並在第 21 天鼻腔注射 2µg α-GalCer；所有組別皆分別在鼻 腔內注射PBS 或 α-GalCer 二小時與五天後犧牲。設計此 protocol 主要目的是想探 討在活化iNKT cells 兩小時後及五天後，BALF 細胞激素、BAL cells 中各細胞所 佔比例的變化，期望探討是否是藉由 iNKT cell 分泌之細胞激素或是由於 iNKT cell recruit 的細胞有所不同，而造成氣喘小鼠發炎嚴重程度之改變。
3.2 探 討 小 鼠 在 OVA 致 敏 前 或 致 敏 後 給 予 α-GalCer 兩 小 時 後 ， 肺 部 的 iNKT cells 與細胞激素有何變化
由於先前研究發現：相較於 T cell 被活化後需數天才可分泌細胞激素，一旦 iNKT cell 被活化後，可在短短數小時內分泌大量細胞激素例如 IL-4 及 IFN-γ(47, 48)，也因為此獨特現象，許多研究學者認為可短時間分泌細胞激素的 iNKT cell 屬於 innate-like immune system，可藉由快速分泌細胞激素調控 adaptive immune system；所以我們分析小鼠在 OVA 致敏前與致敏後給予 α-GalCer 後兩小時 BALF 內 iNKT cells 細胞數與細胞激素的量有無差異。
3.2.1 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 兩小時後肺部 iNKT cells 之變化
首先，我們欲知鼻腔內注射 α-GalCer 是否確實可活化 iNKT cells，故依照 protocol 2（圖五）在 OVA 致敏前（即小鼠為 naïve 情況下）或 OVA 致敏兩次後，
分別將小鼠以鼻腔內注射 PBS（對照組）或 α-GalCer（實驗組），並在鼻腔內注 射 兩 小 時 後 犧 牲 小 鼠 ， 利 用 流 式 細 胞 儀 分 析 BAL cells 中 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比（圖六和圖七(a)）與細胞數（圖七(b)）。
結果發現 OVA 致敏之前給予 α-GalCer 小鼠的 iNKT cells 細胞數比起對照組
（naïve PBS）並無統計上差異（圖七(b)），但 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分
cells 佔 lymphocytes 之百分比相較於對照組（OVA PBS）非但沒有升高，反而顯 著下降（圖七(a)）。
3.2.2 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 兩小時後肺泡沖洗液中 Th2 cytokines 濃度之變化
由於上述實驗已證實 OVA 致敏前與致敏後鼻腔內注射 α-GalCer 會影響肺部 iNKT cells 佔 lymphocytes 的百分比，我們接著探討這群 iNKT cells 的功能是否受 到影響，於是我們在鼻腔內注射 PBS 或 α-GalCer 兩小時後犧牲小鼠，並利用 ELISA 測量各小鼠 BALF 中 Th2 cytokines 濃度，發現 OVA 致敏之前給予 α- GalCer 的小鼠 BALF 中 Th2 cytokines 像是 IL-4，其濃度顯著高於對照組（naïve PBS）（naïve PBS=33.74±9.89 pg/ml，naïve α-GalCer=105.30±21.31 pg/ml，p<0.05，
圖 八 (b) ） ， IL-5 上 升 兩 倍 （ naïve PBS=154.10±49.62 pg/ml ， naïve α- GalCer=399.70±95.14 pg/ml，p=0.0786，圖八(c)），IL-13 則是升高但未達顯著
（ 圖 八(d) ） ， 證 實 OVA 致 敏 之 前 給 予 α-GalCer 會 使 小 鼠 肺 部 趨 向 Th2 environment；而 OVA 致敏之後給予 α-GalCer 的小鼠則和其 iNKT cells 結果類似，
BALF 中 IL-4、IL-5 與 IL-13 濃度皆趨向降低（相較於對照組（OVA PBS））
（圖八）；其中，令人意外地，OVA 致敏後給予 α-GalCer 小鼠 BALF 中 IL-13 濃度非但未升高，且與 OVA 致敏前給予 α-GalCer 小鼠相較後達顯著下降（圖八 (d)）。
由於先前研究發現：相較於 T cell 被活化後需數天才可分泌細胞激素，一旦 iNKT cell 被活化後，可在短短數小時內分泌大量細胞激素，例如 IL-4 及 IFN-γ，
故我們將犧牲時間訂在給予 α-GalCer 後兩小時，推測若給予 α-GalCer 的組別分 泌之細胞激素與對照組有差異，則此差異應是由於 iNKT cell 分泌多寡不同導致。
而由我們的數據發現 OVA 致敏前給予 α-GalCer 兩小時後會使小鼠肺部 iNKT cells 佔 lymphocytes 的百分比升高，且使 Th2 cytokines 濃度升高；而 OVA 致敏 之後給予 α-GalCer 兩小時後會使肺部 iNKT cells 佔 lymphocytes 百分比降低，且 使 Th2 cytokines 濃度降低；由上述結果我們推論在 OVA 致敏前與致敏後給予 α- GalCer 會影響肺部 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比，進而影響 iNKT cells 分 泌Th2 cytokines-例如 IL-4、IL-5 與 IL-13-多寡程度不同。
3.2.3 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 兩小時後肺泡沖洗液中 eotaxin 濃度之變化
在給予 PBS 或 α-GalCer 兩小時後犧牲小鼠，並以 ELISA 測量 BALF 中各種 細胞激素濃度時，我們意外地發現在 OVA 致敏前給予 α-GalCer 的小鼠其肺部 eotaxin 顯著高於對照組（naïve PBS）（naïve PBS=36.98±7.34 pg/ml，naïve α- GalCer=131.40±27.14 pg/ml，p<0.01，圖九），甚至高於 OVA 致敏兩次並給予 PBS 的小鼠（OVA PBS）；但 OVA 致敏後給予 α-GalCer 的小鼠其肺部 eotaxin 則是與對照組（OVA PBS）無異（圖九）。
3.2.4 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 兩小時後肺泡沖洗液中 TSLP 濃度之變化
由 於 近 年 發 現 TSLP 在 氣 喘 當 中 也 扮 演 一 重 要 角 色 ， 它 主 要 由 non- hematopoietic cells 例如纖維母細胞、上皮細胞和不同種類的 stromal 或 stromal- like cells 分泌(67)；在 asthma-like 的情況下，TSLP 分泌量會升高，而 TSLP 的升 高可使抗原呈獻細胞促使T cell 偏好分化成 Th2 cells(30)。
同樣地，我們測量 BALF 中 TSLP 濃度時也意外發現 OVA 致敏前給予 α- GalCer 兩小時後，小鼠肺部 TSLP 濃度會高於對照組（naïve PBS）但未達顯著；
但OVA 致敏後給予 α-GalCer 則是低於對照組（OVA PBS）但不達顯著，然而相 較於OVA 致敏前給予 α-GalCer 組別小鼠後則達顯著下降（圖十）。
3.3 以 OVA 致敏小鼠兩次後，其肺部的 iNKT cells 升高
首先，我們以流式細胞儀分析 naïve 小鼠或 OVA 致敏小鼠鼻腔內注射 PBS 兩小時與五天後小鼠肺部中 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比（圖七(a)和圖十 二(a)）和細胞數（圖七(b)和圖十二(b)），結果顯示不論給予 PBS 兩小時或五天 後，小鼠兩次OVA 致敏後的 iNKT cells 皆比 naïve 小鼠之 iNKT cells 較高（不論 百分比或細胞數），表示兩次 OVA 致敏可使小鼠肺部 iNKT cells 升高，可作為 支持「iNKT cells 在 OVA-induced murine asthma model 中扮演一個重要的角色」
3.4 探討小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後，肺部之細胞組 成與細胞激素有何變化
由於上述結果我們觀察到 OVA 致敏前與致敏後給予 α-GalCer 兩小時後，肺 部 Th2 cytokines、eotaxin 與 TSLP 濃度皆受到影響，故接著我們將犧牲時間點延 至鼻腔內注射 PBS 或 α-GalCer 五天後，觀察肺部較晚期之細胞激素與細胞組成 之變化。
3.4.1 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後肺泡沖洗液中細胞 總數之變化
在鼻腔內注射 PBS 或 α-GalCer 五天後犧牲小鼠並計算其支氣管肺泡沖洗液 中細胞總數，結果發現 OVA 致敏之前給予 α-GalCer 小鼠支氣管肺泡沖洗液中細 胞總數高於對照組（naïve PBS）十倍以上（naïve PBS=0.24±0.05×106，naïve α- GalCer=2.72±0.72×106，p<0.001，圖十一）；而 OVA 致敏後給予 α-GalCer 則只 高於對照組（OVA PBS）約 2.5 倍（OVA PBS=0.35±0.07×106，OVA α-GalCer
=0.94±0.13×106，p<0.01，圖十一）。
更進一步，將 OVA 致敏之前與致敏之後給予 α-GalCer 的小鼠肺泡沖洗液中 的細胞總數相比，則 OVA 致敏前給予 α-GalCer 的小鼠高於致敏後給予的組別近 三倍（naïve α-GalCer=2.72±0.72×106，OVA α-GalCer =0.94±0.13×106，p<0.01，圖 十一），證明同樣給予 α-GalCer，但在 OVA 致敏前給予的組別會使細胞 migrate 至肺部的總數高於致敏後給予的組別。
3.4.2 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後肺部 iNKT cells 百 分比之差異
在發現 OVA 致敏前與致敏後鼻腔注射 α-GalCer 五天後會影響肺部的細胞總 數後，我們進一步探討其中細胞組成之變化，欲知是何種細胞升高或降低而影響 細胞總數之變化。首先，我們在鼻腔內注射 PBS 或 α-GalCer 五天後犧牲小鼠，
並利用流式細胞儀分析BAL cells 中 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比與細胞數，
發現 OVA 致敏前給予 α-GalCer 會使 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比有六倍 升高（naïve PBS=1.34±0.03%，naïve α-GalCer =9.11±0.81%，p<0.001），細胞數
則有兩百倍以上的升高（naïve PBS=0.02±0.00×104，naïve α-GalCer=2.36±0.35
×104，p<0.001，圖十二）；而 OVA 致敏後給予 α-GalCer 分別只使 iNKT cells 佔 lymphocytes 的百分比與細胞數上升兩倍和六倍（naïve PBS 百分比與細胞數分別 為2.45±0.67%與 0.15±0.05×104，naïve α-GalCer 為 4.76±1.11%與 1.08±0.39×104， p 值分別為 p=0.1636 與 p=0.0667，圖十二），且若將 OVA 致敏之前與之後給予 α-GalCer 的小鼠呼吸道肺泡 iNKT cells 相比，則 OVA 致敏之前給予的小鼠不論 百分比或細胞數皆顯著高於之後給予組別的小鼠（圖十二）。
3.4.3 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後肺部 eosinophils 百 分比與細胞數之變化
實驗結果也發現在鼻腔內注射後第五天，OVA 致敏前給予 α-GalCer 小鼠的 total BAL cells 中 eosinophils 所佔百分比與細胞數各高於對照組（naïve PBS）近 40 倍與 600 倍（naïve PBS 百分比與細胞數分別為 1.25±0.07%與 0.003±0.000×106， naïve α-GalCer 為 48.15±8.55%與 1.828±0.727×106，p 值皆為 p<0.001，圖十三），
證實 OVA 致敏前給予 α-GalCer 將使小鼠肺部產生嚴重的 eosinophilia；而 OVA 致敏後給予 α-GalCer 的小鼠其 eosinophils 百分比與細胞數比起對照組（OVA PBS）則分別約只上升 10 和 30 倍（OVA PBS 百分比與細胞數分別為 0.90±0.27%
與0.003±0.001×106，OVA α-GalCer 為 11.97±1.96%與 0.113±0.023×106，p 值皆為 p<0.001，圖十三），且若將 OVA 致敏之前與之後給予 α-GalCer 的小鼠其肺部 eosinophils 佔 total BAL cells 之百分比與細胞數相比，則 OVA 致敏之前給予的小 鼠皆顯著高於之後給予組別（圖十三）。
此外，若觀察各組小鼠肺部 eosinophilia 嚴重程度，發現其嚴重程度之高低和 先前第40 天犧牲小鼠得到結果（圖四）類似。
3.4.4 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後肺部的 conventional CD4+、CD8+ T cells 與 NK cells 細胞數之變化
上述結果已知肺泡沖洗液中細胞總數升高，當我們利用流式細胞儀分析肺部 之細胞組成時，發現肺部總細胞數的升高也包含了來自 conventional CD4+ 與
CD8+ T cells 以及 NK cells 細胞數的上升（圖十四），其中 conventional CD4+是 指利用流式細胞儀分析CD3+CD4+細胞，並扣除CD4+ NKT cells 的部份。
3.4.5 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後肺泡沖洗液中 Th2 cytokines 濃度之變化
我們接著探討肺部較晚期之細胞激素變化，結果發現 OVA 致敏前給予 α- GalCer 的小鼠其肺部 Th2 cytokines 除 IL-4 有升高外（圖十五(a)），其餘像是 IL- 5 與 IL-13 皆與對照組（naïve PBS）無異（圖十五(b)和(c)）；然而 OVA 致敏後 再給予α-GalCer 之小鼠其 BALF 中的 Th2 cytokines 例如 IL-4、IL-5 與 IL-13 反而 達顯著下降（圖十五）。
3.4.6 小 鼠 在 OVA 致 敏 前 或 致 敏 後 給 予 α-GalCer 五 天 後 肺 泡 沖 洗 液 中 eotaxin 濃度之變化
此外，我們也發現在 OVA 致敏前給予 α-GalCer 的小鼠其肺部的 eotaxin 相較 於給予 PBS 的小鼠（naïve PBS）有顯著升高（naïve PBS=36.98±7.34 pg/ml，
naïve α-GalCer= 131.24±30.90 pg/ml，p<0.01，圖十六）；而在 OVA 致敏後才給 予 α-GalCer 之小鼠則與給 PBS 的小鼠（OVA PBS）相較後有些微降低（圖十 六）。
3.4.7 小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 五天後肺泡沖洗液中 TSLP 濃度之變化
另外，我們也發現 OVA 致敏前給予 α-GalCer 的小鼠其肺部的 TSLP 與對照 組（naïve 小鼠鼻腔注射 PBS）無統計上差異（圖十七）；而 OVA 致敏後給予 α- GalCer 組別小鼠與對照組（OVA 致敏小鼠鼻腔注射 PBS）相較後顯著下降
（OVA PBS=164.90±55.49 pg/ml，OVA α-GalCer= 18.24±8.38 pg/ml，p<0.01，圖 十七）。
3.5 研究 α-GalCer 是否可直接影響初代培養之肺臟細胞產生 eotaxin 之能力 由我們的數據中發現 OVA 致敏前給予 α-GalCer 兩小時後，小鼠肺部的
要由上皮細胞、內皮細胞與纖維母細胞分泌(23, 68)，其中並無文獻指出 iNKT cells 可分泌 eotaxin，故我們推論 α-GalCer 是否可直接影響初代培養之肺臟細胞 使之分泌 eotaxin，於是我們將小鼠肺臟細胞初代培養（圖十八(a)為初代培養之肺 臟細胞於顯微鏡下的型態），並以α-GalCer 刺激後收集培養基上清液，以 ELISA 測量 eotaxin 濃度，結果發現以 α-GalCer 刺激初代培養之肺臟細胞 48 小時後，初 代肺臟細胞不會分泌更多eotaxin（相較於 cell only 之對照組；圖十八(b)），故造 成OVA 致敏前給予 α-GalCer 兩小時後小鼠肺部 eotaxin 上升的原因仍需更多進一 步探討。
3.6 探討腹腔注射 α-GalCer 是否吸引 eosinophils 至腹腔中
由上述實驗數據，我們得知 OVA 致敏前-亦指小鼠為 naïve 的情況下-鼻腔內 注射給予小鼠 α-GalCer，則小鼠在五天後其肺部產生 eosinophilia；於是我們好奇 此「naïve 小鼠給予 α-GalCer 後可吸引 eosinophils 至給予 α-GalCer 之局部部位」
的現象是否只侷限於呼吸道，抑或者可延伸至其它部位，故我們設計一個實驗將 α-GalCer 以腹腔注射的方式給予小鼠，並收集腹腔抽洗液觀察是否 eosinophils 有 升高。
首先，我們依照 protocol 3（圖十九）將小鼠以腹腔注射給予 2µg α-GalCer，
在五天後收集小鼠腹腔沖洗液，以 counting chamber 計算沖洗液總細胞數，另外 將細胞以 cytospin 機器固定於玻片上，並計數玻片上 400 顆細胞後，分析 eosinophils 佔所有細胞之百分比，並將百分比乘以總細胞數，計算 eosinophils 細 胞數。
實驗結果發現腹腔注射 α-GalCer 五天後，小鼠腹腔沖洗液之總細胞數高於對 照組（腹腔注射 PBS）約兩倍（PBS=2.22±0.24×106，α-GalCer=4.13±0.80×106， p<0.05，圖二十(a)），而腹腔沖洗液中 eosinophils 不論是佔所有細胞之百分比或 細胞數皆高於對照組三倍與六倍（PBS 的百分比與細胞數分別為 3.15±0.58%與 0.74±0.21×105，而 α-GalCer 為 10.35±1.64%與 4.62±1.30×105，p 值皆為 p<0.01，
圖二十(b)與(c)），推論給予 naïve 小鼠 α-GalCer 後可吸引 eosinophils 至給予 α- GalCer 的局部部位，造成局部性 eosinophilia。
第四章 討論
氣喘是一肺部發炎疾病，伴隨許多發炎症狀及臨床表徵（例如：鳴喘、呼吸 急促與呼吸道過度反應），在過敏性氣喘中，呼吸道發炎反應是由於T cells 辨識 蛋白質的過敏原後分化成Th2 cells，進而產生許多 Th2 cytokines，最後導致呼吸 道eosinophilia。我們已知 Th2 cells 對於過敏性氣喘的呼吸道發炎反應很重要，然 而有一群和 Th2 cells 很像的細胞─iNKT cells─它們同樣表現 CD4 抗原，也可大 量分泌Th2 cyokine；但不同的是，iNKT cells 表現的是 semi-invarant TCR，且可 在短時間內分泌IFN-γ 與 IL-4；不過也是由於它表現的是 semi-invarant TCR 而非 像 T cells 的 TCR 約有 1018的多樣性(69)，認為 iNKT cells 表現的 semi-invarant TCR 較傾向於類似 innate immunity 的 pattern-recognition receptors（像是 toll-like receptor）(48)，加上 iNKT cells 可短時間內快速分泌細胞激素，故目前認為 iNKT cells 屬 innate-like immune response，可連接 innate 和 adaptive immunity，並 在許多疾病中扮演重要的角色，其中包含氣喘。但目前對於 iNKT cells 在氣喘扮 演的角色尚無統一的答案，有些認為活化 iNKT cells 可藉由分泌 Th2 cytokines
（IL-4、IL-5 與 IL-13）直接使小鼠產生氣喘或藉由快速分泌 Th2 cytokines 使 adaptive immunity 的 T cells 分化成 Th2 cells，造成更進一步的呼吸道發炎反應與 呼吸道過度反應；然而另一些研究認為在 OVA 致敏小鼠給予 α-GalCer 可降低小 鼠之氣喘。推論在氣喘疾病進程中不同時期活化NKT cells，會使 NKT cells 扮演 不同的角色。
首先，我們的結果顯示將小鼠以 OVA 致敏兩次後可使小鼠肺部之 iNKT cells 升高，這與在病人身上得到之結果相同(57-60)，證實 iNKT cells 在氣喘中確實扮 演重要的角色。接著我們探討 OVA 致敏前或 OVA 致敏後給予 α-GalCer 活化 iNKT cells 對於小鼠過敏性氣喘之發炎反應有何影響，由支氣管肺泡沖洗液中細 胞總數與 eosinophils 細胞數的實驗結果，我們發現 OVA 致敏前給予 α-GalCer 的 小鼠其呼吸道發炎反應高於致敏後才給予的小鼠（α-GalCer before > α-GalCer after > PBS）；證實在 OVA 致敏前或 OVA 致敏後給予 α-GalCer 皆會使氣喘小鼠 發炎反應趨向嚴重，但在 OVA 致敏前給予 α-GalCer 的氣喘小鼠其發炎反應相較
