量分泌Th2 cyokine；但不同的是，iNKT cells 表現的是 semi-invarant TCR，且可 在短時間內分泌IFN-γ 與 IL-4；不過也是由於它表現的是 semi-invarant TCR 而非 像 T cells 的 TCR 約有 1018的多樣性(69)，認為 iNKT cells 表現的 semi-invarant TCR 較傾向於類似 innate immunity 的 pattern-recognition receptors（像是 toll-like receptor）(48)，加上 iNKT cells 可短時間內快速分泌細胞激素，故目前認為 iNKT cells 屬 innate-like immune response，可連接 innate 和 adaptive immunity，並 在許多疾病中扮演重要的角色，其中包含氣喘。但目前對於 iNKT cells 在氣喘扮 演的角色尚無統一的答案，有些認為活化 iNKT cells 可藉由分泌 Th2 cytokines
（IL-4、IL-5 與 IL-13）直接使小鼠產生氣喘或藉由快速分泌 Th2 cytokines 使 adaptive immunity 的 T cells 分化成 Th2 cells，造成更進一步的呼吸道發炎反應與
於 OVA 致敏後才給予的小鼠更為嚴重，證實在氣喘疾病進程中不同時期給予 IL-13 增加，TSLP 也會增加；且五天後 BALF 中的 eosinophilis 大量升高。上述 結果也可和先前Meyer, E.H. et al.的研究結果(63)作互相驗證，他們在第 0 天將小
IL-5 與 IL-13 降低，TSLP 也會下降；五天後 BALF 中的 eosinophilis 升高，但不 及致敏前給予α-GalCer 的小鼠高。推論在氣喘 Th2 dominant 環境下 iNKT cells 可 同而產生不同的調控，造成Th2 cytokines（IL-4、IL-5 與 IL-13）與 TSLP 降低，
而使小鼠呼吸道發炎反應不如 OVA 致敏前活化 iNKT cells 之小鼠嚴重（圖二十 一）。
然而，由於先前許多研究認為給予第一次 GalCer 後，之後再給予第二次 α-GalCer 時會造成 NKT cells 的 anergy(63, 71)，故在 OVA 致敏後才給予 α-α-GalCer 也可能是造成原已存在於氣喘小鼠肺部之 iNKT cells 的 anergy，使之不分泌 Th2 cytokines（IL-4、IL-5 與 IL-13），造成 Th2 cytokines 降低，而使小鼠呼吸道發炎
反應不如OVA 致敏前之小鼠嚴重，但這部份的實驗仍需進一步實驗探討。 α-GalCer-induced iNKT cells 釋放大量 IFN-γ 而抑制 OVA 引發之小鼠氣喘(72)，但 我們實驗小鼠BALF 中 IFN-γ 幾乎全部都無法以 R&D DuoSet® ELISA kit 測量到 呈獻細胞-例如DCs-而刺激innate immune response(73)。研究發現將小鼠靜脈注射
α-GalCer後，經由α-GalCer活化的NKT cells可使脾臟的DCs完全分化成熟(45)。故 由於α-GalCer可經由活化NKT cells而活化DCs，進一步刺激innate immune response 進而加強adaptive immunity；除此之外，α-GalCer活化的NKT cells亦可幫助B cells 的成熟，以及調控MDSCs（myeloid-derived supperssor cells）的抑制作用(46)（研 究發現iNKT cells可抑制MDSCs的抑制作用，使得IAV（influenza A virus）-specific immune response得以產生進而清除IAV(56)方面，也被認為可加強adaptive SJL/J小鼠）其NKT cells數目會減少(75, 76)，認為NKT cells數目的減少和疾病有 關。而就α-GalCer可使NKT cells expansion方面來看，α-GalCer或許可使上述小鼠 的total cells、eosinophils、IL-4、IL-5、IL-13 與 IFN-γ 的升高(70)，推測在此研究 中 α-GalCer 是扮演類似佐劑的角色，可增強 adaptive immunity。若以此概念觀察 我們的實驗結果，OVA 致敏前將小鼠以鼻腔內注射 α-GalCer 會造成嚴重之呼吸 道發炎反應，由於我們在第 0 天時給予 α-GalCer 後一小時便再給予 OVA，推測
在此 α-GalCer 也是扮演類似佐劑的角色，經由活化 innate immune response 注意α-GalCer 會使 eotaxin 升高，而可能吸引 eosinophils 至肺部的問題。
和 eotaxin 相似的，TSLP 主要也是由 non-hematopoietic cells 例如纖維母細胞、
上皮細胞和不同種類的 stromal 或 stromal-like cells 分泌(67)；已知 TSLP 可刺激 DCs 的分化與活化，使 DCs 表現 Th2 cell-attracting chemokine CCL17 和 CCL22，
更進一步發現利用經過 TSLP 刺激的 DCs 以 primed naïve CD4+ T cells，會使 T cells 產生 IL-4、IL-5 與 IL-13(30)。只會在肺表現 tslp gene 的基因轉殖鼠的研究
發現小鼠會產生嚴重的呼吸道發炎反應與呼吸道過度反應，其 BALF 中 Th2
cytokines 與血清中 IgE 濃度也都升高(77)。另外也有實驗證明 TSLP receptor 的基
因剔除鼠在吸入過敏原後並不會產生肺部發炎反應，證實 TSLP 在肺部發炎反應 之不同而產生不同的調控，造成Th2 cytokines（IL-4、IL-5 與 IL-13）降低，而使 小鼠呼吸道發炎反應不如 OVA 致敏前之小鼠嚴重。再者，naïve 小鼠給予 α-GalCer 會產生 local eosinophilia，故關於欲將 α-α-GalCer 當作佐劑或治療藥物的時 候，需要注意上述問題。
圖
OVA 50µg
!-GalCer after 40µl PBS (i.n.)!
2µg !-GalCer in 40µl PBS (i.n.) !
圖一．protocol 1。
小鼠在 OVA 致敏前或致敏後給予 α-GalCer 後呼吸道發炎反應實驗流程：在第 0 天以腹腔注射50µg OVA / 2mg alum（OVA,ovalbumin；alum, aluminum hydroxide）
致敏小鼠，在第14 及 28 天腹腔注射 25µg OVA / 2mg alum 以 booster 小鼠，並在
圖二．在 OVA 致敏之前或之後給予 α-GalCer 皆會使小鼠血清 OVA 專一性 IgE 升高，但以OVA 致敏之前給予 α-GalCer 的小鼠升高較多。
於OVA 引起小鼠氣喘模式中的第 0、14、21、28 與 35 天對小鼠進行眼窩採血，
取得血清後以ELISA 分析小鼠血清中 OVA 專一性 IgE 的量。
（圖示說明如圖一）
（＊表示p<0.05）
圖三．在OVA 致敏前給予 α-GalCer 會使小鼠 BAL total cell number 升高。
在最後一次OVA challenge 後 24 小時（即第 40 天）犧牲小鼠，各組小鼠的 BAL cells 經由 counting chamber 計數 BAL total cell number。
（圖示說明如圖一）
圖四．在 OVA 致敏前給予 α-GalCer 會使小鼠 BAL cells 中 eosinohpils 佔 BAL total cells 之百分比與細胞數上升。
在第40 天犧牲小鼠後得到之 BAL cells 玻片，依據顯微鏡下不同型態及染色結果 判別細胞，將細胞分類成巨噬細胞（macrophage）、嗜中性白血球（neutrophil）、
嗜酸性白血球（eosinophil）以及淋巴球（lymphocyte），計算 400 顆細胞後計算 eosinophil 之百分比(a)，並將百分比乘上 BAL cells 總細胞數得到 eosinophils 細胞 數(b)。
（圖示說明如圖一）
!"#$ PBS；「OVA α-GalCer」組是在第 21 天鼻腔注射 2µg α-GalCer in 40µl PBS。四組 皆在給予 PBS 或 α-GalCer 兩小時與五天後犧牲，並收集呼吸道肺泡沖洗液，上 清液以 ELISA 測量細胞激素濃度，細胞以流式細胞儀與計數 BAL cells 玻片分析 其細胞組成。
naïve PBS!
a !
OVA PBS!
c !
naïve !-GalCer!
b !
OVA !-GalCer!
d !
圖六． BAL cells 中 iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 兩小時後犧牲小鼠，以流式細胞儀分析其 BAL cell 中 iNKT cell 佔 lymphocytes 之比例，我們先 gate lymphocytes，並將有表現 CD3 與 CD1d:PBS57 tetramer 的細胞定義為 iNKT cells。(a) naïve PBS，(b) naïve α-GalCer，(c) OVA PBS，(d) OVA α-GalCer。 (每組取一隻小鼠之圖當作代表。)
（右上角數字代表iNKT cells 佔 lymphocytes 之百分比）
（圖示說明如圖六）
圖七．BAL cell 中 iNKT cell 佔 lymphocytes 之百分比及細胞數。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 兩小時後犧牲小鼠，以流式細胞儀分析其 BAL cells 中iNKT cells 佔 BAL lymphocytes 之百分比(a)，並將 iNKT cells 佔 total BAL cells 之百分比乘上BAL cells 總細胞數得到 iNKT cell 細胞數(b)。
（圖示說明如圖六）
（＊或＃表示p<0.05）
圖八． BALF 中 IFN-γ、IL-4、IL-5 和 IL-13 濃度。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 兩小時後犧牲小鼠，以 ELISA 分析 BALF 中各種細 胞激素的濃度。(a) IFN-γ， (b) IL-4， (c) IL-5，(d) IL-13。
（圖示說明如圖六）
圖九． BALF 中 eotaxin 濃度。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 兩小時後犧牲小鼠，以 ELISA 分析 BALF 中 eotaxin 的濃度。
（圖示說明如圖六）
（＊＊表示p<0.01）
圖十． BALF 中 TSLP 濃度。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 兩小時後犧牲小鼠，以 ELISA 分析 BALF 中 TSLP 的濃度。
（圖示說明如圖六）
（＃表示 p<0.05）
圖十一．BAL total cell number。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 五天後犧牲小鼠，各組小鼠的 BAL cells 經由 counting chamber 計數 BAL total cell number。
（圖示說明如圖六）
（＊＊或＃＃表示p<0.01，＊＊＊表示 p<0.001）
圖十二．BAL cell 中 iNKT cell 佔 lymphocytes 之百分比及細胞數。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 五天後後犧牲小鼠，以流式細胞儀分析其 BAL cell 中iNKT 佔 lymphocytes 之百分比(a)，並將 iNKT cells 佔 total BAL cells 之百分比 乘上BAL cells 總細胞數得到 iNKT cell 細胞數(b)。
圖十三．BAL cell 中 eosinohpil 佔 total BAL cells 之百分比及細胞數。
鼻腔內注射α-GalCer 或 PBS 五天後犧牲小鼠，將得到之 BAL cells 製成玻片，並 依 據 顯 微 鏡 下 不 同 型 態 及 染 色 結 果 判 別 細 胞 ， 將 細 胞 分 類 成 巨 噬 細 胞
（macrophage）、嗜中性白血球（neutrophil）、嗜酸性白血球（eosinophil）以及 淋巴球（lymphocyte），計算 400 顆細胞後計算 eosinophils 佔 BAL total cells 之百 分比(a)，並將百分比乘上 BAL cells 總細胞數得到 eosinophils 細胞數(b)。
（圖示說明如圖六）
（＊＊＊或＃＃＃表示p<0.001）
圖十四．BAL cell 中 conventional CD4+ 和 CD8+ T cell 以及 NK cell 細胞數。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 五天後犧牲小鼠，以流式細胞儀分析 conventional CD4+ 和 CD8+ T cells 以及 NK cells 佔 total BAL cells 之百分比，並將百分比乘上 BAL cells 總細胞數得到(a) conventional CD4+ T cell，(b) conventional CD8+ T cell，
(c) NK cell 之細胞數。其中 conventional CD4+是指CD3+CD4+細胞，並扣除CD4+
圖十五． BALF 中 IFN-γ、IL-4、IL-5 和 IL-13 濃度。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 五天後犧牲小鼠，以 ELISA 分析 BALF 中各種細胞 激素的濃度。(a) IFN-γ， (b) IL-4，(c) IL-5，(d) IL-13。
（圖示說明如圖六）
（＊＊表示p<0.01）
圖十六． BALF 中 eotaxin 濃度。
鼻腔內注射α-GalCer 或 PBS 五天後犧牲小鼠，以 ELISA 分析 BALF 中 eotaxin 的 濃度。
（圖示說明如圖六）
（＊＊表示p<0.01）
圖十七． BALF 中 TSLP 濃度。
鼻腔內注射 α-GalCer 或 PBS 五天後犧牲小鼠，以 ELISA 分析 BALF 中 TSLP 的 濃度。
（圖示說明如圖六）
（＊＊表示p<0.01）
a
b
圖十八．以 α-GalCer 刺激初代培養之肺臟細胞，其培養基上清液中 eotaxin 濃度。
初代培養之小鼠肺臟細胞於顯微鏡下的型態(a)，並以培養基（cell only 對照組）、
125 ng/ml α-GalCer、500 ng/ml α-GalCer、2000 ng/ml α-GalCer 與 300 nuits/ml IL-4
（陽性對照組）刺激初代培養肺臟細胞 48 小時後，收集培養基上清液，以
day 0 5
!-GalCer 2µg in 200µl PBS
or 200µl PBS
(i.p.)
sacrifice
圖十九．protocol 3。
在第0 天將小鼠腹腔注射 200µl PBS（對照組）或 2µg α-GalCer in 200µl PBS（實 驗組），在五天後犧牲小鼠。
圖二十．腹腔沖洗液中細胞總數與eosinophils 百分比和細胞數。
小鼠腹腔注射 PBS 或 α-GalCer 五天後，收集腹腔沖洗液，利用 counting chamber 計算總細胞數(a)，並以顯微鏡觀察腹腔沖洗液中的細胞製成之玻片，依據不同型 態及染色結果判別細胞，將細胞分類成巨噬細胞（macrophage）、嗜中性白血球
（neutrophil）、嗜酸性白血球（eosinophil）以及淋巴球（lymphocyte），計算 400 顆細胞後計算 eosinophil 之百分比(b)，並將百分比乘上 BAL cells 總細胞數得 到eosinophils 細胞數(c)。
a
b
圖二十一．在不同氣喘疾病進程時給予α-GalCer 刺激 iNKT cells 會使小鼠產生不 同嚴重程度之發炎反應的可能機制。
(a) 在 OVA 致敏前（即小鼠 naïve 情況下）給予 α-GalCer 會使小鼠呼吸道與肺部 的iNKT cells 百分比升高，並使 iNKT cells 分泌之 Th2 cytokines（IL-4、IL-5 與 IL-13）增加，活化 Th2 cells，而增加之 IL-4 與 IL-13 可刺激肺臟上皮細胞產生 eotaxin，最終造成呼吸道與肺部的 eosinophilia。
(b) 若是在 OVA 致敏後才給予 α-GalCer，則在氣喘 Th2 dominant 環境下 iNKT cells 可感應到環境之不同而產生不同的調控，造成 Th2 cytokines（IL-4、IL-5 與 IL-13）降低，而使小鼠呼吸道發炎反應不如 OVA 致敏前之小鼠嚴重。但 OVA 致敏後給予 α-GalCer 仍使 eotaxin 升高（但 eotaxin 升高原因之確切機制目前仍未 知），故仍吸引部份eosinophils 至呼吸道與肺部。
參考文獻
1. Lee, Y.-L., Y.-C. Lin, B.-F. Hwang, and Y. L. Guo. 2005. Changing prevalence of asthma in taiwanese adolescents: two surveys 6 years apart. Pediatric Allergy and Immunology 16:157-164.
2. Eder, W., M. J. Ege, and E. von Mutius. 2006. The asthma epidemic. The New
2. Eder, W., M. J. Ege, and E. von Mutius. 2006. The asthma epidemic. The New