委員會（Animal Committee of National Taiwan University）核定。
2.2 氣喘動物模式之建立
如圖一：小鼠在第 0 天時，利用腹腔注射（intraperitoneally；i.p.）OVA
（ovalbumin，Sigma Chemical Co.，Cat. NO. A5503）50µg 加上佐劑 aluminum hydroxide（alum；Pierce Chemical，Imject®Alum，Cat. NO. 77161） 2mg，在第 14 天及第 28 天時再次腹腔注射 OVA 25µg 及佐劑 alum 2mg，最後在第 38 與 39 連續兩天，以鼻腔注射（intranasal；i.n.）OVA 100µg / 40µl PBS 以 challenge 小鼠。
2.3 α-GalCer 之給予
於實驗進行第 0、14、21、28、35天對小鼠進行眼窩採血 （retro-orbital）以 收集小鼠血液。將小鼠以pentobarbital麻醉後，以pasteur pipet自眼窩靜脈竇採血，
約取 100 ~200 µL血液，靜置 1~2 小時後，以6000 rpm 轉速離心 10分 鐘，收集血 清，於 -20℃ 保存。
2.5 抽取小鼠支氣管肺泡沖洗液（bronchoalveolar lavage fluid；BALF）
小鼠犧牲後，剪開頸部皮肉，用鑷子將氣管外側肌肉撕開，使氣管露出，在 靠近頭部之氣管上剪開一小洞，以靜脈置留管插入氣管，將軟管置留於氣管內，
以1ml HBSS buffer（Hank’s balanced salt solution）透過軟管沖洗支氣管肺泡，重 複三次，第一次沖洗液的上清液保存在-20℃，而三次沖洗液的細胞則resuspend到 200µl 細胞液並利用 cytospin 機器（Shandon Cytospin 3 Centrifuge）離心 500rpm，
4 分鐘，將細胞固定於玻片上，玻片風乾、經由 Liu’s stain 染色後，利用顯微鏡 blocks Fc binding；eBioscience Cat. No. 14-0161-85，clone 93），於 4℃作用 10 分 鐘，再加入 50µl 0.2% BSA in PBS
以及各種欲分析螢光標的的抗體，FITC-conjugated anti-CD8（Cat. No. 100705，clone 53-6.7）、PE-以及各種欲分析螢光標的的抗體，FITC-conjugated anti-CD19
（Cat. No. 115507，clone 6D5）、APC-conjugated anti-CD11c（Cat. No. 117309，
clone N418）、PerCP/cy5.5-conjugated anti-CD4（Cat. No. 100433，clone GK1.5 ）、
APC-conjugated anti-CD3 （ Cat. No. 100311 ， clone 145-2C11 ） ， 以 上 皆 購 於 Biolegend；PE/Cy5-conjugated anti-CD3（Cat. No. 15-0031-82，clone 145-2C11 ）、
FITC-conjugated anti-DX5 （ Cat. No. 11-5971-63 ， clone DX5 ） ， 以 上 皆 購 於 eBioscience；PE-conjugated CD1d:PBS57 tetramer（the Tetramer Core Facility of the National Institutes of Health, USA），加入抗體後，於 4℃作用 30 分鐘，再以 1 ml 0.2% BSA in PBS 沖洗細胞，6000rpm 離心兩分鐘，去除上清液，拍散細胞團塊
加入 100µl 1µg/ml 的 biotin-anti-mouse-IgE（BD Bioscience，Cat. NO. 553419，
clone R35-118），室溫靜置四十五分鐘，再以 PBS 沖洗 well 八次後，加入 100µl 1µg/ml 的 avidin-peroxidase（PIERCE，Cat. NO. 29994），避光，室溫靜置三十分 鐘，再以 PBS 沖洗 well 十次後，加入 100µl tetramethylbenzidine substrate（TMB）
（Clinical Science Products，Cat. NO. 01016-1），最後以 ELISA reader（Cisbio Bioassays，SpectraMax M5e）讀取OD450nm減去OD540nm的吸光值。
2.9 利用 ELISA 測量細胞激素之濃度
小鼠的第一次支氣管肺泡沖洗液與體外刺激初代培養肺臟細胞所得到之上清 液，皆利用 R&D DuoSet® ELISA kit 分別定量 IL-4（Cat. NO. DY404）、IFN-γ
（Cat. NO. DY485）、IL-5（Cat. NO. DY405）、IL-13（Cat. NO. DY413）、
eotaxin（Cat. NO. DY420）與 TSLP（Cat. NO. DY555）之濃度；步驟皆遵照產品
將 48-well plate 的每個 well 加入 500µl 調整過之細胞液，培養過夜（overnight）
後，將培養基丟棄，加入各種刺激物：(1) 500µl 培養基，為 cell only 對照組，(2) 250ng GalCer in 500µl 培養基，故 GalCer 濃度為 125ng/ml，(3) 1000ng α-GalCer in 500µl 培養基，故 α-α-GalCer 濃度為 500ng/ml，(4) 4000ng α-α-GalCer in 500µl 培養基，故 α-GalCer 濃度為 2000ng/ml，(5) 600 units IL-4 in 500µl 培養基，
故 IL-4 濃度為 300 units/ml；刺激四十八小時後，收集上清液以 ELISA 測量 eotaxin 濃度。
2.12 腹腔注射小鼠 α-GalCer 實驗
將小鼠（BALB/c）分為兩組，在第 0 天時，一組腹腔注射 200µl PBS，另一 組注射2µg α-GalCer in 200µl PBS，五天後犧牲小鼠，收集其腹腔沖洗液。
2.13 收集小鼠腹腔沖洗液
小鼠犧牲後，將小鼠腹部表面之毛髮及皮膚去除，切記保留完整腹腔外膜，
以5ml 針筒吸取 3ml HBSS buffer，注射入腹腔內，將液體充分均勻沖洗腹腔後，
在以針筒取出所有液體到15ml 離心管，離心 1500 rpm 五分鐘，將上清液取置另 一管子內，保存於-20℃，直至以 ELISA 分析細胞激素濃度；而細胞團塊則以 HBSS buffer 將調整細胞濃度為 5×105 cells/ml，取 200µl 細胞液並利用 cytospin 機 器（SHANDON）離心 500rpm，4 分鐘將細胞固定於玻片上，玻片風乾、經由 Liu’s stain 染色後，即可利用顯微鏡計數 400 顆細胞，依據不同型態及染色結果 判別細胞，將細胞分類成巨噬細胞（macrophage）、嗜中性白血球（neutrophil）、
嗜酸性白血球（eosinophil）以及淋巴球（lymphocyte）。
2.14 繪圖及統計分析
當繪製曲線圖或柱狀圖時，圖形皆以 mean ± SEM 表達。
分析兩組數據生物統計上的差異時，所使用的是 GraphPad Prism 5 軟體中的 Mann-Whitney test，設定 p value<0.05 時達到統計上的顯著差異。