崑山科技大學環境工程系學生專題製作報告

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崑山科技大學環境工程系

學生專題製作報告

柴油污染土壤之代謝研究

指導老師：曹俊文

專題組員：倪佩君 4960N021

中華民國 100 年 5 月

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摘要

本研究是選以柴油為目標污染物，配置不同柴油污染濃度 (1%、

5%、10%、20%、50%(w/w)) 之土壤，使用土壤原生微生物進行分解[ (礦

化作用(mineralization)或共代謝(cometabolic) ]柴油之情況，以分解過程中所產出之代謝物

CO

₂，計算其

CO

₂

(mmole)累積量，於實驗時間 123

天，觀測判斷其微生物對柴油分解效率以及做柴油對植物毒性試驗，

實驗結果得知，初期以

0~20 天分解較快，之後有緩慢分解之趨勢，以

添加柴油污染濃度

1%及 5%分解效果最佳，20%所代謝出的 CO

₂累積量最多，代表其微生物活性較好，

50%應污染濃度過高，對微生物毒性

較強，分解效果較低，行植物毒性試驗以不同柴油污染濃度之土壤對紅豆及綠豆進行毒性評估，結果顯示柴油對於植物有一定之毒性。

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表目錄

表2-1：原油的化學成份 ... 2

表2-2：原油分餾產品 ... 3

表2-3：石油產品種類 ... 3

表2-4：超級柴油 MSDS... 4

表2-5：車用柴油規範-超級柴油 ... 5

表2-6：生物通氣法優缺點 ... 12

表2-7：自然衰減整治方法優缺點 ... 15

表2-8：石灰(碳酸鈣)的施用量 ... 17

表3-1：質地分類中英對照表 ... 23

表3-2：生物分解瓶構造說明 ... 26

表4-1：實驗用土壤背景值 ... 27

表4-2：綠豆於不同柴油濃度污土生長期 7 天之生長情形 ... 32

表4-3：紅豆於不同柴油濃度污土生長期 7 天之生長情形 ... 33

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圖目錄

圖2-1：好氧微生物代謝烴之途徑 ... 8

圖2-2：碳氫化合物質菌蝕難易順序 ... 9

圖2-3：生物提氣法處理系統 ... 12

圖2-4：初步判斷生物提氣法效果 ... 13

圖2-5：pH 值對一般酵素活性之影響 ... 16

圖3-1：土壤質地分類三角圖 ... 23

圖3-2：生物分解瓶 ... 25

圖4-1：不同柴油濃度污土於 123 天內分解代謝釋出 CO2累積量 ... 30

圖4-2：表面長有白色菌絲之發芽綠豆 ... 32

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第一章前言

隨著18 世紀工業革命以來，人類開始採用新能源，利於科技產品日新月異，

但於不當製造、使用及廢棄過程，導致對地球生態環境產生危害之影響，現今，

有80%以上之能源自石化燃料，其中最為常見油品因於開鑿、運輸、加油站儲存

儲槽中因意外洩漏，由土壤吸附及重力作用滲入，甚至移動導致污染地下水，大部分油污滲入土壤後，減少揮發性碳氫化合物的蒸發散失，一旦超過土壤自淨能力即成為土壤污染，造成對生物的毒害，妨礙植物生長，並導致當地環境生物態改變。

以中華民國領土為例，根據經濟部標準檢驗局之業務統計調查至2011 年 4 月 底加油站總共現有數量有2,854 家，根據環保署土壤及地下水污染整治基金管理會 統計，土壤污染物質為總石油碳氫化合物（Total petroleum hygrocarbons;TPH)公告列管土壤污染場址總共有89 處，其中加油站佔有 49 處及儲槽 2 處。

在1980 年美國專為處理土壤與地下水污染制定之全面環境對策、賠償暨責任

法案(Comprehensive Environmental Response, Compensation, and Liability Act, CERCLA)設立之美國超級基金(Superfund)所列管場址中，使用之整治技術包括物 理、化學和生物方法，其中生物復育技術具有將污染物去除之能力、易於維護、

適用範圍大、符合成本效益等優點，因此本研究是選以柴油為為目標污染物，配置不同柴油污染濃度 (1%、5%、10%、20%、50%(w/w)) 之土壤，原理為分解基質(substrate)和所產生 CO2量成正比，CO2產量成了最好提供微生物是否降解碳氫化物之潛能資訊(周峻湧，2008；王茹涵，2008；Junior et al.,2009)，藉由生物分解瓶或稱微量二氧化碳計量器(biometer flask)觀察其土壤原生性微生物對於不同柴油污染濃度之分解情況。

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第二章文獻回顧

2.1 石油

石油(petroleum)為目前人類重要供給能源之一，其形成大多偏向有機生成論，

為湖或海裡生物遺骸有機物質堆積沉埋沒於地下，經地熱及地壓和複雜的生物及化學作用轉化形成作用轉變而成，以液態、氣態及固態形式存在，未提煉前的液態石油稱為原油(crude oil)，各地出產之原油由其顏色、重量及成份不同，其中一般原油成份如表2-1，主要由碳和氫此 2 種元素以烴類(hydrocarbons)分子組合，分 為烷烴類(石蠟烴)、環烷烴、芳香烴及少數不飽和碳氫化合物的烯烴類，佔原油 97~99%，因此原油歸類為碳氫化合物，其他有少量的氮、氧、硫及金屬共約佔 1~4%(方義杉，1996a；方義杉，1996b；黃武良，2004)。

表2-1：原油的化學成份(林俊雄，2004)

元素重量百分比(wt%)

碳 84~87

氫 11~14

硫 0.04~6

氧 0.01~0.5

氮 0.1~1.5

金屬(鎳、釩、鈉) 0.005~0.015 氫／碳原子比 1.57~1.75

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2.2 石油產品

原油提煉出石油產品，主要依據原理物理分離方法，在不改變分子構造或產出新成分的前提下，依據原油組成特性，如表2-2沸點分佈或碳數分佈分段蒸餾煉製和分子構造間的差異加以分離回收，再視不同所需功用與規範再搭配化學轉化方法衍生煉製出之已多達上千種石油化學品(petrochemicals)與石油產品，根據美國石油協會分類，可分類為如表2-3(林俊雄，2004；台灣中油，?)。

表2-2：原油分餾產品(方義杉，1996b)

油品名稱沸點範圍(℉) 含碳原子數

燃料氣 0 以下 C1~C4

液化氣 0 以下 C3~C4

汽油 100~400 C4~C12

煤油 325~525 C12~C16

柴油 400~700 C16~C20

潤滑油 800~900 C28~C30

燃料油 650~900 C28~C70

柏油 C30以上

表2-3：石油產品種類(台灣中油，?) 種類產品

氣體類天然氣、液化天然氣、丙烷及丁烷等。

燃料類汽油、煤油、柴油、航空燃油、燃料油、漁船用油及石油焦等。

潤滑油脂車用機油、齒輪油、家庭用機油、冷凍機油及多效滑脂等。

石油溶劑用溶劑、油漆滴劑、乾洗油、橡膠溶劑、黏著劑溶、去漬油、揮

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種類產品

發油、石油醚、油墨調和油及正己烷等

石油化學品甲烷、乙烷、乙烯、丙烯、丁二烯、環己烷、苯、甲苯、各種對二甲苯、一氧化碳及合成氣等。

柏油類鋪路柏油、塗料柏油、屋頂柏油、絕緣柏油及柏油漆等。

其他石蠟、硫磺、碳煙及石油焦等。

2.2.1 柴油之特性

供柴油發電機或柴油引擎用、工業及發電之動力，通稱為柴油 (diesel fuel)，

為燃料類石油產品。一般柴油碳數分佈約在10~20 之間，而化學組成主要包含約 為64％脂肪族烴(aliphatic hydrocarbons)、l-2%烯烴(olefinic hydrocarbons)及 35%

芳香烴(aromatic hydrocarbons )(ATSDR,1995)。

實驗用之柴油是購自台灣優力加油站引自台灣中油股份有限公司之產品超級柴油(Super Diesel)，其特性(MSDS)為如表 2-4，表 2-5 為超級柴油品質產品規範。

表2-4：超級柴油 MSDS(台灣中油，2010a) 化學性質：烷烴類

危害物質成分之中英文名稱濃度或濃度範圍(成分百分比) 低硫柴油(C¹⁶〜C²⁰)

(Ultra Low Sulfur Diesel) 68476-34-6

≦98%

生質柴油 (Bio-Diesel)

112-39-0

≧2%

外觀(物質狀態、顏色等)：淡黃色液體 pH 值：中性

pH 值：中性 沸點/沸點範圍： 325℉〜675℉

易燃性(固體，氣體)：-- 閃火點: >52℃ (>125.6℉)

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分解溫度：無資料測試方法: 閉杯自燃溫度：約 177℃( 351℉) 爆炸界限： 1.3%〜6.0%

蒸氣壓：2 mmHg @ 20 ℃ 蒸氣密度(Air=1)：＞1 密度：0.8 ( 比重 ) 溶解度：不溶於水

表2-5：車用柴油規範-超級柴油(台灣中油，2010b)

項目超級

柴油詴驗方法 (Test Methods)

Items SD CNS ASTM/EN/ISO

十六烷指數：Cetane index Min. 48 12016 12761

D976 D4737 密度：Density at 15℃，kg/L

Report 12017 14474

D1298 D4052 多環芳香烴含量：Polycyclic

Aromatic hydrocarbons，%(m/m) Max.11 15079 - -

EN12916 D5186 D6591 含硫量：Sulfur，ppm(m/m) Max.50

13877 14505

- -

D2622 D5453 D6920 D7039 閃點：Flash point PM，℃ _{Min 52} 3574 D93 藍氏殘碳量：Ramsbottom carbon residue on

10%

distillation residue，%(m/m)

Max.0.3 3776 D524 灰份：Ash，%(m/m) Max.0.01 3576 D482 水份：Water content，ppm(m/m) Max.200 4446 ISO12937 水份及沉澱物：Water and sediment，%(v/v)Max.- 14766 D2709 總污染量：Total contamination，ppm(m/m)Max.24 15055 EN12662 銅片腐蝕性：Copper strip corrosion，3hr at

50℃ ^Max.No.1 ¹²¹⁹ ^D130

氧化穩定性：Oxidation stability，g/m3 Max.25 15078 ISO12205 潤滑性，校正磨痕直徑：Lubricity，corrected

wea scar diameter(wsd 1.4) at 60℃，μm Max.460 15074 ISO12156-1 動力黏度：Kinematic viscosity，at 40℃ cStMin.

Max.2.0

4.5 3390 D445 蒸餾溫度：Distillation temperature，

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項目超級

柴油詴驗方法 (Test Methods)

Items SD CNS ASTM/EN/ISO

recovered temp.

脂肪酸甲酯含量：Fatty acid methyl ester (FAME)

content，%(v/v)(註 4)

Min.

Max.

2

5 15057 EN14078 流動點：Pour point，℃ Max.-3 3484 D97

14506 D5949 14667 D5950 冷濾點：Cold filter plugging point，℃ Max.-3 15061 EN116

2.3 土壤之組成

土壤是無機物和有機固體、微生物、空氣及水所組成的混合體，覆蓋於地表的薄層，是孕育萬物生息的場所。若以型態來分，包括固相、液相、氣相和生物多成分體系，一般較受重視為固相及液相成分間的相互作用。土壤固相則由無機質和有機質兩種成分所組成，按狀態來區分，分為固相(50%)-含礦物質、有機質及微生物、液相(25%)-主要指土壤溶液或水份及氣相(25%)-主要指土壤空氣(石濤，

2007) 。

2.3.1 土壤的功能

土壤主要有五個重要功能：(1)保持生物的活性、多樣性和生產力；(2)調節和水之分域及溶質流動；(3)過濾，緩衝，降解，固化，並解毒有機和無機物質包括工業副產品和都市廢棄物和大氣沉降物質；(4)儲存和循環在地球生物界內的營養素和其他元素；(5)提供支持社會經濟結構和保護考古珍品與人類居所 (Soil Survey Division Staff, 1993)。

2.3.2 土壤微生物

土壤微生物參與養分之循環，對自然生態系平衡占有重要地位，如光合作用 (Photosynthesis)、化學合成作用、甲烷生成作用(Methanogensis)及甲烷氧化作用

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(Methane oxidation)、固氮作用(Nitrogen fixation)、硝化作用(Nitrification)、硝酸 還原作用(Nitrate reduction)、脫氮作用(Denitrification)等，而土壤中對植物生長有益之微生物如根瘤菌(Rhizobia)與豆科植物共生進行固氮作用，將大氣中的氮氣轉變為植物可吸收之銨態氮，菌根真菌(Mycorrhizal fungi)幫助植物吸收水分，溶磷微生物將不易被植物利用之礦物性及有機磷轉變為有效性磷以供植物所需的磷素。微生物相會因受到外界干擾而變化，包括天然及人為因素，如養份的加入(以碳源影響最大)、水分、溫度變化、農耕場所等、土壤中的有機質進入及含量是影響生物活性的重要因子(王明光等，2010)。

土壤微生物含有病毒、細菌、放線菌、真菌、藻類、及原生動物，其中於水生與陸地生態系統中主要分解石油碳氫化合物質為細菌和真菌(Leahy &

Colwell,1990)：

 細菌：

(1) 將有機物分解至營養要素的礦質化作用。

(2) 固定氮氣(N2)。

(3) 硝化作用將 NH4+

轉化為NO2-

，而至NO3-。 (4) 脫氮作用將 NO3-轉化為N2及N2。

(5) 促進磷、硫、鐵、錳等物質溶解。

(6) 對其他土壤微生物的生活具有密切關係。

 真菌：真菌是屬於真核微生物，具有菌絲構造：

(1) 分解木質素及有機質，礦質化作用釋放植物養分。

(2) 分泌釋放植物賀爾蒙。

(3) 菌絲綑綁土粒及分泌液促進土壤團粒作用。

(4) 與根系共生作用。

(5) 產生抗生素抑制其他微生物之生長。 (王明光等，2010)

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2.4 生物降解 TPH 特性

生物分解各總石油碳氫化合物能力與否，由碳氫化合物降解菌或其他微生物代謝(或共同代謝)能力，是經微生物呼吸代謝產物來衡量，如圖 2-1，以飽和碳氫化合物烷類在好氧情況下代謝為例，烷類經氧化作用生成有機酸，是微生物代謝的中間產物，接著有機酸進行β-oxidation 作用，其作用為行醯化反應成為醯基 CoA 再轉變為乙醯CoA(acetyl CoA)，之後進入 TCA cycle 及電子傳遞鏈產生能量、二 氧化碳及水。

圖2-1：好氧微生物代謝烴之途徑(Das & Chandran,2011)

污染物質的特性和污染環境會決定生物降解性，例如生物無法分解重金屬，

生物分解效果取決於有機質的化學結構和物理/化學性質(如水溶性，辛醇與水之分配係數)，如高溶解性低分子量有機物比低溶解性的高的分子量化合物較好分解，

低水溶解度通常較複雜的化合物，則較少被生物利用，總石油碳氫化合物的成分、

狀態和濃度，會影響於水生系統中乳化率和擴散性及於陸地生態系統土壤微粒吸附作用，於環境中溫度、氧氣和營養物的濃度也皆是重要因素，例如在某些水生

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環境中鹽度和壓力也可能影響生物降解率，在土壤中其水分，pH 值可能會限制生物降解因子，因碳氫化合物的主要是藉由細菌和真菌降解。

石油碳氫化合物的風化作用主要包含揮發、水洗、溶解及生物降解等，一般微生物分解碳氫化合物，如圖2-2 所示，由低碳數者較易菌蝕，一般其順序由易至 難為正烷(n-alkanes) >支烷( branched alkanes) >低分子量芳香烴

(low-molecular-weight aromatics)>環烷(cyclic alkanes)，其中，已有研究證明生物 降解率是最高的是飽和烴類，其次是芳香烴，而生物降解率極低的是具有較高分子量芳香烴和極性化合物質(polar compounds)以及取代基愈多者愈難分解。

圖2-2：碳氫化合物質菌蝕難易順序(黃德坤等，2004)

因此，生物分解較複雜的化學化合物分解速度緩慢，例如瀝青和重油是不易分解的頑固性化合物，其生物分解比揮發作用為主要移除方式，但其效果會比輕油慢，石油產品成分的生物降解性只要微生物有充足的氧氣和營養物質支持著，

石油產品不論其分子量一般是可生物降解的(石濤，2006；黃德坤等，2004；Leahy

& Colwell, 1990;US EPA,1995;US EPA, 1994)。

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2.5 生物復育

生物復育(bioremediation)是利用微生物來分解污染物的一種處理方法，依處理場地不同可分為現地及非現地，非現地技術是先挖除已受污染物質，離開受污染地區，置於別處做生物處理，現地技術則是直接於污染場地做處理。

大部分用於現地和非現地原地微生物復育處理技術有(Boopathy,2000)：土耕法、堆肥法、生物反應器法、生物通風、生物濾膜法、生物強化、生物刺激、自然生物處理法或自然衰減、抽取處理法，而生物處理技術中主要為：

 生物強化/添加(bioaugmentation)：

以外加營養源及非原性微生物來分解污染物，一般常用於生物復育中生物反應器法或離場系統 (石濤，2006)，其優點為不管是添加經由預選出能針對分解污染物或選殖污染物分解基因經基因重組之微生物，和其他方法相比皆能立即分解污染物質，已有毒害的殺蟲劑化合物、石油化合物及有毒的有機化學品皆成功地藉用生物強化分解(Alisia et al.,2009)。

但添加非原生性微生物並非所有情況適用，有研究指出該研究土壤已污染歷時多年，其土壤微生物群已經馴化適應石油碳氫化合物，且大部分可分解碳氫化合物，再加上柴油在石油碳氫化合物中對微生物而言是較好利用之碳源，以及族群多樣性及豐富性都很足夠，因此生物添加無明顯效果(廖翊廷，2007)，或因土壤裡原生性微生物會影響做生物強化而添加的新菌種之活性或其微生物的基因能否適應環境有關，因此，最佳之生物強化方法為，直接找出現地污染處可分解污染物的原生性微生物並培養增加其數量，原生性微生物較能適應原本環境，分解污染物也較為快速(Bento et al., 2004)。

 生物通氣法/氣提法(bioventing)

生物通氣法是一種常用的現地的復育處理技術，不需開挖土壤能集中處理危險物質且減少處理成本 (Bachman et al., 2001)，其技術可執行任一種處理模式，包

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括：有氧(氧氣呼吸)、無氧(硝酸鹽氮呼吸作用)、厭氧(無氧呼吸)與共代謝，其中好氧模式已被證明是最有效地分解各種脂肪族烴(如正己烷)和通常出現在汽油和柴油燃料中的多環芳香烴化合物(如苯、萘及菲)，也就是只要微生物有充足的氧氣和營養物質支持著，石油產品不論其分子量一般可生物降解的(US EPA,1995；

Javier García Frutos et al.,2010)

於工程復育上，環保署，(1996，附件二)指出，此法主要是針對吸附於不飽和層土壤間隙的揮發性有機物污染物，進行抽取移除的機制。其處理程序類似土壤氣體抽除法(Soil Vapor Extraction, SVE)，亦即其主體設備仍為土壤氣體抽除設備，藉以抽除土壤層中的揮發性有機污染物，但其中比較特別的是多加了一個整治程序單元，於土壤層中添加了營養鹽(Nutrient)的成份，其目的係為增加土壤的生物分解作用，以加速土壤層中污染物質降解速率，使得部分分子量較大、揮發性較低，或是吸附於土壤顆粒微細間隙、吸附引力較強、不易抽離的污染物，可以藉由生物降解作用，將污染物水解或分解成小分子中間產物，而得以再繼續藉由抽氣引力，離開土壤間隙，或是較容易抽離土壤層。

生物通氣法現地馴養微生物的目標種類，主要為好氧性微生物，也就是生物分解的代謝過程中，微生物必須利用氧氣做為電子接受者，而以污染物做為電子提供者，完成完整的降解程序。自然土壤層中的原始氧濃度可能不足以達到促進生物大量分解污染物的需求，因此，土壤層中的氧濃度也成為一項相當重要的因子，而生物通氣法的土壤通氣作用，正好提供了一個良好的通氣環境。

生物通氣法之設備單元如圖2-3 所示，在污染場址的現場，可以於地面上設置 一個營養鹽配製儲放槽，然後經由管線加壓淋灑，使營養鹽能分布於土壤層中，

表2-6 為生物通氣法優缺點。

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圖2-3：生物提氣法處理系統(US EPA, 1994)

表2-6：生物通氣法優缺點(US EPA, 1994)

Advantages Disadvantages

容易取得設備，易於安裝。

干擾最小的運作場址，運用於不易施作進入之地區(如建築物下方)。

整治期程短：在最佳條件下，整治期程一般約六個月至二年。

成本具競爭力。

容易與其他技術結合運用。(如空氣注入法、地下水抽出處理法…等。) 可能不需花費昂貴排氣處理。

初始污染物濃度太高，則可能對毒害微生物。

某些場址狀況不適用。(如土壤低滲透 性、高黏土含量或未充分了解地質背景。)

不常達到極低濃度污染整治標準。

若需注入營養鹽，通常須經過許可。

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一般來說，土壤類型將決定其滲透性。細質土壤(如黏粒和砂粒)比粗質土(如砂和礫石)相比具有較低的滲透不利生物通氣，見圖 2-4。

圖2-4：初步判斷生物提氣法效果(US EPA,1994)

 生物刺激(Biostimulation)

生物刺激是以外加營養鹽及和氧氣及其他電子接受者之方式，促使污染地之微生物生長(石濤，2006)。而營養鹽與氧氣通常先溶於水再將水注入地表下，帶給土壤與地下水微生物，多餘物質則滲入土壤飽和層，必要時將及抽出再回系統中循環，此法可同時復育收污染的土壤與地下水(王士忞，2008)。

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無論在好氧或缺氧情況下復育，氮與磷之營養鹽對柴油菌分解柴油的關係影響非常重大，其中N：P 營養鹽為 10：1(莫耳比)時的柴油分解率與分解率生長量 明顯增加，另外當營養鹽添加愈充分時，微生物對柴油分解量也越大，在相同營養條件時，好氧分解量大於缺氧分解量約2-3 倍(方俊傑，2007)，而營養鹽並非無 適度添加，如Walecka-Hutchison & Walworth.(2006)研究柴油污染砂質黏壤土為研 究發現添加高量營養鹽氮會降低土壤水勢能(soil water potential)導致降低微生物活性，以及營養鹽的添加須慎選來源及考慮添加濃度，一般磷強化藉助KH2PO4，過量添加會因鉀離子過量而導致土壤水勢能失衡而抑制微生物，而在沒有pH 控制 條件下添加尿素(NH2CONH2)會抑制真菌生長，原因於添加同時會有 NH3(g)溢散及水解後會產生OH^-，導致可降解碳氫化合物之真菌無法生存(高俊璿，2008)。

其他相關研究方面，Kauppi et al.(2011)研究生物復育復育技術於寒帶氣候中受 柴油污染土壤之生物刺激與生物強化比較，研究證實經由提供氮及氧的生物刺激證實較明顯改善生物復育油品污染土壤，但Seklemov et al. (2001) 以生物刺激復育 柴油污染森林土壤，發現添加營養鹽幫助收污染土壤來說，並無任何效果可能原因為和生物利用度或有植被的土壤自然存在的氮濃度足夠能幫助生物降解率快速，無需人為干預，營養鹽的添加去刺激微生物分解烴類運用在沙漠土壤較有顯著效果(Delille et al., 2004)。

 自然衰減(Natural Attenuation)

自然衰減法是一有潛能的處理，可侷限擴散或減少石油碳氫化合物的質量和濃度，保護人類健康和環境。自然衰減之整治取決於自然過程，如生物降解 (biodegradation)、擴散(dispersion)、稀釋(dilution)、揮發(volatilization)、水解 (hydrolysis)和吸著(sorption)作用以減少石油碳氫化合物成分的達到整治之目標 (ASTM E1943-98, 2010)。

自然衰減應用於整治污染土壤和地下水且是低成本的方法，但評估此項技 術為整治方案關鍵需依據判斷污染物遷移模式以確保不會對人類和環境有負面影

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響，而且在實行自然衰減法處理污染時，必須徹底的監控整個過程，表2-7 為其優 缺點(Mulligan & Yong, 2004)。

表2-7：自然衰減整治方法優缺點(李在平等，2005)

優點潛在缺點

整治過程對於現地環境的擾動較小易與其他工程整治技術整合運用。可依據現地狀況和整治目標，配合人為措施，以加速生物降解作用。不會因為整治設備維修而延誤。整體所需費用較主動整治方法為低。

減少整治過程所產生之廢棄物。

降低工作人員暴露在污染物中的風險。

達到整治目標所需時間可能較長，而且有可能無法達成目標。

民眾難以認知自然衰減整治方法，需要進一步的教育和宣導。

整治過程中必須進行長期的成果監測。

自然衰減所產生的中間產物可能比原污染物毒性還強。

水文和地化狀況可能隨時間而改變。

所需之現地水文與地化調查工作可能更為複雜，以致耗費不貲。

如果自然衰減整治方法失敗，必須立即執行主動性之替代整治方法。

2.5.1 生物復育之其他環境影響因子

 pH 值

環境中pH 值會影響其微生物酵素活性，如圖 2-5，因為依賴 pH 值的酸性和

鹼性胺基酸於活性中心，就算稍為改變 pH 值都可導致酵素變性進而隨後失去催化活性(Stephen Stoker,2009)，因此若當土壤 pH 值過低或過高均會影響植物或微生物難以利用或不易吸收營養鹽。

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圖2-5：pH值對一般酵素活性之影響(Stephen Stoker,2009)。

礦化作用(mineralization)其最佳 pH 值在中性，在通氣土壤條件與土壤 pH 在 5.5~8.0 範圍時，有利於生物降解 (王明光，2000)，另研究指出柴油污染物於降解 試驗期間之pH 值 5.0~7.8 之間是適合土壤微生物生的環境條件，對於作用可提供 一定的助益(羅文杰，2005)。

若土壤為鹼性，如果需要土壤pH 值降低，可以使用硫酸鋁或特定商用化肥依 廠商建議混合於土壤也將有助於降低pH 值(USDA,1998)，若土壤為酸性，會有磷 的固定現象，另外鹼性離子（鈣、鎂、鉀、鈉等）會有流失情形，部分微量元素的有效性也會降低，嚴重的話則會有鐵、錳、銅、鋅及鋁的毒害現象(林永鴻，2001)，

而常見的做法是添加石灰(碳酸鈣)於做生物復育含有害有機物酸性土壤中

(Alexander, 1999)，以提高 pH 值，而當土壤含有高量有機質和黏土往往比砂質土 壤需要更大量的石灰以改變土壤pH 值，其中，中和土壤酸度常用石灰資材有石灰 (碳酸鈣)、生石灰、消石灰、苦土石灰、氧化鎂、氫氧化鎂、瀘渣等。石灰資材中 所含陽離子和陰離子的種類為決定鹼度高低的決定因子，而石灰資材愈細者在單位體積內可發揮中和酸度效應的表面積愈大，所以效果愈佳。一般而言，以改良 20 公分土層厚度估算，可藉由表 2-8 的簡則來決定土壤的石灰需要量 (黃瑞彰，

2006) 。

(23)

表2-8：石灰(碳酸鈣)的施用量 (單位：公噸/公頃) (黃瑞彰，2006)。

pH 砂土及壤

質砂土砂質壤土壤土坋質壤土粘土有機土

4.5 增至 5.5 0.7 1.2 1.8 2.8 3.7 8.2

5.5 增至 6.5 1.0 1.7 2.4 3.5 4.7 8.5

 溫度

土壤表層溫度隨著每日氣候和季節變化，日夜溫差的大小隨著土壤的深度減少，而濕土壤中水有高比熱容量因此日夜溫差比乾燥土壤小，其中影響土壤溫度的因素包括：土壤坡向、有無陡峭的斜坡、遮蔭度、土壤的顏色和表面有無覆蓋物，大部份土壤微生物嗜溫菌，其最大生長速率和活性在20°〜35 ° C 溫度範圍，

土壤也含有微生物的生長最好的溫度低於 20 ° C 的嗜冷菌以及在 50 °至 60 ° C 的嗜熱菌(Burden & Sims, 1999)。

溫度，會影響生物降解作用中石油碳氫化合物的物理性質和化學成分、微生物代謝碳氫化合物速率以及微生物群落的組成。在低溫時，油的黏度會增加，有毒短烷鏈揮發會減少，導致生物分解速度開始減緩，一般觀察到溫度的降低其分解率隨之降低，這被認為主要是和酵素活性降低有關或因Q10 的影響。增加溫度 可將生物代謝率提高，而其溫度範圍通常在30 至 40℃，但超過此範圍後碳氫化合 物對細胞膜的毒性增加。但仍有適應其環境並利用烷類的嗜熱細菌仍存在。而在不同氣候和季節下可能篩選到不同且能適應環境溫度利用碳氫化合物微生物。此外，嚴冬氣溫也會限制生物降解於河口含多環芳烴及淡水湖各種碳氫化合物(Leahy,

& Colwell,1990)，相關研究證實，因隨土壤溫度降低減少了微生物的生長和代謝活 動，生物分解有機廢質隨之減少，已被證明一般來說是在溫度 0° C 生物就會停止降解(Burden, & Sims,1999)，另 Delille et al.( 2004)研究於指出在自然的亞南極條件下柴油燃料或阿拉伯的輕質原油污染寒冷地區土壤，實地研究結果顯示，在於

(24)

壤，比無覆蓋的受污土壤相較下年平均溫度提高多了2℃，雖然有塑膠蓋可能減少 物理風化干擾及污染物質揮發和光降解，卻幫助縮短了生物復育目標時間，應為空氣和土壤溫度均會影響於土壤中揮發性化合物和地下水文中生物和化學衰減過程的速度，在一般情況下，於實地情況中土壤溫度是很難控制，但可能會受到使用天然或人工材料覆蓋物以及土壤水分而控制.(Burden, & Sims, 1999)，因此可採用植被方式、注入地下水或空氣加熱，以提高土壤溫度及維持微生物活性(廖書賢，

2007)。

土壤水份

土壤的水份含量會影響微生物活性，於復育過程土壤含有過多或過少的水量會不利於好氧生物。當水份過於飽和會降低氧在土壤中滲透傳輸性不能提供足夠的氧，乾燥的環境下會使微生物的活性降低或當水份含量達至凋萎點則會停止生物降解過程(US EPA,2003)，又因在飽和含水層會限制污染物揮發速率及降低養份傳輸，另外過低的含水率則會因土壤的吸附作用而降低污染物揮發性(周孟琦，

2002)，最佳生物降解石油碳氫化合物之其土壤含水率為 50%至 80%之間

(Friend,1996)，而另有研究指出土壤分解有機物質最佳含水率為 60%(Mirsal,2008)。

總結以上而最有效的復育過程主要取決於：(1)合適的微生物的存在；(2)目前污染的類型；(3)對微生物是否有一合適的電子受體；(4)微生物與污染物分子的接觸情況；(5)污染土壤的石油化學結構(Bachman et al.,2001)。

2.5.2 生物復育所需時間

決定生物復育所需的時間取決於幾個因素：

(1)目前的有害化學物質類型和數量 (2)污染區的大小和深度

(3)目前土壤的類型和條件

(4)地面或地下是否有降解情況發生

(25)

這些因素依各地現場情況而不同，微生物它可以在數月甚至數年分解足夠的有害化學品以清理現場(US EPA,2001)。

第三章材料與方法

3.1 實驗用品

(1) 碳酸鈣(Calcium Carbonate,precipitated)：CaCO3，試藥一級，製造廠商：

Shimakyu chemical。

(2) 氫氧化鈉(Sodium Hydroxide)：NaOH，製造廠商：Panreacquimia sau (3) 鹽酸 Hydrochloric Acid HCL：試藥一級，製造廠商： Shimakyu chemical。

(4) 氫氧化鉀(Potassium Hydroxide) KOH，製造廠商：Choneye pure chemicals。

(5) 六偏磷酸鈉 (Sodium polyphosphate)：(NaPO3)6，製造廠商：Aldrich 。 (6) 酚酞 (Phenolphthalein)： C20H14O4，製造廠商：Koch-light Laboratories

Ltd 。

(7) 磷酸氫二銨(Diammonium Hydrogenphosphate)：(NH4)2HPO4，試藥一級，

製造廠商：Katayama Chemical Co.,Ltd。

(8) 燒鹼石棉(Ascarite(Ⅱ)),CO2 absorbent,20-30 mesh,capacity:40-50%，製造廠商：Acros organics。

(9) 超級柴油(Super Diesel) ，製造廠商：台灣中油股份有限公司油品行銷事業 部。

3.2 實驗方法

3.2.1 土壤前處理

實驗用之土壤樣採自未受污染紀錄之土壤，確保實驗不遭受干擾。

土壤採樣後先除去雜物、石塊等，於晴天狀態下將土壤拿出去風乾約一星期，

(26)

再拿取2mm 篩網過濾未過濾之土塊多次磨碎，重複動作數次已確保取得粒徑均勻 之土壤，保存於密封塑膠盒中並每3~4 天曝氣攪動土壤一次。

3.2.1 土壤性質分析

 土壤水分含量(Soil Moisture Content)測定-重量法 預處理風乾土壤樣品的測定法(NIEA S280.61C)：

(1) 取乾淨附蓋稱量瓶置於烘箱內，以 105 ± 5 ℃ 乾燥，然後蓋上蓋子移至 乾燥器內冷卻至少 45 分鐘，測定密閉稱量瓶的重量(m0)，精秤至 10 mg。

以藥杓將 10 至 15 g 土壤置入稱量瓶中，加蓋精秤稱量瓶及土壤重(m1) 準確至 10 mg。

(2) 將裝有土壤稱量瓶及瓶蓋放入 105 ℃ 烘箱中，直至恆重其重量差須不超 過 0.1 ％(m / m)，以最後一次秤重為準。。

(3) 稱量瓶加蓋於乾燥器中冷卻至少 45 分鐘。

(4) 取出加蓋稱量瓶，旋即精秤乾燥後土壤及稱量瓶重量(m2)準確至 10 mg。

(5) 以下式乾重量為基礎計算水分含量百分比，重量百分比精確至 0.1 ％：

m0：含蓋稱量瓶空重(g)

m1：含蓋稱量瓶及風乾土壤重(g) m2：含蓋稱量瓶及烘乾土重(g)

 土壤飽和含水率(maximum water-holding capacity by Hilgard method)

土壤持水能力，取決於在土壤中的有機質和土壤顆粒的大小，其測定方法為，

取適量之由105 ± 5 ℃烘乾並乾燥至恆重土壤，取適當大小之濾紙於篩盤面上，

將濾紙用蒸餾水噴濕後秤總重，小心填入已烘乾之土壤約75%且壓實平整土壤後

(27)

秤總重，拿已吸取蒸餾水之滴管緩慢滴水至土壤，水藉由重力及毛細作用通入土壤，直至自土壤底部滴出水滴，在等數分鐘確定土壤飽和後再秤一次總重量，計算方式如下(Oyeyiola, G.P, 2010)：

=

滴入水重

*100%

乾土之重量

 土壤質地分析(Soil texture analysis) (1) 土壤結構沉澱試驗

將1/2 杯土壤加入 3.5 杯的水及 5 茶匙的 Calgon 溶液，放入有蓋之瓶中，搖 動5 分鐘，再靜置 24 小時之，當所有土壤沉澱安定後，再測量其總(Total)沉澱高 度，之後再搖晃5 分鐘使其靜置 40 秒測量其砂粒(Sand)之沉澱高度，再放置 30 分 鐘後，所測得的沉澱高度減去前一步驟所測得的砂粒(Sand)沉澱高度可得到坋粒 (Silt)的高度，剩下不能沉澱的是黏粒(Clay)，Clay 高度= Total 高-Sand 高-Silt 高 (Plaster,1997)。

計算：

Sand(%)=(Sand 高/Total 高)*100%

Silt (%)=(Silt 高/Total 高)*100%

Clay (%)=(Clay 高/Total 高)*100%

(2) 比重計法

秤取一定量(W)之烘乾土壤 (黏質土及壤質土 40g、砂質土 80g，樣品的重量會增加是由於測量砂質土壤時可降低粘土對比重計測量範圍影響)，至 500mL 玻璃器皿，加入蒸餾水約100mL，置加熱器加熱攪拌煮沸使土粒分散均勻，加入適量 30%~35%過氧化氫(H2O2)數 ml 至有機物消除，加入 1NHCL 10ml 以去除 CaCO3

或可溶性鹽類，再以超純水清洗3 至 4 次，加入 1N 氫氧化鈉 1mL 及六偏磷酸鈉

(28)

水量，以攪拌器攪拌20min，再倒入置 1000mL 並加蒸餾水至 920 mL 或 960 mL，

封住量筒洞孔，搖動數次後放,靜置 20 sec 後置入比重計，靜置 40sec，紀錄比重計讀數(PS)，靜置 2hrs 後再放入比重計，記錄比重計讀數(PC) (梁書豪,2006 ； Burt,2009) 。

計算：

Sand(%)=100-(PS/W)* 100 Silt (%)=(PC/W)*100

Clay (%)=100%- Sand(%)-Silt (%)

土壤質地中礦物顆粒尺寸：砂粒- 2.0mm 到 0.05mm、坋粒- 0.05mm 至 0.002mm 及黏粒-小於 0.002mm。若依感覺法斷，這些粒子若單從外觀或觸覺判別，砂粒會感覺較粗糙的，可以單獨用肉眼看到，而坋粒較無法看到單獨顆粒，另外當乾燥或潮濕時用手摸起來有平滑或黏糊感的感覺的，則是黏土(Soil Survey Division Staff, 1993)。

土壤質地是基於此三種礦物顆粒相對比例或重量再依分類圖3-1 及表 3-1 來分 類定義12 個質地類(USDA, 1999)。

(29)

圖3-1：土壤質地分類三角圖(Rebecca Burt,2009) 表3-1：質地分類中英對照表(李典澤,2006) (1) Sand 砂土 (2) Loamy Sand 壤質砂土 (3) Sandy loam 砂質壤土 (4) Sandy clay loam 砂質黏壤土 (5) Sandy clay 砂質黏土 (6) Loam 壤土

(7) Clay loam 黏質壤土 (8) Silt 坋土

(9) Silty loam 沙土 (10) Silty clay loam 坋砂黏壤土 (11)Silty clay 坋砂黏土 (12) Clay 黏土

(30)

 土壤有機質(Soil organic matter)含量的測定

經土壤水分含量(Soil Moisture Content)測定之烘乾土壤及其容器有蓋之坩鍋秤重，之後放至於馬弗盧(muffle furnace)，逐漸將爐溫升至 750° C，直至土壤完全灰化且至恆重後，取出至乾燥箱冷卻並秤重計算如下(ASTM D2974-87)：

灰份含量(D)(% )= (C * 100)/B 有機質含量(％)=100.0 - D

C = 灰份(g) ,B =試樣烘乾重(g), D =灰分含量(％)。

 土壤酸鹼值(pH 值)測定方法－電極法 (1) pH 測定儀校正

(2) 樣品製備及 pH 值測定

(3) 土壤經風乾過篩(通過 20 mesh 標準篩網，孔徑 0.84 mm)處理後，秤取 20

± 0.2 g 之樣品置於適當體積(如 50 mL)之燒杯內，加入 20 mL 試劑水蓋上錶玻璃，並且持續攪拌混合液 5 分鐘，若含有吸水性的土壤或鹽類等複雜基質，可適度分次加入試劑水至可測量 pH 值為止，並記錄加入之試劑水量。

(4) 靜置混合液約 1 小時，使混合液的大部分固體沉澱，以直接、過濾、離 心或利用其他方式取得水相層，測定水相層之 pH 值，並記錄溫度 (NIEA S410.62C) 。

3.2.2 調整微生物最適之土壤環境

 調整土壤 pH 值至 7.5

由於微生物最佳生長環境pH 值在中性，若土壤 pH 值檢測後得知未達此標準 則，每克土壤要加入10mg CaCO3提升鹼度(Sharabi & Bartha, 1993)，加入後土壤攪拌均勻且須放置於密封袋中,避免土壤於 CO2開放系統狀態中，而因微生物分解有機物產生CO2會使pH 下降，每天需做翻土動作，以利 CO2排放，為期3~5 天

(31)

後，再測量一次pH 值，若仍未達標準再重複以上步驟。

 添加營養源

添加微生物所需之營養源，促進污染地原微生物生長，添加(NH4)2HPO4(Dale et al.,?)1%於土壤中。

 調整土壤含水率

添加適量蒸餾水於土壤中至土壤含水率為60%。

3.2.3 柴油污染土壤呼吸測定(Soil respirometric tests)

使用生物分解瓶(Biometer flask) (250ml)為圖 3-2 及表 3-2，藉以來測量微生物於代謝過程所生產CO2之情況( Pramer & Bartha,1965) 。

圖3-2：生物分解瓶(EPA712–C–98–088,1998)

(32)

表3-2：生物分解瓶構造說明

A：橡皮塞 B：15 號針頭

C：側支瓶 D：矽膠管

E：氣體通道 F：Ascarite 過濾裝置

G：旋轉鈕 H：容量 250mL

I：檢體

首先配置柴油污染土壤濃度為1%、5%、10%、20%、50%和空白組(w/w)，每 一個濃度各重複試驗做3 瓶，各個瓶中置入已添加營養源取 pH 值為中性土壤 20g，

並調整土壤含水率至60%，而再依其配至污染濃度不同加入適當量之柴油，另空 白組不需加入柴油作為實驗結果作為土壤原始背景比較用。

受檢體加入瓶內之後，將生物分解瓶裝置完成，使用幫浦做曝氣，於此過程中氣體會通入ascarite 過濾，避免大氣中 CO2進入生物分解瓶內影響實驗，之後使用注射器(syringe)注入 KOH 溶液 10mL 於瓶身側之瓶(side-arm)中，每經過 3 至 4 天，再回收將已吸收CO2之鹼液準備做酸鹼滴定實驗，經計算後得知CO2釋放含量，如此循環。

而其中需注意的是鹼性溶液只要不長久暴露於玻璃及空氣中，則具有良好的穩定性。強鹼會和玻璃緩慢反應生成矽酸鹽形態，因此要使用一兩週以上的標準鹼液，必須儲存於聚乙烯瓶中，若鹼液的使用不超過一兩週，則將其儲存在有緊密蓋子的聚乙烯瓶中，並擠壓一下瓶子除去存在容易和塞子間的空氣就足以防止吸收大氣中的二氧化碳。(林敬二等，1994)。

3.2.3 植物毒性試驗(Plant toxicity test)

配置柴油污染土壤濃度為0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%、20%、

50%和空白組(w/w)，空白組不添加柴油，各個受污染土壤各種植 5 顆紅豆及綠豆

(33)

種子做毒性試驗，為期7 天收成觀察生長情況，實驗數值以統計分析平均值±標準 差（mean ± S.D ., n = 5 ）表示,另以變異數分析法(analysis of variance，ANOVA)，

分析空白組與各組之間生長情況有無差異，統計結果，當P<0.1 表示統計上有邊際 顯著性差異，當P<0.05 表示有顯著差異達顯著水準，當 P<0.01 表示有極顯著差異 達顯著水準。

第四章結果與討論

4.1 土壤背景

表4-1 為檢測土壤背景之實驗數據，土壤水分含量因預先經前處理風乾過篩處

理過所以僅含7.1%，因此根據文獻調整至 60%，原土壤 pH 值為 6.42 也調整至 7.5 更適合生物復育。

表4-1：實驗用土壤背景值

檢測項目實驗數據

水分含量 7.1%

飽含水率 70.2%

質地分析：

(a)土壤結構沉澱試驗法 (b)比重計法

(a)土壤結構沉澱試驗法：

Sand=81.81%

Silt=9.09%

Clay=9.09%

質地為壤質砂土

(b)比重計法：

Sand=60.84%

Silt=29.24%

Clay=9.92%

質地為砂質壤土

有機質含量 12.7%

灰份含量 87.3%

土壤pH 值 pH 值為 6.42

(34)

土壤質地指的是分佈於土壤中礦物微粒小於2.0mm 大小的砂粒，坋粒和黏粒 之比例。質地是一種最穩定屬性，僅更改耕作和其他因素而導致混合不同土壤而干擾判斷(USDA, 1999)。

土壤質地試驗本實驗採取2 種不同試驗方法分析，第一種為土壤結構沉澱試 驗檢測結果均為壤質砂土，第二種使用比重計法實驗結果均為砂質壤土，結果為比重計法較為可信，推測此2 種試驗法比較，經實驗數據比對比重計法較土壤結 構沉澱試驗期比例砂粒部分少了20.97%、坋粒多了 20.15%、黏粒多了 0.83%，原 因為比重計法分散土壤團粒較為徹底，因土壤團粒為砂粒、坋粒及黏粒所集結而成，檢測時必須將促使團粒的膠結類物質去除，並加入分散劑將其土壤粒子打散，

如：

(1) 添加過氧化氫消除有機質，因有機質提供良好的微生物活動環境，微生物 活動影響團粒化作用，土壤微生物常以複雜之機制結合團粒，如吸附、物理的網羅包封及分泌物之膠結作用等使土壤互相連結，此外有機物尚有減少可濕性及膨脹性的功能，促進土壤團粒之穩定性 (鄭文吉，2003)。

(2) 添加了鹽酸去除是土壤團粒黏著劑的可溶性鹽類。

(3) 並直接添加六偏磷酸鈉，因為六偏磷酸鈉的功能是將土壤溶液裡的 Ca²⁺

複合物及土壤顆粒的中Ca²⁺由Na⁺取代，鈉離子會使土壤團聚體分解至土壤顆粒分散(Kettler et al.,2001)。

(4) 使用電動攪拌器使土粒更均勻分散以及使用比重計更能精準量測。

(5) 而土壤結構沉澱試驗此但此法僅是去除硬離子或其去除溶液可能添加不 夠多以及是使用人工方式攪拌土壤造成土壤粒子未均勻分散，可能和感覺法一樣是適合如在野外中檢驗較為便利粗估土壤質地。

判斷質地是很重要的，因為它會影響土地肥沃度、耕作、曝氣量並決定水攝取率，比如黏粒比砂粒土壤保留更多的水分和養分(Soil Quality Test Kit Guide, 1999)，也就是土壤質地較細者排水率差，污染物不易移動，質地較粗者則反之且

(35)

通氣率較佳。

本實驗土壤質地判定為砂質壤土，關於砂質壤土復育效果例如，蔡威呈 (2003) 以本土菌運用生物通氣法於現地復育油污染土壤中研究指出受石油系列物質污染之砂質壤土及壤質壤土其生物復育成效比較發現砂質壤土復育情況也較壤質壤土效果佳，另外蔡國聖等(2009)研究指出添加砂質壤土於污染土壤中，其原油被降解的效率較壤質土壤中原油被降解的效率高，可能亦是砂質土壤質地的孔隙率較壤質土壤的孔隙率高，所以其氧氣傳輸的效率較佳，故在氧氣較充足的條件下有利本土菌種的生長而提高原油的降解效率。

除了土壤質地有機質含量也是很重要的，大多數的土壤是由岩石風化而成的，而被風化的岩石，通常即稱為母岩(bed rock)。由於岩石是一種礦物，因此其所生成的土壤中，以礦物為主體，故稱為無機土壤，有一部份土壤是大部份是由有機質組成，其有機質含量超過20%者，歸類為有機土壤(陳右人，2003)，本實驗 有機質含量為12.7%屬無機土壤，而有機質雖可增進土壤團粒構造、增進通氣性及 土壤溫度(陳仁炫，?)，但有研究指出有機質或粘粒含量較高的土壤相對於比低有機質含量與粗質地對油品有較大之吸附量(林文元，1999)，高含量有機質也會影響生物分解，例如泥碳土(peat soil)，為一種有機土綱土壤，含有 50%或以上的有機質(洪崑煌等 1996)，吳柏穎(2010)在研究土壤有機質對生物降解石油碳氫化合物之影響說明由BH Medium 添加泥炭土與未添加泥炭土的試驗做比較，添加泥炭土 會使Heptadecane 與 Pristane 的生物降解變慢變差，由此發現，土壤有機質會使菌 群的生物可及性變差，造成降解變慢，由以上得知因此本實驗用土壤適合生物復育。

(36)

4.2 柴油污染土壤呼吸測定

由圖4-1 所示，CO2釋出能代表其微生物活性及代謝情況，其初期以0~20 天 分解較快，之後有緩慢分解之趨勢，首先以無添加柴油的空白組與污染濃度1%及 5%比較，1%於第 10~20 天及 5%於第 15~30 天漸漸開始其 CO2釋出速率近似於空白組，判斷因柴油污染濃度低所導致，而1%由圖示可知 45 天後釋出 CO2的量過低，因此於第74 天開始停止實驗。

以5%、10%及 20%比較，依其 CO2釋出量判斷可能依其污染濃度增加而成倍率成長，而50%於處理時間內理應 CO2釋出量確未依其污染濃度增加而成倍率成長，而10%於 CO2釋出速率也有漸緩之趨勢，20% 其 CO2量仍持續累加代表仍持續分解中，此外，實驗過程中，各個有受柴油污染之土壤均長菌絲體，也應證了分解碳氫化合物大多由真菌及細菌所為。

圖4-1：不同柴油濃度污土於 123 天內分解代謝釋出 CO2累積量

(37)

其中於柴油濃度50%其原生性為生物代謝情況，應是污染濃度過高，毒性物 質多，對生物毒性高，以及油浮於土層表面影響更會氧氣滲入量，導致好氧微生物無法吸收氧氣影響代謝所導致，如黃德坤等(2004)研究報告說明指出在石油風化過程中其微生物的降解作用與含氧量、土壤及地下水的溫度與pH 值、微生物 的特性、分離相中碳氫化合物的濃度及碳氫化合物的化學結構與性質均有極密切的關係，當分離相中碳氫化合物的濃度如果高到形成一個小油池，對微生物將產生毒化現象，其生長將會受到抑制，而合適的濃度可以加速微生物的降解作用。

細菌於高濃度石油裡難以存活(沈俊卿、郭正隆，2002)和陳世賢等(2009)其研究

中，經PCR-DGGE 分子生物技術分析結果顯示該研究復育之遭石化污染之污染場

址其微生物菌相會隨著石油碳氫化合物的污染程度增加而減少。

4.3 植物毒性試驗

4.3.1 綠豆之生長情形

依數據統計結果為表4-2 所示，綠豆葉子長度於柴油污染濃度 5%有邊際顯著 性差異(P<0.1)比空白組短。綠豆莖長度於柴油污染濃度 5%有邊際顯著性差異 (P<0.1)，濃度提高至 10%時為有極顯著差異(P<0.01)，比空白組莖之長度短。綠豆 根部生長情況於柴油污染濃度0.3%以及 1%有極顯著差異(P<0.01)，較空白組長，

而種於柴油10%之有發芽綠豆，其表面佈滿白色菌絲體，依圖 4-2 所示，應為真菌 感染。生長率則是於柴油污染濃度至10%後降低至 20%，隨濃度提高 15 至 50%生

長率皆為0%，而 0%~50%柴油污土之未發芽綠豆均發生種子發黑壞死軟化之現象。

(38)

表4-2：綠豆於不同柴油濃度污土生長期 7 天之生長情形 綠豆

濃度(w/w) 葉(cm) 莖(cm) 根(cm) 萌芽率(%) 空白 2.10±1.07 20.02±10.61 6.14±3.37 80 0.1% 2.14±0.31 18.82±4.99 7.68±1.97 100 0.3% 2.30±0.17 25.18±2.39 14.02±0.59*** 100 0.5% 1.80±0.91 19.74±11.00 8.12±4.58 80

1% 2.08±0.43 20.48±4.52 12.80±1.19*** 100 3% 2.16±0.23 18.86±1.99 9.00±2.95 100 5% 1.00±0.38* 7.06±4.73* 3.12±2.16 100 10% — 0.50±1.00*** —^a 20

15% — — — 0

20% — — — 0

50% — — — 0

註：1.^a根部腐爛。

2.與空白組比較：*P<0.1，**P<0.05，***P<0.01 結果顯示。

圖4-2：表面長有白色菌絲之發芽綠豆

(39)

4.3.2 紅豆之生長情形

依數據統計結果為表4-3 所示，紅豆葉子長度於柴油污染濃度 5%有顯著差異 達顯著水準(P<0.05)比空白組短。紅豆莖長度於柴油污染濃度 5%時為有極顯著差異(P<0.01)，比空白組莖之長度短。綠豆根部生長情況於柴油污染濃度 5%開始有顯著差異(P<0.05)，較空白組短。生長率則是於柴油污染濃度至 10%後降低至 40%，隨濃度提高 15 至 50%生長率皆為 0%。

表4-3：紅豆於不同柴油濃度污土生長期 7 天之生長情形 紅豆

濃度(w/w) 葉(cm) 莖(cm) 根(cm) 萌芽率空白 1.18±0.64 18.40±10.36 7.22±4.19 80 0.1% 1.12±0.40 18.36±3.50 10.96±2.48 100 0.3% 1.16±0.23 18.02±5.50 10.08±0.82 100 0.5% 1.04±0.16 13.40±4.53 11.16±1.15 100 1% 1.12±0.12 13.86±4.05 9.62±2.05 100 3% 0.72±0.13 8.36±3.99 9.50±2.74 100 5% 0.16±0.20** 0.80±1.03*** 1.18±0.72** 100 10% — — 0.22±0.35** 40

15% — — — 0

20% — — — 0

50% — — — 0

註：與空白組比較：*P<0.1，**P<0.05，***P<0.01 結果顯示。

總結以上得知不同濃度柴油污染土壤之植物紅豆、綠豆於生長期7 內之生長 情況，其結果顯示當柴油濃度提高至5%開始其生長高度都較無污染之空白組短，

導致生長速度緩慢，而於濃度至20%以後之高濃度，生長率皆為 0%，表示高柴油 污染濃度對紅豆及綠豆生長有抑制性，即對柴油明顯對植物有毒性之影響。

石油的物理效應和化學毒性會導致降低初級生產量、植物枯萎，生物存活和沼澤化。這些影響機制是經由破壞植物與水的作用關係、直接影響植物的新陳代

(40)

氣孔堵塞而減少氧氣傳輸至根部(Ko & Day,2004)，導致土壤厭氧條件增加，影響呼吸及光合作用及養分傳輸，和影響促進植物生長之根圈微生物(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)好氧性代謝作用，降低豆類之真菌、病毒或細菌病 害之防治效果以及有機物之分解(賴盈瑋，2004；陳俊位等，2009；彭德昌、黃山內，1998)，且若土壤呈厭氧狀態，致使脫氮作用(Denitrification)此時氮會形成游離氮氣而從土壤中逸失，硫會形成硫化氫(H2S)及不溶性硫化物質，碳水化合物則生成甲烷(Methane, CH , 不純者稱為沼氣)，毒害或不利於植物生長(陳尊賢，

2002)。

第五章結論與建議

5-1 結論

本研究為使用Biometer flask 裝置，觀測受檢之土壤其原生性微生物分解柴油 污染物質代謝情況之研究，主要配置不同柴油污染土壤濃度 (1%、5%、10%、20%、

50%(w/w))之因子影響，原理為利用微生物分解基質之產物 CO2，其產量可提供微生物是否降解碳氫化物之潛能資訊作以此推論，另做毒性試驗選擇以植物紅豆及綠豆為檢測對象觀測不同柴油污染濃度下之生長情形。

(1) 實驗天數 123 天為止進行土壤呼吸測定，於不同柴油污染濃度之土壤，其微 生物代謝之CO2累積量多寡比較為20% > 50% > 10% > 5% > 1% (w/w)，可知 受污土壤之原生性微生物其分解柴油效率並非隨柴油濃度提高成正比成長，應為其50%柴油污染濃度過高，使土壤厭氧條件增加及其化學毒性對微 生物產生毒害，致使CO2累積量較柴油污染濃度20%少。

(2) 以 one-way ANOVA 分析以不同柴油污染土壤濃度為單一因子，觀測各別對 紅豆及綠豆根、莖、葉生長長度情形，其p-value 均小於 0.05，由此表示於 不同柴油污染濃度下確實會影響植物生長狀態，柴油污染濃度10%後萌芽率

(41)

明顯降低，顯示隨其柴油濃度提高會抑制植物生長。

有機污染物於微生物合適環境下應有自然分解之能力，只是過高污染濃度及複雜之有機化合物對生物均具有毒性及抑制性，分解所需之時間較長，因此以工程化生物復育之方式進行整治加速處理仍為妥當。

5-2 建議

(1)柴油污染土壤之呼吸測定其實驗時間可再延長觀測。

(2)植物毒性試驗應最佳使用植物生長箱。

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